Prctica No.

1
Espectrofotometra de absorcin
visible

FUNDAMENTO TERICO:
Los mtodos espectroscpicos de anlisis estn basados en la medida de la radiacin
electromagntica que es absorbida o emitida por una sustancia. En funcin de ello se clasifican
fundamentalmente en:

Mtodos de absorcin: Se basan en la disminucin de la potencia de un haz de radiacin

electromagntica al interaccionar con una sustancia.
Mtodos de emisin: Se basan en la radiacin que emite una sustancia cuando es excitada
previamente por medio de otro tipo de energa (trmica, elctrica).

Mtodos de fluorescencia: Se basan en la radiacin que emite la sustancia cuando es excitada

previamente por un haz de radiacin electromagntica.
Otras clasificaciones de los mtodos espectroscpicos se establecen en funcin de la regin del
espectro electromagntico que interviene en la tcnica. As, pueden utilizarse regiones como rayos
X, ultravioleta, visible, infrarrojo, microondas, etc. En la Figura 1 pueden verse las regiones del
espectro electromagntico, en funcin de los valores de la longitud de onda () de cada radiacin:

En la figura 1 puede tambin observarse como la luz visible para el ojo humano constituye nicamente
una pequea parte del espectro electromagntico.
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La base de la espectrofotometra es la ley de Lambert-Beer, la cual se sintetiza en el siguiente
enunciado:

La cantidad de luz absorbida por una solucin coloreada es directamente proporcional a la

concentracin o a la cantidad de partculas coloreadas en dicha solucin.

La palabra espectrofotometra deriva de tres races: espectro (ver), foto (luz) y metra (medicin).

Al incidir radiacin electromagntica visible sobre la materia puede ser totalmente absorbida o
totalmente reflejada. En el primer caso el objeto aparecer de color negro y en el segundo de color
blanco. Puesto que nosotros percibimos los objetos por medio de la luz reflejada, si hacemos incidir
un haz de luz blanca (que contiene todas las longitudes de onda) sobre un objeto, ste absorber
ciertas longitudes de onda y reflejar otras, siendo stas ltimas las responsables del color. Se dice
que este color (observado) es complementario del que se percibira si la luz absorbida se pudiera
detectar. Dado que en la parte experimental de esta prctica las medidas van a realizarse con
espectrofotometra visible, es conveniente conocer para qu longitud de onda tiene cada color su
mxima absorcin, lo que se muestra en la tabla siguiente:

Componentes del espectrofotmetro:

Para medir los valores de absorbancia y transmitancia de una disolucin se utilizan

espectrofotmetros UV-Vis, que, como puede verse en la Figura 2, se componen de cinco elementos
principales:

Una fuente de radiacin que suele ser una lmpara de filamento de wolframio

Un monocromador que permite seleccionar una longitud de onda determinada originando un haz
monocromtico.

Un recipiente para contener la muestra denominado cubeta fabricado con un material que
permite el paso de la radiacin en la regin del espectro de inters. Suelen ser de vidrio, plstico o
cuarzo. El espesor de la cubeta ms habitual es 1 cm.

Un detector que convierte la energa radiante en una seal elctrica.

Una pantalla de visualizacin
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La absorbancia est relacionada con la concentracin de la sustancia, c, por la ley de Lambert-Beer,
que se resume con la ecuacin: A = b c , donde c se expresa en mol/L, b es la longitud del camino
ptico (anchura de la clula que contiene la disolucin de la sustancia) y se expresa en cm, y es la
absortividad molar, propiedad caracterstica de cada sustancia correspondiente a la cantidad de
radiacin que absorbe a una longitud de onda determinada por unidad de concentracin, siendo sus
unidades L mol-1cm-1

Para poder aplicar la ley de Lambert-Beer es necesario seleccionar previamente una longitud de onda
puesto que tanto A como varan con ella. Para ello se obtiene previamente el espectro de
absorcin de la sustancia, que consiste en una representacin de los valores de absorbancia frente
a la longitud de onda expresada en nanometros (nm). Del espectro de absorcin puede seleccionarse
el valor de longitud de onda para el cual la absorbancia es mxima.

Si bien la ley de Lambert-Beer indica que a una representacin grfica de la absorbancia frente a la
concentracin le correspondera una lnea recta, esto slo tiene lugar para disoluciones diluidas, por
ello, no es conveniente utilizar la expresin matemtica directamente, sino construir en cada caso
la recta de calibrado que confirme que la ecuacin de Lambert-Beer se cumple en el intervalo de
concentraciones en el que se trabaja. Esta recta se construye midiendo la absorbancia de una serie
de disoluciones de concentracin perfectamente conocida.
PRCTICA No. 1 (Segunda parte)
Objetivo:

Adquirir los conocimientos bsicos sobre espectrofotometra de absorcin visible, incluyendo la Ley
de Lambert-Beer y sus aplicaciones en Bioqumica. Para ello se realizar un experimento en el

laboratorio que muestre cmo utilizar un espectrofotmetro as como tambin saber preparar un
espectro de absorcin y una curva de calibracin.

Material:

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10 tubos de ensayo con capacidad de 12ml.

1 gradilla

1 Perilla

1 pipeta graduada de 10ml

1 pipeta graduada de 1ml

Reactivos:

Azul de anilina 300mg/L

Anaranjado de metilo 300mg/L

Eosina 300mg/L

Azul de metileno 300mg/L

NOTA: Cada equipo de trabajo utilizar un colorante. Deber trabajarse cada solucin por

separado y en forma simultnea.

a) Encender el aparato y dejarlo calentar de 5 a 10 minutos.
b) Seleccionar la longitud de onda adecuada
c) Calibrar el aparato de 0 % de absorbancia

Procedimiento:

Prepare una dilucin de las siguientes diluciones: 1/10, a partir de las diluciones madres y agua

destilada. Mezclar bien y proceda a leer en el espectrofotmetro como se indica a

continuacin:

La dilucin se somete a lecturas contra el blanco de agua destilada, variando cada vez la longitud de
onda de 20 unidades, iniciando la lectura en 400 nm y finalizando en 700nm (espectro visible). Se
anotan las lecturas correspondientes a cada longitud de onda y se grafican los valores de la longitud
de onda de las abscisa y la absorbancia o el % de transmitancia en la ordenada, en papel milimtrico.
RESULTADOS DE ABSORBANCIAS DE BARRIDO

Absorbancia Eosina Anaranjado de Azul de anilina Azul de

(nm) metilo metileno
400
420
440
460

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 480
500
540
560
580
600
620
640
660
680
700
Actividad:

Graficar la absorbancia en la ordenada y la concentracin de la abscisa, en papel milimtrico.

Para la demostracin de la ley de Lambert-Beer a partir de la solucin madre (en nuestro caso ser
la dilucin1/10), se hace una serie de diluciones como sigue: 1/10, 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, 1/60,
1/70, 1/80, 1/90, 1/100. Preparadas las mezclas se hacen las lecturas de cada una, a la longitud de
onda seleccionada en el paso anterior. Se anotan las lecturas.

RESULTADOS DE ABSORBANCIAS DE LAS DILUCIONES

Absorbancias Eosina Anaranjado de Azul de anilina Azul de metilo

Diluciones (nm) metilo
1/10
1/20
1/30
1/40
1/50
1/60
1/70
1/80
1/90
1/100
Actividad:

Graficar la concentracin en la abscisa contra la absorbancia en la ordenada en papel milimtrico.

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 DIAGRAMA DE FLUJO DE LA PARTE EXPERIMENTAL

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 CUESTIONARIO

1. En que se basa la espectrofotometra.

2. Enuncie el fundamento de la ley de Lambert-Beer.
3. Cules son las caractersticas de la lu
4. Mencione cuatro componentes del espectrofotmetro y explique su funcin.
5. Qu es una curva de calibracin?
6. Mencione los pasos para el manejo del espectrofotmetro.
7. Defina los siguientes trminos: ruido y desplazamiento.
8. Defina transmitancia y absorbancia.
9. Mencione la clasificacin de espectroscopia y sus caractersticas.
10. Cul fue la longitud de onda elegida para medir la absorbancia de su colorante? En que
se basa la espectrofotometra?
11. Enuncie el fundamento de la ley de Lambert-Beer.

BIBLIOGRAFA
TEXTO AUTOR PGINAS EDITORIAL

DATOS DEL ESTUDIANTE

NOMBRE EQUIPO GRUPO CALIFICACIN
Y
CDIGO

Laboratorio de Bioquimica Estructural I

PACHECO MOISES, FERMIN PAUL
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