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1.3.2 Cuajado, 7
1.3.4 Moldeado, 8
1.3.5 Prensado, 8
1.3.6 Salado, 9
1.3.7 Madurado, 9
1.3.8 Acabado, 10
1.10.4.1 Timol, 27
1.12.1 Generalidades, 29
2-OBJETIVOS, 36
3- MATERIALES Y MTODOS, 39
3.4 Metodologa, 46
untable base), 48
matemtico, 51
4- RESULTADOS, 58
4.4.1 S.aureus, 86
4.4.2 E.coli, 96
4.4.3 S.Enteritidis, 105
4.4.4 L.monocytogenes, 113
5-CONCLUSIONES, 132
6-APNDICE, 136
7- BIBLIOGRAFA, 147
RESUMEN
1
1.1 Origen del queso
2
radicalmente el proceso de elaboracin de este producto. Empez a mezclarse leche
de distinta procedencia y distintos rebaos para obtener un producto homogneo y de
ese modo disminuy considerablemente el riesgo de aparicin de organismos que
pudieran contaminar el producto.
El queso tiene una produccin anual superior a otros productos del mundo
muy importantes tales como caf, t, cacao y tabaco. Estados Unidos es el mayor
productor mundial y casi la totalidad de esa produccin est dirigida al mercado
local, siendo casi nula su exportacin. Alemania es el mayor exportador en cuanto a
cantidad y Francia el mayor exportador en cuanto a valor monetario. As mismo,
siguen a Estados Unidos en cuanto a produccin. Dentro de los pases productores
en cuarta posicin encontramos a Italia y en dcimo lugar a la Argentina. Los pases
importadores de quesos por excelencia son: Alemania, Reino Unido e Italia. El
mayor consumo per cpita lo registra Grecia, seguido de Francia y en tercera
posicin, Italia. Luego siguen Suiza, Alemania, Pases Bajos, Austria, Suecia,
etc.(SAGyP, MINAGRI,2010)
3
La Argentina se encuentra dentro de los pases cuyas costumbres dietarias
incluyen el consumo de este producto alimenticio tal como se evidencia en la Figura
1.
4
La produccin nacional de quesos segn el tipo de pasta se puede observar en
la Figura 3. Si se observan los datos estadsticos de elaboracin de quesos de pasta
blanda, se denota un aumento progresivo en los ltimos aos (2004-2008). Luego de
alcanzar el rcord histrico de casi 455.000 toneladas en 1999, la produccin
argentina acus una merma del 27% hasta 2003. En 2004 se produjo un interesante
repunte del 20%, hasta ubicarse en las 398.000 toneladas. Mientras que los quesos
blandos crecieron el 13% en 2004, los quesos semiduros y duros exhibieron ritmos
superiores al promedio general del grupo, con alzas del 28 y 31%, respectivamente.
El crecimiento de la elaboracin de quesos verificado en 2004 fue impulsado
principalmente por la demanda interna alrededor del 80% de la produccin
adicional respecto de 2003 fue absorbido por el consumo domstico- y en menor
medida por las exportaciones, que se llevaron el 20% restante (SAGyP, MINAGRI,
2010).
Son numerosas las recetas queseras tradicionales con las que se cuenta
actualmente y que dan lugar a la gran variedad de quesos artesanales. Pero
independientemente del tipo de leche y del lugar de procedencia, hay un proceso
general (Figura 4) que a continuacin se describe (ICMSF, 1980):
5
Figura 4: Diagrama de flujo de la elaboracin de Queso
Leche
Filtrado
Pasteurizacin
Enfriamiento
Inoculacin con fermentos lcticos
Adicin de CaCl2 y cuajo
Cuajado
Corte de la cuajada
Moldeado
Prensado
Salado
Maduracin, previo oreado, volteado y limpieza de los quesos
Acabado
6
Figura 5: Preparacin de la leche
1.3.2 Cuajado
Una vez la leche en la cuba de cuajado (Figura 6), se aaden los fermentos
lcticos, bacterias que contribuirn a la posterior maduracin del queso. Es en esta
fase donde se le adiciona el cuajo, que dependiendo del tipo de queso podr ser
vegetal, animal o microbiano, formndose la cuajada. Fsicamente, consiste en la
precipitacin de las micelas de casena formando un gel que retiene adems los
glbulos de grasa, agua y sales.
7
elaborar. Luego se trabaja el grano mediante agitacin y elevacin de la temperatura
favoreciendo todava ms la expulsin del suero.
1.3.4. Moldeado
Figura 8: Moldeado
1.3.5. Prensado
8
Figura 9: Prensado
1.3.6. Salado
1.3.7. Madurado
A esta fase pasan los quesos tiernos, semicurados y curados. Son mantenidos
en cmaras donde se controla la temperatura y la humedad. Durante esta fase los
quesos son volteados frecuentemente para evitar que se deformen y la corteza se
forme de forma uniforme. La maduracin comprende una serie de cambios en las
9
propiedades fsicas y qumicas adquiriendo el queso su aspecto, textura y
consistencia as como aromas y sabores caractersticos (Figura 11).
Figura 11: Madurado
1.3.8. Acabado
1.4. Produccin de queso sin conservante (base) efectuada por Danone para el
presente estudio.
10
iniciadores o fermentos lcticos (fermentacin) y cloruro de calcio (por tratarse de
leche pasteurizada) (Johnson,1997).
La funcin principal de este paso es la de producir cido, principalmente
cido lctico, destinado a: a) favorecer la formacin de la cuajada por enzimas
coagulantes, como el cuajo; b) favorecer el drenaje del suero de los granos de
cuajada; c) impedir o inhibir el crecimiento de los microorganismos patgenos y de
los causantes de alteraciones, y d) gobernar las actividades de las enzimas que
inducen los cambios organolpticos deseados. Los cultivos lcticos iniciadores
producen cido lctico a partir de la lactosa propia de la leche rindiendo
componentes del sabor y aroma como diacetilo. Estos cultivos solo son adecuados
para aquellos quesos en los que la temperatura de esta etapa no supera los 40C
durante algunos minutos. El cuajo ,con la colaboracin del cido formado, precipita
la casena (protena principal de la leche) y forma un gel.
La termizacin se realiz a 65C durante 6 minutos a un pH < 4,6
y tiene tres aspectos tecnolgicos:
Aumentar la tasa de recuperacin de protenas solubles, por
insolubilizacin de algunas lacto albminas en medio cido y mejorar el
rendimiento del proceso.
Ajustar la temperatura ptima de separacin de la masa magra del suero.
Disminuir la carga microbiolgica del fermento presente en la cuajada la
cual pasa aproximadamente de 1 x 107 UFC/mL (unidades formadoras de
colonias por mililitro) a valores del orden de 1 x 103 / 1 x 104 UFC/mL.
Esta disminucin es necesaria para reducir la pos-acidificacin del
producto.
Cuando la masa misma (luego de la adicin del resto de los ingredientes como el
cloruro de sodio cuyo objetivo es potenciar el sabor y ayudar a controlar el
crecimiento de microorganismos alterantes) adquiri la firmeza adecuada se
someti al proceso de homogenizacin y envasado. Esta operacin puede ir
acompaada por la aplicacin de una determinada presin (acondicionamiento). El
enfriamiento se realiz a una temperatura de aproximadamente 40C. Finalmente se
almacen en cmara fra (0-5C).
11
Proceso de elaboracin del queso untable base utilizado en el presente trabajo.
Recepcin, descarga
y pasteurizacin de la
leche cruda
Pasteurizacin
Incorporacin de
cloruro de calcio,cuajo y
fermento
Fermentacin
Fermentacin
Termizacin
Inyeccin de crema
Inyeccin de
ingredientes
Homogeneizacin
Envasado
Acondicionamiento
Enfriamiento
Homogeneizacin
Almacenamiento en
cmara fra
12
1.5 Variedades de quesos
Aunque es casi imposible realizar una lista nica de quesos, slo en Francia
hay ms de 400 variedades de quesos, y en Espaa encontramos, por ejemplo, queso
Burgos, Cabrales, Cebreiro, Mat, Quesaillas, Roncal (por slo nombras algunos) y
el queso manchego, tpico de la regin de La Mancha . En Argentina, existen
numerosas variedades de queso (http://www.todoagro.com.ar). Una clasificacin
muy general comprende:
Quesos blandos: son los que tienen abundante materia grasa y humedad. La textura
de ellos es muy cremosa, Eso hace que se los pueda extender con facilidad. Son
elsticos al tacto y tienen un aroma similar al de las nueces. Los quesos que
pertenecen a esta variedad son: el Camembert, el Cuartirolo y el Fontina. En esta
categora entran los semiblandos como el Port Salut y el Mozzarella. Las
caractersticas de estos quesos los hacen ideales para ser usados en pizzas, budines,
terrinas, arroces, polentas y fondues.
Quesos duros y semiduros: son muy grasos pero con muy poca humedad. Son de
sabores suaves fuertes y texturas flexibles desmenuzadas. Algunos quesos de este
tipo tienen agujeros producidos por bacterias lcticas durante la maduracin. En esta
categora estn: el Emmenthal, el Parmesano, el Reggianito, el Sardo, el Provolone y
el Pecorino. En esta categora tambin se incluyen los quesos semiduros, como el
Cheddar, el Fontina y el Pategrs. Los quesos duros son apropiados para rallar,
preparar salsas y gratinar carnes, y los semiduros para fondue.
Quesos azules: son aquellos a los que se les introduce un cultivo fngico (p.e.
Penicillium roquefortii) para generar las caractersticas vetas azules. Son intensos.
No deben oler a amonaco ni tener sabor terroso ni muy salado. En esta variedad se
encuentran : el Azul y el Cabrales.
13
Ricota y el Fundido. Estos quesos son muy aptos para ser incorporados en ensaladas
y para elaborar salsas livianas y fras para acompaar carnes.
Los criterios para la clasificacin de quesos son mltiples, ya que pueden basarse en
cuestiones documentales, jurdicas o tecnolgicas. Sin embargo, los criterios de
clasificacin ms utilizados son los siguientes:
:
14
seguido de un enfriamiento inmediato microfiltrada (leche que ha sufrido una
micro-filtracin. Este proceso consiste inicialmente en separar la nata de la leche,
posteriormente se filtra la leche desnatada a travs de unas membranas muy
delgadas que retienen las bacterias y finalmente a esta leche filtrada se le
incorpora la nata en proporciones adecuadas).
15
1.7 El queso y la salud
Todos los tipos de queso aportan a nuestra dieta un gran valor nutritivo. El ser
humano puede vivir sin sufrir enfermedades causadas por carencias vitamnicas
consumiendo nicamente queso, pan y fruta, puesto que el conjunto de estas tres
llevan las vitaminas, sales minerales y protenas necesarias para vivir. Segn pasa el
tiempo el queso aumenta el aporte de caloras y mejora su calidad bacteriolgica. El
queso tambin contiene la proporcin adecuada de cidos grasos. Es un alimento
fcilmente digerible a su vez. El conjunto de moho, bacterias que confiere puede
actuar de forma favorable en nuestra flora intestinal.
Los alimentos lcteos a los cuales acudimos como fuente de calcio nos
aportan mucho ms a nuestra nutricin y salud. En una dieta, los productos lcteos
contribuyen aproximadamente slo con el 9% de las caloras disponibles. En cambio
proveen el 73% del calcio, el 31% de la riboflavina, el 33% del fsforo, el 19% de
las protenas, el 16% del magnesio, el 21% de la vitamina B12, el 17 % de la
vitamina A, el 10% de la vitamina B6, 6% tiamina, apreciables cantidades de
vitamina D y niacina equivalentes. De hecho los productos lcteos se reconocen
como ricos o fuentes de muchos nutrientes en s mismos sin tener que ser
modificados (Mahaut y col.,2003).
16
recomendaciones previstas por el MERCOSUR, recogiendo los consejos mundiales,
establecen 1000 mg de calcio como Ingesta Diaria Recomendada o Ingesta Adecuada
para mayores de 18 aos. Teniendo en cuenta los hbitos locales, ese requerimiento
es alcanzable slo consumiendo no menos de 4 porciones/da de leche su
equivalente en derivados. Esta cantidad representa la cantidad que al menos el 97%
de la poblacin necesita (Portela, 2007) .
17
Grasas- Aparte de ser fuente de energa (42% de la energa de la leche entera) aporta
a la textura, sabor y al poder de saciedad de este alimento. . Los lcteos son la fuente
natural ms rica en cido linoleico conjugado siendo identificado este producto como
potencial fuente benfica para la salud, teniendo propiedades antioxidantes habiendo
evidencias de tener propiedades anticarcinognicas (colon mama)
antiarteroesclerosis, estimular el sistema inmune.
18
Las BAL ms comnmente usadas desde el punto de vista de la tecnologa
alimentaria pertenecen a los gneros Lactococcus, Lactobacillus, Streptococcus,
Leuconostoc , Enterococcus, Aerococcus, Carnobacterium, Oenococcus,
Pediococcus, Tetragenococcus, Vagococcus y Weisella (Axelsson, L. 2004). Se
utilizan tambin cultivos mixtos como Lactococcus lactis ssp. cremoris y L. lactis
ssp. lactis (ambos mesfilos), Streptococcus salivarius ssp. Thermophilus ,
Lactobacillus delbrueckii ssp. delbrueckii, Lb. delbrueckii ssp. bulgaricus,
Lb.delbrueckii ssp. lactis o Lb. helveticus.
Otro de los roles de las BAL es proveer un ambiente ptimo con respecto al
potencial redox, pH y contenido de humedad del queso (Wood, 1995).
19
pudieran haber contaminado inicialmente, aunque de no haberse respetado las
Buenas Prcticas de Elaboracin podran presentar enterotoxina estafilocccica.
20
La dosis infectiva depende del estado inmunolgico del individuo y ha sido
demostrado que alimentos ricos en grasa tienden a dar un ambiente protector al
microorganismo (Eley, 1996). Salmonella spp. se distingue de otros patgenos por su
frecuente presencia en alimentos, su habilidad para crecer en una gran variedad de
alimentos, su fcil diseminacin y contagio persona a persona y su prolongado
perodo de excrecin (10 semanas).
L.monocytogenes es un bacilo Gram positivo, asporgeno, anaerobio
facultativo y sobrevive a temperaturas de 0 a 45C. Su aw ptima de crecimiento es
de 0,97 con un mnimo de 0,93 y su pH ptimo de crecimiento est en el rango 5,6-
9,6 (Rocourt, 1997). La dosis infecciosa no est bien establecida pero
L.monocytogenes no representa un problema hasta tanto no alcance altos niveles de
contaminacin, en personas sanas. Este microorganismo es ubicuo y puede
contaminar diferentes alimentos y bebidas. Aunque la listeriosis humana es
espordica, se han reportado en algunos casos consecuencias severas a partir del
consumo de productos crudos, inadecuadamente calentados, y recontaminacin de
alimentos tratados (Yuste y col., 2002). Ha sido asociada con varios brotes en los
cuales estaban implicados los quesos y consecuentemente su ocurrencia ha sido
muy bien estudiada. L. monocytogenes es un importante microorganismo asociado a
enfermedades transmitidas por alimentos debido a la severidad de la infeccin
causada y a la mortalidad que produce (30%). La contaminacin de muchos
alimentos con L. monocytogenes es casi inevitable debido a su naturaleza ubicua en
el medio ambiente. Mas an su inusual habilidad por sobre otros patgenos de crecer
a temperaturas de refrigeracin la asocia con productos normalmente almacenados
en estas condiciones (Smith-Palmer y col., 2001). Ha sido detectada en numerosos
alimentos incluyendo pat( Mc Lauchlin ,1991), comida lista para consumo y
particularmente en quesos blandos ( Linnan y col., 1999). La supervivencia de este
patgeno a valores de pH muy bajos (3,0 a 4,5) ha recibido poca atencin,
probablemente debido a que se asume su rpida muerte bajo estas condiciones, pero
resultados obtenidos por Parish y col. (1989) indican que en productos de bajo pH
puede encontrarse Listeria y se puede producir una masiva contaminacin si estos
alimentos son consumidos en un perodo corto de tiempo. Su crecimiento a pH <4,4
est influenciado por la temperatura y el tipo de cido (McLauchlin, 1990).
21
1.10 Tecnologas combinadas de preservacin
22
(reduciendo aw y pH, aadiendo compuestos activos a nivel de membrana). Para
esporas, la idea es daar estructuras claves (por ataque qumico, enzimtico o fsico
sobre el cortex) o provocar la germinacin de las mismas (con falsos disparadores,
por aplicacin de altas presiones, etc.) (Gould y col., 1983; Gould, 1995).
23
Cuando la aw del medio externo se reduce, los microorganismos tienden
rpidamente a alcanzar el equilibrio osmtico con el medio que los rodea,
principalmente a travs de la prdida de agua, producindose plasmlisis de la
clula con prdida de la turgencia de membrana. Inmediatamente se pone en
marcha un mecanismo osmoregulador que les permite recuperar el agua prdida y
mantener la homeostasis con respecto de su contenido de agua. Se produce la
acumulacin intracelular de solutos compatibles por sntesis y/o por transporte
activo desde el medio extracelular hasta balancear la osmolalidad externa (Gould,
1995).
24
El pH es otro factor bsico en la preservacin de alimentos, afectando la
conformacin de las protenas, el camino de sntesis enzimtica y los productos
finales del metabolismo. El crecimiento y la supervivencia de los
microorganismos estn fuertemente influenciados por el pH y el contenido de
cidos orgnicos del alimento. stos determinan, de acuerdo a su valor, floras
contaminantes diferentes y de distinta resistencia a los factores de conservacin.
Las bacterias, en general, requieren un rango de pH externo entre 4 y 9 para poder
crecer, mientras que los hongos y las levaduras exhiben mayor tolerancia,
pudiendo desarrollarse en los rangos de pH externo 1,5-11,0 y de 1,5-8,0,
respectivamente (Alzamora, 1997).
25
membranas y actan como transportadores de protones, ionizndose en el
citoplasma y acidificando el medio interno. El efecto primario es disminuir el
pHi, pero adems, el anin del cido no disociado puede tener efectos inhibitorios
especficos en el metabolismo, incrementando el efecto del pH (ej: cido actico,
frmico, srbico).
26
de los consumidores quienes los perciben como artificiales, ha surgido un creciente
inters en alternativas ms naturales. Particular inters se ha planteado en la potencial
aplicacin de aceites esenciales de plantas. La propiedades antimicrobianas estn
bien establecidas contra un gran espectro de microorganismos incluyendo bacterias
(Smith-Palmer y col., 1998) ,levaduras ( Lachowicz y col.,1998; Mangena y
Muyima, 1999) y hongos (Paster y col., 1990; Mishra y Dubey 1994).
1.10.4.1 Timol
27
El aceite de tomillo es obtenido por destilacin por arrastre de vapor de las
hojas de Thymus vulgaris. Sus componentes mas importantes son los alcoholes
fenlicos los que expresados como timol se encuentran en una concentracin
superior al 35%. Otros componentes observados lo constituyen el p-cimeno y el
terpineno los que junto al timol le imparten su aroma y sabor caracterstico.
El timol es empleado para aromatizar todo tipo de alimentos. Dentro de la
industria farmacutica el timol es un conocido antisptico, su color es amarillo
intenso, olor agradable, densidad 0,91 - 0,94 e ndice de refraccin 1,492 - 1,499.
El mismo es reconocido tambin como conservante natural contra
Staphylococcus aureus y Salmonella Enteritidis (Juven y col. 1994; Lambert y col.,
2001). Algunos de los sinnimos con los que se lo puede encontrar en la bibliografa
son: cido tmico, alcohol timlico, fenol timlico, isopropilmetacresol, etc. Medina
y col. (2004) estudiaron la actividad bactericida in vitro, por el mtodo de difusin
en agar, frente a cultivos puros de cinco bacterias patgenas (Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Salmonella Enteritidis, Enterococcus sp. y
Escherichia coli) y seis cepas de bacterias lcticas que alteran alimentos. Los
resultados encontrados destacan la efectividad del aceite de tomillo frente a cultivos
puros de bacterias patgenas as como frente a bacterias lcticas (Alzamora y
col.,2003).
28
Los quesos presentan problemas de vida til en heladera asociados al hbito
de consumo (alimentos de abre y cierre) que provocan un deterioro prematuro por
desarrollo de microorganismos. Estos productos pasteurizados poseen un pH
relativamente elevado (5,1- 6,2) y una actividad de agua (aw) ptima para el
desarrollo microbiano. Numerosos estudios han establecido que el deterioro de los
mismos depende de factores intrnsecos tales como variedad del queso, aw,
contenido de sal, contenido y tipo de emulsificante, pH y de factores extrnsecos, de
los cuales los ms importantes resultan la temperatura de almacenamiento y la
contaminacin post-pasteurizacin. Datos de bibliografa muestran que Listeria
monocytogenes, Salmonella spp, y Staphylococcus coagulasa positivo representan a
los patgenos de mayor incidencia en quesos (Ahmed y col.,1988; Abdalla y
col,1992; Altekrus y col.,1998; Larson y col.,1999; Jorgensen y col.,2005). Si se
quieren obtener juicios confiables sobre la calidad de este alimento, su vida til y su
seguridad, es necesario disponer de datos cuantitativos sobre los efectos de los
factores que afectan el crecimiento, la supervivencia y/o la inactivacin.
1.12.1 Generalidades
29
apropiados, la microbiologa predictiva permite la seleccin de los factores de
preservacin para alcanzar la vida til deseada de diversos alimentos.
30
microbilogos de alimentos comenzaban a aceptar que los mtodos microbiolgicos
tradicionales para determinar la calidad y seguridad alimenticia, estaban limitados
por el tiempo requerido para obtener los resultados y que los mtodos indirectos
basados en cambios qumicos, fsicos o fisicoqumicos, no proporcionaban una
respuesta hasta que un gran nmero de clulas se encontraba presente. Lo mismo
ocurra con varios mtodos rpidos que necesitaban, o bien un alto nivel de
contaminacin para que la respuesta sea evidente, o dependan del uso de
equipamiento muy sofisticado y oneroso.
Antes del advenimiento de la microbiologa predictiva, la mayor parte de la
bibliografa defina las condiciones ambientales limitantes del crecimiento, cuando
los dems factores ambientales se encontraban en los valores ptimos. Adems, slo
ocasionalmente los efectos de dos o ms factores de conservacin se estudiaban de
tal forma que permitieran cuantificar la interaccin de los mismos. A consecuencia
de ello, muchos de estos datos no eran de utilidad o bien no permitan predecir la
respuesta microbiana.
Si bien el modelado no revela comportamientos microbianos extraos o poco
esperados, los modelos se pueden usar para predecir, por interpolacin, el
crecimiento bajo una combinacin de condiciones que no fueron especficamente
testeadas en el protocolo experimental (Whiting, 1995).
Se han propuesto varios esquemas para categorizar los modelos, uno de ellos
propone dividirlos en modelos de crecimiento y modelos de
inactivacin/supervivencia. Dentro de cada categora se subdividen en modelos
primarios, secundarios y terciarios (Whiting y Buchanan, 1994; Alzamora y col.,
1995; Lpez-Malo, 2000; Alzamora y col.,2010).
Los modelos primarios describen cambios en la respuesta microbiana con el
tiempo en un ambiente especfico. El modelo puede cuantificar unidades formadoras
de colonia por mililitro o por gramo (UFC/mL), formacin de toxinas, niveles de
sustrato o productos metablicos (que son medidas directas del crecimiento);
absorbancia e impedancia (medidas indirectas de la respuesta). Una vez generada la
curva de crecimiento o muerte microbiana, se utiliza una funcin o ecuacin
matemtica para describir el cambio de la respuesta en funcin del tiempo. Ejemplos
de modelos primarios son: la funcin de Gompertz para crecimiento exponencial; el
modelo de Gompertz modificado para describir la inactivacin microbiana; modelos
para describir la declinacin no lineal de esporas sobrevivientes con el tiempo; el
31
modelo logstico aplicado a destruccin trmica; el modelo de Stannard; el modelo
de Schnute; la ecuacin de Fermi; etc. (Mc Meekin y col., 1993). El valor D (tiempo
necesario a una determinada temperatura para reducir en un 90% la poblacin
microbiana ) es tambin ejemplo de un modelo primario (Whiting y Buchanan,1994).
Los modelos secundarios describen las respuestas de los parmetros de los
modelos primarios frente a cambios en uno o ms factores ambientales como
temperatura, pH o aw. Ejemplos de modelos secundarios son el modelo de Arrhenius
y el modelo de la raz cuadrada (Blehrdek), que describen la dependencia con la
temperatura, y el modelo polinmico. El valor z (C necesarios para disminuir el
valor D un ciclo logartmico) utilizado en procesos trmicos es tambin un ejemplo
de modelo secundario (Whiting y Buchanan, 1994). Los mismos no sern objeto de
estudio en el presente trabajo.
Los modelos terciarios son rutinas de software para computadora menos
difundidas que convierten a los modelos primarios y secundarios en programas
amigables. Estos programas pueden calcular las respuestas microbianas frente a
condiciones que no fueron evaluadas inicialmente, comparar el efecto de diferentes
condiciones o contrastar el comportamiento de varios microorganismos, por lo que
permiten elegir a el o los microorganismos blanco de ataque en situaciones
especficas de formulacin-procesamiento de alimentos. Ejemplos de modelos
terciarios son el programa USDA Pathogen Modeling Program realizado por el
Departamento de Agricultura de los Estados Unidos, disponible gratuitamente en
Internet (http://www.arserrc.gov) y el Food Micromodel avalado por el Ministerio
de Agricultura Pesca y Alimentacin del Reino Unido (Wilson y col., 2002).
Es necesario remarcar que llevando a cabo este modelado se puede describir
exitosamente el comportamiento microbiano en la mayora de los alimentos pero hay
ocasiones en las que se encuentran discrepancias entre el modelo y el crecimiento
observado . Estas discrepancias son descriptas como fallas. Un ejemplo sera que
el crecimiento observado es ms lento que el predicho por el modelo (Wilson y col.,
2002).
32
Una de las debilidades mayormente encontradas est dada por la severidad
del medio que representa la matriz alimentaria con respecto a los medios de cultivos
que se utilizan en los ensayos de laboratorio. Otra debilidad observada est
relacionada con cuanto de rpido se adapte el microorganismo a su nuevo medio
ambiente. Si en los experimentos se utilizan los mismos microorganismos a los
utilizados en el programa PMP, medios similares y las mismas condiciones de
crecimiento es de esperar que el alimento en estudio provea condiciones ms
favorables an para el crecimiento bacteriano que el medio utilizado en Laboratorio
(Walls y Scott ,1997).
Recientes estudios han indicado que las condiciones bajo las cuales el inculo
utilizado debe crecer tienen un impacto importante en el crecimiento o inactivacin
bacteriana. Los datos utilizados para generar los modelos estn basados en el
crecimiento de cepas a su vez crecidas en ambientes favorables antes de ser usadas
en el medio de cultivo. Estas clulas pueden tener diferencias en sus tiempos de fase
lag , en sus caractersticas de crecimiento, etc., con respecto a clulas que no fueron
pre-adaptadas.
33
Control de Calidad: Los modelos pueden brindar ayuda en desarrollar
programas HACCP mostrando que condiciones permiten crecer o
sobrevivir y as identificar los puntos crticos de control. Esto es
particularmente importante en alimentos en donde pueden existir
interacciones de diferentes factores que influyen en el crecimiento
microbiano.
34
2. OBJETIVOS
35
2.1 Objetivo general
36
4) Una vez validados los modelos, evaluar la influencia de los factores de
estrs aplicados de uso corriente o potenciales (p.e. uso de antimicrobianos naturales)
a travs del anlisis de los parmetros obtenidos para los distintos modelos.
37
3. MATERIALES Y MTODOS
38
3.1- Matriz utilizada
A los fines prcticos llamaremos queso untable base al queso untable sin
sorbato de potasio y queso untable al que posee sorbato de potasio (1000 ppm) y
que es el que se adquiere para consumo masivo.
39
Crema 15,98%
Gelatina (textura) 0,002%
Citrato de Sodio (estabilizante de protenas) 0,0008%
Cloruro de Sodio 0,0006%
Cloruro de Calcio 0,004%
Fermento(cultivo iniciador) 0,02%
Cuajo 0,0001%
3.1.2 Medicin de pH
40
3.2- Reactivos utilizados
41
Fosfato monopotsico 1,5 gr
42
Agar Levine ( Difco, Detroit, USA), composicin:
Peptona 10,0 gr
Lactosa 10,0 gr
Fosfato dipotsico 2,0 gr
Eosina 0,4 gr
Azul de metileno 0,065 gr
Agar-agar 15,0 gr
43
El enriquecimiento de cada colonia pura fue realizado en los caldos o medios
lquidos correspondientes: S. aureus en caldo cerebro-corazn (BHI), L.
monocytogenes en caldo de enriquecimiento FDA (Food and Drug Administration) y,
S. Enteritidis y E. coli en agua peptonada.
Aislamiento de S.aureus ATCC 25923 utilizados en este estudio, medio agar Baird
Parker.
44
Aislamiento de S.Enteritidis aislada de material clnico utilizada en este estudio,
medio agar Verde brillante-rojo de fenol-lactosa.
45
3.4-Metodologa
Para cada una de las cepas, se aisl una colonia a partir del agar diferencial y
selectivo correspondientes (Figuras 2a, b, c y d). Dicha colonia se inocul en 10 ml
de caldo de enriquecimiento (Materiales y Mtodos, seccin 3.2), el cual se incub
durante 24 hs a 37C.
Para la elaboracin de un inculo madre, se tom 0,5ml del inculo de cada
microorganismo y se diluy en 500 ml de agua peptonada alcanzando en todos los
casos una solucin con un recuento aproximado de entre 105 y 107 UFC/ml .
46
minutos a baja velocidad. Las bolsas, conteniendo los 160 gr de queso inoculado y
0,48 gr de timol, se cerraron manualmente sacando todo el oxgeno remanente y se
almacenaron a las distintas temperaturas correspondientes en cada ensayo (5C-
25C) para su posterior anlisis.
47
La experiencia se llev a cabo tal como se indica en el siguiente cuadro:
48
Volumen de jugo de limn agregado pH final medido
(ml)
0,1 5,0
0,3 4,6
0,5 4,5
0,7 4,4
0,9 4,3
1,1 4,2
1,3 4,1
22C/5,0 0,2,5,7,12,16,19,26,28,30,33 y 38
10C/ 4,3 0,20,40,50,60 y 65.
15C/ 4,3 0,3,7,11,14,17 y 19.
22C/ 4,3 0,2,6 y 20
49
3. 5.4 Estudio de reto microbiano
25C/ 5,0 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6 y 7
50
los fines de poder realizar una comparacin del comportamiento del microorganismo
ensayado. Se realiz el siguiente esquema de muestreo:
3. 6. 1 Modelado primario
donde:
51
Log N: Log. decimal del recuento bacteriano a tiempo t
Tiempo (da)
Log10 (2 ) exp(1)
TG (da ) = eq(2 )
BC
VCE((Log10 UFC / g ) / da ) = eq(3)
BC
exp(1)
LAG(da ) = M
1
eq(4)
B
52
Los valores de los parmetros se pueden determinar por el ajuste de la funcin de
Gompertz a los datos experimentales por un procedimiento de estimacin iterativa
que determine el mejor ajuste de acuerdo al criterio de los cuadrados mnimos.
donde
53
3.6.2 Modelo terciario
54
Figura 16: Ejemplo de curva de crecimiento bacteriano
55
3. 7 Anlisis estadstico
56
4. RESULTADOS
57
4.1 Estudios de microbiologa predictiva en queso untable. Efecto de la
temperatura de almacenamiento
58
Figura 1: Efecto de la temperatura de almacenamiento : 5C (-- ) y 15C ( -- ) en
el desarrollo de S.aureus inoculado en caldo BHI (a) y en queso untable (b); (I)
desvo estndar.
59
Este modelo se ha venido aplicando con xito para caracterizar el
comportamiento de una variada gama de microorganismos y alimentos. Bhaduri y
col. (1991) fueron los primeros en demostrar que la curva descripta por la ecuacin
de Gompertz modificada poda describir el comportamiento no lineal de curvas de
supervivencia en el caso de L.monocytogenes en pasta de salchichas.
Posteriormente, Linton y col. (1995) utilizaron exitosamente esta ecuacin para
describir el comportamiento no lineal de L.monocytogenes y encontraron que esta
ecuacin era efectiva para modelar curvas de supervivencia lineales y curvas de
supervivencia con regin de hombro y cola.
Char (2006) estudi la respuesta de L.innocua en jugo de naranja combinando
tratamientos trmicos a diferentes temperaturas (57 a 61C) y adicionando diferentes
niveles de vainillina (0 a 1100 ppm). La ecuacin de Gompertz modificada explicaba
ms del 98% de las variaciones observadas .En general altas concentraciones de
vainillina combinada con tratamientos trmicos se traducan en curvas cercanas a la
linealidad con pequeos o ausentes hombros (con consecuentes bajos valores del
parmetro A) y altas tasa de muerte caracterizadas a travs del parmetro B. Un
descenso en el parmetro B refleja una disminucin en la resistencia microbiana.
Chhabra y col. (2002) obtuvieron similares respuestas cuando estudiaron la
respuesta de L.monocytogenes en cuanto a resistencia trmica (50, 60 y 65C) en
diferentes condiciones de pH y niveles de grasa en leche. Ellos tambin encontraron
que este modelo era muy verstil describiendo diferentes tipos de curvas de
inactivacin (curvas cercanas a la linealidad, curvas con regin de hombro y curvas
sigmoideas) con altos niveles de correlacin.
Como puede observarse en la Figura 2, en el caso de S.aureus inoculado en
queso untable almacenado a 5C, el modelo ajust correctamente con valores
predichos muy cercanos a los obtenidos experimentalmente. El anlisis de la
varianza (Tabla 1) arroj un coeficiente de determinacin ajustado por grados de
libertad elevado, con lo cual se evidencia que el modelo pudo explicar un 73% de las
variaciones observadas en las repuesta con un valor del estadstico F significativo (
< 0,05%). El anlisis de valores observados vs. valores predichos mostr una
distribucin homognea alrededor
60
Figura 2: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable almacenado a 5C, () valores experimentales; ()
prediccin .
0
-0,4
LogN/N0
-0,8
-1,2
-1,6
-2
-2,4
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da)
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 10,12 3 1348*
RESIDUAL 0,005 2
R2 ajustado 99,70
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
61
Este modelo predijo un hombro inicial (A) de ~ 1 da; una velocidad de
muerte (B ) de 0,35 da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes que
cuadriplica al observado (C= 8,6), hecho que probablemente se deba a la ausencia de
una cola marcada en la curva de muerte (Alzamora y col,2010).
Ferrante y col. (2007) utiliz el modelo de Gompertz modificado para
modelar supervivencia de L.monocytogenes en jugo de naranja fresco (pH 3.5)
ultrasonicado (600 W,2 0 KHz, 95.2 m de amplitud de onda; 45C). Este modelo
represent exitosamente las curvas de supervivencia de L.monocytogenes que
resultaron completamente sigmoideas y semi-sigmoideas dependiendo del
tratamiento. Estos autores tambin describieron la sobreestimacin del parmetro C
para las condiciones ms severas en donde combinaban 1000 y 1500 ppm de
vainillina mas tratamiento con ultrasonido dado que la poblacin microbiana
disminua muy rpidamente describiendo una curva sin cola.
(b)
valores observados
0 (a) 0,06
-0,4
0,04
residuales
-0,8
0,02
-1,2
0
-1,6
-0,02
-2
-0,04
-2,4
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0 -0,06
-2,4 -2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
valores predichos
valores predichos
62
distribucin homognea alrededor de la diagonal mientras que la distribucin de los
residuales no mostr anomalas de conos o herraduras (Figura 5 a y b). Este
modelo predijo para S. aureus inoculado en queso untable base almacenado a 15C
un hombro inicial (A) de 4,55 das; una velocidad de muerte (B) de 0,39 da-1 y un
cambio global (C) de 1,55 ciclos, el cual es muy cercano al valor observado
experimentalmente.
0
-0,3
LogN/N0
-0,6
-0,9
-1,2
-1,5
-1,8
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)
63
Tabla 2 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
almacenado a 15 C.
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 6,49 3 432
RESIDUAL 0,03 6
R2 ajustado 98,59
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
0,16
Valores observados
0 (b)
(a) 0,11
Residuales
-0,3
-0,6 0,06
-0,9 0,01
-1,2 -0,04
-1,5 -0,09
-1,8 -0,14
-1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0 -1,8 -1,5 -1,2 -0,9 -0,6 -0,3 0
valores predichos Valores predichos
64
detalla en Materiales y Mtodos, seccin 3.5.2. Para ello se trabaj con la misma
cepa de S.aureus y una vez inoculado el queso untable base (sin agregado de 1000
ppm de sorbato de potasio) se procedi a incubarlo a 15C.
En este caso se observ un leve decaimiento de la poblacin (1 ciclo
logartmico en ~ 18 das). Este comportamiento fue similar al observado en queso
untable con la presencia de sorbato de potasio a igual temperatura de
almacenamiento (Figura 6).
Estos datos experimentales podran estar indicando la falta de relacin entre
el comportamiento observado de S. aureus en el queso untable y la presencia del
sorbato de potasio ya que en ausencia del mismo el perfil de supervivencia de la
poblacin se mantuvo.
65
las diferentes regiones de la curva de supervivencia: el hombro inicial (A~ 5,9 das),
la mxima velocidad de muerte (B~ 0,5 da-1) y el cambio global en el nmero de
sobrevivientes (C~ 1,4 ciclos), junto a los estadsticos de ajuste del modelo. Se
obtuvo un R2 ajustado por grados de libertad 99%. El valor de F muy significativo
(<0,01), demostr que el modelo fue apropiado para describir el comportamiento
observado. La validacin interna determin concordancia entre los valores
observados y predichos y una adecuada distribucin de residuales (Figura 8 a y b).
0,1
-0,1
Log N/N0
-0,3
-0,5
-0,7
-0,9
-1,1
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (da)
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 1,95 3 325**
RESIDUAL 0,006 3
R2 ajustado 99,08
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
66
Figura 8 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus
en queso untable base almacenado a 15 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; ()
prediccin.
(b)
(a) (X 0,001)
55
Valores observados
0,1
-0,1 35
Residuales
-0,3
15
-0,5
-5
-0,7
-25
-0,9
-1,1 -45
-1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1 -1,1 -0,9 -0,7 -0,5 -0,3 -0,1 0,1
67
4.3 Efecto combinado del pH y la temperatura de almacenamiento
68
Figura 9 : Comportamiento de S. aureus en el queso untable base almacenado a
10C (-- ), 15C ( -- ) y 22C ( --). (a) pH 5,0; (b) pH 4,3; (I): desvo estndar.
69
establece crecimiento de S. aureus (en un caldo de cultivo) con una fase de latencia
de 10 das, aumento exponencial de la poblacin hasta el da 35 y fase estacionaria a
partir de all (Figura 10a).
En queso untable base almacenado a 15C, la respuesta de S.aureus fue
nuevamente de muerte a lo largo del tiempo de almacenamiento pero con una
reduccin de 1 ciclo logartmico en 22 das contradicindose nuevamente con lo
predicho por el programa PMP (Figura 10 b).
La Figura 10c muestra la curva de crecimiento de S. aureus en queso untable
base (pH 5,0) a 22C junto a los datos predichos mediante la aplicacin del
programa predictivo PMP. En la misma se observa que el comportamiento de S.
aureus a 22C, predicho por el programa PMP determina que la fase de crecimiento
exponencial comienza inmediatamente (sin perodo de fase lag) y termina en el da 5,
mientras que experimentalmente se observ que el crecimiento exponencial
comienza a partir del da 12 (tiempo de fase lag) y termina aproximadamente el da
28. Es decir que, si bien hay coincidencia en los valores observados y predichos para
este microorganismo en las condiciones estudiadas, se produce un corrimiento en el
tiempo ya que el comportamiento en la matriz alimentaria presenta un perodo de
adaptacin inicial que retrasa el crecimiento exponencial.
Si bien este software predictivo es de muchsima utilidad en sistemas simples
(como los sistemas modelo y medios de cultivo), en alimentos reales podra fallar
dado que los factores intrnsecos propios del alimento as como tambin las
interacciones que pudieran derivar entre ellos y los microorganismos (se trate de
sinergismos o antagonismos) alteran la respuesta observada y la alejan de la
prediccin. En todo modelo predicho el comportamiento bacteriano est descripto
para un medio de cultivo con los nutrientes ptimos para permitir, si fuera factible, el
crecimiento bacteriano. Esta es posiblemente la causa por la que no se observ
concordancia con la prediccin (Whiting, 1997).
70
Figura 10 : Comportamiento de S.aureus en el queso untable base a pH 5,0 y
diferentes temperaturas de almacenamiento. (a): 10 C, (b): 15C y (c): 22C . ( )
prediccin , ( --- ) limite de confianza superior predicho, ( --- ) limite de confianza
inferior predicho, (-- ) datos experimentales; (I) desvo estndar.
71
Los modelos matemticos usualmente se realizan con una mezcla de 3 a 5
cepas tpicas (Whiting, 1997). De esta forma estos modelos predichos se traducen
muchas veces en rpido crecimiento o por decirlo de otra forma en cepas de fcil
desarrollo. Este mecanismo tiene la ventaja de que el modelo se convierta en un
sistema seguro. Pero existe una diversidad natural en los tiempos de crecimiento o
supervivencia de cepas de microorganismos patgenos. La otra fuente de variacin
no includa en los modelos existentes es el estado fisiolgico de la cepa y su historia
previa. Hudson (1993) ha demostrado que la duracin de la fase lag de Aeromonas
hydrofila depende de la temperatura a la cual la cepa estaba sometida o mantenida en
su estado previo y de la nueva temperatura en la cual la cepa se encuentra en el
alimento que ha contaminado. En cambio la fase de crecimiento exponencial
posterior a la finalizacin de la fase lag no es afectada por la temperatura previa. Un
patgeno en un determinado alimento adaptado a temperatura de refrigeracin en una
planta de procesamiento a 10C presentar una fase lag ms corta y un comienzo ms
temprano del crecimiento exponencial ,si accidentalmente contamina ese mismo
alimento refrigerado, que la que debera observarse en un modelo corriente. Baranyi
y Roberts (1994) consideraron que la fase lag es una consecuencia de dos procesos,
el primero reflejado por el estado previo en el que se encontraba la bacteria (por
ejemplo temperatura) y el segundo dependiente del grado de ajuste de un ambiente
(fisiolgica y bioqumicamente) al siguiente ambiente o medio intrnseco.
En el caso en donde se trabaj con queso untable base (pH 5,0) inoculado y
almacenado a una temperatura de almacenamiento de 10C se observ que el modelo
ajust adecuadamente a los datos experimentales (Figura 11) con un coeficiente de
determinacin R2 de 99%. La Tabla 4 muestra los parmetros A, B y C que
caracterizan a la curva as como tambin la significacin del modelo (F = 927 muy
significativo, <0,01). La validacin interna (Figura 12a y b) del modelo propuesto
mostr concordancia entre los datos experimentales y predichos as como tambin
72
una distribucin homognea de los residuales. Como puede analizarse el modelo
predijo la ausencia de hombro inicial (A= - 0,16 das); una velocidad de muerte de
0,05 da-1 y un cambio global (C) de 9,4 ciclos. Al parecer este modelo fall en la
prediccin de la cada total observada y esto pudiera deberse a la ausencia de una
cola marcada en los datos experimentales, hecho que ya ha sido comentado.
0,6
-0,4
Log N/N0
-1,4
-2,4
-3,4
-4,4
0 10 20 30 40
Tiempo (da)
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
73
Figura 12 : Validacin interna del modelo propuesto para la inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 10 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
() prediccin.
(b)
(a)
Valores observados
0,6 0,32
-0,4 0,22
Residuales
0,12
-1,4
0,02
-2,4
-0,08
-3,4 -0,18
-4,4 -0,28
-4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6 -4,4 -3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
74
Figura 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22C, () valores
experimentales; () prediccin
9,1
Log N 8,1
7,1
6,1
5,1
4,1
0 10 20 30 40
Tiempo (dia)
75
Figura 14 : Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 22 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; () prediccin
0,6
9,1 0,4 (b)
Valores observados
(a)
Residuales
8,1 0,2
7,1 0
6,1 -0,2
5,1 -0,4
4,1
-0,6
4,5 5,5 6,5 7,5 8,5 9,5 4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 9,1
Valores predichos Valores predichos
PARAMETROS BIOLGICOS2
Gompertz PMP
TG (da) 1,17 0,10
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
76
El anlisis de la Tabla 5 determina que comparando los parmetros
biolgicos caractersticos de la curva de crecimiento de S. aureus en queso base (pH
5,0; 22 C) adecuadamente estimados por el modelo de Gompertz con la estimacin
del programa PMP puede verse que, este programa predice escaso tiempo de latencia
(0,7 das vs. 18 das); triplica la velocidad de crecimiento exponencial respecto de la
observada (1,4 Log UFC/g/da vs 0,3 Log UFC/g/da) y disminuye notoriamente el
tiempo de generacin respecto del observado (0,1 da vs 1,2 das). Si bien la
temperatura favorece el crecimiento del microorganismo el alimento real no ofrece
en este caso condiciones tan favorables como el medio de cultivo probablemente
debido a la presencia de flora competitiva y/o posibles inhibidores.
77
Figura 15: Comportamiento de S.aureus a pH 4,3 y 10 C(a), 15C (b) y 22C (c):
() prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite de
confianza inferior predicho ,(-- ) datos experimentales.
78
Si bien en las experiencias de reto microbiano realizadas en queso untable
base con pH reducido (pH 4,3) se dispuso de escasos puntos experimentales se
realiz un modelado primario solo con el fin de orientar sobre los parmetros
caractersticos de las curvas obtenidas a 10, 15 y 22 C y comparar con la prediccin
del programa PMP.
A 10C se observ que el modelo de Gompertz modificado para
supervivencia ajust adecuadamente los datos experimentales (Figura 16). El
anlisis de la varianza (Tabla 6) estim un valor de coeficiente de determinacin R2
de 99,99% con un valor de F muy significativo (F = 8,4x108; <0,001). El modelo
fue validado internamente observando una distribucin homognea en torno a la
lnea diagonal de valores experimentales vs. valores predichos y desestimando
anomalas en la distribucin de residuales (Figura 17 a y b). En estas condiciones, el
modelo estim un hombro inicial de 3 das (A); una velocidad de muerte (B) de 0,17
da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes al final del almacenamiento
de 3,6 ciclos logartmicos (C), siendo este valor algo inferior a la cada predicha por
el PMP (~ 4 ciclos logartmicos, Figura 15a).
0,5
-0,5
Log N/N0
-1,5
-2,5
-3,5
0 10 20 30 40
Tiempo (da)
79
Tabla 6: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
Figura 17: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 10 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
valores experimentales; () prediccin
(X 0,00001)
8
(b)
(a)
Valores observados
0,5
Residuales
-0,5 4
-1,5 0
-2,5 -4
-3,5 -8
-3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5 -3,5 -2,5 -1,5 -0,5 0,5
Valores predichos Valores predichos
80
Figura 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base (pH 4.3) almacenado a 15C, () valores
experimentales; () prediccin .
0
-0,5
Log N/N0
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 3 6 9 12 15
Tiempo (da)
Este modelo predijo un hombro inicial (A) cercano a los 2 das mientras que
en la prctica ste resulto de aproximadamente 3 das. El parmetro C en ambos
casos rond los 3 ciclos logartmicos en 15 das de almacenamiento y no se observ
cola ya que la prediccin es que la cada en ciclos logartmicos contina conforme
transcurre el tiempo.
81
Tabla 7: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
MODELO 14,76 3 49**
RESIDUAL 0,20 2
R2 ajustado 94,12
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 19: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 15 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales;
() prediccin.
(b)
Valores observados
0 0,34
(a)
-0,5 0,24
Residuales
-1 0,14
-1,5 0,04
-2 -0,06
-2,5 -0,16
-3 -0,26
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
82
realizada no mostr anomalas (Figuras 21 y 22). El modelo no predijo, tal como se
observ experimentalmente, un hombro inicial (A); predijo una velocidad de muerte
de 0,3 da-1 y un cambio global en el nmero de sobrevivientes (C) en 18 das de
almacenamiento muy superior al observado experimentalmente (9 vs 4). Ya se ha
comentado la debilidad de este modelo para predecir un salto en el nmero de
sobrevivientes cuando la curva de supervivencia carece de cola marcada. Otros
autores han observado igual desenvolvimiento del modelo en otros sistemas
alimenticios estudiados.
0
Log (N/N0)
-1
-2
-3
-4
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)
83
Tabla 8: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a los datos experimentales y
sus respectivos parmetros caractersticos, correspondientes al comportamiento de
S.aureus en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
Figura 21: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C: Valores observados vs valores
predichos;
Valores observados
-1
-2
-3
-4
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos
84
Figura 22: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 4,3) almacenado a 22 C:Residuales vs. valores predichos
. () valores experimentales; () prediccin
(X 0,001)
23
Residuales
13
-7
-17
-4 -3 -2 -1 0
Valores predichos
85
4.4 Estudio de reto microbiano en queso untable base utilizando cepas
responsables de ETA.
4.4.1 S.aureus
Una vez evaluado el comportamiento de S.aureus en queso untable base
frente a las diferentes variables estudiadas (temperatura, presencia de conservante y
pH) se procedi a estudiar de manera anloga el comportamiento de cuatro
bacterias distribuidas en el medio ambiente, fuertemente relacionadas con
enfermedades transmitidas por alimentos y frecuentemente encontradas en productos
lcteos: S.aureus, E.coli, S. Enteritidis y L.monocytogenes (Araujo y col., 2002). La
experiencia se llev a cabo tal como se describe en Materiales y Mtodos, seccin
3.5.4, en primer lugar, inoculando S.aureus en queso untable base y almacenando
dicho producto a 6, 17 y 25C para su posterior anlisis.
Se observ un decrecimiento no lineal de la poblacin de S. aureus a 6C y
17C (Figura 23). A 25C, el comportamiento del mismo fue de neto crecimiento
describiendo una curva algo sigmoidea. Todos estos datos resultaron coincidentes
con los ensayos anteriormente descriptos a temperaturas similares (10C; 15C y
22C) (Figura 9a ).
La Figura 24a muestra la prediccin por modelado terciario (programa PMP)
del comportamiento de este microorganismo en un medio de cultivo pH 5,0
almacenado a 6C, junto a los datos experimentales. El programa predice, en
coincidencia con lo observado, un decrecimiento de la poblacin. La muerte de este
microorganismo en el queso untable base fue ms rpida que la prediccin promedio
en un medio de cultivo a un dado tiempo de almacenamiento, ms cercana al lmite
inferior predicho.
De la misma manera la Figura 24b muestra que en queso untable base
almacenado a 17C y pH 5.0, mientras experimentalmente se observ muerte de este
microorganismo, el programa de modelado de patgenos, PMP predice el
crecimiento del mismo. Las bacterias cido-lcticas presentes en quesos son
generalmente inhibitorias del crecimiento de S.aureus (Jorgensen y col., 2005). El
pH y la presencia de flora lctica competitiva son factores importantes que
probablemente afecten la presencia del patgeno ensayado (Ercolini y col., 2005).
86
Figura 23: Evaluacin del comportamiento de S.aureus en queso untable base, pH
5,0 a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ), 17C ( -- ) y 25C ( -
-); (I) desvo estndar.
87
Figura 24: Comportamiento predicho de S.aureus a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b) y
25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite
de confianza inferior predicho, (--) datos experimentales.
88
Dado que las curvas cinticas obtenidas exhibieron un comportamiento no
lineal, se realiz una evaluacin cuantitativa de las mismas mediante la aplicacin
de modelado primario (Materiales y Mtodos 3.6.1). Se aplic los modelos de
Gompertz en el caso en donde se observ crecimiento (25C) y de Gompertz
modificado en los casos de muerte (6 C y 17C).
0,6
Log(N/N0)
-0,4
-1,4
-2,4
-3,4
0 10 20 30 40
Tiempo (da)
89
Tabla 9: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 93,00
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad. 2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da) ; B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
(b)
(a) 0,51
Valores observados
0,6
0,31
Residuales
-0,4
0,11
-1,4
-0,09
-2,4
-0,29
-3,4 -0,49
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
-3,4 -2,4 -1,4 -0,4 0,6
Valores predichos Valores predichos
90
Figura 27: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base almacenado a 17C, () valores experimentales; ()
prediccin.
0,1
-0,3
Log(N/N0)
-0,7
-1,1
-1,5
-1,9
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)
Tabla 10: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base almacenado a 17 C.
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,65 3 261**
RESIDUAL 0,07 4
R2 ajustado 96,00%
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
91
Figura 28 : Validacin del modelo propuesto para la inactivacin de S.aureus en
queso untable base almacenado a 17 C: a) Valores observados vs valores predichos;
b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; () prediccin.
0,1
0,18
Residuales
-0,3
-0,7 0,08
-1,1 -0,02
-1,5 -0,12
-1,9 -0,22
-1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1 -1,9 -1,5 -1,1 -0,7 -0,3 0,1
Valores predichos Valores predichos
92
encontrndose que la aplicacin de este modelo represent adecuadamente su
comportamiento.
Tal como se describi en Materiales y Mtodos, seccin 3.6.1.1 con los
valores matemticos de los parmetros correspondientes a la curva se obtuvieron los
parmetros biolgicos. Se determinaron por el ajuste de datos a la funcin de
Gompertz por un procedimiento de estimacin iterativa que determin el mejor
ajuste (Tabla 11). Al observarse una correcta representacin del modelo se
asimilaron dichos parmetros biolgicos como los caractersticos de la curva
experimental. El elevado valor de R2 ajustado, indica que el modelo ajust
adecuadamente a los datos experimentales, pudiendo explicar el 98,5 % de las
variaciones en la respuesta observada. Asimismo, el estadstico F result muy
significativo (0,01) lo que confirma que las variaciones de la informacin
explicada por el modelo es significativamente mayor que la variacin debida a
causas no identificables y que el efecto observado no se debi al azar. En el grfico
de valores observados vs valores predichos (Figura 30a) se observa que hubo una
adecuada correlacin .Los distribucin de residuales (Figura 30 b) tambin fue
homognea entorno a los valores predichos.
Se realiz finalmente el estudio comparativo de los datos biolgicos tiempo
de generacin (TG), fase de latencia (LAG) y crecimiento exponencial (VCE),
calculados a partir de los parmetros extrados de la ecuacin de Gompertz con los
valores predichos por el programa de modelado terciario, PMP.
En el caso de S.aureus inoculado en queso crema base almacenado a 25C, se
observa que el tiempo de generacin, predicho por PMP fue 0,07 das mientras que
el predicho por el modelo primario fue 0,54 das. Ambos modelos, en concordancia,
predijeron TG inferiores a 1 da aunque, como es de esperar algo menor en el caso de
la prediccin medio de cultivo donde no se considera la presencia de flora
competitiva y/o inhibidores (Tabla 11). Ambos modelos coincidieron en la
prediccin de la velocidad de crecimiento. La fase de latencia predicha por el modelo
primario fue superior (5das) a la estimacin del programa PMP (0,42 das). La fase
de latencia representa el tiempo de ajuste que necesita el inculo desde la fase de pre-
incubacin en su medio de cultivo
93
Figura 29: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C, () valores
experimentales; () prediccin
Log N
7
5
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)
Tabla 11: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 C
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
94
Figura 30: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs
valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. () valores experimentales;
() prediccin
0,11
Residuales
8
7 0,01
6 -0,09
5 -0,19
5,1 5,6 6,1 6,6 7,1 7,6 8,1 5 6 7 8 9
Valores predichos Valores predichos
95
4.4.2 E. coli
96
aproximadamente), una fase de crecimiento exponencial que va desde el da 3 al da
8 (con una pendiente velocidad de crecimiento menos pronunciada que la predicha)
,para finalmente, a partir del da 8, llegar al perodo de crecimiento estacionario,
perfil que es coincidente con lo comentado en los prrafos anteriores (Figura 32c ).
Figura 31: Evaluacin del comportamiento de E.coli en queso untable base, pH 5,0
a diferentes temperaturas de almacenamiento: 6C (-- ),17C ( -- ) y 25C (-- );
(I):desvo estndar.
97
Figura 32: Comportamiento predicho de E.coli a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b) y 25C
(c): ( ) prediccin , ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- ) lmite de
confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales
98
Figura 33: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
E.coli en queso untable base almacenado a 6C, () valores experimentales; ()
prediccin
0,07
-0,03
Log(N/N0)
-0,13
-0,23
-0,33
-0,43
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)
Tabla 12: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 6 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 99,98
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
99
Figura 34: Validacin interna del modelo propuesto para la supervivencia de E.coli
en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; ()
prediccin.
0,07
-0,03
Residuales
28
-0,13
8
-0,23
-12
-0,33
-0,43 -32
-0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07 -0,43 -0,33 -0,23 -0,13 -0,03 0,07
Valores predichos Valores predichos
-0,4
-0,9
-1,4
-1,9
-2,4
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (da)
100
Tabla 13: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 17 C.
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 8,02 3 133**
RESIDUAL 0,04 2
R2 ajustado 98,12
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%. A: hombro de la curva de muerte (da); B: mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
(a) (b)
Valores observados
0,6 0,2
0,1
Residuales
0,1
-0,4
-0,9 0
-1,4
-0,1
-1,9
-2,4 -0,2
-2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6 -2,4 -1,9 -1,4 -0,9 -0,4 0,1 0,6
Valores predichos Valores predichos
101
Esto sugiere la presencia de otros factores influyentes en el comportamiento
adaptacin de las clulas bacterianas al alimento.
Roberts y col. (2002) describieron que no hubo diferencias significativas en
el recuento bacteriano de E. coli O157:H7 entre el sistema control (0% sorbato de
potasio) y sistemas con concentraciones crecientes de sorbato de potasio (0.1, 0.15,
0,20 y 0.30 %) en queso cheddar y mozzarella, durante 70 das de almacenamiento a
10C. Esto podra ser una evidencia de que la muerte observada de E.coli en queso
con humedad media y alta no estara relacionada al poder inhibitorio de un
conservante qumico.
8,4
7,4
Log N
6,4
5,4
4,4
3,4
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)
102
Tabla 14: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de E.coli en queso untable base
(pH 5.0) almacenado a 25 C
PARAMETROS BIOLGICOS2
Gompertz PMP
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *: significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.
103
Figura 38: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de E.coli en
queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; ()
prediccin.
8,4
Valores observados
0,55 (b)
(a)
7,4
0,35
Residuales
6,4
0,15
5,4
-0,05
4,4
-0,25
3,4
-0,45
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
3,4 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos
104
4.4.3. S. Enteritidis
105
Figura 40 : Comportamiento predicho de S.Enteritidis a pH 5,0 y 6 C (a), 17C (b)
, 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior predicho, ( --- )
lmite de confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales.
c*
*en este caso no se superpuso la respuesta observada ya que se registr crecimiento (ver figura 39)
106
Datos bibliogrficos indican que Salmonella spp. en medios ligeramente cidos
(pH 5.5) (prechoque) seguida de la exposicin de las clulas adaptadas al valor
de pH menor (choque cido) desencadenan una compleja respuesta de
cidotolerancia que potencia la supervivencia del microorganismo en medios
cidos (pH< 5,4). La respuesta se traduce en una sntesis de de 43 protenas de
choque cido en la fase logartmica de crecimiento y de 15 protenas de choque
cido en la fase estacionaria. Probablemente estos sistemas actan en los medios
cidos que predominan en los alimentos fermentados y acidificados. El estrs
cido tambin puede desencadenar resistencia bacteriana aumentada frente a
otras condiciones ambientales adversas (Daoust, 1997).
Las curvas de supervivencia obtenidas a 6 y 17C se caracterizaron utilizando
el modelo de Gompertz modificado. Las Figura 41 y 43 muestra un adecuado ajuste
del modelo a los datos experimentales. El anlisis de la varianza (Tablas 15 y 16)
arroj valores de R2 entre 99,2% y 97,3% con F muy significativo ( < 0,01). La
validacin interna realizada (Figuras 42 y 44) mostr que en los grficos de valores
observados vs predichos as como en el grfico de residuales vs. valores observados
los datos experimentales y los predichos presentaron distribucin homognea.
-0,4
Log(N/N0)
-0,8
-1,2
-1,6
-2
0 10 20 30 40
Tiempo (da)
107
Tabla 15: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 6 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 15,23 3 1016**
RESIDUAL 0,02 4
2
R ajustado 99,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
Figura 42: Validacin interna del modelo propuesto para S.Enteritidis en queso
untable base (pH 5,0) almacenado a 6 C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; ()
prediccin
(b)
(a)
Valores observados
0,3 0,1
-0,1
0,06
Residuales
-0,5
0,02
-0,9
-1,3 -0,02
-1,7 -0,06
-2,1
-0,1
-2,1 -1,7 -1,3 -0,9 -0,5 -0,1 0,3
-2 -1,6 -1,2 -0,8 -0,4 0
Valores predichos
Valores predichos
108
Figura 43: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17C, () valores
experimentales; () prediccin
0,9
Log(N/N0)
-0,1
-1,1
-2,1
-3,1
0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da)
Tabla 16: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 17 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
MODELO 29,90 3 249**
RESIDUAL 0,15 4
R2 ajustado 97,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
109
Figura 44: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 17 C: a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; () prediccin
(a) (b)
0,33
Valores observados
0,9
0,23
Residuales
-0,1 0,13
-1,1 0,03
-0,07
-2,1
-0,17
-3,1 -0,27
-3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9 -3,1 -2,1 -1,1 -0,1 0,9
Valores predichos Valores predichos
110
Figura 45: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25C, () valores
experimentales; () prediccin
8,7
7,7
Log N
6,7
5,7
4,7
3,7
0 2 4 6 8 10
Tiempo (dia)
111
Tabla 17 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) almacenado a 25 C
PARAMETROS BIOLGICOS2
Gompertz PMP
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2 TG: tiempo de generacin; VCE: velocidad de
crecimiento exponencial; LAG: tiempo de fase lag.3NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**:
muy significativo al 1%.
Figura 46: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de S.Enteritidis en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 25 C: a)
Valores observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . ()
valores experimentales; () prediccin
8,7 0,06
Valores observados
0,02
6,7
0
5,7
-0,02
4,7
-0,04
3,7 -0,06
4,1 5,1 6,1 7,1 8,1 4,4 5,4 6,4 7,4 8,4
Valores predichos Valores predichos
112
4.4.4. L.monocytogenes
113
Figura 48: Comportamiento predicho de L.monocytogenes a pH 5,0 y 6 C
(a), 17C (b) y 25C (c) : ( ) prediccin, ( --- ) lmite de confianza superior
predicho, ( --- ) lmite de confianza inferior predicho, (-- ) datos experimentales.
114
Una de las bacterias lcticas utilizadas en la elaboracin del queso es
Lactococcus lactis subsp.lactis, productor de nisina. La nisina, fue la primer
bacteriocina aislada a partir de la bacteria cido lctica Lactococcus lactis subsp
lactis. Es la bacteriocina mejor caracterizada y es utilizada como conservador de
alimentos .Es la nica reconocida por la FDA con categora GRAS (Generally
Recognized as Safe). Se produce de forma natural en algunos productos lcteos y se
utiliza en la produccin de alimentos como un aditivo en dichos productos para
prevenir la descomposicin ocasionada por bacterias Gram positivas, especialmente
de los gneros Clostridium, Staphylococcus, Bacillus y Listeria ( Delves-Broughton,
1990 ; Gonzalez y col.,2003). Esta podra ser la razn de la diferencia observada
entre los datos experimentales y los predichos por el programa de modelado de
patgenos PMP.
Con el propsito de caracterizar las curvas de muerte obtenidas se aplic el
modelo de Gompertz modificado a las tres temperaturas estudiadas. Las Tablas 18;
19 y 20 exhiben los parmetros estimados que representan las diferentes regiones de
la curva de supervivencia junto a los estadsticos de ajuste del modelo. El ajuste del
modelo result altamente satisfactorio a las 3 temperaturas de almacenamiento,
obtenindose valores de R2 ajustado por grados de libertad entre 94 y 98%.El mismo
describi a las 3 temperaturas curvas sigmoideas donde la temperatura pareci no
tener influencia en el cambio global de numer de sobrevivientes. Los valores de F
muy significativos (<0,01), demostraron que el modelo fue apropiado para describir
el comportamiento observado tal como se observa en la Figura 49. La validacin del
modelo fue correcta tal como puede observarse en los grficos de valores observados
y predichos (Figuras 50).
115
Figura 49 : Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0) almacenado a 6C (a),17C (b) y
25C (c) () valores experimentales; () prediccin
0,7 0,8
LogNN0
LogNN0
-1,3 -1,2
-2,3 -2,2
-3,3 -3,2
0 10 20 30 40 50 0 4 8 12 16 20 24
Tiempo (da) Tiempo (da)
0,7
-0,3 (c)
LogNN0
-1,3
-2,3
-3,3
0 10 20 30 40
Tiempo (da)
116
Tabla 18: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 6 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
Fuente SS gl FISHER2
MODELO 51,77 3 215**
RESIDUAL 0,41 5
R2 ajustado 94,26
Tabla 19: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 17 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 98,14
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -)
117
Tabla 20: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de L.monocytogenes en queso
untable base (pH 5.0) almacenado a 25 C
ANLISIS DE LA DESVIACIN1
FISHER2
Fuente SS gl
R2 ajustado 94,23
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
118
Figura 50: Validacin interna: Anlisis estadstico del modelo propuesto para el
crecimiento de L.monocytogenes en queso untable base (pH 5,0). a) Valores
observados vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores
experimentales; () prediccin
- 6C
(a) (b)
Valores observados
0,7
3
-0,3 2
Residuales
1
-1,3
0
-2,3 -1
-2
-3,3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7 -3
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos
- 17C
Valores observados
0,8
0,4
-0,2
Residuales
0,2
-1,2
0
-2,2
-0,2
-3,2
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -0,4
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos
Valores predichos
- 25C
Valores observados
0,7 6
4
Residuales
-0,3
2
-1,3 0
-2
-2,3
-4
-3,3
-6
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
-3,3 -2,3 -1,3 -0,3 0,7
Valores predichos Valores predichos
119
Roberts (2002) encontr que este microorganismo no se desarrollaba cuando
se lo inoculaba en queso mozzarella (pH 5,3) y cheddar (pH 5,0) almacenado a 10C
y sin la presencia de sorbato de potasio siguiendo, en concordancia con este trabajo,
una cintica no lineal. Por otro lado, Urlich y col. (2006) estudiaron el
comportamiento de L.monocytogenes en queso Blanco (queso blanco, semi-blando
elaborado con leche pasteurizada ,sal, enzimas y cultivos lcticos, sin aditivos) y
observaron que a las diferentes temperaturas de almacenamiento (5C, 10C, 15C,
20C y 25C) el microorganismo describa una marcada curva de crecimiento de
forma tpicamente sigmoidea.
La leche y los quesos fueron los alimentos investigados primero y se
encuentran entre los alimentos estudiados ms extensamente. Pueden estar
contaminada una gran variedad de quesos, pero son de inters mximo los quesos
blandos con una frecuencia de contaminacin con L.monocytogenes del 2 al 10%.
Rocourt (1997) vi que existe una correlacin significativa del crecimiento
de L.monocytogenes con los valores de pH (>5.5) y con la ausencia de cultivos
iniciadores durante la fabricacin del queso. El yogur (los cultivos lcticos termfilos
inhiben el crecimiento de Listeria) rara vez est contaminado
120
4.5 Uso de antimicrobianos naturales: timol
121
Figura 51: Comportamiento de S.aureus en queso untable base con (--) y sin
agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0, almacenado a tres temperaturas: (a)
6C, (b) 17C, (c) 25C ; (I):desvo estndar.
122
Figura 52: Comportamiento de S.Enteritidis en queso untable base con (--) y sin
agregado de (--) timol (0,3% p/p), pH 5,0 almacenado a 17C; (I): desvo estandar.
Juven y col. (1994) sugirieron que los alimentos con cierto tenor de grasa
(Materiales y Mtodos, seccin 3.1.1) podran formar una barrera protectora
alrededor de las bacterias protegindolas de los agentes antimicrobianos. Estos
estudios sugirieron tambin que la fraccin lipdica del alimento absorbe el agente
antimicrobiano, reduce su concentracin en la fase acuosa y por ende su accin
bactericida. El contenido proteico del alimento podra tambin ser un factor
influyente en la inefectividad del timol ya que la albmina de suero bovino
neutralizaba la accin antimicrobiana del timol sugiriendo formacin de complejos
entre los componentes fenlicos del timol y las protenas del alimento. Estas
reacciones podran haber prevenido toda otra formacin de complejos similares entre
compuestos fenlicos y protenas u otros componentes de la membrana celular
bacteriana que es considerada el sitio de accin blanco de los aceites esenciales
(Peter, 2004).
Es necesario evaluar tambin el comportamiento de la flora lctica frente al
timol. Nuevos estudios seran necesarios para evaluar si el timol tiene algn tipo de
efecto sobre su crecimiento lo que provocara que el accionar metablico de las BAL
se vea alterado as como tambin su capacidad competitiva. Esto, de comprobarse,
podra explicar la causa por la cual la muerte bacteriana observada tanto en S. aureus
123
como en S. Enteritidis a las temperaturas ensayadas es menor con timol que sin la
presencia del mismo. Es decir, el timol en cierta forma altera la capacidad
biopreservativa y competitiva de las BAL permitiendo mayor desarrollo de otra flora
acompaante.
124
timol, la presencia de timol aumentara levemente su resistencia a esta temperatura o
bien, actuara indirectamente, inhibiendo la flora competitiva.
A 17C, se observ que las curvas de supervivencia de S. aureus en queso
untable base con timol presentaron un perfil de curva quebrada similar al observado
para la curva de supervivencia en igual sistema sin agregado de timol, aunque la
inactivacin fue mucho menor. Ello queda evidenciado en los parmetros
caractersticos de ambas curvas. En el caso de la presencia de timol (Tabla 22), la
curva no present hombro inicial (A ~ - 4 das) al igual que en ausencia de timol
(Tabla 10). La velocidad de muerte y el cambio global en el numero de
sobrevivientes fueron significativamente mayores (Bc/ timol=1,3 da-1 ; Bs/ timol= 0,5
-1
da ; Cc/ timol= 3,4 ciclos; Cs/ timol =0,07 ciclos). Tal como se coment anteriormente,
son varios los factores que en combinacin podran estar generando este efecto
protector observado. Estos estudios debieran intensificarse evaluando varias
concentraciones de este antimicrobiano con el propsito de arribar a una conclusin
ms definitiva.
125
Figura 53: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de inactivacin de
S.aureus en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 6C (a); 17C (b); y
de S. Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C (c) () valores experimentales;
() prediccin
(a) (b)
0 0,19
-0,5 -0,01
Log (N/N0)
Log (N/N0)
-1 -0,21
-1,5
-0,41
-2
-0,61
-2,5
-3 -0,81
0 10 20 30 40 0 4 8 12 16 20 24
0 (c)
-0,5
Log (N/N0)
-1
-1,5
-2
-2,5
-3
0 4 8 12 16 20
Tiempo (da)
126
Tabla 21: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 6 C.
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 99,07
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 89,29
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
127
Tabla 23: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.Enteritidis en queso untable
base (pH 5.0) con timol almacenado a 17 C.
ANLISIS DE LA DESVIACIN
FISHER
Fuente SS gl
R2 ajustado 98,27
1
SS: suma de cuadrados; gl: grados de libertad; : nivel de significacin; R2 ajustado: coeficiente de
determinacin ajustado por grados de libertad.2NS: no significativo; *:significativo al 5% ;**: muy
significativo al 1%.A: hombro de la curva de muerte (da); B : mxima velocidad de muerte (1/da) y
C : cambio total en el nmero de sobrevivientes ( -).
128
Figura 54: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base (pH 5,0) con timol almacenado a 6C ; 17C; y de S.
Enteritidis en igual matriz almacenada a 17C: a) Valores observados vs valores
predichos; b) Residuales vs. valores predichos . () valores experimentales; ()
prediccin.
S.aureus- 6C
Valores observados
0,8 0,22
Residuales
-0,2 0,12
-1,2 0,02
-2,2 -0,08
-3,2 -0,18
-3,2 -2,2 -1,2 -0,2 0,8 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
S.aureus- 17C
0,12
Valores observados
0,19
0,08
Residuales
-0,01
0,04
-0,21
0
-0,41
-0,04
-0,61 -0,08
-0,81 -0,12
-0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19 -0,81 -0,61 -0,41 -0,21 -0,01 0,19
Valores predichos Valores predichos
S.Enteritidis- 17C
0,21
Valores observados
0
-0,5
Residuales
0,11
-1
-1,5 0,01
-2
-0,09
-2,5
-3 -0,19
-3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0 -3 -2,5 -2 -1,5 -1 -0,5 0
Valores predichos Valores predichos
129
Figura 55: Ajuste del modelo de Gompertz modificado a la curva de crecimiento de
S.aureus en queso untable base con timol almacenado a 25C, () valores
experimentales; () prediccin
8,9
7,9
Log N
6,9
5,9
4,9
3,9
0 3 6 9 12 15 18
Tiempo (dia)
Tabla 24: Ajuste del modelo de Gompertz modificado y sus respectivos parmetros
caractersticos, correspondientes al comportamiento de S.aureus en queso untable
base con timol (pH 5.0) almacenado a 25 C
130
Figura 56: Validacin interna del modelo propuesto para el crecimiento de S.aureus
en queso untable base con timol (pH 5,0) almacenado a 25 C: a) Valores observados
vs valores predichos; b) Residuales vs. valores predichos. () valores
experimentales; () prediccin
(a) (b)
8,9
Valores observados
0,33
7,9 0,23
Residuales
6,9 0,13
5,9 0,03
-0,07
4,9
-0,17
3,9
4 5 6 7 8 9 -0,27
3,9 4,9 5,9 6,9 7,9 8,9
Valores predichos
Valores predichos
131
5. CONCLUSIONES
132
La microbiologa predictiva se ha convertido en los ltimos aos en una
herramienta muy valorable y necesaria para un correcto diseo de los procesos de
preservacin de alimentos. Los modelos matemticos generales que se utilizan para
describir el crecimiento la inactivacin microbiana generalmente se derivan de
estudios en sistemas modelo con factores ambientales controlados tales como el pH;
el nivel de sal; la temperatura; etc. La comparacin de las predicciones brindadas
por estos modelos con el comportamiento de los microorganismos en un alimento
real puso en evidencia en este estudio las limitaciones de los mismos. En particular,
cuando no todas las condiciones ensayadas quedaron bien descriptas este anlisis
permiti determinar qu factores adicionales ( consideraciones del microambiente)
se necesitan incluir en el modelo o considerar para aumentar su aplicabilidad. En
particular este estudio permiti arribar a las siguientes conclusiones:
133
observada entre el medio de cultivo (crecimiento) y el alimento real (supervivencia
/inactivacin)
La reduccin del pH del queso untable base (pH 5,0) hasta un valor
organolpticamente aceptable (pH 4,3) gener una alternativa interesante ya que
aument notoriamente la inactivacin observada del microorganismo de prueba (S.
aureus) sobretodo en situaciones de abuso trmico (15 y 22C), donde este efecto se
ve incrementado. Es posible que al aumentar la temperatura, la flora acidolctica, que
no se ve afectada por el descenso de pH, incremente su poblacin por tener una
temperatura ms propicia y por lo tanto aumente su poder biopreservante eliminando
al microorganismo de prueba que es ms sensible al microambiente imperante.
134
resultado fue relevante pues seala un punto de inicio para futuras investigaciones y
aspectos a tener en cuenta al momento de desarrollar quesos untables saborizados.
135
6. APNDICE
136
Este captulo incluye informacin con respecto a los mtodos estadsticos que se
utilizaron para el anlisis de los resultados, definiciones y frmulas.
6.1.2-Distribucin normal
(
f ( x) = 1 / 2 ) exp[ (Y Y ) 2 / 2 2 ] (6.1)
Donde:
exp = funcin exponencial con base e
Y= medicin realizada
Y = media del total de las mediciones
= desviacin estndar
= varianza
137
6.1.3- Parmetros y estimadores
Y i
Y= i=1
(6.2)
N
donde Yi : valor individual del sistema i
N: nmero total de datos
(Y Y )
i=1
i
2
= (6.3)
(N 1)
138
N 2
(Y Y )
i
=
2 i =1
(6.4)
N 1
2
Y t 2,n1 (6.6)
N
Donde
t/2,n-1 = el estadstico t de Student de nivel de confianza /2 y de n-1 grados
gl=n-r (6.7)
donde:
n= el nmero de sujetos en la muestra
r=el nmero de sujetos estadisticamente dependientes.
139
en el que se encontraban los datos originales. Los grados de libertad del error los
determina, precisamente, el valor de esta menor dimensin.
140
valor experimental es mayor que el tabulado para P 0,99 la conclusin es (**) y
para P 0,999 (***). Cuando :
VE < VT (NS)/(-)
141
Suma de Cuadrados Totales (SST) se obtiene sumando los cuadrados de las
desviaciones del valor observado en cada sistema Yi respecto de la media Y .
( )
N 2
SST = Yi Y (6.9)
i =1
Y Y = 0
i =1
i (6.10)
( )
2
SSR = Yi Y (6.11)
SSR
MSR = (6.12)
p 1
142
entre los valores medidos de N elementos de la poblacin y los valores de los
mismos elementos tal como son predichos por el modelo.
( ) = r
N 2 N
SSE = Yi Yi i
2
(6.13)
i=1 i=1
SSE
MSE = (6.14)
Np
Los residuales se usan para evaluar el ajuste del modelo a los valores
experimentales. La suma de los residuales de cada corrida tericamente es siempre
cero, sin embargo, en la prctica puede no serlo exactamente pero debera
aproximarse.
SSR
DEBIDO A p-1 SSR MSR =
LA REGRESION p-1
SSE
RESIDUAL N-p SSE MSE =
N-p
143
la variacin de la informacin explicada por el modelo o relacin propuestos es
significativamente mayor que la variacin debida a causas no identificables
(residuales) y que el efecto observado no se debi al azar . Es de destacar que los
test t-Student y F son esencialmente los mismos . Para un diseo completamente
aleatorio donde se estudian slo dos tratamientos y dos test t a dos colas para
muestras independientes se verifica que:
F = t (6.15)
MSR SSR (p 1)
F= = (6.16)
MSE SSE (N p )
SSR
R2 = 100 (6.17)
SST
144
Tambin se usa el coeficiente de determinacin ajustado por los grados de
libertad del modelo:
SSE (N p )
Raj2 = 1 (6.18)
SST (N 1)
6.2.3.1- Versus valores predichos, Yi
Se grafican los valores de los residuales (ri) versus los valores predichos por
el modelo. Dichos residuales no se grafican en funcin de los valores observados
(Yi) debido a que ambos grupos de valores estn correlacionados. Debe observarse
una distribucin uniforme horizontal de los residuales en torno a los valores
predichos, Yi (homocedasticidad). Pueden manifestarse algunos comportamientos
anormales tales como los que se describen a continuacin.
145
ri
Yi
ri
Yi
ri
Yi
146
7. BIBLIOGRAFA
.
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BIOQ. MIRYAM SICILIANO DRA. SANDRA GUERRERO
TESISTA DIRECTORA
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