Guia Bioquímica 2017-I

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS
Universidad del Per, DECANA DE MERICA
FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA
E.A.P DE INGENIERA AGROINDUSTRIAL
MANUAL UNIVERSITARIO
PRACTICAS DE BIOQUIMICA
(QA1013)
Elaborado por:
MARIA ROSARIO CALIXTO COTOS
Mg. Bioqumica
2017-I
Lima Per
Rosario Calixto Cotos Bioqumica
PRESENTACION
La presente edicin de este manual constituye el producto del esfuerzo y

entusiasmo con la finalidad de transmitir una informacin consistente en la
competencia conceptual, procedimental y actitudinal.
El manual de prcticas est destinado a los alumnos de la carrera profesional
de Ingeniera agroindustrial de la Universidad Nacional Mayor de San Marcos
El esquema de las prcticas consiste en la formulacin de objetivos,
introduccin: consideraciones tericas, parte experimental, hoja de resultados,
cuestionarios y revisin bibliogrfica; asimismo se presenta una hoja de reporte de
resultados. La intervencin del alumno es dinmica y constante.
Por ltimo deseo expresar con anticipacin mi agradecimiento por las
sugerencias, que sern bienvenidas para mejorar el manual en futuras ediciones.
Mara Rosario Calixto Cotos

Magister en Bioqumica.
Docente Asociada UNMSM
2
Rosario Calixto Cotos
INDICE DE PRCTICAS
Pg.
Presentacin.. .. 2
Indic 3
Organizacin. .. 4
Control de Calidad de los resultados en el Laboratorio de Bioquimica . 6
Preparacin de soluciones buffer y determinacin de la capacidad
amortiguadora. 10
Hidrlisis enzimtica del almidn y el efecto del in
activador.... 13
Actividad enzimtica y factores que la afectan 17
Fermentacin lctica 22
Cambios bioqumicos durante la fermentacin de una bebida a base
de maz . 26
Evaluacin de las enzimas oxido reductasas en material biolgico. 34
Evaluacin de emulsificantes de la digestin 39
Hidrlisis de las grasas por accin de la lipasa pancretica 42
Determinacin del punto isoelctrico de la casena 50
Cromatografa de metabolitos secundarios de vegetales. 56
3
ORGANIZACIN
1. Asistencia. El registro de la asistencia es obligatorio a los alumnos

oficialmente matriculados.
2. La tolerancia para ingresar a las sesiones de laboratorio es de 10 minutos,
pasado este tiempo el alumno no tendr derecho a dar las evaluaciones, ni
podr ingresar al laboratorio. Tampoco podr recuperar dicha prctica. La
nota es cero, en este caso, de acuerdo a la programacin.
4. El 30 % de inasistencias inhabilitar al alumno para continuar en las prcticas.
5. Toda prctica es irrecuperable, una falta puede ser justificada slo con
certificado mdico, visado por la autoridades de la Universidad
6. El uso del mandil largo y limpio es obligatorio durante la sesin
7. Grupos de alumnos, se ubicaran en su respectiva mesa de trabajo para el
desarrollo de la prctica. Dos alumnos del grupo se acercarn al profesor que
les dar materiales de laboratorio para el desarrollo de las prcticas.
8. El alumno en el laboratorio debe cumplir las medidas de seguridad y
mantener constantemente el orden.
9. Est prohibido fumar ni comer
10. Cada alumno debe cuidar el material de laboratorio a su cargo, la ruptura o
la prdida de alguno ser responsabilidad del alumno. Si algn alumno rompe
el material debe reponerlo en un plazo mximo de un mes, coordinando con
el docente responsable de la asignatura.
11. Mantenga el rea de trabajo limpia, si se derrama alguna sustancia u otro
accidente comunicar inmediatamente a su profesor.
12. Si el alumno desconoce el uso del material o reactivo, pedir a su profesor las
instrucciones del caso.
13. El alumno en cada sesin de prctica debe traer, guantes, gorro y lentes
de proteccin y papel toalla.
4
DESARROLLO DE LA ELABORACION DEL INFORME
El informe se presentar la semana siguiente, al momento de pasar la asistencia los primeros

10 minutos.
La caratula consiste de ttulo de la prctica el N de practica fecha en q se realiz la prctica.
Persona que no asisti a la sesin de prctica no tendr tampoco nota de informe
El informe es manuscrito.
1. Introduccin se incluye el objetivo solo es de una pgina entre 10 a 20 lneas
2. Esquema de la metodologa puede ser Diagrama de Flujo
3. Resultados Se incluyen los clculos. Tablas y grficos numerados
4. Interpretacin de los resultados / discusin de resultados
5. Conclusiones (4 a 5 conclusiones)
Las conclusiones tienen que referirse si se cumplieron o no los objetivos, si el
fundamento del mtodo aplicado result adecuado para alcanzar el objetivo.
6. Cuestionario
7. Referencias Bibliogrficas, consultadas que realizo al hacer la introduccin, resultados,
discusin y otras. Deben incluir artculos de investigacin libros, y citas de internet (2) si
fuera 10 referencias.
5
PRCTICA 01
CONTROL DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS EN EL

LABORATORIO DE BIOQUIMICA
I. OBJETIVO
Determinar la media, desviacin estndar y el coeficiente de variacin que puedan
influir en el trabajo experimental en el laboratorio.
II. INTRODUCCION
El control de calidad es un conjunto de reglas y procedimientos que se deben

seguir para garantizar la confiabilidad de un proceso, se fundamenta en mtodos de
sondeo y en empleo de la estadstica.
Las mediciones en bioqumica estn influenciadas por varios factores los
materiales medicin de laboratorio, el personal, la temperatura, la humedad, el
registro de datos.
Cuando se realiza cualquier medicin cientfica es necesario considerar que se
pueden cometer diferentes tipos de error. Este trmino e utiliza para referirse a la
diferencia numrica entre el valor real y el valor medido.
Los errores pueden clasificarse en errores de sesgo o de exactitud y errores de
precisin.
Los errores de sesgo o exactitud se refieren a la diferencia entre un valor real
y la media de la distribucin de un mayor nmero de medidas realizadas con el mismo
mtodo. Mientras menor sea la diferencia habr ms exactitud en las medidas.
Los errores instrumentales son los debidos al aparato de medida; por ejemplo,
un error de calibrado generara este tipo de imprecisin. Los errores personales se
deben a las limitaciones propias del experimentador;
En el campo de investigacin cientfica es necesario tener un alto grado de
precisin de las determinaciones experimentales para poder afirmar que el fenmeno
que se est registrando es el real y as tener que una alta confiabilidad en los
resultados.
Los errores de precisin implican el grado de dispersin de los datos obtenidos.
Si un fenmeno se mide en repetidas ocasiones con el mismo mtodo, siempre habr
un grado de dispersin de datos. La magnitud de esta dispersin se puede expresar
de diversas maneras, tales como la desviacin estndar
El error absoluto es la diferencia entre el valor experimental y el valor verdadero.
E abs = x-T x= valor determinado experimentalmente, T valor verdadero
Error relativo = E abs/ T

Tambin se puede expresaren porcentaje %E relativo
Exactitud y precisin
6
La exactitud es el grado de concordancia entre el valor verdadero y el

experimental.
Un aparato es exacto si las medidas realizadas con l son todas muy prximas
al valor "verdadero" de la magnitud medida.
La precisin es el grado de concordancia entre una medida y otras de la misma
magnitud realizadas en condiciones sensiblemente iguales. Un aparato es preciso
cuando las diferencias entre diferentes medidas de una misma magnitud sean muy
pequeas.
Un trmino que resulta mucho ms fcil de tratar y determinar es la precisin.
Este parmetro es una medida de cmo reproducibles o cmo de prximas llega a
ser las medidas duplicadas. Si una serie de ensayos repetitivos producen resultados
similares, entonces diramos que la precisin de dicho ensayo es buena. Desde un
verdadero punto de vista estadstico, la precisin se denomina frecuentemente el
error, cuando de hecho estamos observando la variacin experimental.
La diferencia entre exactitud y precisin se puede ilustrar en la siguiente figura:
FACTORES QUE INFLUYEN EN LA EXACTITUD Y PRECISION
FACTOR
Manipulacin Calibrado Instrumento Exactitud Precisin
Descuidada Imperfecto Defectuoso Mala Mala
Descuidada Imperfecto Eficiente Mala Mala
Descuidada Exacto Eficiente Razonable Mala
Cuidadosa Imperfecto Defectuoso Mala Mala
Cuidadosa Imperfecto Eficiente Mala Buena
Cuidadosa Exacto Eficiente Buena Buena
Fuente: W-F Pickerring
En cualquier serie de anlisis repetitivos de una misma muestra, los valores de los
resultados experimentales sucesivos difieren entre si en cantidades mayores o
menores, y la labor del investigador es la de decidir si las discrepancias entre aqullas
son excesivas. Se pueden tomar decisiones de mayor garanta si los resultados
experimentales se someten a alguna forma de tratamiento estadstico normalizado.
III. PARTE EXPERIMENTAL
Materiales
7
Calculadora, balanza analtica, un racimo de uva negra integro con 12 unidades de

preferencia que tengan el mismo tamao, tijera, papel toalla, dos cucharaditas de
plstico. 10 unidades de caramelos pequeos.
Procedimiento
1. Pesar cada una de las uvas 10 unidades y de los caramelos sin empaque
2. Anotar los pesos en mg de 10 uvas
3. Calcular la media, la deviacin estndar, y el coeficiente de variacin
Tabla de resultados y el error relativo
mg mg mg mg
1 6 1 6
2 7 2 7
3 8 3 8
4 9 4 9
5 10 5 10
Media
Desviacin estndar
Coeficiente de Variacin
Ejercicios
1. Cul es la variacin de los pesos de los empaques (en gramos), de uno de sus productos;
por lo que se opta por seleccionar al azar cinco unidades de ellos para pesarlos. Los
productos tienen los siguientes pesos (490, 500, 510, 515 y 520) gramos respectivamente:
Media
Varianza
Desviacin estndar
Coeficiente de variacin (CV)

8

CV = 100
Xm es la media
2. Al determinar cinco veces el PM del glutamato deshidrogenasa de plantas, por filtracin

en gel, se obtuvieron los resultados siguientes: 243, 247, 244, 241 y 245. Calclese la media,
la desviacin estndar y el intervalo de confianza de 70 por 100.
Respuestas:
DS= 244.000 2.236
Intervalo de confianza 70 % 244.00 2.66
IV. CUESTIONARIO
1. El error absoluto o el error relativo es ms til, fundament su respuesta.
2. Qu es una medida de tendencia central y una medida de dispersin.?
3. Qu tipos de errores se pueden cometer en las prcticas de laboratorio?
4. Disee un lista de valores de una metodologa donde encuentre alta precisin y baja
exactitud.
5. Que diferencia hay entre varianza y coeficiente de variacin
V. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Gonzales ES, Bucio Ortis L., Damin Matsumura P, Manual de Bioqumica. AGT Editor.
2007. Impreso en Mxico.
2. Nielsen Suzanne Anlisis de los alimentos. Ed. Acribia. 2003
3. W-F Pickerring Qumica Analitica Editorial Reverte. 1999.
9
PRCTICA 02
PREPARACIN DE SOLUCIONES BUFFER Y DETERMINACIN DE LA

CAPACIDAD AMORTIGUADORA
I. OBJETIVOS
1. Preparar una solucin buffer y determinar su pH.

2. Demostrar la capacidad amortiguadora de un lquido biolgico
II. INTRODUCCIN
DISOLUCIONES REGULADORAS
Las disoluciones buffer son aquellas que se caracterizan por tener capacidad para
resistir el efecto de cidos y bases con los que se ponen en contacto. Estas disoluciones
son las mismas que las disoluciones acuosas de solutos ionizables con la diferencia que
adems del soluto est presente disuelto otro soluto llamado conjugado. Ejm.
a) Por un cido dbil y la sal de su base conjugada; Ejemplos
cido cetico/acetato de sodio
Fosfato monocido disdico (Na2HPO4)/fosfato dicido disdico (NaH2PO4),
Cuando a sta mezcla se le aade un cido fuerte HCl ste reaccionara con la sal
menos cida, el cido fuerte ha sido convertida en una sal neutra. El otro caso cuando
se le aade una base fuerte, esta se convierte en agua. En ambos casos los efectos
fuertes del cido la base han sido amortiguadas por el sistema tampn, y hay una
variacin muy pequea del pH.
b) Por una base dbil y la sal de su cido conjugado; Ejm.

Amonaco y el cloruro de amonio.
Se puede definir la capacidad amortiguadora de una disolucin reguladora como la

cantidad de cido o base que puede neutralizar dicha disolucin, con una variacin
mxima de una unidad en el pH de la disolucin.
La Ecuacin de Henderson-Hasselbach
Es una frmula utilizada para el estudio y clculo de los equilibrios cido-base de las
disoluciones reguladoras
pH = pKa + log [sal conjugada] / [cido]
Si la composicin de un tampn est compuesto por una base dbil y su sal, el pH del
mismo vendr dado por :
pH = pKw +pKb - log [sal conjugada] / [base]
10
La adicin de una pequea cantidad de cido convertir algo de la base en la sal, y

la adicin de una pequea cantidad de alcal podr convertir algo de la sal en la base,
pero de nuevo si las concentraciones de la sal y de la base son suficientemente grandes,
estos cambios sern despreciables.
Consideraciones sobre las disoluciones reguladoras
1. El valor de pH de un buffer depende de la proporcin relativa de cido/sal o base/sal;

no depende de sus concentraciones absolutas.
2. La amortiguacin es mxima cuando el pH del medio coincide con el pKa de la
disolucin. Esto sucede, lgicamente, cuando las concentraciones de cido y sal o de
base y sal son iguales.
3. Las disoluciones reguladoras tamponan bien hasta valores de pH una unidad por
encima o por debajo del valor de su pKa, es decir, cuando la proporcin sal/cido o
base/sal no es superior a 1:10 o 10:1. Si se supera este valor, la capacidad de
amortiguacin disminuye considerablemente.
MATERIALES y REACTIVOS
Tubos de prueba. 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL, bombilla succionadora
Gradilla
o Sol. De buffer
o NaH2PO4 0.2 M Na2HPO4 0.2M
o HCl 0.2 M
o NaOH 0.2 M
o pH metro, Cintas de pH
o Baguetas
o Beacker 50 ml y de 100 mL, fiola 100 ml
Materiales que traen los alumnos
o Jugo de granadilla, jugo de toronja, jugo de uvas, clara de huevo diluida a la
mitad.
o calculadora cientfica Plumn marcador, gasa dos bolsitas
PROCEDIMIENTO
Experiencia N 1
Preparacin del buffer Fosfato y demostracin de su capacidad
1. Con una pipeta medir 3.5 ml de la disolucin de NaH2PO4 0.2M y colocar en

un tubo limpio. Con otra pipeta medir 1.5 ml de la disolucin Na2HPO4 0.2 M y
adicionar al mismo tubo y completar hasta 10 ml con agua.
2. Dividir stos 10 ml en dos tubos de ensayo de igual volumen.
3. Formar dos GRUPOS de CUATRO TUBOS
Tubo 1: 3 ml jugo de granadilla
Tubo 2: 3 ml de Buffer fosfato
Tubo 3: 3 ml de clara de huevo diluida a la mitad
Tubo 4. 3 ml jugo de uvas
3. Con las cintas de pH o el pH metro medir el pH inicial de las disoluciones. Anotar
4. Aadir con pipeta 0.2 ml de HCl 0.1 M a cada tubo del primer tro, medir el pH
final de cada tubo.
11
5. Hacer lo propio con 0.2 ml de NaOH 0.1 M y luego evaluar la capacidad buffer.
IV. REPORTE DE RESULTADOS

Experiencia. N 1: Preparacin del buffer Fosfato y demostracin de su capacidad
Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 3 Tubo 4

1 2 3 4 1 2
M A Buffer jugo Lech MA Buffer jugo Leche
e
Ms HCl (0.2 ml) Ms NaOH ( 0.2 ml)
pH
inicial
exp.
pH
final
exp
Diferen
cia
pH x x x x
inicial
terico
pH x x x x
final
terico
Escriba las reacciones qumicas que se desarrolla en el tubo 2 tanto al adicionar

HCl y NaOH.
1. Con HCl
2. Con NaOH
Realice sus clculos empleando la frmula: pH = pKa + log [sal conjugada] / [cido]
. V. CUESTIONARIO
1. Calcule la variacin de pH que se producir al aadir 25 ml de NaOH 0.1M a 0.5L de
una disolucin 0.25 M de ACH y 0.2 M de AcNa suponiendo que los volmenes son
aditivos. pKa = 4.74
2. En la prctica, se prepar un buffer fosfato pH = 6.5, si su pKa = 6.8. Calcular la
proporcin en que se encuentran el cido y sal.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada. UNMSM-Fac.
Medicina .Lima, Per 2008 p.30
2. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007. India, p. 490
3. Coultate T.P Qumica y Bioqumica de los alimentos. 3 edicin Edit Acribia
Zaragoza-Espaa.200.
12
PRCTICA 03
HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON Y EL EFECTO DEL ION

ACTIVADOR
I. OBJETIVO
Determinar el pH ptimo de la -amilasa

Demostrar la accin del activador de la enzima sobre la digestin del almidn.
II. INTRODUCCIN
Las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones metablicas para el proceso de

digestin, las biomoleculas ingeridas en la dieta deben ser degradadas a sus componentes
ms sencillos para ser absorbidas a nivel del tubo digestivo y as llegar al lugar
correspondiente a nivel celular.
El almidn es un polisacrido formado por la polimerizacin de miles de monmeros de
glucosa que forman largas cadenas. El almidn est realmente formado por una mezcla de
dos sustancias, amilasa y amilo pectina.
La digestin de los carbohidratos comienza en la boca, donde los alimentos se mezclan con
la Amilasa salival que degrada los enlaces del almidn liberndose Maltosa, Glucosa y
dextrinas de almidn que poseen todos los enlaces. La accin de las enzimas, por sus
caractersticas fsico-qumicas, puede afectarse por las condiciones presentes en el lugar de
accin de stas. Entre los principales factores que pueden modificar la accin enzimtica
tenemos:
. La temperatura.
. El pH.
. Inductores e inhibidores.
MATERIALES Y REACTIVOS
Gradilla
Pipetas de 1, 2 y 5 mL
Tubos de ensayo
Propipeta y Beaker 50 mL
pH metro o cinta de Ph
Bao mara de 37 C
Agua destilada
Solucin de Almidn 1 g %
Cloruro de sodio al 0.9 %
Buffer fosfato a pH 6.8 a 0.2 M
13
NaOH 0.2 M
HCl 0.2 M
PROCEDIMIENTO
a) RECOLECCION DE SALIVA
Un alumno proceder a enjuagarse dos veces la cavidad oral; luego mantendr la

boca cerrada durante 5 minutos, evitando pasar la saliva.
La saliva acumulada se colectar en un beaker dejando caer por gravedad la saliva

acumulada para evitar la formacin de espuma. Realizar una dilucin de la enzima
1/3, colocando 1 mL de saliva y agregue 2 mL de agua destilada, agitar lentamente.
b) LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA SALIVAL
Preparar los siguientes tubos de digestin, rotular.
Tubos de Digestin 1 2 3
Fos-Na Fos HCl
Solucin de almidn 1g/dL (mL) 1.0 1.0 1.0
Buffer fosfato 0.2 M (mL) 1.0 1.0 -
cido HCl 0.1 N - - 1.5
Agua destilada 1.0 2.5 2.0
Cloruro de sodio 0.9 g/dL 1.5 - -
1. Medir el pH en cada tubo. Anote.

2. Llevar los tubos a pre incubacin a 37 C por 5 minutos.
3. Agregar 3 gotas de saliva diluida, agitar por 30 segundos.
4. Luego aadir 5 gotas de solucin de guayacol y una gota de perxido de
hidrgeno.
5. Observar las coloraciones caractersticas.
c) PRUEBA DE LUGOL
Identificar la presencia de almidn por la aparicin de la coloracin azul oscura.
Tubos para la 1 2 3
reaccin con Lugol
Tubos de digestin 1 mL 1 - -
Tubos de digestin 2 mL - 1 -
Tubos de digestin 3 mL - - 1
HCl 0.1 M, gotas 4 4 4
14
Solucin de lugol, gotas 2 2 2
Hoja adicional
Coloracin que se observar despus de la adicin de lugol (*)
Amarillo tenue: Desaparicin completa del sustrato
Amarillo pardo: Digestin incompleta
Azul: No hubo digestin del almidn
Los valores de actividad enzimtica: Se reporta de acuerdo a los colores observados.
Tubos 1 2 3 4 5
pH exp
pH terico
Coloracin
(*)
Actividad
enzimtica
V. CUESTIONARIO
1. Qu variables se mantienen constante en este estudio.
2. Cules son los productos de la digestin del almidn por accin de la amilasa.
3. Seale 4 productos agroindustriales que pueden ser tratados por hidrolisis con
enzimas amilolticas a nivel industrial y que productos se obtienen.
4. Mencione las formas de expresar la actividad enzimtica.
5. Cite cuatro caractersticas bioqumica de la alfa amilasa salival.
6. Cuales son isoenzimas, escriba cinco ejemplos de isoenzimas en el metabolismo
de carbohidratos.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Calixto C. Mara R. Gua de prcticas de Qumica Integrada. UNMSM-Fac.
Medicina .Lima, Per 2008 p.30
2. Da Zagoya. Bioqumica. 1 edicin, Editorial Mc Graw Hill. 2007. India, p. 490
Zaragoza-Espaa.200.
4. Nielsen Suzanne Anlisis de los alimentos. Ed. Acribia. 2003
15
REPORTE DE RESULTADOS
ESTUDIO DEL EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y LA ACCION DEL

ACTIVADOR
Profesora: Mg. Rosario Calixto Cotos

Apellidos y Nombres:.Fecha.
Resultados
Tubos 1 2 3 4
pH exp
pH terico
Coloracin
(*)
Actividad
enzimtica
1. Segn la clasificacin de enzimas, A qu clase pertenece la amilasa
salival:..y que tipo de enlace rompe: .
2. Seale la funcin de los siguientes reactivos:
Reactivo de lugol ..
Buffer fosfato en los tubos de reaccin?
Buffer acetato, HCl, e NaOH ..
3. Como expres la actividad enzimtica:
RESPECTO AL ACTIVADOR
1. Qu reactivo proporcion el in activador .

2. El activador enzimtico es: .
3. Qu funcin cumple el activador en este experimento
CONCLUSIONES
16
PRCTICA 04
ACTIVIDAD ENZIMTICA Y FACTORES QUE LA AFECTAN
I. OBJETIVOS
Determinar la actividad enzimtica
Estimar los valores de Km y Vmax
II. INTRODUCCION
Las enzimas son catalizadores biorgnicos que aceleran la velocidad de la reaccin
qumica, se une con el sustrato en el sitio activo de la enzima.
Los sustratos son molculas que se une a la enzima de manea especfica,
tambin pueden participar cofactores enzimticos
En una reaccin bioqumica catalizada por una enzima, a medida que progresa la
reaccin, aumenta la concentracin de los productos a expensas de la desaparicin
de los correspondientes substratos en tanto permanece fija la concentracin de la
enzima.
La Actividad Enzimtica se puede expresar como:

a.- La desaparicin del sustrato.
b.- La aparicin del producto
c.- La modificacin de cofactores
Factores que Modifican la Actividad Enzimtica

1.- pH del medio
2.- Temperatura
3.- Concentracin de Enzima
4.- Concentracin de Substrato
5.- Accin de Inhibidores y Activadores
La PEPSINA es una enzima que hidroliza los enlaces pptidos de las protenas, se
encuentra en la mucosa gstrica.
La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrar por desaparicin del substrato, o sea la

disminucin de la turbidez de una solucin de Albmina de huevo sobre la cual
actuar la enzima. La turbidez se leer en el ESPECTROFOTOMETRO.
MATERIAL Y METODOS
Pepsina, Hielo, Espectrofotmetro, celdas, clara de huevo, HCl 1N, agua destilada, 25
tubos de prueba, baguetas, gradillas, bao de incubacin, 4 beaker 250 ml, 1
17
beaker 500 ml 5 pipetas 5ml , 10 pipetas 10 ml, tiras de pH Merck, reactivo de biuret,
papel parafina
PROCEDIMIENTO
EFECTO DE LA CONCENTACION DE SUSTRATO
a. En una gradilla disponer 7 tubos de prueba de 13 x 100 mm. y proceder

como sigue:
TUBOS 1 2 3 4 5
Agua destilada 8.0 7.0 6.0 5.0 4.0

ml.
HCl 1N ml. 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5
Albmina ml. 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0
c. Incubar los 7 tubos a 37C durante 5 minutos.

d. Adicionar 0.2 ml de la pepsina, a cada uno de los tubos del 1 al 7 e
Incubar a 37 C por 10 minutos.
e. Retirar del Bao a 37C y llevar a bao de hielo.
f. Observe la transparencia de los tubos, y marque con cruces
g. Mida una alcuota de 2 ml de cada tubo en y aada 1 de reactivo de
Biuret, mezcle incubar a 40 C por 3 minutos
h. Observe los resultados
existe diferencia en el color de cada tubo de reaccin
18
CALCULOS: Para obtener la actividad enzimtica se debe restar la mayor

absorbancia obtenida menos la absorbancia de cada tubo. Graficar los
Resultados, en un papel milimetrado, colocando las concentraciones de

sustrato en las abscisas y la actividad enzimtica en las ordenadas.
1. Disminuyo o aumento la presencia de la turbidez de los tubos,

despus de la incubacin
2. Como expresara la actividad enzimtica
3. Qu clase de enzima es
4. Cuales son los productos de la reaccin enzimtica.
5. Que mtodo uso para determinar la presencia de productos ..

19
6. Escriba el fundamento de la reaccin qumica que se desarrolla en el (g)
7. Realice un grafico, expresando sus resultados.
Conclusiones.
V. CUESTIONARIO
1. Grafique los siguientes resultados mediante la linea de Lineaweaker and Burk

usando siguientes datos:
1 2 3 4 5 6 7
(concentracin 0.1 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4
de sustrato)mM
Lectura inicial 0.15 0.32 0.48 0.62 0.75 0.82 0.93
Lectura final 0.05 0.12 0.20 0.28 0.36 0.41 0.51
20
Calcule el Km, el V max,

La Actividad enzimtica se obtiene:
Actividad enzimtica = Lectura inicial Lectura Final
2- Explique el mecanismo de accin de la las enzimas.

3.- Escriba la reaccin que cataliza la pepsina
4. A que se llama actividad especifica
5. A que se llama Kcat.
7. Realice un sistema indicando la enzima, sustrato pH, temperatura, tiempo
Y como expresara la actividad enzimtica, caso real.
VI. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
1. Devlin, T.M. Bioqumica, Libro de texto con aplicaciones clnicas.

Tomo I y II. Barcelona Edit. Revert. 1991.
2. Lehninger, A. Bioqumica. Barcelona. Edit. Omega. 2008
3. Stryer, L. BIOQUMICA. 4ta. Ed. Revert; 2012.
4. Villavicencio, M. Bioqumica. Tomo I y II. 1era Ed. Lima. Edit. UNMSM.
CONCYTEC. 2006.
21
PRCTICA 05
FERMENTACIN LCTICA
I. OBJETIVOS
1. Demostrar la aparicin de productos en una fermentacin alcohlica de glucosa por levadura

2. Comprender la importancia de la fermentacin alcohlica
II. INTRODUCCIN
La fermentacin es el proceso en el cual se utilizan los hidratos de carbono para

obtener energa (ATP Y NADH) de manera anaerbica.
La primera etapa del metabolismo de glucosa en levadura es la produccin de
piruvato y luego etanol Este proceso que se efecta mediante una serie de
reacciones que involucran un nmero considerable de intermediarios, se conoce
como fermentacin o gliclisis.
Fermentacin con levaduras
C6H1206 levaduras 2CO2 + 2 C2H50H
La reaccin total podra considerarse como la transferencia de dos pares de tomos de

hidrgeno de la glucosa al NAD. Puesto que la coenzima se encuentra solo en cantidades
catalticas, es necesario reoxidarla para que el proceso no se suspenda, y as, el NADH2
formado es reconvertido a NAD por oxgeno molecular a travs de la cadena respiratoria.
Esto no es posible en condiciones anaerbicas y en este caso la reoxidacin se efecta
cuando el piruvato se convierte en acetaldehdo, y luego en etanol.
En los productos que se leudan con levadura, el CO2 que se produce lentamente infla las
burbujas de aire que se han introducido en la masa durante la mezcla.
La velocidad de la reaccin se medir mediante la liberacin de CO2
III. MATERIALES Y REACTIVOS
10 tapas de placa petri

estufa
2 esptulas
Balanza, bao de incubacin
Bureta, soporte universal,
2 Baguetas de vidrio
4 termmetros
Erlemeyer de 250 ml
Beacker de 250 ml
Cocinilla con rejilla
Piceta con agua destilada
22
Yogurt natural un frasco de 100 ml

Leche pura vida entera cada grupo de 250 ml
10 probetas de 50 ml
4 cucharas de plstico por grupo
Azcar rubia 100 g
PROCEDIMIENTO
FERMENTACION LCTICA
El yogurt resulta de la fermentacin de la leche por una flora bacteriana compuesta de

Lactobacillus bulgaricus y Streptococcus thermophilus. Los estreptococos remueven el
oxgeno y los lactobacilos transforman el azcar lactosa en cido lctico. Cuando el pH oscila
entre 5 y 6, la leche coagula. Otras especies bacterianas tambin pueden fermentar la leche:
Lactobacillus acidophilus, Streptococcus lactis, Bifidobacterium bifidum, etc. Existen
diferentes tipos de yogurt y leches fermentadas, todos ellos productos altamente nutritivos,
ricos en protenas, sales minerales y vitaminas. Las variaciones descritas en la figura 1
dependen de los aditivos (azcar, frutas, etc.) y de las modificaciones de consistencia
(cremosa, firme, batido)
PROCEDIMIENTO
1. Calentar a 85C 250 ml leche por 8 minutos y enfriar en un vaso de hielo y dejar enfriar
hasta alcanzar una temperatura de 42C. (40 a 45C)
2. Aadir a la leche tibia una cucharada de azcar y una cucharadita de leche en polvo
aadirle 2 cucharadas de yogurt natural, mezclar bien
3. Dejar en un ambiente tibio (42C) durante 6-8 horas, hasta que la mezcla se espese. Esta
etapa puede realizarse en la cocina (a bao mara) o en el horno. Para incubar en el horno
a microondas, basta calentar la mezcla cada hora durante 3 segundos a 1 minuto.
4. Dejar 24 horas en el refrigerador antes de consumir.
5. Analizar el olor, la textura, el color y el sabor del producto obtenido.
4. Medir la acidez inicial de la leche y del yogurt obtenido la acidez proviene del cido
lctico presente en el yogurt, mediante titulacin cido base
5, En una bureta colocar NaOH 0.1 % y en el erlemeyer colocar 30 g de yogurt obtenido y
en otro matraz 30 g de leche utilizada como insumo. Colocar a cada matraz 2 gotas de
fenolftalena, anotar el gasto de NaOH y calcular el % de acido lctico.
% de acido lctico = N NaOH x ml de NaOH x 0.060 x 100/ g. de la muestra
El producto debe alcanzar una acidez entre 0.8 y 1.4 % de cido lctico y un pH entre 3.5 y
4.6.
23
IV. RESULTADOS
Realice un diagrama de flujo del procedimiento, indicando los indicadores de su
fermentacin
24
V. CUESTIONARIO
1. Por qu se pasteuriza previamente la leche explique 4 razones
2. Qu cambios bioqumicos ocurre durante l a fermentacin lctica
3. Cules son los microorganismos que utilizamos en el proceso fermentativo
4. Cules son los sustratos utilizables en los microorganismos

1. Plummer DT. 1981. Bioqumica prctica. Edit. Mc Graw Hill, Bogot,
Colombia. 345 p.
2. Rawn M. Bioqumica. Madrid McGraw- Hill .Interamericana. Espaa
2003.
3. Robinson David. Bioqumica y valor nutritivo de los alimentos. 2da
edicin. Editorial Acribia 1991. Zaragoza
25
PRCTICA 06
CAMBIOS BIOQUMICOS DURANTE LA FERMENTACIN DE

UNA BEBIDA A BASE DE MAZ.
I. OBJETIVO:
1. Elaborar una bebida a partir de maz de jora (maz germinado)
2. Demostrar las cualidades organolpticas y bioqumicas de la bebida.
II. INTRODUCCIN
Bioqumica de la fermentacin de cereales germinados

Todos los hetertrofos obtienen fundamentalmente su energa de las reacciones de
oxidacin - reduccin, es decir, aquellas en las que los electrones son transferidos
desde un compuesto, el dador electrnico, o agente reductor, a un aceptor
electrnico, el agente oxidante. La fermentacin es una de las diversas rutas
catablicas mediante las cuales muchos organismos obtienen energa qumica de
varios combustibles orgnicos en ausencia de oxigeno molecular o, de una manera ms
general, cualquier compuesto inorgnico oxidado. Las levaduras pueden obtener la
energa que les es necesaria para vivir, siguiendo dos vas en la transformacin de los
azcares del mosto, la respiracin y la fermentacin . La Respiracin es la va oxidativa
de los combustibles orgnicos por el oxigeno molecular; el oxigeno acta, por

tanto, como el aceptor electrnico final en la respiracin.
C6H12O6 + 6O2 + 36Pi + 36ADP 6CO2 + 42H2O + 36ATP

En la Fermentacin ocurre una degradacin incompleta de los azcares hasta CO2
y etanol. Los electrones pasan desde un intermediario orgnico producido en la
degradacin del azcar, el dador electrnico, hasta otro intermediario orgnico,
que acta como aceptor electrnico. Este proceso libera muy poca energa; por
ello, las levaduras al utilizar esta va deben transformar mucho azcar en alcohol
para cubrir sus necesidades energticas.
C6H12O6 + 2 ADP + 2 Pi 2CH3-CH2OH + 2 CO2 + 2 ATP Independientemente de

la va utilizada, la principal ruta bioqumica en la degradacin de los azcares es la
gluclisis, a travs de la cual la glucosa se transforma en cido pirvico.
C6H12O6 + 2ADP + 2Pi + 2NAD+ 2piruvato+ 2NADH +2H+ + 2H2O + 2 ATP

26
Fermentacin alcohlica
En la fermentacin alcohlica se pueden distinguir dos etapas.
1 etapa: Las levaduras degradan algunas molculas de azcar.
por va respiratoria: el metabolismo sigue la ruta de la gliclisis, pasando el cido
pirvico formado al ciclo de Krebs con una elevada produccin de energa, que
permite una rpida multiplicacin de las levaduras alcanzando una gran biomasa.
Esta etapa se mantiene hasta agotar el oxgeno disuelto en el mosto. Una vez
agotado el oxgeno, las levaduras comienzan a seguir la va fermentativa.
2 etapa: En la ruta fermentativa, el cido pirvico formado en la gliclisis se
descarboxila a acetaldehdo y ste a su vez, se reduce posteriormente, a etanol
(Epifanio Fernndez) .Pero no todas las molculas de azcares del mosto van a seguir
la ruta de la glucolisis hasta la obtencin de etanol y anhdrido carbnico, sino que
dependiendo del propio metabolismo de las levaduras, una parte de los azcares
son degradados mediante la fermentacin gliceropirvica (figura 1), en la que
adems de glicerina se forma cido pirvico: este compuesto ser el origen de los
diferentes productos secundarios de la fermentacin alcohlica tales como: cido
succnico, cido actico, cido lctico, los metabolitos del ciclo diacetilo -
acetonico, etc. [Epifanio Fernndez].
Tambin se produce la transformacin de materia nitrogenada y
compuestos azufrados, necesarios para el mantenimiento de las estructuras
celulares y la multiplicacin de las levaduras. Los principales productos del
metabolismo nitrogenado de las levaduras en los producto fermentados son
los alcoholes superiores como el isobutanol, los alcoholes amlicos o el 2-
feniletanol, que junto con sus steres contribuyen a la calidad
organolptica de los productos fermentados como el vino (figura 2),
aunque alguno de estos alcoholes superiores provenga como el caso del
npropanol del metabolismo glucdico. Los compuestos azufrados se utilizan
en los procesos de biosntesis de aminocidos, protenas y vitaminas
necesarios para la multiplicacin de las levaduras. Este metabolismo
azufrado puede producir compuestos como el cido sulfhdrico o los
mercaptanos que afectan negativamente a las caractersticas
organolpticas de los productos fermentados, y cuya formacin va ligada
a la necesidad de la levadura de sintetizar aminocidos azufrados. Todos
27
estos procesos bioqumicos quedaran englobados en lo que denominamos

fermentacin alcohlica [Epifanio Fernndez].
Fig. 1 Fermentacin alcohlica y gliceropirvica
Fig 2. Formacin de los compuestos aromticos en las levaduras

NECESIDADES NUTRICIONALES
28
Las levaduras utilizan los compuestos carbonados como fuente de energa y como
fuente de carbono. Solo unos pocos glcidos, principalmente hexosas, los
disacridos y trisacaridos pueden ser fermentados por estos microorganismos, pero
el rango de compuestos que pueden asimilar es mucho ms amplio incluyendo
pentosas, alcoholes, cidos orgnicos, aminocidos y glucsidos. Las fuentes
comunes de nitrgeno utilizadas por las levaduras son amonio, urea y aminocidos.
Muchas especies sintetizan todas las vitaminas necesarias pero otras requieren
biotina y otros compuestos como tiamina y adenina. Tambin requieren fsforo,
azufre, potasio, magnesio, zinc, calcio entre otros componentes. El fsforo en forma
de iones fosfato (PO4 -3) regula la sntesis de los lpidos y los glcidos. El potasio
estimula la fermentacin y la respiracin a pH cido consumiendo dos veces ms
de potasio en la fermentacin que en la respiracin. El magnesio y zinc actan
como cofactor de enzimas. El calcio mantiene la integridad celular a nivel de las
membranas en entornos hostiles.
CRECIMIENTO DE LAS LEVADURAS DURANTE LA FERMENTACIN ALCOHLICA:

Crecimiento y fermentacin alcohlica estn ntimamente relacionados, ya que
durante la fermentacin se da un paralelismo entre la desaparicin del azcar y la
evolucin de la poblacin de levaduras en el tiempo. La pauta de crecimiento de
las levaduras durante la fermentacin alcohlica es similar al ciclo de crecimiento
clsico de microorganismos, pero prcticamente se reduce a tres fases (figura 2.8):
fase de crecimiento con multiplicacin activa de las levaduras, fase estacionaria,
donde se mantiene la viabilidad de las levaduras presentes, pero no hay
multiplicacin y fase de declive, donde comienza la mortandad celular y

avanza paulatinamente.
Fig. 3 Crecimiento de las levaduras durante la fermentacin alcohlica
29
FACTORES QUE AFECTAN AL DESARROLLO DE LA FERMENTACIN ALCOHLICA

La fermentacin alcohlica del mosto es el resultado de un conjunto de variables que
pueden integrarse en tres categoras: composicin del mosto, microflora asociada al
proceso y tecnologa de procesamiento
PROCESO DE ELABORACION DE LA CHICHA
1. Malteado del maz Esta operacin consiste en la germinacin del maz y secado de los
granos para dar lugar al producto final llamado jora. Este proceso tiene por objeto
degradar el endospermo por las enzimas propias del maz. (Hough S)
2. Molienda La molienda tiene por objeto triturar la jora para que las partculas del mismo
se hidraten de modo que liberen fcilmente sus sustratos y as producir el mosto de jora.
El tamao de la partcula deber sopesar entre la facilidad de liberacin del extracto y
la facilidad de recuperar el mosto [5].
3. Coccin Esta operacin tiene por objeto extraer al mximo los compuestos solubles de
la jora y para ello se realiza una coccin que va de 6 a 24 horas. Se utiliza de 3 L a 10 L
de agua por cada kg de jora. (De Florio Ramrez E.)
4. Filtracin Esta operacin tiene por objeto de separar el bagazo del mosto. Se realiza por
lo general empleando un cedazo.
5. Fermentacin Para la fermentacin se deja el mosto en cantaros de arcilla en donde se
produce la inoculacin de microorganismos de manera natural ya que estos
microorganismos se encuentran en las
Beneficios saludables Favorece la eliminacin de lquidos y la disminucin de la presin
arterial alta. Se activa la microflora lctica.
30
Tabla 2 Composicin qumica de la chicha de

jora
MATERIALES Y REACTIVOS
1. 400 g Maz de jora
2. Agua
3. 01 Olla de 2 litros
4. 01 Cucharon de madera, 4 cucharas de plstico
5. 1 botella limpia y secas de (tipo botella de 750 ml con tapa corcho)
6. Gasa
7. Embudo vidrio
8. Papel Kraft 1 pliego y 6 ligas, 03 bolsas de polietileno limpias
9. Tijera
10. Guantes,
11. Balanza de medida de 100 g a 200 g
12. Beacker de 50 ml
13. Cocinilla
14. Cuatro frascos de vidrio ambar de 100 ml
15. 03 Matraz Erlemeyer de 250 ml
16. Buretas
17. Cintas de pH
18. Solucin de NaOH 0.05 N
19. Bagetas
20. Probeta de 100 ml
21. Etiquetas 7
22. Plumn marcador
23. Goteros de plstico con medida
24. Fenolftalena
25. Calculadora
26. Toallas de limpieza
31
27. Guantes y gorro

28. Colador
PROCEDIMIENTO
1. Hacer hervir 2 L de agua en una olla
2. Lavar los cereales con ayuda de un colador
3. Luego aadir 150 g de de maz de jora, 80 g de cebada tostada
4. Agregar, luego clavo de olor, canela y pimienta de chapa.
5. Dejarlo en coccin hasta que se reduzca la mitad de su volumen.
6. Colocar el filtrado en una botella de vidrio hasta de su volumen.
7. Luego colocar 3 cucharadas de azcar rubia y disolver.
8. Envolver con tres capas de papel Kraft a temperatura ambiente.
Retirar aprox 50 a 100 ml con este volumen Muestra UNO
Hacer los siguientes ensayos
Medir el pH,
Acidez titulable
Grado alcohlico.
Azcares reductores
9. Despus de 48 horas, retirar aprox. 50 a 100 ml del filtrado y colocarlo en
un frasco (Muestra DOS) y almacenarlo en refrigeracin. Limpiar la boca de
la botella con papel toalla y colocar el tapn de corcho
10. Hasta completar un tiempo de incubacin de 70 horas. Luego de all
colocarlo en refrigeracin ( Muestra TRES) Cumplido el tiempo de
fermentacin la actividad enzimtica se detiene manteniendo en
refrigeracin a 5 C. cubierto en una botella
11. Las muestra uno y dos y tres
IV. RESULTADOS
Muestra uno
N de pH Acidez Grado Azucares
muestra titulable alcohlico reductores
mEq de g/ ml de
acidez en chicha de
Ac. jora
actico
1
2
3
4
Muestra dos
32
mEq de g/ ml de
acidez chicha de jora
1
2
3
Muestra tres
mEq de g/ ml de
acidez en chicha de jora
Ac.
actico
1
2
3
Preguntas.
1. De qu manera expreso la actividad enzimtica, desarrollada por las enzimas

presentes en las levaduras
2. Cules son las pruebas bioqumicas que realizaste para evaluar el seguimiento
del proceso de fermentacin.
3. Esquematice los procesos tecnolgicos.
CONCLUSIONES
V. CUESTIONARIO
1. Seale 4 diferencias entre fermentacin, digestin y respiracin celular.
2. Describe 2 clases fermentaciones artesanales propias de la amazonia y la zona
andina indicando los insumos principales, tiempo, muestra de enzimas, matriz
del alimento y las pruebas para evaluar el avance de la fermentacin.
33
3. Supongamos que ha elaborado un vino con un contenido alcohlico del 10 %

p/v (10g de alcohol por 100 ml d vino) Qu concentracin molar de glucosa
tendra que haber contenido la mezcla de fermentacin inicial para generar
esa cantidad de etanol?
4. Qu entiende por mosto.
5. Cules son las diferencias en el contenido de cereales existe entre un
germinado y otro no germinado.
6. Realice un flujograma de la elaboracin de la chicha de jora, indicando los
procesos efectuados.

Zaragoza-Espaa.2000.
2. De Florio Ramrez E. Estudio de la fermentacin de chicha de jora. [Tesis pre
grado]. Tacna: Facultad de Ingeniera en Industrias Alimentarias, Universidad
Nacional Jorge Basadre; 1986.
3. Hough S. Biotecnologa de la cerveza y de la malta. Zaragoza: Acribia S.A.;
1990.
4. Manrique Senz I. Flora microbiana de la chicha de jora. [Tesis pre grado]. Lima:
Facultad de farmacia y bioqumica, Universidad Nacional Mayor de San Marcos;
1978.
5. Epifanio Fernndez S. Influencia de la tecnologa de vinificacin en la
microbiologa y el desarrollo de la fermentacin alcohlica. [Tesis doctoral].
Rioja: Universidad de la Rioja; 2005.
PRCTICA 07
EVALUACIN DE LAS ENZIMAS OXIDO REDUCTASAS EN MATERIAL

BIOLGICO
I. OBJETIVO
Evaluar la accin cataltica de las oxido reductasas en diferentes muestras

biolgicas.
II. INTRODUCCIN
En el organismo vivo el fenmeno de la oxidoreduccin cumple uno de los papeles ms

importantes de proveer energa. Las enzimas que catalizan estas reacciones se denominan
oxidoreductasa; un grupo importante son las deshidrogenasas y las reductasas. El sustrato que
34
se oxida se considera como donador de H o electrones, y aceptor pueden ser sustancias

naturales (Coenzima, NAD, FAD, etc.)
Las Oxidasas catalizan la oxidacin de un sustrato sin incorporar el oxgeno del O 2 al producto.
Generalmente se produce una oxidacin de 2 electrones con el que el oxgeno se convierte
en H2O2. La mayora de las oxidasas utilizan un metal o coenzima de flavina.
Las oxigenasas incorporan tomos de oxigeno del O 2 a los productos oxidados, existen dos
clases, las monooxigenasa y las dioxigenasas. Tanto las oxigenasas y oxidasas utilizan al O 2
como sustrato.
La peroxidasa cataliza el H2O2 en calidad de aceptor y catalasa, el enzima que cataliza las
reacciones donde el par donador-aceptor lo constituyen dos molculas de H2O2.
Tubos de ensayo
2 Pipetas de 1 mL y 5 mL
Propipeta
Gradilla
Matraz aforado
Agua destilada
Azul de metileno
Formaldehido
Guayacol
Solucin de H2O2
Higado de pollo
Leche de establo
Leche pasteurizada
Papa
IV. PROCEDIMIENTO
a) PRUEBA DE LA LACTOPEROXIDASA
La lactoperoxidasa pertenece al grupo de enzimas de las peroxidasas, que junto con

la catalasa y el perxido dismutasa reducen el perxido de hidrgeno gracias a una
variedad de donantes de electrones y protegen a las clulas del metabolismo txico
del oxgeno. Las peroxidasas estn ampliamente distribuidas en los tejidos de los
mamferos.
La lactoperoxidasa se inactiva parcialmente por pasteurizacin corta a 74C y se

inactiva totalmente si se calienta durante 15 minutos a 75C, sin embargo si se calienta
15 segundos a 80C slo se reduce su actividad en un 40%. La lactoperoxidasa resiste
la acidez hasta un pH igual a 3 y la accin proteoltica del jugo gstrico.
La peroxidasa cataliza la oxidacin de ciertos compuestos dadores de hidrogeno,

como fenoles (guayacol, pirogalol) y aminas aromticas (o-fenilenamina) por medio
35
de perxidos (H2O2). El sustrato ms usado es el guayacol que es oxidado a un

complejo coloreado de tetraguayacol en presencia de peroxidasa.
Curso de la determinacin:
1. Medir 3 mL de leche, luego agregar 2 mL de guayacol lquido al 1% en mezcla de
agua y etanol (1+1).
2. Aadir 3 gotas de agua oxigenada y mezclar. Dejar reposar por 5 minutos.
3. Observar el color rojizo o salmn en la leche cruda o si el color es reducida indica
deficiente pasteurizacin.
a) PRUEBA DE LA PEROXIDASA
Las peroxidasas corresponden a un grupo de enzimas de las oxido reductasas, se

encuentran en muchos productos de origen vegetal que contribuye al oscurecimiento
enzimtico de alimentos. La prueba de la peroxidasa es la que se utiliza para ver la
efectividad del escaldado debido a la gran resistencia trmica y consiste en aadir
guayacol y Fe al alimento; si la enzima no se inactiv durante el tratamiento trmico
se produce una coloracin que se debe a la polimerizacin de cuatro molculas de
guayacol.
1. En una placa Petri colocar una rodaja de papa recin cortada.
2. Luego aadir 5 gotas de solucin de guayacol y una gota de perxido de
hidrgeno.
3. Observar las coloraciones caractersticas.
36
b) PRUEBA DE LA ALDEHIDO-REDUCTASA
La enzima causante es la xantino-O-aldehido deshidrogenasa, que cataliza la

oxidacin de xantina y de diversos aldehdos a cido rico y los respectivos cidos
carbnicos; se trata de una flavoproteina con molibdeno. La reaccin se basa en que
la deshidrogenasa, en presencia de HCHO, decolora al azul de metileno como
aceptor de H. Se emplea el azul de metileno para evidenciar la actividad de la
deshidrogenasa. Este colorante recibe los protones y electrones provenientes del cual
pasa de su forma oxidada (azul) a la forma reducida (incolora).
1. En 2 tubos de ensayo rotular tubo A y tubo B, en ambos colocar 5 mL de leche.
2. Al tubo A aadir 1mL de agua y al tubo B 1 mL de formaldehido.
3. A ambos tubos agregar 1 mL de azul de metileno.
4. Cubrir con papel parafilm (proteger la mezcla del contacto con el oxgeno del aire).
5. Colocar los tubos en bao de agua a 37 C. Despus de 5 a 10 minutos comparar
el cambio de coloracin en ambas muestras. Luego de agitar fuertemente el tubo
de ensayo, nuevamente observar la variacin de color.
37
c) PRUEBA DE LA CATALASA
La catalasa es una hemoproteina, tiene como funcin la destruccin del H 2O2, cataliza
la siguiente reaccin:
2 H2O2 -----------> 2 H2O + O2
1. Colocar en un mortero 0.3 g de homogenizado de hgado de pollo fresco.
2. Aada 5 gotas de agua oxigenada en el mortero. Tome el tiempo inicial al aadir
el agua oxigenada y el tiempo final de producirse las burbujas.
V. REPORTE DE RESULTADOS
38
VI. CUESTIONARIO
1. Realice las ecuaciones de cada uno de los experimentos.

2. Mencione cinco propiedades bioqumicas de la lactoperoxidasa.
3. Realice una tabla donde incluya 4 enzimas de tipo oxidasas y otra de tipo
fosfatasas con los alimentos que lo contienen.
4. Realice la ecuacin qumica del lactato reductasa.
VII REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Zamora Espitia. Mtodos selectos de bioqumica experimental. Univ.
nacional de Colombia. 1 edicin. 2012
2. Campbell Bioqumica 6ta edicin, Editorial Cengare Learning, 2009, Mxico.
3. Feduchi, Blasco, Romero, Yaez. Bioqumica Conceptos esenciales. Editorial

Moderno. 1 edicin. 2011.
PRCTICA 08
EVALUACIN DE EMULSIFICANTES DE LA DIGESTIN Y EN LA

INDUSTRIA
I. OBJETIVOS
1. Evaluar el comportamiento de los emulgentes
II. INTRODUCCIN
Las emulsiones se obtienen agitando una mezcla de los dos lquidos inmiscibles, de manera
que se formen gotitas de la fase dispersa. Una emulsin simple se rompe por coalescencia
39
de las gotas dispersas para formar una capa que flota en la superficie o sedimenta en el
fondo del recipiente en que se encuentra.
Las emulsiones alimenticias son sistemas complejos cuya estabilidad est determinada por
muchos parmetros Aun cuando se han realizado progresos en la compresin de los
fenmenos involucrados en la estabilizacin de emulsiones, la prediccin del
comportamiento de estos sistemas es todava muy difcil.
La actividad emulsificante de protenas y tensoactivos se ve afectada por las propiedades
del medio: concentracin, solubilidad y fuerza inica. La actividad emulsificante entonces
no es una propiedad exclusiva del emulsificante sino de todo el sistema de emulsin. Son
muchos los casos en los que no se conoce exactamente como un emulsificante afecta el
rea interfacial. Una emulsin debe mantenerse constante su rea interfacial para
conserva su estabilidad.
La estabilidad de la emulsin mejora con la presencia de sustancias cuyas molculas tienen

regiones polares y apolares como los fosfolpidos, protenas, sales biliares (taurocolato de
sodio, desoxiglicocolato de sodio, etc)
Los fosfolpidos contienen grupos hidrfilos lo representan tanto los grupos fosfato (cargados
negativamente al pH normal encontrado en los alimentos)
Para que la grasa sea digerida en el ID debe ser emulsificada por las sales biliares, derivados
del cido clico. El taurocolato sdico constituye un ejemplo de esta sal. Las sales biliares
se requieren para una absorcin eficiente de las vitamina liposolubles
La bilis no contiene enzimas digestivas, sin embargo, contiene grandes cantidades de sales
biliares as como un fosfolpido importantes en el proceso de emulsificacin. Este proceso
hace que las gotas de grasa reduzcan su tensin superficial, y al ser agitadas en el intestino
delgado se fragmenten fcilmente. Este es el mismo principio utilizado en las sustancias
detergentes para remover la grasa. Las micelas son gotas esfricas y cilndricas de tres a
seis nanmetros de dimetro compuestas de 20 a 40 molculas de sales biliares. Las
micelas actan tambin como un medio de transporte de cidos grasos libres y
monoglicridos para su posterior absorcin en el borde en cepillo de las clulas epiteliales
intestinales.
40
En los alimentos, el emulgente tradicional es la yema de huevo. /

En las soluciones acuosas las molculas anfipticas como los jabones y
detergentes forman micelas (agregados cuyos grupos hidrocarbonados se encuentran
fuera de contacto con el agua)
Esta disposicin molecular elimina los contactos desfavorables entre el agua
y las colas hidrfobas de los anfipticos, pero permite la solvatacin de los grupos cabeza
polares.El dimetro de las micelas depende de la longitud de las colas.
Las micelas esferoidales compuestas por muchas ms molculas de lpidos
que el nmero ptimo tendrn un centro lleno de agua desfavorable, estas micelas
podran aplanarse y ser inestables.
Tubos de prueba, matraz erlemeyer, embudos, beacker, probeta, bagueta,

pipetas, bombillas. Goteros, pinzas, gradillas, bombillas baguetas. Picetas, frascos
Monooleato de polioxietilensorbitan (Tween 80), aceite vegetal, jabn
pulverizado, dodecilsulfato de sodio, vinagre, bicarbonato de sodio, sales biliares, lecitina,
agua destilada, lecitina, sal, pimienta, SDS, aceite, leche y aceite de oliva, acido oleico
EXPERIMENTO: PODER ESTABILIZANTE RELATIVO

PROCEDIMIENTO
1. Colocar 8 tubos de ensayos en una gradilla y rotular los tubos.
2. En cada tubo poner 1 ml de agua y 1 ml de vinagre (los tubos 4, 6, 7 y 8 solo contiene
agua y no vinagre)
3. Aadir en cada tubo cantidades iguales de uno de los siguientes compuestos como
esta en el cuadro 1:
4. Despus agitar con ayuda de una bagueta si fuera necesario
5. Luego aadir 5 gotas de aceite vegetal a cada tubo agita uniformemente por 2
minutos. Colocar por 5 minutos a 37C Observar la formacin de micelas en la zona de
interface
6. Observar la velocidad (anotar el tiempo) con que se rompen las emulsiones.
Observar si se destruida la estabilidad de la emulsin

Tubos Emulsificante Tiempo de Formacin de micelas
estabilidad
segundos
1 500 mg de sales
biliares
41
2 Mitad de yema
de huevo
3 500 mg de
NaHCO3 +
lecitina
4 Clara de huevo
5 2 g de lecitina
6 200 mg de tween
80
7 500 mg de
detergente
8 1 g de jabn
Presencia de micelas mediante cruces
V.CUESTIONARIO
1. Explique de qu manera funcione los emulsificantes empleados en el experimento.
2. Cul es la composicin qumica porcentual de la yema de huevo y la bilis?
3. Esquematice la sntesis de los cidos biliares
4. Por qu se llevaron los tubos de ensayo a temperatura de 37C?
5. Esquematice la estructura de la lecitina, dodecilsulfato de sodio y los
acilgliceroles?
6. Qu sustancias se usan para mantener la emulsin en la tecnologa
alimentaria?
7. Las protenas pueden actuar como emulsificantes?
VI. REFERENCIAS BILBIOGRFICAS

1. Coultate T.P. Manual de qumica y bioqumica de los alimentos Editorial
Acribia, 3 edicin 2007
2. Temas debioquimica.wordpress.com/tag/sales-biliares/2015-abril.
3. Donald Voet, Judith G. Voet Bioqumica, Medica Panamericana.2006
4. Qumica: un proyecto de la American Chemical Societ. Editorial El Libro
PRCTICA 09
HIDRLISIS DE LAS GRASAS POR ACCIN DE LA LIPASA

PANCRETICA
42
I. OBJETIVO
Determinar la actividad de la lipasa pancretica mediante la formacin de

cidos grasos libres por titulacin.
II. INTRODUCCIN
En el organismo de los animales casi todos los lpidos se encuentran en

complejo con las protenas, los carbohidratos y otras sustancias, en realidad los
lpidos rara vez se encuentran en estado libre. Los mamferos los acumulan en
forma de grasa, los peces en forma de ceras y en las plantas se almacenan en
forma de aceites que adicionalmente tienen funciones de proteccin y proveen
aromas y sabores caractersticos.
Los acilgliceroles (constituido por una molcula de glicerol y cidos

grasos) pueden existir como monoacilglicridos, diacilglicroles y
triacilglicridos (TAG) En los alimentos los ms comunes son los TAG, los otros son
usados como aditivo por sus propiedades emulgentes.
La presencia de cidos grasos en la estructura de los lpidos determina

sus propiedades. Aunque se considera que no todos los lpidos tienen cidos
grasos, s tienen por lo menos alguno de sus derivados.
Los trminos grasas y lpidos no pueden ser usados indistintamente, ya

que al hablar de grasas se refieren a un tipo especial de lpidos: Los
triacilgliceroles, que generalmente son slidos a temperatura ambiente y
constituyen la principal reserva energtica en algunos organismos.
Los cidos grasos naturales poseen un nmero par de tomos de

carbono, producto del mecanismo de biosntesis, iniciada a partir AcetilCoA.
Su nmero de tomos de C varia de 4 (cido butrico de lpido de la leche) a
38 (ceras)
Los acilgliceroles se hidrolizan para formar glicerol libre y los cidos

grasos que los constituyen; en las clulas, las enzimas llamadas Lipasas
realizan la hidrlisis; sta hidrlisis catalizada por lipasas se caracteriza por
cierto grado de especificidad, de modo que las distintas lipasas actan de
modo preferencial sobre diferentes enlaces ster.
La enzima principal de la hidrlisis de los TAG es la lipasa pancretica, que

prefiere cidos grasos de cadena larga de ms de 10 tomos de carbono;
hidroliza a los TAG en diacilgliceroles, liberando el cido graso de la posicin 1
43
3 del glicerol. Los diacilgliceroles son hidrolizados rpidamente hasta glicerol

y cidos grasos libres. Los productos son cidos grasos libres (AGL) o
2-monoacilglicero (2-MAG). Este ltimo puede ser hidrolizado por medio de la
transferencia del grupo acilo en posicin 2 hacia la posicin 1 o 3 por medio de
las ismeras lipasa y ser finalmente hidrolizado a glicerol y AGL
La lipasa pancretica es un polipptido de 449 aminocidos y PM de

50,000 daltons que hidroliza los enlaces ster en posicin 1 y 3 de los
triacilglicridos.
La accin conjunta de las enzimas pancreticas y de las sales biliares

lleva a la formacin de micelas, que progresivamente se enriquecen en
productos hidrolticos ms polares que sus precursores. La velocidad de
absorcin de los cidos grasos depende de la longitud de su cadena (nmero
de tomos de carbono) y de su grado de saturacin. As, los insaturados de
cadena larga son absorbidos ms eficazmente que los saturados.
Fundamento
La actividad de la enzima se evala midiendo los cidos grasos libres que se

liberaron en el curso de la hidrlisis de la grasa por accin de la lipasa
pancretica.
La concentracin de los cidos grasos libres se determina mediante la titulacin
con NaOH 0,05N.
La accin de lipasa se ve potenciada por las sales biliares que al emulsificar las
grasa las transforma en pequeas micelas
Aceite, buffer fosfato 0.1 M pH 8, sales biliares, lecitina y glicerol, pancreatina

1%
Bureta, probeta, tubos de ensayo, gradilla, vasos de 50 mL, pipetas, bombillas,
papel parafina, Balanza analtica, bao mara.
IV. PROCEDIMIENTO
HIDROLISIS DE LAS GRASAS POR ACCION DE LA LIPASA
Tubos 1 Sales 2 blanco 3 Sin sales 4 blanco

Aceite ml 1 - 1 -
44
Buffer fosfato 0.1

- - 2 2
M pH 8, ml
Sales biliares en
- 2 - -
buffer, ml
Agua destilada, ml 2 3 2 3
El color rosa del aceite no debe desaparecer en caso contrario, agregar

NaOH 0,05N hasta que aparezca el color (Slo a los tubos 1, 2 y 3).
Agregar 5 ml de pancreatina 1% a cada tubo (los 5). La Pancreatina es un
extracto de enzimas que contiene a la Lipasa pancretica. Incubar por 45
minutos a 370C. Agitar por 15 ser cada 10 minutos.
Titular cada tubo con NaOH 0,05N hasta coloracin ligeramente rosa, anotar el
gasto en ml, agitar constantemente durante la titulacin.
Reactivos
5 mL de Aceite 5 mL de Buffer Sales biliares en Lecitina / Aceite

fosfato 0,1 M PH 8 Buffer
Tubo de ensayo 1 Sales

45 Agua
Sales biliares en
Aceite destilada
buffer
Tubo de ensayo 2
Sales biliares en Agua destilada
Blanco
buffer
2 mL de Sales biliares 5 mL de Sales biliares en

en buffer buffer + agua destilada
Tubo de ensayo 3
Sin sales Aceite Buffer fosfato Agua destilada
0,1M PH 8
46
Tubo de ensayo 4
Blanco Buffer fosfato Agua destilada
0,1M PH 8
2 mL de Buffer 5 mL de Buffer
fosfato 0,1M PH 8 fosfato 0,1M PH 8
+ agua destilada
Adherencia de
Pancreatina al 1%
Pancreatina al 1%
(Lipasa Pancretica)
4 Tubos de ensayo 4 Tubos de ensayo con 10 mL

conIncubacin y
5 mL de mezclas de mezclas + 5 mL de
Agitamiento Pancreatina al 1%
47
Agitar por 15 seg cada Incubar por 45 minutos
10 minutos a 37C
El color rosado del aceite

NaOH
no debe desaparecer en
0.05 N
caso contrario, agregar
NaOH 0,05 N hasta que
aparezca el color
Tubos 1, 2 y 3 Color Rosado

No desaparece
Titulacin de
los 5 tubos
NaOH 0,05 N NaOH 0,05 N
10 mL de las mezclas
Mezcla titulada
Coloracin Transparent
Coloracin Rosada
V. RESULTADOS
Clculos: Los gastos en ml de NaOH 0.05 N
48
Gasto Con sales Gasto Gasto

Sin sales
Ml biliares ml ml
Tubo 1 Tubo 3 Tubo 5
Tubo 2 Tubo 4 Tubo 4
gasto gasto gasto
1. Determinar la concentracin de los AGL en funcin de la acidez:
1.1 Miliequivalentes de Acidez con sales biliares = gasto x 0.05 N
1.2 Miliequivales Acidez sin sales biliares = gasto x 0.05 N
4. Cul de los tubos presento mayor actividad enzimtica?
5. Mencione cinco propiedades de la lipasa pancretica
6. Que funcin cumplieron las sales biliares
7. Por qu se neutralizo el aceite utilizado en la prctica?
8. Cul fue la utilidad de la fenolftalena?
VII. CUESTIONARIO
1. Esquematice la estructura de un triestearina y tripalmitina.
2. Cules son los productos liberados por accin de la lipasa pancretica?
49
3. Cules son los cidos grasos poliinsaturados, monoinsaturados y saturados

presentes en los alimentos.
4. Cules son las enzimas que digieren las grasas en el sistema digestivo de un
mamfero? Indique la funcin de cada una.
5. Cite cuatro sales biliares y como intervienen en la emulsificacin de las grasas
VIII. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Zamora Espitia. Mtodos selectos de bioqumica experimental. Univ. nacional

de Colombia. 1 edicin. 2012
2. Campbell Bioqumica 6ta edicin, Editorial Cengare Learning, 2009, Mxico.
3. Feduchi, Blasco, Romero, Yaez. Bioqumica Conceptos esenciales. Editorial

Moderno. 1 edicin. 2011.
PRCTICA 10
50
DETERMINACIN DEL PUNTO ISOELCTRICO DE LA

CASEINA
I. OBJETIVO
Determinar el punto isoelctrico de la casena
II. INTRODUCCIN
Las protenas contiene una secuencia de aminocidos y las cadenas

laterales libres pueden existir en tres formas dependiendo del pH del medio:
catinicos, neutros y aninicos. Cualquier protena tendra una carga neta
positiva si se encuentra en un medio lo suficientemente cido debido a que los
grupos COOH de los aminocidos asprtico y glutmico estaran en su forma
neutra pero los grupos amino de Arginina y Lisina estaran protonados (-NH3+).
De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto
estara cargado negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo
estaran desprotonados (COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra
(NH2). De lo anterior se deduce que las protenas tienen un pH caracterstico al
cual su carga neta es cero.
A este pH se le denomina punto isoelctrico (pI). En el punto isoelctrico
(pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y negativas por lo que la
protena presenta su mxima posibilidad para ser precipitada al disminuir su
solubilidad y facilitar su agregacin.
La casena est formada por alfa (s1), alfa (s2)-casena, beta-casena, y
kappa-casena formando micelas. Ni la alfa ni la beta casena son solubles en la
leche, solas o combinadas. Si se aade la kappa casena a las dos anteriores o
a cada una de ellas por separado se forma un complejo de casena que es
solubilizado en forma de micela. Esta micela est estabilizada por la kappa
casena mientras que las alfa y beta son fosfoprotenas que precipitan en
presencia de iones calcio.
La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6.
El pH de la leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada
negativamente y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la
carga negativa de la superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se
protonan) y la protena neutra precipita.
Las protenas que aparecern en el sobrenadante cuando precipitemos
la casena en medio cido son protenas globulares, hidrofilicas y fcilmente
solubles en agua as como susceptibles de desnaturalizacin por calor. Las
principales son beta lactoglobulina, alfa lactoalbumina, albmina de suero de
bovino (BSA), e inmunoglobulinas (Ig).
La conformacin de la casena es similar a las protenas desnaturalizadas

globulares. El alto nmero de residuos de Prolina en la casena causa un
51
especial plegamiento en la cadena de protena e inhibe la formacin de una

fuerte y ordenada estructura secundaria.
Tubos de prueba. 2 pipetas de 1 mL y de 5 mL, bombilla succionadora

Gradilla
Sol. de acetato y de cido actico
pH metro, Cintas de pH
Matraz aforado,
Calculadora,
Casena
PROCEDIMIENTO
Preparar una gradilla de 9 tubos de ensayo de acuerdo a la siguiente tabla
Tubos 1 2 3 4 5 6 7 8 9
mL de casena 5% 1 1 1 1 1 1 1 1 1
mL de agua 8.4 7.8 8.8 8.5 8.0 7.0 5.0 1.0 7.4
destilada
mL de cido 1
actico 1.0 N .
6
mL de cido 0 0 1 2 4 8
actico 0.1 N . . . . . .
2 5 0 0 0 0
mL de cido 0 1
actico 0.01 N . .
6 2
pH terico
pH experimental
Observa la
precipitacin de la
casena a los 15
minutos (X)
52
Reactivos
Tubo de Ensayo 1
Tubo de Ensayo 2
53
Tubo de Ensayo 3
Tubo de Ensayo 4
Tubo de Ensayo 5
54
Tubo de Ensayo 7
Se agito
suavemente los Tubo de
tubos con Ensayo 8
IV. REFERENCIAS
BIBLIOGRAFICAS
1. Da Zagoya.
Bioqumica.
1 edicin,
Editorial Mc
Tubo de Ensayo 9
55
Graw Hill. 2007. India, p. 490

Zaragoza-Espaa.2000
2003.
4. Robinson David. Bioqumica y valor nutritivo de los alimentos. 2da
edicin. Editorial Acribia 1991. Zaragoza
56
PRCTICA 11
CROMATOGRAFIA DE METABOLITOS SECUNDARIOS DE

VEGETALES
I. Objetivo: Separar e identificar los metablicos de bajo peso molecular un mezcla de

matriz de alimentos
II. Introduccin
La tcnica de separacin de TLC consta de un sistema de dos fases, una solida (fase
estacionaria) que se aplica en forma de capa delgada, absorbente, usualmente de entre
0.1 a 0.25 mm de grueso para fines analticos, pero el grosos puede variar. Esta capa
puede es fijada a una placa o lmina firme de vidrio, aluminio o plstico que acta como
soporte. A travs de la fase estacionaria transita un liquido o solvente (fase mvil o
eluente)
La fase estacionaria
La fase estacionaria es un slido fijo al soporte. El sorbente debe ser inerte, poroso e
insoluble en los solventes usados como fase mvil. Existen diferentes materiales inertes,
pero los ms comunes son la de silica gel y el oxido de aluminio. La utilizacin de soportes
hidrfobos facilita la separacin de compuestos no polares (lpidos, por ejemplo).
El silica gel tambin es llamada como cido silico o kieselgel, es un polvo blanco, poroso
y amorfo, y una que se elimina el agua da luigar a la formacin de un gel. El control de
la temperatura y el pH durante esta etapa es crucial para la calidad del gel formado. Las
partculas coloidales una vez formadas, con la consiguiente condensacin y
encogimiento forma una red tridimensional descrita como un hidrogel. Despus de
lavado y calentamiento un gel poroso y duro es formado, llamado silica gel, el q se usa
para la TLC.
La eficiencia de la silica gel en la separacin est ligada al tamao de la partcula. El
tamao de partcula en TLC tpicamente est entre 5 a 40 um, y entre ms pequeo
sea su valor, es mejor la resolucin. El tamao de poro tambin incide en la buena
separacin, tpicamente se emplean silica gel que desarrolla un tamao de poro de 40-
150 A
VOLUMEN DE MUESTRA APLICAR
Para el desarrollo de la cromatografa, las muestras, en un disolvente adecuado, se
aplican puntualmente con la ayuda de jeringas, micropipetas o capilares en un extremo
de la placa. El volumen de muestra a aplicar es crtico, ya que va a afectar a la resolucin
(separacin de los componentes de una mezcla compleja), y depende de la
57
concentracin del compuesto o compuestos de inters en la muestra. Para soluciones

concentradas bastar una cantidad muy pequea (rango de l) para aplicar suficiente
cantidad de los solutos a separar sin llegar a saturar la capacidad de resolucin de la
placa cromatogrfica. Para soluciones muy diluidas, deber aplicarse un volumen
suficiente (de hasta varios ml) para asegurar una cantidad detectable de soluto o solutos
de inters. En este caso conviene hacer la aplicacin en pequeos volmenes
fraccionarios, no procedindose a una nueva adicin hasta haberse secado totalmente
la precedente (de lo contrario la superficie de aplicacin se hara muy grande, distando
mucho de la situacin ideal de concentracin de la muestra en un solo punto de
aplicacin). Una vez aplicada y seca la muestra, la placa se introduce en un recipiente
cerrado (cmara cromatogrfico)
CAMARA CROMATOGRAFICA
La cmara cromatografa consiste en un recipiente con tapa de cierre hermtico, a este
recipiente se le aade la fase mvil. Que contiene, butanol, cido actico y agua. La
cantidad que se agrega depende de la ubicacin del origen en la placa cromatografa.
El origen est colocado a una altura de o.5 cm, por lo tanto, si el nivel del solvente no
debe llegar hasta el origen, se agregar hasta un nivel de 0.3-0.4 cm de altura. Se tapa y
se deja que el vapor del solvente sature la atmsfera interna del recipiente antes de
introducir la palca cromatografa.
III. MATERIALES Y EQUIPOS.
Etanol absoluto.
Butanol.cido actico glacial. Agua destilada.
Solucin de FeCl3, 5 %,
EQUIPOS Y MATERIALES.
Estufa regulada a 50 C.
Cmara de cromatografa.
Pulverizador.
Secadora de mano.
Tubos de prueba de 13 x100mm.
Pera de decantacin.
Palitos de fosforo, soporte universal, anillo de filtracin, Baguetas, pipetas de 5 ml, 4
capilares
Placas cromatografas de HPTLC
Guantes, tapa boca, cuatro capilar de hematocrito, frascos de tapa boca, fsforos
o encendedor, frascos de plsticos de anlisis con tapa (h= 8 a 10 cm) secador de
cabello. Embudo de separacin, soporte universal, pulverizador.
butanol-cido actico- agua destilada (4-1-5 v/v) estndares de aminocidos,
alimentos que probablemente contengan aminocidos, etanol, ninhidrina la 5 %,
acetona.
IV. PROCEDIMIENTO
58
a. Preparacin de la cmara cromatogrfica:
En una pera de decantacin se mezclan: butanol: cido actico: agua, en la

proporcin de 4: 1: 5 se agita suavemente por rotacin y luego se deposita en una
pera de decantacin, dejarlo por una hora hasta q se separe, usar la fase orgnica, la
micro-cmara, se tapa y se deja en reposo por 15 minutos, o hasta saturacin de la
cmara.
b. Preparacin del soporte.
Se prepara una cromatoplaca de 8 x 2.5 cm, a unos cm del borde se traza con lpiz
una lnea recta. Sobre esta lnea se marcan puntos, a distancia de 0.5 cm, donde se
depositar la muestra problema y los standard.
c. Preparacin
del
Cromatograma
Utilizando un capilar se van depositando en uno y otro de los puntos marcados

, la mezcla de 3 estndares, as como una muestra de material biolgico. Tras
cada aplicacin se seca la mancha.
59
d. Desarrollo del Cromatograma.
El Cromatograma as preparado se introduce en la cmara previamente

saturada, cuidando que el solvente impregne el silica gel, pero no cubra
las gotas de muestras aplicadas. Cuando el solvente ha ascendido hasta
la parte superior de la placa, se saca sta de la cmara, y se seca bien
con un secador.
60
e. Revelado del Cromatograma
A continuacin la cromatoplaca se pulveriza con la solucin de cloruro de

fierro y la solucin de tricloruro de aluminio, y se seca en estufa a 60 C. A
los pocos minutos aparecern las manchas de que se pueden identificar
por su Rf (distancia origen- mancha / distancia origen - frente del
disolvente).
V. RESULTADOS.
Una vez que se revela el Cromatograma, se procede a determinar el Rf de

cada mancha correspondiente al estndar. El Rf permite determinar que
aminocido se muestra en la muestra problema.
VI. CUESTIONARIO
1. Describa como realizara la separacin de los aa. TLC y HPTLC.

2. Cmo investigara la presencia de azucares libres en harina de
maz. que pruebas previas realizaras
3. Describa los metabolitos secundarios en los vegetales
4. Que otros solventes podemos usar separar aminocidos, azcares
simples, alcaloides, flavonoides, antocianinas?
61
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS

2003.
2. Robinson David. Bioqumica y valor nutritivo de los alimentos. 2da edicin.
Editorial Acribia 1991. Zaragoza
Zaragoza-Espaa.200.
62

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FACULTAD DE QUMICA, INGENIERA QUMICA

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La presente edicin de este manual constituye el producto del esfuerzo y

Mara Rosario Calixto Cotos

Control de Calidad de los resultados en el Laboratorio de Bioquimica . 6

Preparacin de soluciones buffer y determinacin de la capacidad

Hidrlisis enzimtica del almidn y el efecto del in

Actividad enzimtica y factores que la afectan 17

Cambios bioqumicos durante la fermentacin de una bebida a base

Evaluacin de las enzimas oxido reductasas en material biolgico. 34

Evaluacin de emulsificantes de la digestin 39

Hidrlisis de las grasas por accin de la lipasa pancretica 42

Determinacin del punto isoelctrico de la casena 50

Cromatografa de metabolitos secundarios de vegetales. 56

1. Asistencia. El registro de la asistencia es obligatorio a los alumnos

DESARROLLO DE LA ELABORACION DEL INFORME

El informe se presentar la semana siguiente, al momento de pasar la asistencia los primeros

CONTROL DE CALIDAD DE LOS RESULTADOS EN EL

El control de calidad es un conjunto de reglas y procedimientos que se deben

Error relativo = E abs/ T

La exactitud es el grado de concordancia entre el valor verdadero y el

FACTORES QUE INFLUYEN EN LA EXACTITUD Y PRECISION

Fuente: W-F Pickerring

III. PARTE EXPERIMENTAL

Calculadora, balanza analtica, un racimo de uva negra integro con 12 unidades de

Coeficiente de variacin (CV)

2. Al determinar cinco veces el PM del glutamato deshidrogenasa de plantas, por filtracin

PREPARACIN DE SOLUCIONES BUFFER Y DETERMINACIN DE LA

1. Preparar una solucin buffer y determinar su pH.

b) Por una base dbil y la sal de su cido conjugado; Ejm.

Se puede definir la capacidad amortiguadora de una disolucin reguladora como la

pH = pKa + log [sal conjugada] / [cido]

pH = pKw +pKb - log [sal conjugada] / [base]

La adicin de una pequea cantidad de cido convertir algo de la base en la sal, y

Consideraciones sobre las disoluciones reguladoras

1. El valor de pH de un buffer depende de la proporcin relativa de cido/sal o base/sal;

III. PARTE EXPERIMENTAL

1. Con una pipeta medir 3.5 ml de la disolucin de NaH2PO4 0.2M y colocar en

IV. REPORTE DE RESULTADOS

Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo Tubo 3 Tubo 4

Escriba las reacciones qumicas que se desarrolla en el tubo 2 tanto al adicionar

VI. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

HIDROLISIS ENZIMATICA DEL ALMIDON Y EL EFECTO DEL ION

Determinar el pH ptimo de la -amilasa

Las enzimas aceleran la velocidad de las reacciones metablicas para el proceso de

Un alumno proceder a enjuagarse dos veces la cavidad oral; luego mantendr la

La saliva acumulada se colectar en un beaker dejando caer por gravedad la saliva

b) LA ACTIVIDAD ENZIMATICA DE LA AMILASA SALIVAL

Preparar los siguientes tubos de digestin, rotular.

1. Medir el pH en cada tubo. Anote.

Identificar la presencia de almidn por la aparicin de la coloracin azul oscura.

Solucin de lugol, gotas 2 2 2

IV. REPORTE DE RESULTADOS

Los valores de actividad enzimtica: Se reporta de acuerdo a los colores observados.

ESTUDIO DEL EFECTO DEL pH SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMATICA Y LA ACCION DEL

Profesora: Mg. Rosario Calixto Cotos

1. Qu reactivo proporcion el in activador .

ACTIVIDAD ENZIMTICA Y FACTORES QUE LA AFECTAN

La Actividad Enzimtica se puede expresar como:

Factores que Modifican la Actividad Enzimtica

La ACTIVIDAD ENZIMATICA se demostrar por desaparicin del substrato, o sea la

III. PARTE EXPERIMENTAL