Lucrare de laborator

Determinarea activitii enzimei catalaza

Enzimele oxidoreductaze dup mecanismul de aciune se clasific n trei grupe:

dehidrogenaze anaerobe i aerobe, care sunt enzime transportoare de hidrogen;
citocromi, care sunt enzime transportoare de electroni;
oxidaze, enzime care catalizeaz reaciile de oxidare a substratului cu oxigenul molecular sau
cu oxigenul peroxidic.
Oxidazele se mpart n trei subgrupe:
oxigenaze;
hidroxilaze;
oxidaze transportoare de electroni.

Oxigenazele catalizeaz reaciile de combinare a substratului cu oxigenul molecular (cu

ambii atomi din molecul):
AH + O2 AOOH; sau A + O2 AO2

Hidroxilazele enzime care oxideaz substratul cu formarea concomitent a apei. Un atom

din oxigenul molecular particip la oxidarea substratului, iar alt atom la formarea apei:
AH2 + S + O2 A + SO + H2O
unde: AH2 donator de hidrogen; S substrat; A donor liber; SO substrat oxidat.

Oxidazele transportoare de electroni conin n molecula sa ioni metalici i catalizeaz reacia

de oxidare a substratului cu ajutorul oxigenului atomic. Oxidazele se mpart n dou subgrupe:
cupruoxidaze, enzime care conin cupru, din ele fac parte fenoloxidazele, polifenoloxidazele,
ascorbatoxidaza, tirozinaza etc.;
feroxidaze, enzime care conin fier, din ele fac parte peroxidazele i catalazele.

Peroxidazele sunt enzime ce conin Fe3+. Ele descompun peroxidul de hidrogen (H2O2) numai
n prezena unui acceptor de oxigen sau a unui donor de hidrogen:
H2O2 + A AO + H2O;

H2O2 + AH2 2 H2O + A

Ele sunt larg rspndite n regnul vegetal (mai ales n rdcinile de hrean) i mai puin n cel
animal (lapte, saliv, ficat, leucocite).
Peroxidazele sunt active n struguri n perioada maturrii lor. Temperatura de peste 70 oC i
dozele ridicate de SO2 inactiveaz sau distrug peroxidazele din must i vin.
Catalazele sunt enzime ce conin Fe3+. Se gsesc n toate celulele vegetale, dar pot fi prezente
i n microorganisme, n special n bacteriile acetice. La animale se conin mai mult n snge i ficat.
Catalaza (are proprietatea de a descompune peroxidul de hidrogen (apa oxigenat) n ap i
oxigen molecular. Peroxidul de hidrogen poate fi i donor de oxigen:

1
 catalaza
H2O2 H2O + 1/2 O2
catalaza
2 H2O2 2 H2O + O2

Activitatea catalazei este inhibat de cianuri, hidrogenul sulfurat i fluoruri, i pierde

activitatea funcional la nclzire.
Apa oxigenat se formeaz la etapa final de oxidare biologic, cnd dehidrogenazele
aerobe (flavinice) transmit hidrogenul direct oxigenului atmosferic. Apa oxigenat (H2O2) este
toxic pentru celulele vii.
Preparatele enzimatice de catalaz, obinute din ficat de bovine sau prin sintez microbian,
se utilizeaz n industria alimentar pentru distrugerea H2O2 rmase n urma pasterizrii laptelui.

Principiul metodei

Determinarea activitii catalazei se bazeaz pe evidena apei oxigenate, descompuse de

enzim timp de 30 minute, prin titrarea peroxidului cu permanganat de potasiu 0,1 N:

5 H2O2 + 2 KMnO4 + 4 H2SO4 5 O2 + 2 KHSO4 + 2MnSO4 + 8 H2O

Diferena volumelor de soluie 0,1N KMnO 4 (cm3) a probei de control i probei de lucru,
indic cantitatea apei oxigenate descompuse de enzim.

Ordinea ndeplinirii lucrrii pentru probe solide

Aparate, vase i materiale:

baloane conice 100 cm3 i 250cm3 ;

cilindru de 100 cm3;
mojar cu pistil;
pipete 5, 10 i 20 cm3;
biuret 25 cm3;
soluie 1 % ap oxigenat;
soluie 0,1N KMnO4;
soluie 10 % H2SO4;
probe de produs (fin, cereale, mal).

5 g de produs se infuz timp de 1,5 ore cu 100 cm3 de ap distilat la temperatura camerei n
balon conic de 250 cm3. Suspensia obinut se filtreaz prin hrtie de filtru pliat.
Pentru determinare se iau dou probe cte 20 cm 3 de filtrat limpede. Coninutul probei de
control se fierbe timp de 5 minute pentru inactivarea enzimei. n ambele probe se dozeaz cte 20
cm3 ap distilat i 3 cm3 soluie 1 % peroxid de hidrogen i se las pentru 30 minute la temperatura
de camer. Aciunea enzimei este stopat prin administrarea a 3 cm 3 soluie 10 % de H2SO4, iar
restul de peroxid de hidrogen se titreaz cu soluie 0,1 n de KMnO4.
Diferena volumelor de soluie 0,1n de KMnO 4 (cm3) a probei de control i probei de lucru,
indic activitatea enzimei. Activitatea catalazei poate fi exprimat n mg peroxid de hidrogen sau
cm3 soluie 0,1 n KMnO4 la 1g produs analizat. 1 cm3 soluie 0,1n KMnO4 corespunde 1,7 mg
peroxid de hidrogen.
2
 Activitatea catalazei (Ac) n mg H2O2/g x 30 min se determin dup formula:

(a-b) x 1,7 x 5
Ac =
n
unde:
a volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3;
b volumul soluiei 0,1N KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3;
5 recalcularea la volumul extractului
1,7 mg H2O2 echivalente 1cm3 0,1N KMnO4;
N masa probei, g.

Ordinea ndeplinirii lucrrii pentru probe solide

Aparate, vase i materiale:

soluie 1 % de ap oxigenat, prealabil neutralizat cu soluie 0,1n NaOH;

soluie 0,05 n de KMnO4;
soluie 10 % de H2SO4;
probe de produs (vin, suc).

n 4 baloane conice cu dop rodat de 100 cm 3 se adaug cte 10 cm3 de vin sec. Dou probe
( de control) se fierb 5 minute cu rcitor invers pentru inactivarea enzimei. n dou probe de lucru i
n cele de control se adaug cte 10 cm 3 de ap distilat i cte 3 cm3 soluie 1% de H2O2, preventiv
neutralizat cu soluie 0,1n NaOH i se las n repaus 30 minute la temperatura camerei. Apoi n
toate probele se adaug cte 5 cm3 soluie 10 % H2SO4, se agit bine i se titreaz cu soluie 0,05 n
KMnO4. Titrarea continu pn cnd apare culoare roz stabil 5 secunde.
Activitatea catalazei se exprim prin cantitatea de peroxid, descompus de enzim timp de
30 minute, care se conine n 1 cm3 de vin.
Activitatea catalazei se determin dup formula:
(a-b) x 0,85
Ac =
n
unde: a volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de control, cm3;
b volumul soluiei 0,05 n de KMnO4 pentru titrarea probei de lucru, cm3;
0,85 mg de H2O2 echivalente cu 1cm3 0,05 n de KMnO4;
n volumul vinului analizat, cm3.

ntrebri de control.
1. Caracteristica oxidoreductazelor, oxidazelor.
2. Explicai de ce catalazele se refer la oxidaze.
3. Importana catalazelor i peroxidazelor pentru organismele vii.
4. Descriei metodele de determinare a catalazei n produse solide i lichide.