CAPTULO 1

PROPSITO Y ORGANIZACIN

1.1 Planteamiento del problema

S. typhi causa la fiebre tifoidea en humanos, quienes son sus nicos hospedantes. La
fiebre tifoidea prevalece principalmente en pases en vas de desarrollo, donde
normalmente significa un reto a las autoridades en salud pblica. Hay
aproximadamente 17 millones de casos anuales con casi 600,000 muertes,
principalmente en Asia y frica. Las ms altas incidencias se encuentran en
Indonesia y en algunos puntos del sureste asitico, como Papua Nueva Guinea, en
donde puede alcanzar niveles de 103 por cada 100,000 habitantes. En otros lugares
en Asia la incidencia es menor. Interesantemente, la mayora de los casos en las
regiones de mayor incidencia, se encuentran en nios en edad escolar de 13 a 19 aos
de edad.

En Mxico, la incidencia es cien veces menor a la de Indonesia, o sea de 10 por cada

100,000 habitantes. De hecho, de 1989 a 1993, la incidencia disminuy a la mitad,
coincidiendo con las campaas del sector salud para la prevencin del clera. El
grupo etario ms afectado es el de adultos jvenes, de 19 a 44 aos de edad.
Ciertamente, las diferencias en incidencia y en grupos de edad afectados son
problemas de inters para la epidemiologa, cuya resolucin involucra la mejor
comprensin de los modos de transmisin y sobrevivencia de la bacteria en el
ambiente, el conocimiento ms profundo de la respuesta inmunolgica del
hospedante y de las posibles variaciones genticas entre los aislados clnicos de S.
typhi.

1.2 Propsito de la investigacin

Esta investigacin propone la evaluacin del crecimiento de la bacteria Salmonella

typhi, en medios de origen vegetal (jugo de naranja) y animal (leche) permitiendo as
demostrar e identificar en cul de estos dos medios muestra un crecimiento favorable

1
o en cul se inhibe el mismo. Determinando as de qu origen son los alimentos en
los que se facilita la existencia de esta bacteria y en cules no, a su vez proponer
cules alimentos no son recomendados al adquirir esta enfermedad.

1.3 Objetivo general

Evaluar el crecimiento exponencial de bacterias en medios de cultivo vegetal y
animal jerarquizando cul factor tiene mayor influencia en su ciclo de vida, para as
determinar qu medio enriquece y optimiza la proliferacin de la bacteria.

1.4 Objetivos especficos.

Evidenciar claramente el crecimiento bacteriano en relacin a las diferentes
concentraciones y composicin de cada medio de cultivo (jugo de naranja o leche).

1.5 Justificacin de la investigacin

Es sabido que Salmonella typhi causa fiebre tifoidea en seres humanos. La fiebre
tifoidea es comn en pases en desarrollo, pero menos de 400 casos se notifican en
los Estados Unidos cada ao. La mayora proviene de otros pases en donde la fiebre
tifoidea es comn. Estos factores constituyen un amplio campo de estudio para
determinar:
En qu ambientes del planeta se encuentra.
Qu daos a corto, mediano y largo plazo causa en humanos.
Qu se recomienda y qu se debe evitar para prevenir enfermedades causadas
por S. typhi.
Cmo combatir la bacteria (frmacos, vacunas, tratamientos, etc.).
Resistencia a cualquier tipo de medicamentos especficos contra la bacteria.

Cada uno de los datos que se obtienen del estudio de este organismo, aportan un
sinnmero de beneficios que cambian el panorama en el que la bacteria se observa,
ya que se puede inferir qu medidas y precauciones en higiene utilizar para afrontar
la salmonella para no adquirir alguna enfermedad inducida por la bacteria, y con ello
saber qu es recomendado para evitar contraer su carcter patgeno que afecta
nicamente al humano.

1
1.6 Alcances y limitaciones
Se tiene como alcance principal el que esta investigacin sea difundida a diferentes
niveles acadmicos y al sector salud para tomar precauciones y medidas preventivas
ante qu alimentos recomendar a la dieta de una persona infectada con Salmonella.

La limitacin principal es que la fiebre tifoidea pude adquirirse por muchos factores
como alimentos mal cocinados, personas portadoras, agua o alimentos contaminados,
etc. Dando esto un mayor nmero de variables a tomar en cuenta.

1.7 Tipo de investigacin

Experimental de estudios correlacinales.

Tiene el propsito de medir el grado de relacin que existe entre 2 a ms factores o

variables.
La correlacin puede ser positiva o negativa.

En este caso en especfico se estudia la interaccin entre el crecimiento de bacterias

en base al medio de crecimiento y a su concentracin.

1.8 Hiptesis y diseo del proyecto

Se plantea que el desarrollo de la especie Salmonella typhi est fuertemente
relacionado con los alimentos de origen animal gracias a los compuestos que
proporciona y los cuales favorecen su ptimo crecimiento y supervivencia cuando las
bacterias estn expuestas a este medio.

El diseo del proyecto es de tipo factorial 2 2 con tres replicas, teniendo as dos
factores controlables (medio y concentracin) y dos niveles (jugo/leche y alto/bajo
respectivamente).

1
1.9 Cronograma de actividades

1
 CAPTULO 2
MARCO TERICO

2.1 Salmonella
Salmonella es un bacilo Gram negativo que hace parte de la familia
Enterobacteriaceae, actualmente contempla cerca de 2700 serovares. Con excepcin
de la serovariedad Gallinarum-Pollorum, son mviles gracias a la presencia de
flagelos pertricos (Brunia 2008). Este gnero bacteriano se divide en dos especies:
Salmonella entrica y Salmonella bongori (Grupo V) (Corbun et al 2007),
(Ellermeier & Slauch 2006). Salmonella entrica se subdivide en 6 subespecies como
se observa en la tabla 1 que se presenta a continuacin:

Ministerio de la Proteccin Social, Instituto Nacional de Salud y UERIA

Muchos aislamientos de humanos y animales de sangre caliente se relacionan con la

subespecie I: Salmonella entrica sub entrica; el 99% de las salmonelosis se
relacionan con este grupo (Ellermeier & Slauch, 2006), otras subespecies de
Salmonella entrica y S. bongori se encuentran en el medio ambiente y en animales
de sangre fra (siendo de especial inters los reptiles). En general se estima que
tienen una menor virulencia, pero estudios recientes han sealado nuevos serovares
responsables de brotes (Quirs et al 2007).

Debido a la diversidad de los serovares identificados, la Organizacin Mundial de la

Salud (OMS) han propuesto una clasificacin basada en las combinaciones de los

1
antgenos que posee somtico (O), flagelar (H) y capsular (K), este sistema se
conoce como el Kauffman-White (Braden et al 2007).

Los serovares de Salmonella entrica son normalmente escritos por su nombre corto,
el cual incluye el nombre del serovar, por ejemplo, Salmonella entrica subs entrica
serovar Typhimurium se denota como S. Typhimurium. Adicionalmente, los subtipos
son tiles para conocer la distribucin geogrfica de este microorganismo y estos se
realizan mediante fagos especficos. Esta clasificacin se escribe con nmeros de
fagotipo (PT) o fagotipo definitivo (DT). Los dos trminos son intercambiables en
la literatura y pueden usarse indistintamente (Braden et al, 2007).

Los serovares de Salmonella han evolucionado y se han adaptado a infectar

huspedes especficos (Kingsley & Baumler, 2000), sin embargo, algunos
serovares tales como Typhimurium, pueden infectar muchas especies incluido el
hombre (Callaway et al 2007).

Salmonella Typhi y Salmonella Paratyphi son serovares responsables de causar

fiebres entricas (denominadas fiebre tifoidea y fiebre paratifoidea respectivamente),
estos serovares se han adaptado a los tejidos humanos, difieren sustancialmente de
los otros serovares en su ecologa, por lo que no se incluyen en este perfil (Pokharel
et al, 2006).

2.1.1 Morfologa
Morfologa microscpica: Bacilos.
Tincin: Gramnegativos.
Cpsula: s.
Metabolismo: Anaerobio facultativo.
Hbitat natural: Carne cruda, productos de aves y bebidas contaminadas.
Movilidad: S, por flagelos.
Medios de cultivo: Agar MacConkey, Agar SS (salmonella-shigella).
Modo de infeccin: Ingestin de alimentos y bebidas contaminadas.
Tamao del inculo: 106 UFC (unidades formadoras de colonias)

1
2.1.2 Fisiologa
Temperatura

Salmonella puede crecer entre 7-49C, su crecimiento se ve reducido a < 15C. Al

evaluar la temperatura de este microorganismo, sealan que puede crecer a 5.9 oC, sin
embargo, estos datos no son concluyentes porque dependen del ambiente y el medio
de cultivo donde se inocula. En el caso de la carne de pollo empacada al vaco se ha
observado que Salmonella sobrevive a 3C, pero no se multiplica (Nychas &
Tassou, 1996).

pH

Salmonella crece a un pH que vara entre 4-9, la tolerancia al cido depende del tipo
y tamao del cido al cual se expone el microorganismo, y por factores como la
temperatura y sustancias como los nitritos. Diversos serovares de Salmonella se han
adaptado al pH del ciego en los pollos, favoreciendo de esta manera su colonizacin
(Joeger et al, 2009). Por el pH cercano a la neutralidad que tiene la carne de pollo,
Salmonella no se ve inhibida.

Condiciones atmosfricas

Salmonella se clasifica como anaerobio facultativo. El crecimiento bajo atmsferas

de nitrgeno es ligeramente menor a las condiciones aerbicas. Puede crecer de 8-
11oC con concentraciones de 20-50% de CO2, su crecimiento se ve retardado cuando
hay un 80% de CO2 en el aire.

Ruta metablica: Fermentacin cido mixta

Es caracterstica de la mayora de las enterobacterias. Bacterias como Shigella,

Salmonella y E. coli fermentan las hexosas a travs del piruvato a cido lctico,
cido actico, cido succnico y cido frmico.

1
 http://www.higiene.edu.uy/cefa/2008/FisiologiayMetabolismoBacteriano.pdf

2.1.3 Patogenicidad

Las fuentes de infeccin suelen ser otros animales portadores infectados, pero
tambin otros mamferos, aves, roedores, insectos, el hombre, el agua o el alimento
contaminado y el ambiente (heces, polvo, equipos, suelos mal desinfectados, etc.).

Segn Clarke & Gyles (1993):

La principal puerta de entrada de la Salmonella es la va oral, por contacto

con heces de animales infectados. Resistente al pH del estmago, sales
biliares y peristaltismo, coloniza el intestino delgado e invade los ganglios
linfticos mesentricos, provocando una infeccin localizada.

La Salmonella evade las defensas intracelulares de las clulas intestinales sin ser
destruida y comienza a dividirse dentro de la clula. Posteriormente, pasa a la sangre

1
y produce una infeccin sistmica, multiplicndose en macrfagos, y localizndose
en hgado, bazo, mdula sea, etc. Se elimina por las heces, y se multiplica en el
ambiente, donde es muy resistente. (SSA, 1998)

En caso de entrada por va aergena, se produce una invasin en las amgdalas y los
pulmones.

Con el trmino "salmonelosis" se engloban cuadros clnicos distintos: la "fiebre

tifoidea", producida por S. typhi o S. paratyphi (salmonelas tficas), y las
"salmonelosis no tifoideas", producidas por otras subespecies (salmonelas no
tifoideas). (Gutirrez-Cogco, 2000).

2.1.3.1 Fiebre tifoidea

La fiebre tifoidea es una enfermedad febril aguda de origen entrico producida por la
Salmonella typhi. En raras ocasiones Salmonella paratyphi A, paratyphi B
Salmonella schottmuelleri) y Salmonella paratyphica C (Salmonella hirschfeltii)
(Eley, 2004). Dichas bacterias pueden producir un cuadro clnico similar, aunque de
menor gravedad. Estas salmonellas slo afectan al ser humano.

La mortalidad con un tratamiento adecuado es casi nula y las complicaciones ms

graves suelen ser la perforacin y la hemorragia intestinal. (Jones, 1991)

La fiebre tifoidea es una infeccin grave y, en algunos casos, con riesgo de vida, que
afecta en su mayora a personas de los pases en vas de desarrollo, en los que es
difcil encontrar agua potable y otras medidas sanitarias. La enfermedad suele
provocar sntomas como fiebre elevada, dolor de estmago y dolor general. Se puede
curar con antibiticos.

Sin tratamiento, la fiebre tifoidea puede durar un mes o ms, y transformarse en una
enfermedad muy grave e incluso con riesgo de vida.

1
Despus de recuperarse de la fiebre tifoidea, algunas personas pueden continuar
siendo portadoras de la bacteria. Esto significa que no tendrn sntomas, pero tienen
la bacteria en su organismo y pueden transmitirla a otras personas.

2.1.3.1.1 Causas

En general, las personas se contagian la fiebre tifoidea al tomar bebidas o comer

alimentos que han sido manipulados por alguien que tiene fiebre tifoidea o que es
portador de la enfermedad. Quienes estn infectados tambin pueden contagiar la
enfermedad a otras personas de manera directa (por ejemplo, al tocarlos sin lavarse
las manos). Tambin se puede contraer la enfermedad al beber agua contaminada por
desechos cloacales que contienen la bacteria S. Typhi.

De acuerdo a Ryan, Hargrett-Bean, & Blake (2006):

Por este motivo, la enfermedad es ms comn en zonas con malos sistemas de
tratamiento de los desechos cloacales y el agua. Siendo un factor muy
influyente para la sociedad expuesta al mal tratamiento de estos servicios.
Tambin es comn en las zonas tropicales y subtropicales del mundo, como
frica, Asia y Amrica Latina.
La acidez gstrica es una barrera natural importante, siendo factores predisponentes
aquellas circunstancias que modifican el pH gstrico, como aclorhidria, vagotoma,
gastrectoma o la toma de frmacos que lo modifican.

Una vez superada la barrera gstrica las salmonellas pasan al intestino delgado,
donde encuentran un medio ms idneo, ms an si hay una alteracin de la flora
intestinal normal por el uso previo de antibioterapia. (Snchez, 2008)

2.1.3.1.2 Tratamiento

La fiebre tifoidea se trata con antibiticos que destruyen a la bacteria S. Typhi. . En

los pacientes ms vulnerables, con enfermedades asociadas o patologas que alteren

1
la resistencia a la infeccin, se barajar la posibilidad de emplear antibioterapia, que
puede realizarse con quinolonas, cotrimoxazol o amoxicilina durante 48-72 horas.

El antibitico ms utilizado es el cloranfenicol. Dada su toxicidad en Espaa se

utiliza ms frecuentemente el cotrimoxazol o la ampicilina. La amoxicilina se reserva
para las embarazadas. (Gattell, 2009)

La convalecencia puede durar varios meses, pero los antibiticos disminuyen la

gravedad y las complicaciones de la fiebre tifoidea, as como la duracin de los
sntomas.

Tambin es necesario que la persona se alimente con frecuencia debido a las

hemorragias intestinales u otras alteraciones del tracto digestivo. En ciertos casos
debe administrarse alimentacin por va intravenosa hasta que se puedan digerir los
alimentos. (Jones, 1991)

2.1.3.1.3 Sntomas

El perodo de incubacin para S. typhi abarca de una semana a un mes, siendo

principalmente de dos semanas, a partir de la ingesta de la bacteria proveniente de
alimentos o agua contaminada. Se presume que S. typhi invade a travs de las clulas
M del intestino, las cuales forman parte del tejido linfoide o inmunolgico. Sin
embargo, debido a que no se han podido cultivar las clulas M en el laboratorio, los
experimentos de invasividad de Salmonella se han realizado con clulas epiteliales y
macrfagos, los cuales, adems, constituyen otros eslabones en el proceso de
invasin.

No siempre ocurre la diarrea, pero generalmente hay ulceracin. S. typhi se

multiplica en el epitelio de la submucosa, despus de lo cual entra el torrente
circulatorio y se disemina por el cuerpo. La multiplicacin ocurre otra vez en el bazo
y en el hgado, para que despus la bacteria sea liberada en grandes cantidades al
torrente sanguneo. Esta septicemia o invasin generalizada puede confirmarse por el
cultivo de la bacteria de la sangre, lo cual refleja una bacteriemia. Este estadio de la

1
infeccin, que puede durar 2 a 3 semanas, se caracteriza por una tos seca, fiebre alta,
e intenso dolor de cabeza. La fiebre puede ser cclica, es decir, la temperatura puede
incrementarse por las tardes, acompaada de escalofros, convulsiones y delirio. De
hecho, el nombre de la enfermedad proviene del griego typhus, o "neblina o humo",
que probablemente se us para describir enfermedades febriles que causan
alteraciones mentales.

Desenlaces fatales por tifoidea ocurren primordialmente por la ruptura de bazo,

ocurriendo un choque sptico ocasionado por el LPS, que estimula la liberacin de
agentes mediadores de la respuesta inmune como las citocinas. Alternativamente, el
10% de los individuos afectados pueden desarrollar el sndrome de portador sano,
excretando continuamente las bacterias del bazo. La hepatitis por S. typhi ha sido
documentada.

Sin embargo, no se cuenta con informacin suficiente para describir en detalle los
nichos de sobrevivencia y multiplicacin de la bacteria en el humano, excepto que se
considera que invade clulas epiteliales del intestino y, adems, se han aislado
macrfagos hospedantes de la bacteria. Por otro lado, estudios de la patognesis (o de
los mecanismos para generar enfermedad) de S. typhimurium en ratones, ha
conducido a la postulacin de la sobrevivencia y multiplicacin en ambientes
extracelulares.

2.1.4 Alimentos involucrados en la Salmonelosis

La mayora de los casos de salmonelosis resultan del consumo de:

Alimentos de origen animal (carnes de abasto, pollo, marisco, pescado, leche y

huevos).
Subproductos de origen animal (ovoproductos no pasteurizados, productos lcteos
no pasteurizados).
Alimentos sanos que se contaminan con productos en malas condiciones de
salubridad o son mal manipulados.

1
Segn Daz, Hernndez & Paredes (2007):
Muchos alimentos, sobre todo los de origen animal o contaminados con aguas
residuales, han servido como vehculos en brotes de salmonelosis. La carne
de matadero est contaminada habitualmente con Salmonella; su incidencia es
mayor en las canales de aves. La Salmonella est presente en la superficie de
las canales como consecuencia de su contaminacin a partir del contenido
intestinal de la res.

Entre las verduras, cualquiera de ellas puede contener Salmonella cuando se

cultivan en aguas residuales contaminadas o son fertilizadas con abonos de origen
animal. Algunas verduras determinadas han sido causa de brotes de salmonelosis,
especialmente los berros. (Ingraham & Ingraham 1998)

Los casos ms comunes de salmonelosis se dan por comer alimentos de origen

animal contaminado: pollo, huevos, carne vacuna, leche. Pero tambin las verduras
pueden estar contaminadas con esta bacteria. Las mascotas tambin pueden estar
infectadas y transmitir la infeccin al entrar en contacto con ellas. Son especialmente
portadores los reptiles (tortugas, lagartos, serpientes) y los pjaros. La salmonelosis
ocurre ms frecuentemente durante el verano. (Daz, Hernndez & Paredes 2007)

Como lo mencionan Tortora, Funke & Case (2007):

La infeccin se da cuando se entra en contacto con las heces de animales o

humanos infectados. Numerosos brotes estn relacionados con la ingesta de
huevos y derivados crudos (mayonesa, queso, helado, crema). Tambin se han
dado casos por contacto con animales domsticos infectados con la bacteria
como perros y gatos.

2.1.4.1 Prevencin
El primer paso para controlar la presencia de Salmonella en los alimentos es
prevenir su contaminacin con materias fecales o tratarlos trmicamente para destruir

1
su presencia como, por ejemplo. La higienizacin de algunos de ellos mediante la
pasteurizacin. (Leche, productos lcteos, ovoproductos). (Pascual 2005).

Cocinar bien el pollo, la carne picada, y los huevos. Evitar comidas con alimentos
crudos de origen animal.
Preparar cuidadosa y con mucha higiene comida para nios, ancianos o quienes
tratan una enfermedad de inmunodeficiencia.
Lavar bien frutas y verduras.
Lavarse bien las manos antes de comer, luego de ir al bao, y luego de tocar
alimentos crudos.
Lavarse bien las manos con agua y jabn luego de tocar animales.

2.1.5 Mtodos para conteo de bacterias

El crecimiento de las poblaciones microbianas puede medirse de diferentes

maneras. Algunos mtodos determinan el nmero de clulas y otros la masa total de
la poblacin, que a menudo es directamente proporcional al nmero de clulas.
(Pommerville 2010). La magnitud de las poblaciones normalmente se registra como
el nmero de clulas que hay e un mililitro de lquido o en un gramo de material
slido. Como las poblaciones bacterianas suelen ser muy grandes la mayora de
mtodos de cuantificacin se basan en mediciones directas o indirectas de muestras
muy pequeas; despus se determina mediante clculos el tamao de la poblacin
total. (Rodrguez, Gamboa, Hernndez y Garca 2009)

Para el recuento de microorganismos presentes en una muestra de agua, suelo, aire,

alimento, cultivos, entre otros, existen diferentes mtodos o tcnicas: Algunas
tcnicas son directas y permiten un recuento de todas las clulas, tanto las vivas
como las muertas. (Daz, Hernndez & Paredes 2007) Las medidas directas
incluyen los recuentos directos al microscopio o recuento electrnico, el recuento en
placa, o el clculo del nmero ms probable (NMP).

1
Otras son medidas indirectas y miden una propiedad de la masa de las clulas como
son la turbidez, el peso seco, o una actividad metablica. La eleccin de un mtodo
de seguimiento del cultivo en concreto depende de las caractersticas del cultivo y del
proceso.

2.1.5.1 Nefelometra (Turbidimetra)

Para algunos tipos de trabajo experimental la determinacin de la turbidez

(turbidimetra) es un mtodo prctico para controlar el crecimiento bacteriano.
Cuando las bacterias se multiplican en un medio lquido este se torna turbio o
nebuloso. (Daz, Hernndez & Paredes 2007)

La turbidez es proporcional a la masa de las clulas en suspensin y su medida nos

permite estimarla. El instrumento utilizado para medir la turbidez es un
espectrofotmetro (o colormetro). En l un haz de luz se transmite a travs de una
suspensin bacteriana a una clula fotoelctrica. Cuando la cantidad de bacterias
aumenta, menos luz alcanza la clula fotoelctrica. Este cambio de luz se registra en
la escala del instrumento como una medicin logartmica del instrumento
denominada absorbancia (a veces densidad ptica o DO); o como un valor derivado
del porcentaje de transmisin. La absorbancia se utiliza para graficar el crecimiento
bacteriano. Cuando las bacterias estn en fase logartmica de crecimiento o
declinacin la representacin de la absorbancia frente al tiempo forma una lnea casi
recta. La turbidez se determina por la densidad ptica (DO) que puede ser expresada
como Absorbancia, % de Transmitancia o Unidades Klett (UK). (Pommerville
2010).

Longitud de onda ()
Bacterias 540nm *
Protozoarios 580nm*
Levaduras 600nm *

*valores tomados como Blanco para realizar el anlisis de Espectrofotomtrico.

1
 CAPTULO 3
METODOLOGA

3.1 Alcance y enfoque del proyecto

El enfoque del presente proyecto es un enfoque mixto ya que la informacin
analizada muestra datos cuantitativos (la absorbancia obtenida para cuantificar y
demostrar o no el crecimiento de la bacteria de acuerdo al medio) como cualitativos
(existe crecimiento o no). Este enfoque nos permite obtener una visin ms integral
de la realidad.

El alcance del proyecto sigue un perfil descriptivo debido ya que presenta

informacin detallada respecto al fenmeno a estudiar especificando propiedades,
caractersticas y rasgos importantes de la bacteria Salmonella Typhi definiendo las
variables involucradas.

3.2 Diseo del Experimento

Este experimento es un diseo factorial 22 con 3 rplicas el cual tiene como finalidad
observar la supervivencia de la bacteria sometida a 2 medios distintos a diferente
concentracin.

Se realiz un cultivo semilla con la bacteria; en este caso la Salmonella typhi se

procedi con la metodologa siguiente:

1
Material:
Matraces aforados 100mL
Puntas para micropipeta
Tubos de ensaye
Micropipetas
Vasos de precipitado
Jugo pasteurizado
Leche ultrapasteurizada
Probetas
Gradilla
Mechero
Asas bacteriolgicas
Caldo Muller Hinton
Muestra de Salmonella
Agua destilada
Incubadora
Campana de flujo laminar
Autoclave
Refractmetro o espectrofotmetro

3.3 Procedimiento:
1. Se preparan 5 mL de caldo Muller Hinton (0.105g de caldo para 5mL de agua
destilada) en tubo de ensaye para hacer el cultivo semilla, se calienta
ligeramente hasta homogeneizar y proceder a la esterilizacin.
2. Se renen los materiales para esterilizarlos en la autoclave a 121 C y 14 PSI
durante 15 min.
3. Se limpia la zona de trabajo con benzal.
4. Se enciende el mechero para proceder a trabajar en zona de esterilidad (30
cm).
5. Se inocula 2 veces con Salmonella y ayuda del asa bacteriolgica a tubo de
ensaye con caldo ya estril.
6. Se incuba 4 das el tubo de ensaye con la muestra (este es el cultivo semilla)
para asegurar el ptimo crecimiento de la bacteria.
7. Se preparan las concentraciones de leche y jugo al 10% y al 1%.
Preparacin de solucin al 10%: 10 mL de jugo o leche en
matraz aforado de 100mL y aforar con agua destilada.
Preparacin de solucin al 1%: 1 mL de jugo o leche en matraz
aforado de 100mL y aforar con agua destilada.
8. Se hacen 3 rplicas de cada concentracin y de cada medio, dando un total de
12 tubos.

1
 9. A estos tubos se les inocul con 200L del cultivo semilla de Salmonella.
10. Los tubos de ensaye ya inoculados se dejaron en incubadora durante 24hrs
para ver el crecimiento bacteriano que se haya producido en los diferentes
tipos de medios y a sus diferentes concentraciones.
11. Despus de la incubacin de todos los tubos se realiz un anlisis de la
absorbancia o refraccin de luz de cada un tubos para as obtener el promedio
de bacterias que crecieron en el medio.
12. Se procedi a hacer el anlisis de la supervivencia de la bacteria y as las
conclusiones.

3.4 Proceso del Experimento

Tubo
semilla con Incubacin
5ml de te tubo
caldo de semilla a
cultivo, 37C
inoculado durante 5
con das
salmonella

Preparacin de diferentes medios a diferentes

concentraciones (en zona estril) para su prxima
inoculacin con Salmonella typhi.

1
Medios de cultivo vegetal y animal preparados a
sus respectivas concentraciones.

Preparacin e inoculacin de
tubos de ensaye con su
respectivo medio y dicha
concentracin del mismo.

Preparacin e introduccin de tubos de

ensaye a incubadora.

Incubacin de tubos a 37C durante 5

das.

1
 Medicin de medios inoculados por
Salmonella typhi con celdas en
espectrofotmetro.

3.5 Resultados: Anlisis de datos

Teniendo en cuenta que la Fiebre tifoidea causada por S. typhi, es una enfermedad
que provoca una alta tasa de mortalidad se plantea observar en base al estudio
estadstico realizado por el software MiniTab 16 para analizar este diseo factorial
y ver que variables es conveniente controlar y concluyendo que concentracin tomar
en cuenta para cuantificar el crecimiento de la misma. Se tom como blanco una
absorbancia de 650 nm.

1
Nmero de Contenido Medio Concentracin % Absorbancia
tubo medida a 650
nm
1 Leche 1% 0.0
2 Blanco (sin Leche 10% 0.0
3 bacteria) Jugo 1% 0.0
4 Jugo 10% 0.0
5 Jugo 1% 072
6 Jugo 1% 109
7 Jugo 1% 094
8 Jugo 10% 005
9 Jugo 10% 000
10 Salmonella Jugo 10% 005
11 typhi Leche 1% 102
12 Leche 1% 114
13 Leche 1% 136
14 Leche 10% 176
15 Leche 10% 229
16 Leche 10% 248
Tabla 1. Resultados de absorbancia (nm)

Medias de la absorbancia en los distintos tratamientos:

Jugo 1%= 91.6

Jugo 10%= 3.3
Leche 1%= 117.3
Leche 10%= 217

1
Grfico 1. Grfico de dispersin; donde se muestra la absorbancia medida en las muestras, como se
puede observar la absorbancia del jugo es pequea ya que en este medio la S. typhi no encuentra
condiciones apropiadas y por lo tanto no sobrevive, por otra parte la absorbancia de la leche es mayor
indicando que el crecimiento de la bacteria es ptimo en medios de origen animal como en este caso
es la leche, mientras ms absorbancia tiene una muestra mayor nmero de bacterias hay.

Ilustracin 1. Tabla de orden de corridas aleatorizadas siguiendo un diseo Factorial 22 con 3 rplicas.
Celda Absorbancia (nm); hace referencia a la variable de respuesta obtenida despus de las
mediciones espectrofotomtricas.
Diseo factorial completo

Factores: 2 Diseo de la base: 2, 4

Corridas: 12 Rplicas: 3
Bloques: 1 Puntos centrales (total): 0

Todos los trminos estn libres de estructuras alias.

1
Ajuste factorial: Absorbancia (nm) vs. Concentracin, Medio

Efectos y coeficientes estimados para Absorbancia (nm) (unidades

codificadas)

Trmino Efecto Coef SE Coef T P

Constante 107.500 6.526 16.47 0.000
Concentracin 6.000 3.000 6.526 0.46 0.658
Medio 120.000 60.000 6.526 9.19 0.000
Concentracin*Medio 94.333 47.167 6.526 7.23 0.000

S = 22.6072 PRESS = 9199.5

R-cuad. = 94.48% R-cuad.(pred.) = 87.58% R-cuad.(ajustado) = 92.41%

Anlisis de varianza para Absorbancia (nm) (unidades codificadas)

Fuente GL SC Sec. SC Ajust. CM Ajust. F

Efectos principales 2 43308.0 43308.0 21654.0 42.37
Concentracin 1 108.0 108.0 108.0 0.21
Medio 1 43200.0 43200.0 43200.0 84.53
2-Interacciones de (No.) factores 1 26696.3 26696.3 26696.3 52.23
Concentracin*Medio 1 26696.3 26696.3 26696.3 52.23
Error residual 8 4088.7 4088.7 511.1
Error puro 8 4088.7 4088.7 511.1
Total 11 74093.0

Fuente P
Efectos principales 0.000
Concentracin 0.658
Medio 0.000
2-Interacciones de (No.) factores 0.000
Concentracin*Medio 0.000
Error residual
Error puro
Total

Observaciones inusuales de Absorbancia (nm)

Absorbancia EE de Residuo
Obs OrdenEst. (nm) Ajuste ajuste Residuo estndar
5 8 176.000 217.667 13.052 -41.667 -2.26R

R denota una observacin con un residuo estandarizado grande.

Coeficientes estimados para Absorbancia (nm) utilizando datos en unidades no

codificadas

Trmino Coef
Constante 103.833
Concentracin 0.66667
Medio 2.3519
Concentracin*Medio 10.4815

Conclusin: En base al estudio estadstico y de un anlisis completo al diseo

factorial, en base al Anlisis de Varianzas (ANOVA) podemos concluir con un nivel
de significancia de = 0.05 y guindonos por los resultados por el valor P, que el

1
factor que desempea principal papel en el experimento es el origen del medio en
cual fue sembrada la bacteria Salmonella typhi a su vez tambin nos permite valorar
que su interaccin con la concentracin afecta esto como resultado de la gran
significancia que nos ofrece el origen del medio; dndonos pauta a poder responder
posteriormente a cada uno de los objetivos planteados y problemas presentados.

Diagrama de Pareto de efectos estandarizados

(la respuesta es Absorbancia (nm), Alfa = 0.05)
2.306
F actor N ombre
A C oncentracin
B M edio

B
Trmino

AB

0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
Efecto estandarizado

Grfico 2. Diagrama de Pareto; permite establecer un orden de prioridades sobre los factores que
afectan ms el crecimiento de bacterias Salmonella typhi, para poder tomar una decisin y corroborar
todo el planteamiento estadstico sobre el origen del medio.

Grficas de residuos para Y

Grfica de probabilidad normal vs. ajustes
99
100
90
Porcentaje

50
Residuo

50 0
-50
10
-100
1
-200 -100 0 100 200 60 80 100 120 140
Residuo Valor ajustado

Histograma vs. orden

3
100
Frecuencia

2 50
Residuo

0
1 -50

-100
0
-100 -50 0 50 100 150 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Residuo Orden de observacin

Grfico 3. Grfico de probabilidad normal vs ajustes e Histograma vs orden; permiten verificar la

normalidad y la distribucin directamente del ANOVA, para cerciorar este anlisis.

1
 Grfica de efectos principales para Absorbancia (nm)
Medias de datos

Concentracin Medio
175

150

Media 125

100

75

50

1 10 Jugo Leche

Grfico 4. Grfica de efectos principales; evidencia de manera concreta en cul de los dos factores
existe mayor efecto sobre los resultados.

Grfica de interaccin para Absorbancia (nm)

Medias de datos
C oncentracin
1
200 10

150
Media

100

50

0
Jugo Leche
Medio

Grfico 5. Grfico de interaccin para la variable de respuesta; nos demuestra el mejor diseo en el
cual podemos observar el medio ptimo en el que la bacteria se desarrolla mejor.

Conclusin: Despus del estudio estadstico, el anlisis del experimento y la

correlacin del mismo con sus debidos grficos podemos corroborar y concluir a su
vez con un nivel de significancia de =0.05 que el medio de cultivo de las bacterias
es el que afecta principalmente al experimento por su parte la concentracin no es
factor determinante del mismo.

1
 CAPTULO 4
CONCLUSIONES

4.1 Conclusiones relativas a los objetivos especficos y al general

Mediante la exposicin de Salmonella typhi a diferentes medios, que en este caso son
alimentos de origen animal y vegetal (leche y jugo de naranja) incluidos en la dieta
bsica de la poblacin mexicana; se evidenci el progreso de crecimiento de esta
bacteria de acuerdo a su requerimiento metablico segn el medio, comprobando con
esto que la bacteria prolifera de manera ptima en los alimentos de origen animal.

Entonces se puede decir que el organismo manifiesta un mayor crecimiento en

medios de origen animal, ya que estos proporcionan nutrientes esenciales para que la
bacteria lleve su ciclo de vida sin ningn factor contra producente para su desarrollo.
Por lo tanto se hace evidente la recomendacin de alimentos de origen vegetal para
prevenir y/o tratar la infeccin emanada por el organismo.

4.2 Aportaciones originales

Basados en la problemtica de salud que genera la salmonella y sus diversas cepas
patgenas nos incitan a la bsqueda de agentes que involucren la magnificacin del
dao de esta bacteria. Despus de una investigacin profunda acerca de las
caractersticas virales del organismo en cuestin se hace una lista de factores que
permiten a la bacteria tener un periodo de vida e infectar a otros organismos, se
jerarquizan los mismos y se toman como agentes primordiales para posteriormente
validar su importancia desarrollando un diseo experimental como el que aqu se
propone.

4.3 Lmites del modelo planteado

El trabajo con cepas de alto ndice de patogenicidad tiene consecuencias que nos
afectan directamente como persona, como salir infectado o propagar el
microorganismo a diferentes reas, por lo que es de gran importancia desarrollar el
modelo en ambientes controlados para que la bacteria con la que se trabaja no
alcance a propagarse en sitios no deseados. Ya que el peligro de usar estas cepas esta

1
latente no es sencillo adquirirlas por cuenta sola, por lo que se debe hablar con una
persona capacitada en el tema y con ello hacer una peticin al laboratorio de donde
se quiere conseguir la bacteria y mencionar para que se va usar la misma. Es por esta
razn que este tipo de microorganismos tiene limitantes al interactuar con ellos.

4.4 Recomendaciones para futuros estudios

Basados en nuestra experiencia de trabajar con microorganismos, se debe de tener
especial cuidado en la seleccin del mismo, seleccin del cultivo, seleccin del
mtodo de anlisis. La metodologa planteada debe estar basada en el o los objetivos
que se deseen comprobar, analizar o evaluar respectivamente. Si se decide cmo fue
en nuestro caso trabajar con microorganismos patgenos se debe de priorizar tener
cuidado en su manipulacin, a su vez se debe contar con el equipo y la esterilidad del
medio en donde se va a trabajar, el equipo de anlisis debe de estar calibrado y se
debe buscar que no afecte de ninguna manera la eficiencia del experimento. Los
mtodos a considerar deben ser estrictos en base al microorganismo estudiado ya que
de lo contrario su crecimiento no tendr lugar y no se podr evaluar ningn
parmetro posterior.

1
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1
 GLOSARIO

Absorbancia: Es la cantidad de intensidad de luz que absorbe la muestra.

Agar: Una gelatina vegetal de origen marino. Es un polisacrido sin ramificacin
obtenida de la pared celular de varias especies de algas, utilizada como medio
semislido para cultivar bacterias.
Bacilo: Se usa para describir cualquier bacteria con forma de barra o vara ovalada.
Bacteriemia: Es la presencia de bacterias en la sangre.
Clula fotoelctrica: Es un pequeo mecanismo electrnico que convierte la energa
luminosa (fotones) en energa elctrica (electrones) mediante el denominado efecto
fotovoltaico.
Cinosina: Protena que regulan la funcin de las clulas que las producen u otros
tipos celulares (agentes responsables de la comunicacin intercelular)
Espectrofotmetro: Instrumento usado en el anlisis qumico para medir, en funcin
de la longitud de onda, la relacin entre valores de una misma magnitud fotomtrica
relativos a dos haces de radiaciones y la concentracin o reacciones qumicas que se
miden en una muestra.
Flagelo: Un apndice movible con forma de ltigo presente en muchos organismos
unicelulares y en algunas clulas de organismos pluricelulares.
LPS (endotoxina o lipopolisacridio): Es un componente estructural de la
membrana externa de las bacterias gram negativas y es el factor microbiano, entre los
que activan la respuesta inflamatoria
Macrfagos: Son clulas del sistema inmunitario que se localizan en los tejidos, su
funcin principal es la de fagocitar todos los cuerpos extraos que se introducen en el
organismo como las bacterias y sustancias de desecho de los tejidos.
Peristaltismo: Es una serie de contracciones musculares organizadas que ocurren en
el tubo digestivo y que tambin se observan en algunos rganos que conectan los
riones a la vejiga.
Piruvato: Conocido como cido pirvico es un cido que tiene un papel importante
en los procesos bioqumicos en organismo unicelulares o pluricelulares.
Serovares: (Serovar) Un serotipo es un tipo de microorganismo infeccioso
clasificado segn los antgenos que presentan en su superficie celular.

1
Sistema nervioso entrico: Es una subdivisin del sistema nervioso autnomo que
se encarga de controlar directamente el aparato digestivo. Se encuentra en las
envolturas de tejido que revisten el esfago, el estmago, el intestino delgado y el
colon.
Transmitancia: La cantidad de energa que atraviesa un cuerpo en determinada
cantidad de tiempo.