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Resumo: So apresentados conceitos bsicos sobre clula, cdigo gentico e sntese protica, e sobre
algumas tcnicas de biologia molecular, tais como PCR, PCR-RFLP, seqenciamento de DNA, RT-PCR e
immunoblotting. So fornecidos protocolos de extrao de nucleotdeos e de protenas, como salting
out no sangue perifrico e mtodos do fenol-clorofrmio e do trizol em tecidos. Seguem-se exemplos
comentados da aplicao de tcnicas de biologia molecular para o diagnstico etiolgico e pesquisa
em dermatoses tropicais, com nfase na leishmaniose tegumentar americana e hansenase.
Palavras-chave: Biologia molecular; Biologia molecular/mtodos; Hansenase; Hansenase/diagnstico;
Leishmaniose; Leishmaniose mucocutnea/diagnstico; Reao em cadeia da polimerase;
Polimorfismo gentico
Abstract: Initially, basic concepts are presented concerning the cell, genetic code and protein synthesis,
and some techniques of molecular biology, such as PCR, PCR-RFLP, DNA sequencing, RT-PCR and
immunoblotting. Protocols of nucleotides and of proteins extraction are supplied, such as salting out
in peripheral blood allied to phenol-chloroform and trizol methods in skin samples. To proceed,
commented examples of application of those techniques of molecular biology for the etiologic
diagnosis and for research in tropical dermatoses, with emphasis to American tegumentary
leishmaniasis and leprosy are presented.
Keywords: Leishmaniasis; Leishmaniasis, mucocutaneous/diagnose; Leprosy; Leprosy/diagnose;
Molecular biology; Molecular biology/methods; Polymerase chain reaction; Polymorphism, genetic;
INTRODUO
As doenas tropicais no Brasil, citadas tambm decorrentes de transmisso do agente etiolgico pelo
como doenas exticas, procedem da contaminao ar e doenas relacionadas aos artrpodes, apontando
dos ndios por ocasio da colonizao, permitida pelas que medidas ambientais, econmicas, regulatrias
temperaturas elevadas e pelo excesso de umidade nos legais, como tambm medidas de sade pblica, se
trpicos, condies ideais para essas doenas. O des- tornam necessrias.2
matamento sem critrio, resultando em intensa altera- Entre as doenas tropicais situam-se as doenas
o ambiental local e global, somado s condies cli- negligenciadas, que ocorrem em regies pobres e
mticas e baixa qualidade de vida caracterstica da que, por sua vez, agravam a pobreza.3,4 Quando asso-
quase-totalidade dos pases situados em regies tropi- ciadas Aids, a situao torna-se pior.5-8 Mais recente-
cais , vem estimulando a ocorrncia de epidemias.1 mente, as doenas tropicais se transformaram em pro-
Vrias tm sido as discusses em relao ao blema de mbito mundial, devido migrao popula-
impacto do aquecimento global sobre epidemias cional e ao turismo internacional, refletido tambm
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em sua transmisso durante transplantes de rgos as parasitrias, que envolvem vetores e hospedeiros
slidos.9,10 intermedirios, muito tem contribudo para o desen-
Em relao, mais especificamente, s dermato- volvimento da biologia celular e molecular, assim
ses tropicais, todos os dermatologistas no s lati- como para a imunologia.37
nos, mas de todo o mundo necessitam ter familiari- Por outro lado, a aquisio de conhecimentos
dade com as doenas tropicais que cursam com leses na rea de biologia molecular gerou, em 1973, por
cutneas, justamente devido ao aumento de viagens Herbert Boyer e Stanley Cohen, novas possibilidades
para pases tropicais e subtropicais.11 para a construo do DNA recombinante, que, teorica-
As dermatoses tropicais podem ser classifica- mente, leva probabilidade de criao de novas for-
das segundo o agente etiolgico envolvido como mas de vida.38
virais;12,13 bacterianas, em especial, as micobacteria- A seguir, faz-se breve reviso dos conceitos bsi-
nas;14,15 fngicas e parasitrias.16-18 Em inqurito de con- cos e das aplicaes das tcnicas de biologia molecu-
sultas dermatolgicas em consultrios e em servios lar, com exemplos prticos laboratoriais envolvendo
credenciados, realizado no Brasil, a hansenase apare- resultados parciais de projetos das linhas de pesquisa
ce em 20o lugar no pas e em quarto lugar na Regio Sero apresentadas as tcnicas de biologia molecular
Centro-Oeste.19 Entre as mais comumente relatadas rotineiramente usadas para o diagnstico do agente
nas reas rurais do Panam, citam-se micetomas, para- etiolgico presente no tecido do hospedeiro e tam-
coccidiodomicose, lobomicose, cromomicose, histo- bm aquelas que buscam identificao de protenas e
plasmose, rinosporidiose, esporotricose, hansenase, de polimorfismos genticos do microorganismo ou
rinoscleroma e leishmaniose cutnea e mucocutnea.20 do hospedeiro, que podem ou no estar relacionados
susceptibilidade ou resistncia do hospedeiro frente
Biologia molecular e dermatoses tropicais ao parasito. Para que sejam sedimentados os concei-
Para o diagnstico das dermatoses tropicais, tos aqui descritos, sugere-se consultar o livro DNA
vrios so os mtodos subsidirios que, quando alia- Segredos e Mistrios38 e, para mais detalhes, o livro
dos ao exame clnico, permitem o diagnstico etiol- Molecular biology of the cell.39
gico de cada uma delas. Para cada dermatose, existem
excelentes revises na literatura.12-18, 21-29 Conceitos bsicos sobre a clula
Entre as dermatoses bacterianas, fngicas e As clulas so compostas por ncleo e citoplas-
parasitrias, com exceo do bacilo Mycobacterium ma. No ncleo, est contido o material gentico das
leprae, todos os organismos infectoparasitrios so clulas; no citoplasma, as organelas responsveis por
cultivveis, permitindo o diagnstico etiolgico da suas funes e pela sntese de protenas, que ocorre
doena em investigao. Porm, cada doena, por nos ribossomos.
sua vez, manifesta-se de forma distinta no homem, Os organismos unicelulares, chamados de pro-
quer pela virulncia do agente etiolgico, quer pela cariotos, como as bactrias, vrus e algumas algas, no
susceptibilidade gentica e resposta imune do hos- apresentam membrana nuclear separando o contedo
pedeiro.30,31 Por isso, algumas manifestaes clni- nuclear do citoplasma. As plantas e animais possuem
cas, por exemplo, de doenas bacterianas, fngicas um ncleo verdadeiro, organismos eucariotos, onde se
ou parasitrias no hospedeiro com imunidade celu- situa o cdigo gentico, ou DNA. As regras gerais que
lar exacerbada, podem fugir do usual, pois o antge- regem a informao gentica se aplicam a todos os
no pode encontrar-se escasso na bipsia da leso, e organismos vivos, quer procariotos, quer eucariotos.
o emprego de mtodos diagnsticos clssicos, em As bactrias representam as clulas mais sim-
busca da definio do agente infeccioso, pode ples, posto que os vrus, que so ainda mais simples
retardar o diagnstico etiolgico final.32,33 Tambm do que as bactrias, no podem sobreviver de forma
vale a pena ressaltar que o emprego da biologia independente. Os vrus so formados basicamente
molecular pode auxiliar no diagnstico etiolgico pelas molculas de DNA ou de cido ribonuclico
diferencial entre as leses sarcodicas e da prpria (RNA), empacotadas em uma cpsula de protena. Os
sarcoidose.34,35 vrus mais estudados so os bacterifagos, ou fagos,
Com a descoberta da molcula do cido deso- que se perpetuam ao infectar uma bactria.
xirribonuclico (DNA), por Watson e Crick em 1953, o Vrus, bactrias e qualquer outra forma de
estudo dos tecidos e das clulas passa da observao vida utilizam o cdigo gentico para a expresso pro-
morfolgica, macroscpica ou microscpica, para a tica. Da mesma forma que uma bactria aceita a
molecular. A biologia molecular, alm de sua relevn- infeco de um vrus, permitindo a duplicao do
cia clnica e epidemiolgica, representa um campo em DNA viral e a sntese das protenas codificadas, um
potencial para a pesquisa na rea mdica.36 gene humano pode tambm ser introduzido em uma
Alm desses aspectos, o estudo per se das doen- bactria, resultando a produo de protena em gran-
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fontes de gua quente, evoluiu para sobreviver em fragmentos maiores. Por outro lado, para fragmentos
altas temperaturas mantm-se estvel depois de pequenos de DNA, torna-se necessrio aumentar a
repetidas exposies a 94oC. concentrao de agarose (2% ou mais). Para frag-
mentos menores, at 1000pb, o gel de acrilamida
A PCR compreende trs passos: melhor, sendo ideal para produtos de seqenciamen-
1- Desnaturao do DNA: a ruptura das pontes to, permitindo a distino de fragmentos que diferem
de hidrognio, que ligam a dupla hlice do DNA, em um par de bases.
feita em altas temperaturas, de 94oC a 98oC, por 5min. Para o DNA ser visualizado no gel de agarose,
2- Anelamento dos primers: esse passo ocorre torna-se necessria a incubao do gel com um coran-
quando a temperatura reduzida entre 37oC e 65oC, te fluorescente, o brometo de etdeo, cujas molculas
por 30seg. se intercalam entre os nucleotdeos da dupla hlice,
3- Extenso ou sntese do DNA: esse passo se d tornando-se fluorescente radiao ultravioleta.
em intervalo de tempo que varia de dois a 5min, a Existem outros corantes, que no so txicos como o
72oC, temperatura ideal para que a Taq polimerase brometo de etdeo, mas so mais dispendiosos. O gel
atue, havendo incorporao das bases nitrogenadas s de poliacrilamida fixado e corado pela prata.
fitas copiadas. Para se observar o tamanho do fragmento
Esse ciclo repetido de 25 a 35 vezes, sendo amplificado no gel de agarose ou de acrilamida, usa-
que a partir do segundo ciclo, o tempo de desnatura- se um marcador de DNA com peso molecular conhe-
o pode ser reduzido a 30seg. cido. Um comumente utilizado o DNA do fago lamb-
Uma vez obtido o produto de DNA amplifica- da digerido com a enzima de restrio HindIII. Os
do, ele pode ser observado em gel de agarose ou de fragmentos digeridos possuem peso molecular prede-
poliacrilamida, atravs da eletroforese, verificando-se terminado, podendo ser vistos no gel como bandas.
o tamanho da banda esperada. Como o DNA tem Para se comprovar se a banda correta, isto ,
carga negativa, devido ao cido fosfrico, as amostras se o produto amplificado o esperado, pode ser feita
iro migrar do plo negativo (ctodo) para o plo confirmao: a) transferindo-se o DNA do gel para uma
positivo (nodo). membrana de nitrocelulose pelo mtodo de Southern,
A agarose permite a separao de fragmentos com posterior hibridizao com sonda complementar;
de 200pb a 50kb. Quanto menor a concentrao de b) digerindo-se o produto da PCR com enzima de res-
agarose (0,3%), menor a resistncia migrao da trio; ou c) seqenciando-se o produto da PCR.
molcula de DNA, facilitando, portanto, a migrao de
PCR-RFLP (PCR-restriction fragment length
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e de protenas de uma mesma amostra (Figuras 3-5). ou Coumassie Blue, sendo que o mtodo pela prata
Mais recentemente, tem sido extrado RNA de mostra sensibilidade de cinco a 200 vezes maior.
apenas uma clula, empregando-se a tcnica de O termo blotting refere-se transferncia das
microdisseco a laser.47 fraes proticas contidas no gel de poliacrilamida
O mtodo da RT-PCR consiste na combinao para uma membrana de nitrocelulose (Western blot-
da tcnica de transcriptase reversa com a PCR, envol- ting). A utilizao de anticorpos marcados contra
vendo trs etapas: determinada protena recebe o nome de immunoblot-
1- extrao do mRNA; ting.
2- sntese do cDNA, fita complementar do Para esse processo, inicialmente tem-se que
mRNA, pela enzima transcriptase reversa; obter a protena em estudo (ver extrao de protenas
3- amplificao do DNA pela Tac polimerase. pelo mtodo trizol), o gel de poliacrilamida, buffer
Algumas DNAs polimerases estveis, por exem- apropriado e o aparelho de eletroforese vertical. Faz-
plo a enzima rTth, podem utilizar mRNA como fita se o gel em duplicata. Um deles corado para visuali-
molde para a sntese de cDNA, permitindo que o zao das bandas proticas, e o outro transferido
mtodo completo seja feito em tubo nico. para membrana de nitrocelulose, utilizando-se um
aparelho de transferncia de protenas.
3. Eletroforese de protenas Immunoblotting
A eletroforese baseia-se na separao de BIOLOGIA CELULAR APLICADA AO ESTUDO DE
molculas com cargas eltricas distintas em um DERMATOSES TROPICAIS
campo eltrico. A corrida eletrofortica depender do Leishmaniose tegumentar americana
tamanho da molcula, da carga eltrica dos aminoci- Justifica-se a utilizao da PCR para o diagnsti-
dos e do pH do buffer. co etiolgico da LTA pela baixa porcentagem de acha-
A eletroforese de protenas em gel de poliacri- do do parasito na bipsia de pele, em especial na
lamida (Page) a mais utilizada na anlise de prote- forma mucosa. Levantamento realizado na regio nor-
nas. O gel de poliacrilamida formado por monme- deste do Estado de So Paulo demonstrou aproxima-
ros de acrilamida, cujas cadeias se interligam com damente 55% de identificao do parasito na bipsia,
N,N-metileno bisacrilamida (bis), com formao de comparada a 85-90% na PCR.48,49
polmeros de acrilamida. Aps a corrida eletrofortica Quando se trata da forma mucosa, a porcenta-
com amostras de protenas em estudo, o gel deve ser gem do encontro do parasito na bipsia ainda
fixado com cido tricloroactico e corado com prata menor, reforando o emprego da PCR para seu diag-
nstico.48-51 to procarioto.61
H vrios pares de primers descritos na literatu- Alguns resultados de PCR e de PCR-RFLP para
ra para o diagnstico molecular das leishmanioses.48-51 identificao de DNA de leishmnias em amostras de
Tem-se a alternativa de uso de primers que amplificam pele ou de mucosa so mostrados nas figuras 6-8.48,52,55
seqncias especficas de espcies de leishmnias48 ou
primers que amplificam seqncias comuns a todas as Hansenase
espcies. Neste ltimo caso, existe a opo do uso de A despeito da diminuio de casos de hansena-
primers que amplificam seqncia do DNA do minicr- se registrados, o nmero de casos novos diagnostica-
culo do cinetoplasto (kDNA), comum a todas espcies dos ainda permanece inalterado, e o diagnstico con-
de leishmnia.49-51
A utilizao de enzimas de restrio para deter-
minar a espcie da leishmnia tem sido muito descri-
ta na literatura, sendo mtodo mais barato e mais rpi-
do do que o seqenciamento do produto da PCR.49,52
Com a utilizao da PCR-RFLP, identificou-se a espcie
L. (L.) amazonensis na forma mucosa da LTA na regio
de Ribeiro Preto (SP).53
Em relao amostra a ser estudada para o
diagnstico da LTA, tem-se dado preferncia a mto-
dos de coleta no invasivos, como a escarificao da
borda da leso54 ou coleta de amostra em papel de fil-
tro, seguida pela extrao do DNA.55 Ultimamente,
tem-se utilizado o eludo da amostra, coletada em
papel de filtro na forma de imprint, diretamente na
PCR, seguida da confirmao por restrio enzimtica,
com resultados comparveis extrao do DNA da
bipsia de pele ou de mucosa de paciente com LTA.56
A PCR para pesquisa do parasito tambm pode FIGURA 6: Gel de agarose 1,5%. Produtos de PCR com amostras man-
tidas em cultura, utilizando-se par de primers especfico para kDNA,
ser aplicada ao flebtomo,43 assim como a espcie que amplifica fragmento de 120pb, comum a todas as leishmnias
identificada em amostras humanas pode estar relacio-
nada resposta teraputica da LTA.57 Colunas: 1. L. (V.) braziliensis (Lbb. 2903); 2. L. (L.) amazonensis
A manifestao clnica das leishmanioses depen- (IFLA/BR/67/PH8); 3. L. (L.) chagasi (LV 9.3); 4. amostra de DNA extrado
de sangue de co com calazar; 5: Trypanosoma cruzi; 6. PM 100pb.
de da trade: espcie do parasito-vetor-hospedeiro. Observar amplicon de 120pb para todas as amostras, com exceo da cul-
Entre os fatores genticos descritos no hospedeiro, tura de T. cruzi, confirmando a especificidade dos primers para
relacionados susceptibilidade e resistncia a parasi- Leishmania spp.. Observe neste gel que est havendo consumo quase
tos, tem-se o gene NRAMP1, que expressa uma prote- completo da concentrao de primers utilizada nas reaes (setas).
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Prez-Pertejo Y, Balaa-Fouce R. DNA topoisomerase I Fax: +55.16.36336695
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eltrica negativa e, quando ligados de forma linear, reagentes, denominada mix, com o buffer, os oligonu-
constituem a estrutura primria de uma protena. cleotdeos, os primers, a amostra de DNA e a Taq
c) A sntese de uma protena est diretamente polimerase. Assinale a resposta INCORRETA:
relacionada ao cdigo gentico. Portanto, se hou- a) Um elemento muito importante no buffer o
ver alterao de uma base no cdon, esta pode Mg2+, que atua como co-fator da polimerase.
resultar em uma protena alterada ou no. b) Os primers devem ser desenhados cuidadosa-
d) Se todas as clulas humanas possuem o mente, pois, quando inespecficos, se ligam a
mesmo cdigo gentico, todas as clulas expres- vrios fragmentos do DNA genmico.
sam protenas semelhantes. c) As bases A, U, C e G devem ser incorporadas
ao mix, porque a sntese do DNA depender de
9. Enzima uma protena. Assinale a resposta sua concentrao no mix.
INCORRETA: d) A Taq polimerase enzima isolada da bactria
a) Enzimas so responsveis pelas reaes Thermus aquaticos, que se mantm estvel a altas
qumicas de uma clula; so especficas, atuando temperaturas.
sobre determinado substrato.
b) As endonucleases so enzimas de restrio 13. Assinale a resposta CORRETA:
que podem cortar uma molcula de DNA em a) Quando se quer estudar a expresso de deter-
vrios fragmentos. minado gene, faz-se a extrao do RNA total da
c) As enzimas de restrio, produzidas no cito- amostra, a seguir, com a enzima transcriptase
plasma viral, auxiliam a introduo do material reversa, transforma-se o RNA em cDNA, e, final-
gentico viral em uma bactria. mente, a PCR, constituindo a tcnica de RT-PCR.
d) As endonucleases so denominadas de acor- b) As tcnicas de PCR e PCR-RFLP (restrio enz-
do com o microorganismo do qual foram extra- imtica) muito se prestam investigao etiolgi-
das; algumas suportam altas temperaturas, como ca do agente causal em uma amostra, quer
a Taq polimerase. humana, animal ou de inseto, cujos primers no
necessitam ser to especficos.
10. Assinale a frase INCORRETA: c) O seqenciamento do DNA tcnica mais dis-
a) Todas as clulas humanas possuem o mesmo pendiosa, pois depende de um seqenciador
nmero de genes, portanto, a mesma informao automtico, e nada mais do que uma PCR da
gentica. PCR, originando fita dupla a ser analisada.
b) Todas as clulas humanas expressam todos os d) No existem tcnicas de extrao de DNA e de
genes, portanto, a expresso de uma protena RNA de uma nica amostra, tendo-se que optar
pode ser estudada em qualquer clula. por uma das molculas a ser estudada.
c) Se todas as clulas humanas possuem o
mesmo cdigo gentico, um determinado gene 14. Qual a melhor tcnica de biologia molecular para
poder ser estudado em qualquer clula. se estudar um polimorfismo de determinado gene?
d) Todas as clulas humanas, com exceo das a) A PCR, sem dvida, podendo-se extrair RNA
clulas sexuais, possuem 46 cromossomos, con- do sangue perifrico, constituindo o RNA
stituindo o caritipo. genmico.
11. A tcnica da PCR consiste na sntese in vitro de mil- b) Se o polimorfismo j descrito, pode-se veri-
hares de cpias de DNA, catalisada pela enzima ter- ficar na seqncia do DNA qual a enzima que
moestvel Taq polimerase. Assinale a resposta CORRETA: poder cortar a seqncia justamente no stio
a) A PCR tcnica simples, que consiste na polimrfico. Portanto, pode-se usar a PCR-RFLP.
desnaturao das duas cadeias do DNA, seguida c) Necessariamente, tem-se que proceder ao
pelo anelamento dos primers, e sntese do DNA, seqenciamento do DNA aps a PCR.
catalisada por uma polimerase. d) Os polimorfismos genticos so estudados
b) Para a tcnica da PCR, extrai-se RNA de qual- por RT-PCR.
quer clula ou tecido com o intuito de se estudar
a expresso protica. 15. Quais as tcnicas laboratoriais para se verificar a
c) A dupla hlice do DNA formada por duas expresso de um gene?
cadeias de polipeptdeos ligadas por pontes de a) Faz-se inicialmente a extrao de RNA total da
hidrognio. amostra e, a seguir, a RT-PCR com primers espec-
d) A extrao de DNA para a PCR s alcanada ficos para a seqncia do gene em estudo.
de amostra congelada a -70oC. Tambm pode ser realizada hibridizao in situ,
202 Roselino AM
com probes que se ligaro ao mRNA especfico. 18. Observe a figura abaixo e assinale a resposta
b) Pode-se buscar pela expresso protica no INCORRETA:
tecido, por exemplo, imuno-histoqumica com
anticorpo especfico contra a protena.
c) Pode-se realizar cultura das clulas que
expressam o gene em estudo, e, por Elisa, quan-
tificar a protena sintetizada no sobrenadante, ou
proceder immunoblotting com anticorpo contra
a protena.
d) Todas as respostas esto corretas.
Gabarito
Disidrose: aspectos clnicos, etiopatognicos e
teraputicos. 2007;83(2):107-15.
1b 11 b
2a 12 c
3c 13 d
4a 14 d
5d 15 a
6b 16 b
7a 17 b
8c 18 d
9a 19 a
10 b 20 c