1 3.

A DNS Szintzise

A DNS REPLIKCI
DIA 18
DNS szintzis in vitro A DNS kettzds (replikci) mechanizmusnak megfejtshez egy
alapveten fontos eljrst dolgozott ki Arthur Kornberg. A kutat az ltala elsknt izollt DNS
polimerz enzim felhasznlsval, templt DNS-rl dezoxiribonukleotidok (dATP, dTTP, dCTP,
dGTP) hozzadsval DNS szintzist tudott vghezvinni kmcsben (in vitro, sz szerint: vegben). 1
Fogalom magyarzat: a templt DNS az a DNS szl, amelyikrl a msik (komplementer) szl
kpzdik.
DIA 19, 20
A mechanizmus: szemikonzervatv DNS replikci. A Watson/Crick-fle DNS modell
azt sugallta, hogy a DNS replikci n. szemikonzervatv (flig konzervatv) mdon zajlik, ami
annyit jelent, hogy els generciban kpzdtt DNS egyik szla az eredeti szli DNS szl, a msik
pedig jonnan kpzdik, mgpedig a szli szlat hasznlva templtknt (mintaknt). Ezt a hipotzist
azonban be kellett bizonytani, a Kornberg-fle ksrletbl ugyanis nem kvetkezett a replikcis
mechanizmus mikntje. A bizonytst Meselson s Stahl vgezte. Az amerikai kutatk els lpsben
fellltottk a hrom elmletileg lehetsges replikcis modellt: (1) szemikonzervatv; (2) konzervatv
(a szli DNS szlai egytt maradnak, s az utd DNS mindkt szla jonnan kpzdik); (3) diszperzv
(sztszrt; az utd DNS mindkt szla tartalmaz j s szli DNS szakaszokat is). Meselson s Stahl
mdszere az n. srsg gradiens ultracentrifuglson alapult. E technika lnyege a kvetkez: a
centrifuga csben - pl. szacharz oldatbl - egy srsg gradienst kpznk (a cs tetejn alacsony, az
aljn pedig magas az oldat srsge), majd hozzadjuk a sztvlasztand anyagokat, melyek srsge
eltr. A centrifuglst kveten, a sr anyagok a cs aljhoz, a kevsb srek pedig a cs szjhoz
kzel fognak elhelyezkedni. A nitrogn norml (knny) 14-es (N14) formja mellett ltezik egy
nehezebb, nem-radioaktv 15-s molekulasly (nehz) nitrogn izotp is (N15). Ha baktriumokat
nehz N-t tartalmaz tpfolyadkban nevelnk, annak izollt DNS-e - az ultracentrifuglst kveten
- a centrifugacsben lejjebb fog elhelyezkedni, mint a knny tptalajon nevelt baktriumbl
szrmaz DNS. Meselsonk els lpsknt az elzleg hossz ideig nehz N-t tartalmaz
tpfolyadkban nevelt baktriumokat (Escherichia coli = blbaktrium) knny N-t tartalmaz
tpfolyadkba helyeztek (ez azt eredmnyezte, hogy a baktriumok DNS-e nehz nitrognbl llt).
Ezt kveten idztettk a mintavteleket az osztdshoz szksges id szerint: egyetlen osztds 20
percig tart, kt osztds 40 percig, s gy tovbb. A kutatk izolltk, majd lecentrifugltk az gy
kapott DNS-eket, s a kvetkez eredmnyeket kaptk: 20 perc utn (1. osztds) az izollt DNS a
knny s nehz DNS cskja kztt helyezkedett el; 40 perc utn kt cskot kaptak: egy kztes cskot
s egy knny DNS-nek megfelel cskot; 60 perc utn a knny DNS svja vastagabb lett, mint a
nehz. Ez a ksrlet kitn bizonytkknt szolglt a DNS szemikonzervatv replikcis mdjnak
igazolsra. Ha a DNS a konzervatv modell szerint replikldna, akkor 20 perc utn egy knny s
egy nehz DNS-nek megfelel cskot kellene kapnunk, ha a diszperzv (szrt) modell szerint folyna a
replikci, akkor elmosdott svokat kapnnk a centrifuglst kveten, melynek oka az, hogy
minden egyes DNS molekula eltr srsg lenne az eltr arny knny s nehz nitrogn atomok
miatt. Meselson s Stahl munkjt sokan a valaha vgzett legelegnsabb biolgiai ksrletknt
emlegetik.
DIA 21
Az j szl szintzise 53 irny A szemikonzervatv modell szerint a szli DNS egyik
szla templtknt szolgl az j DNS szl szintzishez. A szintzis mindig 53 irnyban zajlik. A
lncnvekedshez az energit dezoxiribonukleotid trifoszftokrl (dNTP) lehasad pirofoszft (kt
foszft) szolgltatja. A dNTP-k szintzishez ezrt a sejtnek elzetesen energit kell befektetnie.
DIA 22
RNS primer kell a lnckezdshez A DNS szintzist vgz enzim a dimer szerkezet (kt
alegysgbl ll) DNS polimerz-III (pol-III) molekula. Ez az enzim csak akkor kpes elindtani a

ALAPKVETELMNY 2. Elads Boldogki Zsolt

 2 3. A DNS Szintzise

szintzist, ha egy rvid egyszl RNS szakasz (primer) elzleg elhelyezkedik a DNS szlon. A
primer lnyegben kijelli a pol-III szmra a DNS azon szakaszt, ahol a replikci elkezddhet. Az
RNS szlat a primz nev enzim kpezi a DNS szlat hasznlva templtknt annak szintzishez.
DIA 23
Okazaki fragmensek A DNS szintzishez szmos fehrje szksgeltetik, melyek egytt az
n. replikcis komplexet alkotjk. A helikz enzim feladata a DNS szlak kitekerse, az n. egyszl-
kt fehrjk pedig a kt szli szlat tartjk elvlasztva a replikci folyamn. Mivel az j lncok
szintzise 53 irnyban halad, a kt szl eltr problmval tallja szembe magt a DNS
replikcija sorn. Az n. vezet szlon a szintzis folyamatosan haladhat, a kvet szlon azonban 2
llandan jra kell kezddnie a szintzisnek, hiszen itt a templt DNS csak akkor hozzfrhet a DNS
polimerz enzim szmra, ha a msik szlon mr elrehaladt a szintzis. Ennek eredmnyeknt a
kvet DNS szlon nem folyamatos a DNS lnc nvekedse, hanem kisebb DNS darabok jnnek ltre,
melyeket Okazaki fragmenseknek neveznk a felfedez japn Okazaki hzaspr utn. Az Okazaki
fragmensek RNS primerjeit egy RNz folyamatosan eltvoltja, a DNS fragmenseket a DNS ligz
enzim kapcsolja ssze. Korbban azt gondoltk, hogy a szintzis folyamn a replikcis komplex
mozog a DNS mentn, ma azonban mr tudjuk, hogy a replikcis komplex rgztett, s a DNS szl
mozog.
DIA 24
Telomer Az eukaritk kromoszminak vgein ismtld szekvencik helyezkednek el (az
embernl TTAGGG szekvencia 2,500-szor ismtldik), melyeket telomereknek neveznk. Ezekhez az
ismtld szekvencikhoz specilis fehrjk kapcsoldnak, melyek fontos szerepet jtszanak a
kromoszmk stabilitsnak fenntartsban. Ha 2-3 ezer bzispr eltnik a kromoszmk vgrl,
akkor problma lp fel. Mrpedig ez a helyzet az ember testi sejtjeiben; a DNS szintzisekor a DNS
kvet szlnak vgei ugyanis nem msoldnak le. Ennek oka az, hogy az RNS primernek a
lemsoland szekvencia eltt kellene kapcsoldnia a DNS-hez, a kvet szl vgn azonban ezen a
helyen 5 irnyban nincs semmi (a vezet szlon nem ez a helyzet). A sejt nem szereti az egyszl
DNS-eket (taln vrusknt rzkeli ezeket), s levgja ket. Kvetkezmnyknt, a kromoszmk
telomer rgija minden egyes sejtosztdssal rvidl, destabilizlva ezzel a kromoszmt. Sokan az
regedst a testi sejtek telomernek rvidlsvel magyarzzk. A krds az, hogy mirt nem
vdettek a testi sejtek a telomer rvidlssel szemben? Azrt, mert a tl hossz let evolcis
szempontbl nem kedvez. Az brn a kromoszmk vgeit az n. FISH (fluoreszcens in situ
hibridizci; ld. a Mol. Biol. Technikai Arzenlja eladst) jelltk meg.
DIA 25
Telomerz Ha a csravonal sejtekben (ezek kpzik az sivarsejteket, amikbl az ivarsejtek
keletkeznek) is vgbemenne a telomer rvidls, akkor az az emberisg vgt jelenten, hiszen az
utdokban egyre rvidebb lenne a DNS. Ezekben a differencilatlan sejtekben ltezik egy
mechanizmus, amely meggtolja a telomer rvidlst. A telomerz enzim egy RNS templtot
felhasznlva minden replikci utn kiegszti a megrvidlt kvet DNS szlat. A telomer s
telomerz szerepnek tisztzsrt hrom szemlyt tntettek Nobel-djjal 2009-ben: Elisabeth Blackburn,
Carol Greider s Jack Szostak.

Rkkpzds A tumor tpusok egy rszben aktivldik a telomerz enzim, teht, regenerldik a telomer, s emiatt a
tumort alkot sejtek korltlanul kpesek szaporodni. A tumor sejtek nagyobbik hnyadra azonban ppen az ellenkez
sajtsg jellemz: gyors telomer veszts, akr telomerz jelenltben is. A telomer veszts kromoszmlis instabilitst
okoz. Az instabil kromoszmval rendelkez sejtben megnvekszik a mutcis rta s az aneuploidia (eggyel tbb vagy
kevesebb kromoszma lesz a sejtekben) kialakulsnak eslye. Ez a kt folyamat megteremti a tumorok rksejtekk
alakulsnak genetikai feltteleit (rszleteket ld A rk molekulris biolgija c. eladsban.)

Optimlis lettartam A testi sejtek felteheten gy vannak megtervezve, hogy a telomer rvidls instabilitst
okozzon. Hosszabb telomer ltrehozsval a termszet egyszeren megoldhatn, hogy a kromoszmk tolerljk a
rvidlst akr vezredekig. gy tnik, hogy a termszet egy genetikai rt ptett a DNS-nkbe, hogy ezltal
optimalizlja az lettartamunkat. Ezt a nzetet tmasztjk al azok a tnyek pl., hogy a telomer s krnyki DNS rgik
trsre hajlamosak, ill. hogy telomert kvet DNS szakaszok hiperszenzitvek a trsre, s egy trs nagy esllyel okoz
kromoszmlis instabilitst.

ALAPKVETELMNY 2. Elads Boldogki Zsolt