PORTOFOLIU BIOMOLECULE

LUCRRI PRACTICE

Bndic Evelina Alexandra

Biochimie-Tehnologic, Anul III, Grupa A

2017

1
 LP1 Metode de analiz

a. Dozarea activitii fosfatazei acide

Fosfataza acid este o enzim din clasa hidrolazelor care catalizeaz reacia de hidroliz a
monoesterilor acidului fosforic.
n aceast metod, activitatea fosfatazei se evalueaz prin dozarea cantitii de p-nitrofenol (pNP)
care se formeaz, ntr-un minut, prin aciunea enzimei asupra substratului p-nitrofenil fosfatul
(pNPP).

nmol
p-NP/prob A410
Rezultate
0 0,025
Curba etalon pentru dozarea activitii fosfatazei acide
20 0,0943
standard: p-nitrofenol
2 0,1766
40
1.8
1.6
60 0,3206
1.4
1.2 80 0,306
A410

1
A410 0,4395
0.8 100
0.6 Linear (A410)
0.4 200 0,7711
0.2
400 1,7661
0
0 100 200 300 400 500
600 2,4406
c p-nitrofenol (nmol/prob)

Fig 1. Curba de etalonare pentru dozarea activitii fosfatazei acide

(A410=0.0043 CpNP + 0,0042 r2=0.9928)

O unitate de activitate enzimatic (U) reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz eliberarea
unui mol de p-NP pe minut, n condiii optime.
2
b. Dozarea proteinelor prin metoda Bradford

Principiul metodei:
Prin aceast metod, legarea colorantului Coomassie Brilliant Blue G-250 la proteine
produce o schimbare a maximului de absorbie de la 465 nm (forma roie) la 595 nm (forma
albastr). Colorantul se prepar ca soluie-stoc n acid fosforic sau percloric. Metoda este
rapid, ntr-un singur pas, n care reactivul este adugat probei, iar absorbana se citete la
595 nm. Complexul colorant-proteina are tendina de a se lega la suprafeele de sticl, dar
poate fi ndepartat cu uurin prin nmuiere n HCl 0,1 M sau splare cu soluie concentrat
de detergent.

Rezultate:

Curba etalon pentru dozarea concentraiei proteinelor (Bradford) g

standard: albumina seric bovin protein/mL A595
0 0,2032
0.6

0.5 20 0,3031

0.4
40 0,3758
A410

0.3 0,4419
A595 60
0.2 Linear (A595)
80 0,5027
0.1
100 0,5413
0
0 50 100 150
c proteina (microg/mL)

Fig. 2 Curba de etalonare pentru dozarea proteinelor

(A595=0.0034xcprotein + 0.2264 r2=0.9808)

3
 LP2 Fracionarea proteinelor prin precipitare cu solveni organici
Principiul metodei

Prin pipetarea solventului organic, etanol (Et-OH), n volume de extract proteic total (EPT) se obin
cele trei fracii , F1, F2, F3 de saturaii 20%, 40%, respectiv 60%,). Pentru F1 vom avea : 4 mL EPT i 1
mL Et-OH, pentru F2 vom avea : 3 mL EPT i 2 mL Et-OH, respectiv pentru F3 : 2 mL EPT i 3 ml Et-
OH. Aceste fracii se obin prin : precipitare (15 min repaus pe baie de ghea) , centrifugare,
decantarea supernatantului i redizolvarea precipitatului (n tampon acetat). Urmnd ca prin
dozri s se determine cantitatea de protein (metoda Bradford) i activitatea fosfatazei acide
(prin metoda cu p-nitrofenol ca substrat). Prin adugarea Et-OH se micoreaz constanta
dielectric a soluiei i puterea ei de solvatare, rezultnd scderea solubilitii proteinei i poate
avea loc agregarea acesteia prin atracie electrostatic. Precipitarea proteinei are loc mai uor
cnd valoarea pH-ului este apropiat de valoarea pI (pH-ului izoelectric) al proteinei.

Proteina purificat: Fosfataza acid.

Solventul utilizat: Etanol.

Rezultatele obinute:

Etapa Proteine Activitate Activitate Randament Gradul de

totale total specific (%) purificare
(mg) (uniti) (uniti/ mg)
Omogenizare
(EPT)

Precipitare
cu etanol
60%

Se observ c la 60% saturaie n etanol au precipitat........% din proteinele cu activitate

fosfatazic. Gradul de purificare a fosfatazei realizat prin precipitare cu etanol 60% a fost de ......

n concluzie, precipitarea cu etanol 60% este/nu eeste eficient pentru purificarea fosfatazei
acide.

4
 LP3 Dozarea activitii peroxidazelor solubile
Peroxidazele nespecifice sunt hemoproteine care catalizeaz reacia:
H2O2 +DH2 2 H2O + D

n metoda utilizat pentru dozarea peroxidazelor nespecifice, am folosit ca substrat

cromogen peroxid de hidrogen i am msurat absorbana probelor la lungimea de und de 436 nm,
corespunztoare maximului de absorbie al tetraguaiacolului.

Pentru aceast reacie, o unitate enzimatic reprezint cantitatea de enzim care catalizeaz
conversia unui mol de peroxid de hidrogen pe minut la 25oC.

Plantele de gru au fost tratate cu acid salicilic i cupru, iar activitatea peroxidazelor nespecifice a
fost dozat n extractele obinute din rdcini i frunze, la dou sptmni dup tratament.

70.00

60.00
Activitatea enzimatic (U/g s.p.)

50.00

40.00
Rdcin
30.00
Frunze
20.00

10.00

0.00
CONTROL 50 mM Cu 100 mM Cu 50 mM Cu 100 mM
+SA Cu+SA

Figura 3 Activitatea peroxidazelor la plantele de gru crescute pe medii contaminate cu acid

salicilic i cupru.

Din figura 3 se observ c att n cazul rdcinilor, ct i al tulpinilor, activitatea enzimatic are
valoarea cea mai mare la proba care conine 50 M Cu+SA.

5
 LP4 Determinarea parametrilor cinetici ai unei reacii enzimatice

KM i Vmax n prezena i n absena inhibitorilor

Pentru o reacie enzimatic, dependena vitezei de reacie de concentraia substratului are
forma unei curbe.

Aceast dependen este descris de ecuaia Michaelis Menten,

[S]
V = Vmax
[S] + KM

n care Vmax este viteza maxim

iar KM este constanta lui Michaelis-Menten.

Reprezentare dublu reciproc

(Lineweaver-Burk) y = 0.0312x + 0.0595
R = 0.9025
0.35
0.3 1/v (fara inh)
1/v, L.min.mol-1

0.25
1/v (cu inh)
0.2
0.15 Linear (1/v (fara
0.1 inh))

0.05
0 y = 0.0142x + 0.0508
R = 0.9072
0 2 4 6 8
1/S, L.mmol-1

Figura 4 Reprezentare Lineweaver-Burk a datelor cinetice

6
 Parametrul
Metoda
KM Vmax
Valoarea Unitatea Valoarea Unitatea
numeric de msur numeric de msur
Regresie liniar a cu inh: 0,68 moli L-1 cu inh: 34,6 nM min-1 L-1
datelor cinetice fara inh: 0,24 fara inh: 34,25

Regresie neliniar cu inh: 1,05 moli L-1 cu inh: 42,63 nM min-1 L-1
a datelor cinetice fara inh: 0,42 fara inh: 40,89

7
 LP5 Determinarea pH-ului optim de aciune al fosfatazei acide

Efectele posibile ale variaiilor de pH asupra activitii enzimelor sunt:

inactivitatea enzimei n afara unui anumit domeniu de pH;

schimbarea strii de ionizare a substratului;
modificarea poziiei echilibrului chimic cnd H+ este implicat n reacie.

Figura 5 Curba pH-activitate pentru fosfataza acid

Din figura 5 se observ c pH-ul optim de aciune al enzimei studiate este de 4,67.

8
 LP6 Efectul inhibitorilor asupra vitezei reaciilor enzimatice

Principiul metodei:
Pentru a evalua influena KH2PO4 asupra vitezei reaciei catalizate de fosfataza acid,
reacia de hidroliz a p-NPP se va efectua la pH 5 la concentraie constant a enzimei n mediu de
reacie i concentraii ale substratului de 0,33 pn la 8,33 mM, n trei experimente independente
n care mediul de reacie va conine i KH2PO4 n concentraiile 0,5 mM, 1mM si, respectiv 2mM.
Cantitatea de produs format se dozeaz colorimetric i este utilizat pentru a calcula viteza
reaciei enzimatice.
Inhibitorul testat: KH2PO4.

Reprezentare directa
(Michaelis-Menten)
30.00

25.00
v, mol.L-1min-1

20.00

15.00
v (fara inh)
10.00
v (cu inh)
5.00

0.00
0 2 4 6 8 10
S, mmol.L-1

Figura 6 Viteza reaciei catalizate de fosfataza acid n absena i n prezena KH2PO4.

9
Rezultatele obinute:

KM Vmax
Parametrul Valoarea Unitatea de Valoarea Unitatea de
numeric msur numeric msur
n absena 0,52 moli L-1 24,67 moli L-1 min-1
KH2PO4.

n prezena 0,74 moli L-1 20,08 moli L-1 min-1

KH2PO4.

n concluzie, activitatea fosfatazei aicide este/nu este inhibat competitiv/necompetitiv de KH2PO4.

Aceast concluzie este argumentat de valorile parametrilor cinetici:

- KM n prezena inhibitorului > Km n absena inhibitorului;

- Vmax n prezena inhibitorului < Vmax n absena inhibitorului.

KI
Metoda Valoarea numeric Unitatea de msur
- calcul (din KM aparent) 2,28 moli L-1

-grafic 4,86 moli L-1

10
 CONCLUZII

(O scurt sintez a rezultatelor obinute n experimentele efectuate

cu fosfataza acid)

11