2017

UNIVERSIDAD NACIONAL AGRARIA LA MOLINA

CURSO:

Alimentacin y nutricin humana

LABORATORIO 1:

Determinacin de la capacidad antioxidante

INTEGRANTES:

Espinoza La Cruz, Mara Del Carmen

Lian Acosta, Rossio Isabel
Mendoza Vargas, Mirtha
Rodrguez Santilln, Lesly Sofa
Vargas Acn, Camila Juliana

PROFESORA:

Repo de Carrasco, Ritva

FECHA: 12 Setiembre del 2017

I. INTRODUCCIN

Los antioxidantes son sustancias que cuando estn presentes, retardan e inhiben la
oxidacin de sustratos susceptibles al ataque de las especies reactivas del oxgeno
(ROS).

Todos los seres vivos que utilizan el oxgeno para obtener energa, liberan radicales
libres, lo cual es incompatible con la vida a menos que existan mecanismos celulares de
defensa que los neutralice. A estas defensas se les denomina antioxidantes y se pueden
clasificar en endgenos o exgenos. Dentro de los antioxidantes endgenos se
encuentran tres enzimas fundamentales: la superxido dismutasa, la glutatin peroxidasa
y la catalasa. Dentro de los antioxidantes exgenos estn la vitamina E y C, betacaroteno
o provitamina A, los flavonoides, los licopenos, los cuales se incorporan al organismo
mediante la alimentacin.

Los radicales libres, resultantes de las reacciones oxidativas que acompaan el

metabolismo, pueden inducir al cncer, enfermedades cardiovasculares o
inmunodeficiencias, cataratas oculares, aterosclerosis, diabetes, artritis, envejecimiento y
disfunciones cerebrales. Por eso es de suma importancia contrarrestar su efecto con
antioxidantes naturales como las vitaminas C y E, compuestos fenlicos, carotenoides y
antocianinas.

Nuestra salud, el bienestar y la longevidad estn relacionados con la diversidad

bioqumica de los alimentos que consumimos. La relacin entre los alimentos y la salud es
un buen ejemplo. Por este motivo es de suma importancia determinar y conocer la
capacidad antioxidante de las frutas y hortalizas.

En la presente prctica se tiene como objetivo, conocer una tcnica de determinacin de

la capacidad de antioxidante en frutas y verduras y comparar la capacidad antioxidante de
3 distintos productos como son pasta de tomate, aj y mango.
II. REVISIN DE LA LITERATURA

2.1 ANTIOXIDANTES

Los antioxidantes son un conjunto de compuestos qumicos o productos biolgicos que

contrarrestan de una manera directa o indirecta los efectos nocivos de los radicales libres
u oxidantes, tales como oxidacin a lpidos, protenas y cidos nuclecos, alterando las
funciones celulares (Lopz et al. 2012).

Martinez-Valverde et al. (2000), menciona que todos los antioxidantes, deben cumplir dos
requisitos bsicos para ser considerados como tales: en primer lugar, es que cuando se
encuentre en una concentracin baja con relacin al sustrato que va a ser oxidado pueda
retrasar, hacer ms lenta o prevenir la auto oxidacin o la oxidacin medida por un radical
libre y en segundo lugar es que el radical formado tras el secuestro sea estable y no
pueda actuar en oxidaciones posteriores.

Cada antioxidante posee una afinidad hacia un determinado RL o hacia varios, puede
actuar en los diferentes procesos de la secuencia oxidativa y tener ms de un mecanismo
de accin. Es necesario la incorporacin al organismo de ciertos oligoelementos como el
cobre, hierro, cinc, selenio y manganeso, ya que forma parte del ncleo activo de las
enzimas antioxidantes (Criado y Moya, 2009).

2.2 CLASIFICACIN DE LOS ANTIOXIDANTES

El dao oxidativo puede ser prevenido por molculas antioxidantes, las cuales son
capaces de donar electrones para estabilizar a los radicales libres y neutralizar sus
efectos dainos, stas pueden ser de origen endgeno (sintetizados por el organismo) y
exgeno (provenientes de fuentes externas) (Ultara, et al. 2009 citado por Olivares et al.
2010).

2.2.1 ANTIOXIDANTES ENDOGENOS

Entre los antioxidantes endgenos, se encuentran: La superxido dismutasa que

cataliza la dismutacin del O2 para dar origen al H2O2. El H2O2 es descompuesto
en oxgeno y agua por la catalasa. La glutatin peroxidasa dependiente de
selenio que cataliza la reduccin del H2O2. La glutatin quien contribuye con la
 glutatin peroxidasa, para reducir el H2O2 a agua, as mismo neutraliza al OH
cedindole un electrn. Adems recicla antioxidantes como la vitamina C,
reducindolos para que puedan continuar neutralizando a los radicales libres.

2.2.2 ANTIOXIDANTES EXGENOS

Se encuentran en los alimentos naturales (Tabla 1), entre estos estn las
vitaminas A, E y C, los -carotenos, lutena, flavonoides, licopenos, cido tiico o
lipoico, los cofactores (cobre, zinc, manganeso ,hierro, selenio) que son necesarios
para la actividad del sistema enzimtico endgeno y la coenzima Q.

Tabla 1. Antioxidantes Exgenos

Antioxidante Fuente Accin Antioxidante Efectos secundarios

Aguacate, camote, esprragos,

espinacas, tomate, brcoli,
Vitamina E zanahoria, aceites (oliva, maz,
(tocoferol) crtamo, soya), cereales, arroz
integral, lentejas, yema de huevo,
mantequilla, pltano, moras,
frutos secos.
Acelgas, tomates, perejil,
Vitamina C pimiento verde, coliflor, coles de
(cido Bruselas, nabos, grosellas,
ascrbico) ctricos, meln, kiwi, fresas.
-caroteno Zanahoria, tomates, espinacas,
(pro-vitamina meln, melocotn, mango)
A)
Espinacas, cebolla, ajo, t verde,
Flavonoides vino, manzanas, peras, ctricos
(polifenlicos)
Mantiene la integridad de la
membrana celular, protege la
destruccin de la vitamina A,
retarda el envejecimiento
celular
Inhibidor de la oxidacin de
lpidos, regenera a la
vitamina E, ofrece proteccin
contra todo tipo de cnceres. clculos en riones o vas
Protege al DNA, detiene el
deterioro de tejidos.
Quela metales
NRN
Su ingesta en grandes
cantidades puede
ocasionar presencia de
urinarias
Su consumo excesivo
produce descamaciones
de la piel, cada del
cabellos, debilidad, ahogo
y vmito
NRN

Forman parte del ncleo El Se, es el ms txico de

Oligoelement Carne, pescado, cereales activo de las enzimas con los minerales, su ingestin
os Selenio integrales, lcteos, ajo, cebollas, actividad antioxidante, en dosis altas produce
(Se), Zinc brcoli, frutos secos, t, pia, mantienen en buen estado perdida de cabello,
(Zn), vsceras, cacao y derivados las funciones hepticas, alteracin de uas,
Manganeso cardiacas y reproductoras, dientes, nauseas, vmito
(Mn), Cobre protector contra el cncer. y aliento a leche agria.
(Cu).
Fuente: Olivares et al (2010)
2.3 RADICALES LIBRES

De acuerdo con Coronado et al. (2015), un radical libre es aquella figura qumica que
tiene en su estructura uno o ms electrones no apareados. Es altamente reactiva y clave
para formar otros radicales libres de cadena.

Los radicales libres endgenos, son producidos normalmente en el organismo y juegan un

importante papel en su defensa del mismo contra infecciones por bacterias y virus. Si
bien, la concentracin de stos puede ser controlada por los sistemas antioxidantes
endgenos, el problema radica cuando los radicales libres provienen d fuentes exgenas,
tales como el consumo de alimentos con alto contenido de grasa, alimentos procesados,
fritos o asados y con conservadores, tambin por el consumo excesivo de alcohol, la
exposicin a diversos qumicos, radiaciones ionizantes y la exposicin prolongada a
temperaturas elevadas (Nguyen y Donnalson, 2005 citado por Olivares et al. 2010).

2.4 CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

El concepto bsico de la actividad antioxidante de varios compuestos naturales y

sintticos comprende una transicin redox mediante la cual la molcula antioxidante dona
un electrn (o tomo de hidrgeno, equivalente a la donacin de un electrn y un H+ al
radical libre R+). Durante el transcurso de esta transferencia de electrones, el carcter
radical (inestabilidad) es transferido al antioxidante, formndose un antioxidante radical
derivado. En la siguiente ecuacin se muestra la accin de un flavonoide sobre un radical
libre (Ojeda, 2003):

Flavonoide (OH) + Radical Radical flavonoide (O.) + RH

La capacidad antioxidante de los distintos grupos de compuestos depende de la

estructura individual, del nmero de oxidrilos sustituyentes, as como del peso molecular y
su solubilidad en fase acuosa o lipdica y est fuertemente condicionada por el sistema
usado como sustrato, las condiciones de catlisis de la oxidacin, las propiedades redox
de sus grupos hidroxifenlicos y la relacin estructural entre las diferentes partes de la
estructura qumica (Snchez, 2010).
Para expresar la actividad antioxidante de compuestos puros o de extractos vegetales, se
utiliza el Trolox (cido 6-hidroxi-2, 5, 7, 8-tetrametilcroman-2-carboxilico) como patrn,
sustancia que se caracteriza por ser un anlogo hidrosoluble de la vitamina E (Martnez-
Valverde et al. 2000).

Figura 1. Interaccin entre radicales libres y antioxidantes

2.5 METODOS PARA EVALUAR LA CAPACIDAD ANTIOXIDANTE

Segn Arnao (2000), citado por Yapuchura (2010), para la cuantificacin de la capacidad
antioxidante de un material biolgico existen diferentes mtodos, entre los cuales se
tienen: la medida de la capacidad antioxidante en funcin a la especie oxidante
(ERO/ERN especficos o radicales estables no biolgicos) a evaluar; el mecanismo de
actuacin del antioxidante (capacidad secuestradora de radicales, capacidad de inhibicin
de la perxidasa lipidica, capacidad de reducir metales, etc.) o del sustrato oxidable
utilizado (qumico o biolgico)

Los mtodos ms comnmente usados por su facilidad, rapidez y sensibilidad con los que
emplean radicales cromgenos naturales o radicales que simulan a una ERO o ERN. LA
presencia del antioxidante conduce a la desaparicin de estos radicales cromgenos.
Entre los radicales ms ampliamente usados estn el ABTS (1,1-diphenyl-2-
picrylhydrazyl).

2.5.1 METODO ABTS

Utiliza radical cromgeno ABTS + (color azul-verdoso), este presenta un espectro

con 3 absorbancias mximas a 414,752 y 842 nm en medio acuoso y 414,730 y
873 nm en medio etanlico. Este mtodo se basa en la actividad de una molcula
oxidante para inhibir al radical ABTS + producto de la reaccin que se observa un
cambio de coloracin de azu-verdoso a incoloro. El grado de decoloracin refleja al
radical ABTS + que fue atrapado y esto puede ser monitoreado por deteccin
espectrofotomtrica (Lima et al., 2005 citado por Yapuchura, 2010)

2.5.2 METODO DPPH (Difenil Picril Hidrazilo)

El DPPH (figura 2) es uno de los pocos radicales libres orgnicos estable,

presenta una fuerte coloracin violeta, es comercialmente disponible. El ensayo se
fundamenta en la medicin de la capacidad de un antioxidante para estabilizar el
radical DPPH, esta medicin puede hacerse espectrofotomtricamente siguiendo
el decaimiento de la absorbancia a 517 nm (Londoo, 2012).

Figura 2. Estructura qumica del radical libre metaestable DPPH

Londoo (2012), tambin menciona que entre las ventajas de este mtodo estn
su simplicidad y el bajo requerimiento instrumental; sin embargo, entre las
desventajas estn la dificultad de interpretar los resultados cuando se tienen
sustancias cuyo espectro de absorcin se solapa con el del radical; adicionalmente
el DPPH es un radical estable, centrado en nitrgeno, que dista mucho de
parecerse a las especies reactivas de importancia biolgica; de hecho muchos
 antioxidantes que reaccionan rpidamente con radicales peroxilo no lo hacen as
con DPPH , debido al impedimento estrico que representa la estructura qumica
que rodea al radical, lo cual hace que sustancias pequeas generalmente
muestren una mayor actividad.

III. MATERIALES Y MTODOS

3.1 MUESTRA ALIMENTICIA

PASTA DE
AJI AMARILLO TOMATE MANGO

3.2 MATERIALES

- Materiales de vidrio: tubos de ensayo, probeta, fiolas.

- Papel tis

- Micropipeta de 20-200 l

- Micropipeta de 100-1000 L

3.3 REACTIVOS

- Metanol

- 2,2-Diphenyl-1-picryl-hydrazyl (DPPH)

Solucin madre de DPPH. Disolver 6 mg de DPPH en 25 ml de metanol. Esta solucin

es estable aproximadamente 1 semana si se guarda protegida de la luz y en
refrigeracin.
 Solucin diluida de DPPH. Tomar 10 ml de solucin madre de DPPH y aadir 45 ml de
metanol. Medir la absorbancia, debe ser aproximadamente 1.1 ajustar la absorbancia a
este valor aadiendo metanol o solucin madre. Guardar en frasco oscuro.

3.4 EQUIPOS

- Agitador orbital

- Balanza analtica

- Centrifuga

- Espectrofotmetro

- Vrtex

3.5 PROCEDIMIENTO

- Tomar 5 g de tejido de muestra y aadir 25 ml de metanol, homogenizar.

- Colocar en un tubo Falcn protegido de la luz y agitar por 15 minutos en un agitador

orbital.

- Centrifugar el homogenizado por 15 minutos a 4000 RPM. El extracto puede ser

analizado inmediatamente o almacenado a -20 oC para su posterior anlisis.

- Ajustar el espectrofotmetro a cero con metanol

- Asegurarse que la absorbancia inicial de la solucin DPPH a 515 nm es alrededor de

1.1.

- Con una micropipeta agregar una alcuota de 150 L de la muestra y 2850 L de la

solucin DPPH en un vial de plstico. Correr un blanco con 150 L de metanol puro para
obtener un factor de correccin (debido a la dilucin).

- Permitir que la muestra reaccione con el DPPH, durante 30 minutos, mantener con
agitacin.

- A los 15 minutos transferir la solucin a una cubeta, realizar la lectura a 515 nm.

- Si la lectura de absorbancia es menor a 0.2, diluir el extracto de la muestra a un factor

apropiado y realizar la prueba nuevamente.
IV. RESULTADOS Y DISCUSIN
4.1 Resultados
Cuadro 1. Porcentaje de inhibicin de los radicales libres, segn la capacidad
antioxidante de cada muestra.
Muestras Absorbancia Promedio A g.eq.Trolox/g de % de
(A) absorbancia muestra inhibicin
Tomate 0.861 0.849 0.855 0.148 211.68456 14.755733
Aj 0.632 0.696 0.664 0.339 475.78408 33.798604
Mango 0.043 0.035 0.039 0.964 1339.98408 96.111665
Blanco 1.003

4.2 Discusin

4.2.1 Tomate
Se determin el porcentaje de inhibicin y la capacidad antioxidante del tomate utilizando
el mtodo de decoloracin del DPPH. Segn Palomo et al. (2009), la actividad
antioxidante se mide en trminos de donar hidrgeno o de la capacidad atrapadora de
radicales. La reduccin y estabilizacin del DPPH por los antioxidantes da lugar a la
decoloracin de ste, produciendo una disminucin de la absorbancia a 515nm y se
expresa como porcentaje de decoloracin de la solucin a una concentracin dada;
adems se tiene que tener en cuenta que este mtodo solo puede disolverse en medio
orgnico

La actividad antioxidante total de los tomates vara considerablemente de acuerdo a la

variedad gentica, etapa de madurez y las condiciones de cultivo. Los estudios qumicos
del fruto fresco indican que es una fuente importante de betacaroteno y vitamina C,
ambas de gran nivel antioxidante, las cuales fortalecen el nivel inmunolgico y la visin
(Rojas, 2013)

Como se observa en el Cuadro 1, el tomate tiene una capacidad antioxidante de 211.68

gTrolox equivalente por gramo, el cual resulto ser menor en comparacin al aji y el
mango, a pesar de que tenga presencia de antocianinas , las cuales son referencia para
la presencia de antioxidante (Rojas, 2013).

Pineda et al. (1999) sealan que la mayor parte de la actividad antioxidante en tomates
frescos es debida al contenido de vitamina C, carotenoides (licopeno) y diferentes
polifenoles, siendo el cido ascrbico y los compuestos fenlicos los principales
contribuyentes de la actividad antioxidante en el extracto acuoso del tomate. Sin embargo,
los cambios fsicos como elevadas temperaturas pueden producir cambios estructurales
en la vitamina C, licopeno, polifenoles y en su capacidad de inhibir radicales libres. Como
se observa en la figura 3, la capacidad antioxidante del tomate fresco es de 119.2
molTE/g, sin embargo este es en micromol, si lo paso a microgramo seria multiplicarlo
por el peso molecular del trolox (medido en unidades llamadas Trolox equivalentes (TE),
por ejemplo micromolTE/100 g) dando una cantidad de 298.34568 gmol TE/g , esta
cantidad se encuentra muy prximo al experimental, pero en mayor cantidad, puede
deberse a que el tomate en el segundo caso se agit bien y se incub durante 60 minutos
a 20 C en la oscuridad. La reduccin del DPPH radical se determin midiendo la
absorcin a 517 nm en el lector de micro placas; y en nuestro experimento fue por 30
minutos y a 515 nm (Lutz et al. 2015), por lo que influye en el momento de determinar la
capacidad antioxidante

Figura 3 : Capacidad Antioxidante de frutas y verduras frescas deshidratadas

Fuente: Lutz et al. (2015)

Como puede observarse existe una variabilidad en los valores de capacidad antioxidante,
al respecto, Spigno, citado por Bustos et al. (2012) afirma que la composicin, los
rendimientos y las respuestas observadas son notablemente influenciados tanto por la
naturaleza del disolvente como por las condiciones de extraccin. Adems la temperatura
y el pH juegan un papel esencial ya que podran facilitar la accesibilidad a la compleja
estructura tisular del tomate. Asimismo, las diferencias en las investigaciones podran
explicarse en parte por las diferentes variedades botnicas del cultivo utilizadas, como
tambin diferencias del lugar, condiciones de crecimiento, de almacenamiento, y de
procesamiento, adems de las diferentes metodologas utilizadas en la medicin de la
capacidad antioxidante (Palomo et al. 2009 y Mosqueta, 2012).

Cabe resaltar que segn Williamson y Manach, citado por Araya et al. (2006), una
capacidad antioxidante ms alta, no siempre significa que su accin sea mejor o ms
efectiva in vivo, ya que la estructura qumica determina la absorcin de los polifenoles y la
efectividad en el organismo depende de la biodisponibilidad de estos compuestos
antioxidantes

Por otro lado el porcentaje de inhibicin del tomate fue de 14.76 %, este valor se
encuentra muy prximo al mencionado por Lutz et al. (2015) de 16.4 %, esta mnima
diferencia puede deberse por lo ya antes mencionado, es decir por los diferentes
tratamientos a que las muestras fueron sometidas.

4.2.2. Aj
4.2.3 Mango
El mango (Mangifera indica) es un alimento fuente de cido ascrbico (9.79 a 186 mg
/100 g), carotenoides (1159 a 3000 mg/100 g) y (poli) fenoles presentes en la parte
comestible de la fruta que le confieren capacidad antioxidante. Lo cual significa que
contrarrestan los efectos perjudiciales de las molculas de oxgeno dainas conocidas
como radicales libres (Peralta et al., 2008). El contenido de carotenos se incrementa a
medida que avanza el estado de maduracin, en la cual se generan procesos de
biosntesis de dichas sustancias (Mier & Cez, 2011).

El mtodo se basa en la reduccin de la absorbancia medida a 515 nm del radical DPPH,

por antioxidantes. Es decir, se determina la actividad antioxidante frente a sustancias
cromgenas de naturaleza radical, ocurriendo una prdida de color proporcional con la
concentracin (Vintimilla, 2013). Debido a que el mayor porcentaje de inhibicin fue de
99.11 % en el mango, consecuentemente present un menor valor de Absorbancia
(0.039), pues a mayor poder antioxidante, mayor ser la prdida de color debido a la
inhibicin de radicales que se genera, como explica la autora.
Segn Corrales et al. (2014), la capacidad antioxidante de la pulpa de mango madura es
de 1181.46. Dichos valores indican que la pulpa de mango de contiene sustancias que
pueden ceder un tomo de hidrgeno (capacidad para atrapar radicales libres). El valor
presentado por los autores es cercano al obtenido en la prctica, siendo este de
1339.98408 g.eq.Trolox/g de muestra.

Corrales et al. (2014) exponen que se debe tener en cuenta el alto contenido de fenoles
en la pulpa de mango, 50 - 200 mg /100g, lo que confirma lo expuesto por Vintimilla
(2013), quien explica que mientras mayor sea la cantidad de poli (fenoles), mayor ser la
capacidad antioxidante de la materia prima en cuestin.

V. CONCLUSIONES

1. El poder antioxidante del mango se debe al alto contenido en fenoles totales y

carotenoides, especialmente en la pulpa madura. Lo que le confiere una propiedad
biolgica incomparable respecto a las otras muestras analizadas.
2. La capacidad antioxidante del tomate, se encuentra en menor porcentaje en
comparacin al del mango y aji, debido a que tiene un menor contenido de
carotenos y compuestos fenolicos.
3. El mtodo del DPPH es cuantitativo ms no se puede identificar los componentes
que brindan la capacidad antioxidante ni la proporcin en la que se encuentran
VI. BIBLIOGRAFA

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Lima,Per.
VII. ANEXOS

Anexo 1. Contenido de flavonoides y vitaminas antioxidantes de distintos frutos.

Fuente: Wall et al. (2015)

Anexo 2. Composicin de mtodos para medir capacidad antioxidante basada en la

instrumentacin requerida, la relevancia biolgica, el mecanismo antioxidante, el punto
final, el mtodo de cuantificacin y la adaptabilidad para medir antioxidantes lipofilicos
e hidrofilicos.
Fuente: Londoo (2012)