GUA DE PRCTICAS

Unidad acadmica:

EAP DE FARMACIA Y BIOQUIMICA

ASIGNATURA: BIOQUMICA

SEMESTRE: 2017 II
INTRODUCCION

La Bioqumica es una ciencia bsica, cuya actividad primordial est dirigida a

demostrar las reacciones bsicas que determinan la estructura y el funcionamiento
de los seres vivos.

La enseanza de la Bioqumica en las distintas reas de Ciencias de la Salud requiere de

una metodologa especfica y profunda, para la Carrera de Farmacia y Bioqumica
se ha preparado la presente gua que permitir a nuestros estudiantes contar con un
instrumento prctico y didctico para fortalecer el proceso enseanza-aprendizaje.

La presente gua otorga metodologas sencillas y claras para la

obtencin, determinacin, identi fi cacin u observacin de metabolitos o
sustancias relacionadas con los procesos bioqumicos de los seres vivos;
asimismo, plantea los ejercicios que debe realizar cada estudiante para un mejor
resultado acadmico.
 PRCTICA 01

CAPACIDAD AMORTIGUADORA DE UN FLUIDO BIOLGICO

I. Fundamento terico

La titulacin es una tcnica que permite determinar la concentracin de una solucin cuya
concentracin es desconocida utilizando como patrn otra solucin pero con
concentracin conocida denominada (solucin valorada).
La titulacin de una sustancia cida o bsica se fundamenta en la reaccin de neutralizacin
de dos especies contrarias, as tenemos que si no conocemos la concentracin de la
solucin cida, la solucin bsica debe estar valorada y debe conocerse en ambas
soluciones los volmenes utilizados.

HCl + NaOH NaCl + H2O

Los buffer son una mezcla de dos especies qumicas relacionadas (cido o base dbil y su
respectiva sal conjugada) ambas tienen una capacidad para captar y liberar H+.
Los Buffer estn presentes en casi todos los fluidos biolgicos ejerciendo un equilibrio en la
concentracin de H+.

Dentro de los buffer ms conocidos que se encuentra presente en los sistemas biolgicos
tenemos:
Buffer bicarbonato HCO3-1 y H2CO3
Buffer Fosfato HPO4-2 y H2PO4-1

Las protenas y los aminocidos tambin ejercen capacidad buffer, debido a los grupos
funcionales que presentan, a pesar que literalmente no son buffer sin embargo por la funcin
son considerados como buffer biolgicos.

II COMPETENCIA

Determina la concentracin de una muestra desconocida mediante la titulacin Determina la

capacidad buffer.

III. Materiales y equipos:

3.1 Reactivos.
a. HCl 0,1N
b. NaOH 0,01N
c. Fenolftalena
d. Agua destilada
 3.2 Equipos y materiales
a. Cinta para medir pH
b. Matraz 100 mL
c. Bureta 25 mL
d. Soporte universal
e. Pipetas 5 y 10 mL
f. Potencimetro
g. Beaker de 50 mL
h. Pinzas de nueces
i. Baguetas

IV. Procedimiento:

a) Titulacin de una solucin cida desconocida:

1. En un Matraz agregar 1 mL de la muestra desconocida del cido y 9 mL de agua
destilada, homogenizar.

2. Luego agregue II gotas de fenolftalena.

3. Iniciar la titulacin con NaOH 0.01 N, agregando gota a gota utilizando la
bureta.

4. Observar con que volumen de NaOH cambia de color (debe de quedar de un color
rosado plido) anotar el gasto del NaOH.

5. Determinar la concentracin [H+], mediante la siguiente formula.

[MP] x VMP = [bs] x Vbs

b) Capacidad buffer de la orina:

1. Colocar 2 mL de orina en un beaker, luego agregue 5 mL de agua.

2. Agregue II gotas del indicador de fenolftalena
3. Titule con la bureta que contiene el NaOH 0.01 N.
4. Anotar el gasto del NaOH
5. Determinar la concentracin de H+ en cada muestra, con la formula anterior.
6. Determinar la capacidad amortiguadora de la orina, mediante la siguiente
formula:

= # n (base adicionado)
Vol buffer (L) x pH
V. Cuestionario:
1. Si el pH de la sangre es de 7,42 Determinar la concentracin de
hidrogeniones libres?
2. A una solucin de 80 mL de cido carbnico 0,05 mol/L se le adiciona 20 mL de
NaOH 0,01 mol/L.

a) Represente la reaccin en ecuacin qumica

b) Despus de la mezcla cual es la concentracin del cido y sal en la
solucin
c) Determine el pH de la solucin
d) Si a la solucin final se le agrega 20 mL de agua destilada, cual ser su pH.
Explique si existe variacin o no.

VI. Fuentes de Informacin.

a. Devlin Thoms M. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas. Tomo
I y II. Barcelona. Edit. Revert Colombiana. S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biologa Molcular e Ingenieria Gentica.
Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioqumica de Harper. Mxico .Edit Manual Moderno. 2000.

d. Rawn M. Bioqumica. Madrid McGraw- Hill .Interamericana. 2003.

 PRCTICA 2

EXTRACCIN DE CASEINA Y DETERMINACIN DE SU PUNTO ISOELCTRICO

I. Fundamento terico

La leche contiene tiamina, riboflavina, cido pantotnico y Vitaminas A, D y K,

minerales (Ca, K, Na, P), protenas, carbohidratos (lactosa) y lpidos.
Las protenas se pueden clasificar de manera general en protenas globulares y
fibrosas. Las protenas globulares son aquellas que tienden a agregarse en formas
esferoidales y no establecen interacciones intermoleculares como son los puentes
de hidrgeno (caractersticos de las protenas fibrosas) siendo solubilizadas en
suspensiones coloidales.
En la leche hay tres clases de protenas: casena, lacto albminas y lacto globulinas
(todas globulares).
La casena es una protena conjugada de la leche del tipo fosfoprotena que se
separa de la leche por acidificacin y forma una masa blanca. Las fosfoprotenas
son un grupo de protenas que estn qumicamente unidas a una sustancia que
contiene cido fosfrico. En la casena la mayora de los grupos fosfato estn
unidos por los grupos hidroxilo de los aminocidos serina y treonina. La casena en
la leche se encuentra en forma de sal clcica (caseinato clcico).
La propiedad caracterstica de la casena es su baja solubilidad a pH 4,6. El pH de la
leche es 6,6 aproximadamente, estando a ese pH la casena cargada negativamente
y solubilizada como sal clcica. Si se aade cido a la leche, la carga negativa de la
superficie de la micela se neutraliza (los grupos fosfato se protonan) y la protena
neutra precipita
Ca2+ Caseinato + 2HCl Casena + CaCl2

Todas las protenas tienen una carga neta dependiendo del pH del medio en el que
se encuentren y de los aminocidos que la componen.
Debido a la composicin en aminocidos de la protena, los radicales libres pueden
existir en tres formas dependiendo del pH del medio: catinicos, neutros y
aninicos.
Cualquier protena tendra una carga neta positiva si se encuentra en un medio lo
suficientemente cido debido a que los grupos COOH de los aminocidos asprtico
y glutmico estaran en su forma neutra pero los grupos amino de Arginina y lisina
estaran protonados (-NH3 +).
De igual forma si la protena se encuentra en un medio con un pH muy alto estara
cargada negativamente ya que en este caso los grupos carboxilo estaran
desprotonados (COO-) y los grupos amino estaran en su forma neutra (NH2). Las
protenas tienen un pH caracterstico al cual su carga neta es cero. A este pH se le
denomina punto isoelctrico (pI).
En el punto isoelctrico (pI), se encuentran en el equilibrio las cargas positivas y
negativas por lo que la protena presenta su mxima posibilidad para ser
precipitada al disminuir su solubilidad y facilitar su agregacin.
 II. COMPETENCIA

Obtiene Caseina a partir de leche y determina su punto isoelctrico.

III. MATERIALES Y REACTIVOS

- Beaker de 25, 50 y 250 mL

- Probeta de 50 mL
- Matraz aforado de 50 mL
- Pipetas de 0,5; 1,0 y 10 mL
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Termmetro
- Tubos

- Reactivos por grupo:

o Agua destilada
o Acetato sdico 0,1.
N o cido actico 0,01
N o cido actico 0,1
N o cido actico 1,0
N o NaOH 1N
o ter etlico
o Etanol al 70%

- Materiales y reactivos de uso general:

o Soluciones buffer pH 4,0 y 7,0 para calibrar el potencimetro

o Potencimetro (pH-metro)
o Leche entera corriente ( 1 litro)

DESARROLLO EXPERIMENTAL

A. Aislamiento de la casena:

a. Caliente, en un vaso de precipitados, 150 mL de agua destilada a 38 C,

aada 50 mL de leche y luego gota a gota y con agitacin, adicione cido
actico 1M hasta que observe que se forma un precipitado (la leche se
corta)
b. Deje sedimentar y filtre sobre papel de filtro usando un embudo de cristal.
c. Lave el precipitado con 20 mL de etanol en el mismo filtro.
d. Seque el precipitado colocando varios pliegues de papel de filtro.
 e. Coloque el precipitado en un vaso de precipitado pequeo previamente
pesado, vuelva a pesar el vaso con el precipitado y luego adicione 5 mL/g
de ter etlico.
a. Filtre nuevamente.
b. Deseche el lquido, quedar un precipitado blanco de fcil manipulacin
que es la casena.

B. Preparacin de la solucin de casena:

a. Coloque aproximadamente 250 mg de casena en un vaso de 50 mL.

b. Agregue 20 mL de agua destilada y 5 mL de NaOH 1N; agite hasta lograr
una solucin total de la casena.
c. Una vez disuelta la casena, se vierte en un matraz aforado de 50 mL,
adicione 5 mL de cido actico 1N y diluya con agua destilada hasta 50 mL
y mezcle bien.
d. La solucin debe ser clara y limpia y si no es as, debe volver a filtrar.

C. Determinacin del pI de la casena:

En diez tubos de 25 mL limpios y secos adicione exactamente los volmenes de los

reactivos segn la siguiente tabla:

TABLA DE DISOLUCIONES

TUBO Acetato 0.1N Ac. Actico Ac. Actico pH

0.1 N 0.01 N resultante(aprox.)

1 0.5 9.5 - 3.2

2 1 9 - 3.6
3 1.5 8.5 - 3.8
4 2 8 - 4.0
5 3 7 - 4.2
6 4 6 - 4.5
7 6 4 - 4.7
8 8 2 - 5.1
9 6 - 4 5.5
10 8 - 2 6.1

Medir experimentalmente el pH en todos los tubos, que debe cubrir un

rango aproximado semejante al terico (3 a 6,5). Anotar los valores reales en la
Tabla, que deben ser semejantes a los expresados y en todo caso creciente.

Aadir 1 mL de disolucin de casena a cada tubo.

Agitar suavemente cada uno y esperar aproximadamente 3 minutos.

 Medir la absorbancia de cada muestra a 640 nm con las cubetas de colorimetra
de 1 cm de paso ptico, teniendo la precaucin de agitar bien el contenido de
cada tubo para obtener una solucin / suspensin homognea antes de verter
una parte en la cubeta.

Anotar resultados, representar la absorbancia frente al pH, y determinar el pI

aproximado de la casena.

IV. Cuestionario
1) Cul es el punto isoelctrico de la casena?
2) Por qu las protenas tienen solubilidad mnima en el pI?

V. Fuentes de informacin:

a. Devlin Thoms M. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas. Tomo

Barcelona. Edit. Revert Colombiana. S. 2000.
b. Luque L, Hermoza A. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica.
Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.

c. Martin D W. Bioqumica de Harper. Mxico .Editorial Manual Moderno.

2000.

d. Rawn M. Bioqumica. Madrid Mc Graw - Hill. Interamericana. 2003.

 PRCTICA 3

I. MARCO TERICO

El almidn constituye un importante componente de la dieta de los seres humanos. El proceso de

digestin de este nutriente se inicia en la cavidad oral, lugar en que acta la alfa-amilasa salivar,
enzima que tiene la propiedad de hidrolizar los enlaces alfa 1,4 del almidn y formar
polisacridos de menor peso molecular.

II. COMPETENCIA:
Realiza in vitro la hidrlisis del almidn por accin de la amilasa salival

III.MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES
- Beaker de 25, 50 y 250 mL
- Probeta de 50 mL
- Matraz aforado de 50 mL
- Pipetas de 0,5; 1,0 y 10 mL
- Embudo de vidrio mediano
- Papel de filtro
- Tubos

Reactivos
- Agua destilada
- Buffer fosfatos 0,1 M pH 6,5
- Solucin de almidos al 1 %
- cido Clorhidrico 0,5 N
- Solucin de Saliva al 10 %

IV. TCNICA OPERATORIA

Para realizar el experimento se prepararn los siguientes medios de reaccin:

1 2 3

mL. tampn fosfato 0.1 M pH 6.5 1.0 1.0 1.0

mL. de almidn al 1 % 2.0 2.0 2.0
mL. cido clorhdrico 0.5 N --- --- 1.5
mL. de agua destilada 2.0 1.5 ---

Colocar los tubos de ensayo en el bao mara a 37 C durante 2 min, luego adicionar:

mL. solucin de saliva --- 0.5 0.5

Colocar nuevamente los tubos en bao mara y sacar alcuotas de 0.5 mL. de cada uno de los
tubos a los 0, 5, 10, 15 y 20 minutos, y adicionarlos a tubos previamente preparados que
contienen 2.0 mL de cido clorhdrico 0.05 N, de acuerdo al siguiente esquema:

Tubo N 1 2 3
mL de cido clorhdrico 0.05 N 2.0 2.0 2.0

Luego adicionar a cada tubo:

Gotas de solucin de Lugol I gota I gota 1 gota

Dejar en reposo durante 1 minuto y observar el color formado.

Durante el desarrollo del experimento se observarn modificaciones del color inicial de los tubos
como consecuencia de la accin de la alfa-amilasa salivar.
El experimento concluye cuando uno de los tubos muestre un color pardo claro.

V. CUESTIONARIO

a. Elabore un mapa conceptual acerca de los factores que afectan la

actividad enzimtica
b. Explique las aplicaciones clnicas de la ecuacin de Linewaber y Burk.

VI. FUENTES DE INFORMACIN

a. Devlin Thomas M. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas. Tomos I y II.

Barcelona. Revert Colombiana. S. 2000.

b. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud. Espaa. McGraw

Hill- Interamericana. 2001.

c. David L N, Cox M M. y Lehninger A. Principios de Bioqumica.

Barcelona. Omega. 2001.

d. Luque L y Hermoza A. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica.

Barcelona. Hartcourt. 2001.
 PRCTICA 4

EXTRACCIN DE OLIGOFRUCTANOS E IDENTIFICACIN DE CARBOHIDRATOS

I. FUNDAMENTO TERICO:

Los carbohidratos son biomolculas que presentan grupo funcional carbonilo

(aldehdo y cetona) y varios grupos hidroxilos en cada carbono.
Los carbohidratos tienen la propiedad qumica oxidarse por el carbono anomrico,
(grupo carbonilo) dando origen a un cido orgnico, y produciendo la reduccin de
otros compuesto, es por ello que los carbohidratos principalmente los monosacridos
y algunos disacridos expresan esta propiedad, sin embargo e n los polisacridos
dicha propiedad est ausente.
Los carbohidratos pueden formar polmeros mediante la unin entre ellos (enlaces o-
glucosdicos) dando origen a monosacridos, disacridos, oligosacridos y
polisacridos.

Los fructanos son los polisacridos no estructurales ms abundantes en la naturaleza,

presentes en muchas especies de plantas, en hongos del tipo Aspergillus sp. y en
bacterias. De este grupo los ms ampliamente estudiados y de mayor uso a nivel
industrial son la inulina y los fructooligosacridos o FOS, que se caracterizan por sus
enlaces de tipo -(2-1) entre las unidades de fructosa, con un grado de polimerizacin
que vara entre 2 y 60 unidades, y se les considera carbohidratos de cadena corta o de
bajo nivel de polimerizacin.

II. COMPETENCIAS:
Extrae oligofructanos del jugo del yacon e identifica los carbohidratos con los diferentes
reactivos.
Explica el fundamento de reconocimiento de los reactivos.

III. MATERIALES Y REACTIVOS:

Reactivo de Lugol
Reactivo de Benedict
Reactivo de Molish
Reactivo de Selivanoff
cido clorhdrico 0,5 N
Alcohol etlico
Acido sulfrico
Solucin A (Galactosa)
 Solucin B (Sacarosa)
Solucin C (Maltosa)
Solucin D (Almidn)
Pipetas de 1, 5 y 10 mL
Beaker 250 mL
Rejilla
Trpode
Mechero
Bao mara
Tubos de prueba 13 x 100mm

IV. MTODO OPERATORIO:

a. El extracto de yacn se obtiene triturando muestra fresca, se diluye con agua y

se agita por 15 min a 80 C. Se enfria y se afora a 100 mL con agua destilada. Se
filtra (muestra).
b. Reaccin con el reactivo de Lugol: esta prueba es utilizada para identificar
polisacridos:
A B C D E
mL Solucin A 0,5 -- -- -- --
mL Solucin B -- 0,5 -- -- --
mL Solucin C -- -- 0,5 -- --
mL Solucin D -- -- -- 0,5 --
mL Muestra -- -- -- -- 0,5
mL HCl 0,5 N 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2
mL Rvo. de Lugol 0,2 0,2 0,2 0,2 0,2

Llevar a bao Mara a 100 C por 3 a 5 minutos. Evaluar el color y el precipitado.

Indique segn resultados, que carbohidratos corresponde a cada solucin.

c. Reaccin de Molish.
Colocar 2 mL de cada solucin y la muestra problema. Luego adicionar
II gotas de reactivo de Molish, mezclar. Lentamente deslizar por las
paredes del tubo, 1 mL. de cido sulfrico concentrado, (reaccin
exotrmica). La formacin de un anillo de color violeta o prpura indica
presencia de glcidos.

d. Reaccin de Benedict.
Colocar 2.5 mL de Reactivo de Benedict en 5 tubos, calentar hasta
ebullicin por 2 minutos. Si no hay cambio de color se adicionan V
gotas de c a d a s o l u c i n y d e Muestra problema, luego se colocan
en B.M. hirviente durante 3 minutos, luego se deja enfriar. La aparicin
de una coloracin o, precipitado, amarillo anaranjado o rojo, indica
presencia de glcidos reductores.
 e. Reaccin de Selivanoff. En un tubo de prueba se coloca 3 mL de
solucin clorhdrica de resorcinol y 6 mL de cada solucin y de la
Muestra problema. Luego se coloca en Bao de Mara hirviente por
unos minutos. El desarrollo inmediato de una coloracin anaranjado
rojizo indica presencia de cetosas.

V. CUESTIONARIO:

1. Explique el fundamento del reconocimiento de Benedict.

2. Indique dos mtodos qumicos para reconocer azucares reductores

VI. FUENTES DE INFORMACIN.

a. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud. Espaa. Edit.

Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.
b. Luque L y Hermoza A. Biologa Molecular e Ingeniera
Gentica. Barcelona. Edit. Hartcourt. 2001.
c. Matheus Van Holde. Bioqumica. Mxico. Edit. Mc Graw Hill. 2000.
d. Martin, D.W. Bioqumica de Harper. Mxico. Edit. Manual Moderno.
2000.
d. Lehninger, A.. Bioqumica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.
e. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001
 PRCTICA 5

DETERMINACIN DE LA CONCENTRACIN DE GLUCOSA EN SUERO SANGUINEO

I. MARCO TERICO.

La glucosa es una sustancia cuyos niveles en la sangre pueden constituir un indicio, que podra
permitir diagnosticar diversas patologas: diabetes mellitus, mixedema, hipopituitarismo, etc.

II. COMPETENCIA
Determina la concentracin de glucosa en sangre utilizando el mtodo enzimtico de Trinder.

III MATERIALES Y EQUIPOS.

a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara 37 C.
a. Gradilla.
b. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
c. Micropipeta de 10 a 50 uL
d. Micropipeta de 100 a 1000 uL
e. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
f. Ligaduras
g. Agujas 20 x 1
h. Tips azules y amarillos

Reactivos.

a. Solucin estndar de Glucosa 100 mg/dL.

b. Reactivo Enzimtico
c. Alcohol etlico absoluto
d. Indicador rojo de fenol.
e. Agua destilada.
f. Algodn

IV. FUNDAMENTO DEL MTODO:

La determinacin enzimtica de glucosa sangunea se realiza utilizando 2 enzimas: glucosa

oxidasa y peroxidasa, cuyas acciones catalticas en presencia de apropiados reactivos qumicos,
permitirn la formacin de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reaccin.

Glucosa oxidasa
Glucosa + H2O + 02 Acido glucnico + H2O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
V. PROCEDIMIENTO.

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B X St

Suero o plasma ---- 10 L ----

Standard ---- ---- 10 L
Reactivo de trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0

Incubar en bao mara a 37 C durante 10 minutos y leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

VII. RESULTADOS.
Determinar la concentracin mg/dL utilizando el mtodo del factor de calibracin

VII. Cuestionario
1. Cules son los valores normales de glicemia?
2. En qu condiciones debe tomarse la muestra?
3. Como procedera si el resultado es 220 mg/dL?

VIII. FUENTES DE INFORMACIN

a. Lehninger, A. Bioqumica. Barcelona . Omega. 2002.

b. Devlin TM. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Barcelona. Revert Colombiana S.A.
2000.
c. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud. Espaa McGraw -
Hill- Interamericana. 2001.
d. Luque L. y Hermoza A. BiologaMolecular e Ingeniera
Gentica. Barcelona. Hartcourt. 2001.
e. Martin DW. Bioqumica de Harper. Mxico. Manual Moderno.2000.

PRCTICA 6

AISLAMIENTO DE GLUCGENO DEL HGADO DE POLLO

I. MARCO TERICO.

El glucgeno como sustancia de reserva, se encuentra en muchos

tejidos animales, especialmente en el hgado y msculos. El hgado de
gran nmero de especies animales tiene la capacidad de almacenar la
glucosa bajo la forma de glucgeno.
 El glucgeno puede ser extrado por varios mtodos, uno de los
cuales es la hidrlisis alcalina del tejido, la que degrada a las
protenas y otros constituyentes de la clula dejando l i b r e al
glucgeno, posteriormente puede ser precipitado por su baja
solubilidad en alcohol.

Si una persona es sometida a un perodo de ayuno durante 24 horas,

el glucgeno heptico disminuye ya que tiene que cubrir las
necesidades de glucosa.

Las vas de sntesis y degradacin de este polisacrido,

denominadas glucognesis y glucogenlisis respectivamente, estn
integradas en el conjunto de reacciones de la red metablica
celular a travs de un metabolito comn la glucosa-6-fosfato.

II. COMPETENCIA

Aisla glucgeno del hgado de pollo y determina el porcentaje de

este carbohidrato contenido en el hgado.

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

3.2. Equipos y materiales.

a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara 37 C.
d. Cocina elctrica.
e. Mortero y piln.
f. Balanza.
i. Gradilla.
j. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
k. Micropipeta de 10 a 50 uL
l. Tubos de prueba de 13 x 100mm y de 16 x 150 mm.
m. Micropipetas de 100 a 1000 uL con punteras.
n. Embudo mediano; baguetas y punteras amarillas.
o. Pinzas de madera y bolas de vidrio de 100 mm de dimetro

3.2. Reactivos.

g. Solucin saturada de sulfato de sodio.

h. KOH al 30% ;
i. NaOH O.5M.
j. HCl 1.2 M
k. Alcohol etlico absoluto
l. Indicador rojo de fenol.
m. Agua destilada.
IV. PROCEDIMIENTO.

A. Aislamiento de glucgeno

a.En un tubo de prueba de 16 x 150 mm, depositar 1 g. de

hgado (triturado), adicionar 4 mL de KOH al 30 %, luego
colocar el tubo en Bao Mara hirviente durante 20 minutos,
agitando de vez en cuando.
b. Retirar el tubo y colocarlo en un recipiente con agua
helada.
a. Adicionar 0.4 mL de solucin saturada de sulfato de
sodio y mezclar enrgicamente
b. Adicionar 8 mL de alcohol absoluto (para pp el
glucgeno), dejar en el bao de hielo durante 5 minutos.
c. Centrifugar por 5 minutos a 3,000 g.
d. Elimine el sobrenadante y disuelva el glucgeno pp en 5 mL de
agua destilada, (caliente suavemente para disolver).

B. Hidrlisis y determinacin del glucgeno.

a. En una gradilla disponga dos tubos de prueba, y adicione a cada

tubo 2mL de la solucin anterior.
b. Adicionar a cada tubo 2 Ml de HCL 1.2 M., tape la boca de los
tubos con una bolita de vidrio, y luego coloque los tubos a B.M.
por 2 hrs.
c. Agregue a cada tubo I gota de rojo de fenol y neutralice con NaOH
0.5 M hasta que el indicador vire de rosa a anaranjado y luego a
amarillo.
 d. Deje enfriar y luego complete a 5 mL con agua destilada.
e. Determine luego glucosa por el mtodo de la glucosa oxidasa.

V. RESULTADOS

El glucgeno se expresa en mg/dL de glucosa.

VI. CUESTIONARIO.

a. Grafique la cascada glucogenoltica

b. Fundamente la causa por la que la glucosa no se almacena en el
organismo como glucosa, sino bajo la forma de glucgeno.
c. Describa como actan las enzimas que intervienen en la
glucogenolisis.
d. Cmo se realiza la regulacin de la glucogenogensis?

VII. FUENTES DE INFORMACIN

a. Lehninger, A. Bioqumica. Barcelona . Omega. 2002.

b. Devlin TM. Bioqumica con aplicaciones clnicas. Barcelona.
Revert Colombiana S.A. 2000.
c. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud.
Espaa McGraw - Hill- Interamericana. 2001.
d. Luque L. y Hermoza A. Biologa Molecular e
IngenieraGentica. Barcelona. Hartcourt. 2001.
e. Martin DW. Bioqumica de Harper. Mxico. Manual
Moderno.2000.
 PRCTICA 7

DETERMINACIN DE LA ACTIVIDAD DE LA CATALASA EN DIVERSOS TEJIDOS

DE ORIGEN ANIMAL Y VEGETAL

I. MARCO TERICO

La enzima catalasa, controla la formacin del perxido de hidrgeno al trmino de la

cadena de transporte de electrones, desdoblndolo en agua y media molcula de
oxgeno, juega un rol importante en el equipo de antioxidantes de tipo enzimtico.

II. COMPETENCIA
Evidencia la presencia de Catalasa en diversos tipos de tejidos mediante el
Desdoblamiento del perxido de oxigeno

III. MATERIALES

a. Tabla y cuchillo para picar

b. Balanza.
c. Esptula
d. Mortero con piln
c. Tubos de prueba de 13 x 100mm y de 16 x 150 mm
d. Pipetas de 1, 5 y 10 mL
e. Baguetas
f. Centrifuga.
f. Embudo de vidrio
g. Papel de filtro

Reactivos.
a. Solucin de perxido de hidrgeno 30 mM
b. Solucin salina fisiolgica (Cloruro de Sodio 0.9 %)

IV. PROCEDIMIENTO

1. Se limpiarn apropiadamente, m u e st ra s d e te j i d o ve ge ta l
( p a p a , ra b a n i to ) y a n i m a l ( h ga d o, c o ra z n , m u s c u l o ) , s e
p e s a r 1 g d e c a d a m u e st ra , s e t r i t u ra r y h o m o g e n e i za r
a l 1 0 % c o n s o l u c i n s a l i n a fi s i o l g i c a .
2 . C o l o c a r e n t u b o s d e e n s ayo 3 m L d e s o l u c i n d e
p e r x i d o d e h i d r g e n o 3 0 m M y a a d i r 0 . 5 m L d e l fi l t ra d o .
3 . O b s e r va r e l d e s p re n d i m i e nto d e x i ge n o
Re p e ti r e l e n s ayo c o n c a d a m u e st ra y c o m p a ra r l o s
re s u l ta d o s

V. RESULTADOS
 Formular las conclusiones de acuerdo a lo observado en el procedimiento
operatorio

VI. CUESTIONARIO.

a. Elabore la grfica de la cadena respiratoria poniendo nfasis en la

participacin de la catalasa
b. Elabore un mapa conceptual de la actividad biolgica de la
enzima.

VII. FUENTES DE INFORMACIN.

a. David LN, Cox M.M. y Lehninger A. Principios de Bioqumica.

Barcelona. Omega 2001.
b. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud .Espaa.
McGraw-Hill Interamericana. 2001.

c. Luque L, Hermoza A. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica. Barcelona.

Hartcourt 2001.
d. Martin DW. Bioqumica de Harper. Mxico. Manual Moderno. 2000.
 PRCTICA 8

SAPONIFICACIN

I. MARCO TERICO

Los aceites vegetales, como el aceite de coco o de olivo, y las grasas animales, como el
sebo, son steres de glicerina con cidos grasos. Por eso cuando son tratados con una
base fuerte como sosa o potasa se saponifican, es decir producen la sal del cido graso
conocida como jabn y liberan glicerina. En el caso de que la saponificacin se efecte
con sosa, se obtendrn los jabones de sodio, que son slidos y ampliamente usados en
el hogar. En caso de hacerlo con potasa, se obtendrn jabones de potasio, que tienen
consistencia lquida.

II. OBJETIVO:

Poner de manifiesto ciertas propiedades de los lpidos, algunas de las cuales pueden
servirnos para su identificacin.

III. MATERIALES

Materiales
Beaker 500ml 100ml,
Bao mara
Papel filtro
Pipetas de 10ml
Cpsula de porcelana.

Reactivos

Aceite de palma o aceite de coco

KOH (1g/ml agua),
 HCl al 10%
CaCl2 al 10%
NaCl (sal de cocina).

IV. TECNICA OPERATORIA

Reaccin de saponificacin
En un vaso de precipitado de 1000ml calienta en un bao mara 15 g de aceite de
palma o aceite de coco. Agitando constantemente agrega 13 ml de KOH (1g/ml
agua). Terminada la adicin, contina calentado en bao mara y agita durante 50
min. Adicionar cloruro de sodio para separar el jabn.

V. CUESTIONARIO

1) Si se agita frecuentemente la mezcla de reaccin, Se acelera la velocidad de

saponificacin? Porqu?

2) Qu son las micelas?

3) Una molcula de jabn, Es o no soluble en agua? Explica tu respuesta.

4) Explica fsicamente cmo un jabn es capaz de quitar una mancha de

aceite de una tela.

5) Qu diferencia estructural hay entre un jabn y un detergente?

VI. FUENTES DE INFORMACIN

a. Lozano - Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud. Espaa .
Edit. Mc Graw- Hill- Interamericana de. 2001.

b. Luque L y Hermoza A. Biologa Molcular e Ingenieria

Gentica. Barcelona.Edit. Hartcourt. 2001.

f. Matheus Van Holde. Bioqumica. Mxico. Edit. Mc Graw Hill.2000.

g. Martin, D.W. Bioqumica de Harper. Mxico. Edit. Manual Moderno.

2000.

h. Lehninger, A.. Bioqumica. Barcelona .Edit. Omega. 2001.

i. Claros MG, Avila C. Gallardo F. Madrid .Edit. ISBN. 2001

 PRCTICA 9

DETERMINACIN DE COLESTEROL EN SUERO SANGUINEO

I. MARCO TERICO.

El colesterol es el esteroide ms abundante en el organismo humano.

Es un componente habitual de la dieta ( carne, leche, huevos) , pero
fundamentalmente el, organismo lo sintetiza en el higado. Es importante
mencionar que una de sus principales funciones biolgicas es la de
regular la fluidez de las membranas celulares y la de constituirse como
uno de los precursores de hormonas esteroideas, gestgenos y
corticoides, andrgenos, estrgenos , vitaminas y otros compuestos
biolgicos

Se desplaza por la sangre en partculas denominadas lipoprotenas, que

contienen tanto lpidos como protenas. El organismo cuenta con tres
tipos de lipoproteinas:

Lipoproteinas de baja densidad (LDL): Contienen cerca del 70 por ciento

del colesterol del suero y favorecen los trastornos cardiovasculares

Lipoproteinas de baja densidad (HDL): Acumulan el 20 por ciento del

colesterol total y tienen un efecto protector

Lipoproteinas de muy baja intensidad (VLDL): Contienen en torno al 10

por ciento del colesterol total del suero y la mayor parte de los
triglicridos

La principal consecuencia del exceso de colesterol en sangre es el

desarrollo de enfermedades coronarias (EC). Que son frecuentes en las
poblaciones cuya alimentacin es rica en grasas saturadas

La hipercolesterolemia est estrechamente ligada a la arterosclerosis,

una alteracin degenerativa que ataca a las arterias en las que se forman
placas de ateroma.
que obstruyen total o parcialmente los vasos de las arterias ocasionando
una falta de riego. Si la falta de riego se localiza en las arterias coronarias
que irrigan el corazn se puede originar una angina de pecho o un infarto
de miocardio. Si se produce en las arterias cerebrales son frecuentes las
hemorragias y trombosis cerebrales. Cuando la obstruccin se localiza en
las extremidades puede favorecer la gangrena de un miembro y, en el
peor de los casos, su amputacin.
II. COMPETENCIA

Determina la concentracin de colesterol en suero sanguneo.

Concientiza el riesgo que genera concentraciones elevadas de
colesterol (a t e r o m a ) o bajas (a f e c c i n heptica o tiroidea).

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

Equipos y materiales.
1. Espectrofotmetro.
2. Centrifuga.
3. Bao Mara regulado a 37C.
4. Jeringas descartables x 5ml. con aguja hipodrmica estril.
5. Algodn, ligadura.
6. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
7. Pipetas de 10 mL.
8. Micropipetas de 0 a 50 uL.
9. Punteras amarillas, gradillas y baguetas.

Reactivos.
10. Set de reactivos para colesterol ( enzimtico ).
11. Muestra biolgica.
12. Alcohol medicinal.

IV. TECNICA OPERATORIA.

A.En una gradilla disponer tres tubos de prueba de 13 x 100mm,
rotularlos con P (problema), S (Standard ) y B (blanco) luego
proceder como sigue

REACTIVOS P S B

Suero del paciente 10 ul - -

Standard de colesterol 200mg/dl - 10ul -

Agua destilada - - 10 ul

Reactivo enzimtico 1mL 1mL 1mL

B. Reposo x 20 minutos.
C. Leer a 650 nn, llevando el espectrofotmetro a cero en
absorvancia con el blanco de reactivos.
D. Para obtener la concentracin de colesterol de la muestra
problema, se aplica la siguiente frmula.
 mg de colesterol/ dL = absorbancia del problema X 200
absorbancia del standard

V. RESULTADOS.
Concentraciones de colesterol, en mg/dL, obtenidos por los alumnos enen
las muestras analizadas.

VI. CUESTIONARIO.
i. Describa como se realiza la biosntesis del colesterol.
ii. Qu ocurre cuando el LDL-colesterol no es fagocitado?
iii. Mencione cuatro mtodos para la determinacin de
colesterol en sangre, indicando cul? de ellos es el ms
exacto y porque. y
Porqu?
iv. Mencione lo requisitos indispensables que debe
observar una persona,para que su determinacin de
colesterol sea real.
v. Explicite la biosntesis de colesterol a partir de la
ingesta de carbohidratos.

VII. FUENTES DE INFORMACIN.

i. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.
ii. Devlin TM.Bioqumica . 4 ed. Barcelona. Reverte. 2004.
iii. Lehninger .Principios de Bioqumica.4 ed. Barcelona. Omega . 2006.
iv. Mathews CK, Van Holde KE Bioqumica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.
2002.
 PRCTICA 10

HIDRLISIS ENZIMTICA DE LOS LPIDOS

I. MARCO TERICO.
Los lpidos de la dieta son hidrolizados a nivel del yeyuno por accin de la lipasa
pancretica. En este proceso juegan un papel muy importante las sales biliares,
compuestos que tienen la propiedad de emulsionar los lpidos para una eficiente accin
de la lipasa pancretica.

II. COMPETENCIA
Demostrar experimentalmente la accin hidroltica de la lipasa pancretica

III. MATERIALES y REACTIVOS.

a. Tubos de ensayo
b. Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
c. Gradillas
d. Probeta de 50 mL.
e. Beakeres de 50, 100 y 250mL
f. Frasco gotero.
g. Piceta
h. Mortero con piln
i. Bureta de 25 o 50mL
j. Bao Mara

Reactivos

a. Aceite
b. Sales biliares al 1 %
c. Solucin de NaOH 0,05 N
d. Buffer fosfato 0,1 M, pH 7,8
e. Solucin de fenolftalena
f. Solucin de pancreatina al 1 %

IV. TCNICA OPERATORIA

Con la finalidad de mostrar experimentalmente la accin hidroltica de la lipasa

pancretica se prepararn los siguientes medios de reaccin:
 B 1 2 3

mL. de tampn fosfato 0.1 M pH 7.8 2.0 2.0 2.0 ---

mL. de aceite 1.0 1.0 1.0 1.0
mL. de sales biliares al 1% 2.0 2.0 --- 2.0
mL de agua 5.0 --- 2.0 2.0

Aadir II gotas de fenolftalena a cada uno de los tubos, luego adicionar gota a gota una
solucin de NaOH 0.05N hasta que aparezca una coloracin dbilmente grosella estable,
luego adicionar:

mL. de solucin de pancreatina al 1% --- 5.0 5.0 5.0

Volver a incubar los tubos a la misma temperatura durante 1 hora, agitndolos cada 5
minutos.

Al finalizar el tiempo de incubacin adicionar nuevamente a cada tubo II gotas de

fenolftalena y proceder a titular, utilizando una bureta, con una solucin de NaOH 0.05 N
hasta que aparezca nuevamente la coloracin ligeramente grosella.

V. RESULTADOS

Los resultados se expresarn como miliequivalentes de cido esterico liberado por accin
de la lipasa pancretica.

VI. CUESTIONARIO
1. Que funcin cumple la fenolftalena
2. Como explica los resultados obtenidos?
3. Qu rol tuvieron las sales biliares?
4.

VII. FUENTES DE INFORMACIN

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioqumica . 4 ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioqumica.4 ed. Barcelona. Omega .

2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioqumica. 3a ed. Madrid.Addison

Wesley. 2002.
 PRCTICA 11

REPRESENTACIN GRFICA DEL MECANISMO DE ACCIN DE

LAS HORMONAS A NIVEL DE MEMBRANA y A NIVEL DE

NUCLEO

I. MARCO TERICO.
Las hormonas son sustancias qumicas que se caracterizan por ejercer su
actividad en un lugar diferente a donde se producen, se encuentran por lo
general asociadas a una glndula endocrina, esta libera a la hormona al
torrente sanguneo hasta que recibe la seal fisiolgica adecuada. La
hormona viaja por el torrente circulatorio e interacta con la las clula
diana mediante la unin inicial a un receptor macromolecular, situado en la
membrana plasmtica o en el interior de la clula .

Para ejercer su accin, todas las hormonas deben unirse a su receptor

especfico, estas uniones inician mecanismos intracelulares que conllevan
las respuestas celulares. De acuerdo a su mecanismo de accin las
hormonas se dividen en dos grupos , unas de las que vamos a tratar en
esta prctica , se unen a los receptores celulares localizados en la
membrana de las clulas diana. Esta unin dispara uno o ms de las vas de
transduccin que llevan a las respuestas celulares. La interaccin con el
receptor de membrana es rpida y reversible. Debe existir alta afinidad y
especificidad, ya que las hormonas se encuentran en muy baja
concentracin a nivel sanguneo. Con la unin de la hormona al receptor y
activacin del segundo mensajero se producen seales intracelulares que
son especficas para cada receptor; son amplificadas y generan una
variedad de efectos secundarios y terciarios que modifican la funcin
celular.

Los receptores de membrana en general presentan dominios especficos

que: a.). Se unen al ligando; b). Interactan con sistemas efectores ya sea
en forma indirecta a travs de la protena G o directa por los canales del
calcio; c). Tienen actividad enzimtica inherente; d). Determinan la
localizacin en la membrana e internalizacin.

Las hormonas esteroideas y tiroideas actan a nivel de ncleo, utilizando

receptores intracelulares.
Con respecto a las hormonas esterodeas, estas se producen en clulas
especficas de los testculos, la corteza adrenal, ovarios y placenta. Los
testculos son los encargados de secretar, principalmente, testosterona
(andrgenos), la corteza adrenal produce la aldosterona, cortisol y la
DHEA (dehidroepiandrosterona), los ovarios producen los estrgenos que
engloban el estradiol, 4-androsteno-3, 17-diona y la progesterona, y por
ltimo esta la placenta que tambin secreta estradiol y progesterona,
pero adems produce otra sustancia, el estriol.

Gracias a su naturaleza lipdica las hormonas esterodeas atraviesan

facilmente las membranas de las clulas diana o clulas blanco, y se unen
a las molculas receptoras de tipo proteico, que se encuentran en el
citoplasma. De esta manera llegan al ncleo, donde actan sobre genes
del ADN, se produce la transcripcin. Las molculas de ARNm originadas
se encargan de dirigir en el citoplasma la sntesis de unidades proteicas,
que son las que producirn los efectos fisiolgicos hormonales.

Las hormonas tiroideas se liberan cuando el hipotlamo secreta la

hormona liberadora de tirotropina, que estimula la hipfisis anterior para
liberar TSH, que a su vez estimula la glndula tiroides para secretar: L-
tiroxina (T4) y L-triyodotironina (T3) (fig. ). Pequeas cantidades de T4 y T3
estimulan el metabolismo energtico, especialmente en el hgado y en el
msculo. Estas hormonas se unen a un receptor proteico intracelular
especfico; el complejo hormona-receptor activa algunos genes que
codifican enzimas que intervienen en la produccin de energa,
incrementando su sntesis y, por tanto, incrementando la tasa metablica
basal del animal.

II. COMPETENCIA.

Representa con grficos el mecanismo de accin de las

hormonas a nivel de membrana.
 III. MATERIALES

a. Bibliografa del silabo de Bioqumica I

b. Bibliografa de carcter cientfico (revistas, manuales, etc.)
c. Retroproyector.
d. Videos VHS, etc

e. Libros y revistas

f. C D .Power point.

IV. PROCEDIMIENTO.

Se realizar de acuerdo a la tcnica para elaborar representaciones

grficas del mecanismo de accin de las hormonas a nivel de membrana
biolgica y a nivel del ncleo.

V.RESULTADOS.
Grficos de los diferentes mecanismos de accin.

VI.CUESTIONARIO.
a. Elabora un grfico sobre el mecanismo de accin de la adrenalina
b. Cules son las funciones del glucagn y de la adrenalina en el
organismo?
c. Elabore un mapa conceptual de los receptores de membrana.

VII.FUENTES DE INFORMACIN.

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioqumica . 4 ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioqumica.4 ed. Barcelona. Omega . 2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioqumica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.

2002.
 PRCTICA12

DETERMINACIN DE UREA POR MTODO ENZIMTICO

I.MARCO TERICO.
La rea es el metabolito final del metabolismo de las proteinas ,es excretada
en grandes cantidades por la orina. Su excrecin es la funcin principal del
rin, representando por s sola bastante ms de la mitad del residuo slido
de la orina. Usualmente constituye del 80 al 90% del nitrgeno total; El cuerpo
produce en promedio 25 a 30 gramos de urea al da algo ms en personas
que comen dieta rica en protenas, menos en personas con dieta pobre en
protenas Toda esta urea debe eliminarse por orina; de lo contrario se
acumular en lquidos corporales.
Los dos factores principales que establecen el ritmo de excrecin de urea son:
1) la concentracin de urea en el plasma, y
2) la intensidad de filtracin glomerular.

Estos factores aumentan la concentracin de rea.

En general, la cantidad de rea que pasa por los tbulos y va a la orina es

aproximadamente proporcional a la carga de rea que penetra en los tbulos
proximales, en promedio 50 a 60%. Sin embargo, esto solo es cierto cuando la
intensidad de filtracin glomerular es normal.

Cuando la intensidad de filtracin glomerular es muy baja, el filtrado persiste

en los tbulos por largo tiempo, antes de acabar en la orina.

Como todos los tbulos son por lo menos ligeramente permeables a la urea,
cuanto ms tiempo persista el liquido tubular en los tbulos, mayor
reabsorcin de rea hacia la sangre; la proporcin de rea filtrada que llega a
la orina disminuye considerablemente.

Por otra parte, cuando la filtracin glomerular es muy intensa, el liquido pasa
a travs del sistema tubular tan rpidamente que se reabsorbe muy poca
rea. Por lo tanto con intensidad de filtracin glomerular muy elevada, casi el
100% de rea pasa a la orina.

Es importante destacar que en aquellos pacientes con insuficiencia renal se

debe conservar la intensidad de filtrado glomerular en valores altos, debido a
que cuando esta disminuye demasiado, se incrementa la rea en sangre.

II.COMPETENCIA.

Determina la concentracin de rea tanto en suero sanguneo como en orina

por el mtodo enzimtico de la ureasa.
III. MATERIALES Y REACTIVOS
-Equipos y materiales.
a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara regulado a 37.
d. Jeringas descartable x 5 mL; ligadura y algodn.
e. Tubos de prueba de 13 x 100 mm.
f. Micropipetas de 0 a 50 uL., pipetas de 1 , 5 y 10 ml.
g. Gradillas, baguetas.

- Reactivos.
a. Reactivo 1: contiene fenol y nitroprusiato de sodio.
b. Reactivo 2: contiene una solucin concentrada de
hipoclorito de sodio e hidrxido de sodio.
c. Ureasa en solucin.
d. Standard de rea solucin de rea 60 mg / dL.

IV.TCNICA OPERATORIA.
a. En una gradilla disponer 3 tubos de prueba de 13 x 100 ml.,
marcarlos con las letras S (standard ); P (problema ) y B (blanco ) y
proceder como sigue :

B S P
Standard - 20ul -
Suero - - 20ul
Ureasa I gota I gota Igota
Mezclar por agitacin suave e incubar x 5 minutos a 37C
Luego agregar
Reactivo N 1 mL. 1 1 1
Reactivo N 2 mL. 1 1 1
Mezclar por agitacin suave e incubar x 5 minutos a 37C
Luego agregar
Agua destilada mL 10 10 10

a. Mezclar por inversin. Reposos 10 minutos y leer a 540 nn.

 b. Calcular la concentracin de rea en mg/dL aplicando la
siguiente frmula

mg / dL = lectura del problema x 60

lectura del Standard

Valores de referencia. De 20 a 45 mg / dL.

V.CUESTIONARIO.

a. Explique porque para obtener mg/dL, se multiplica por 60.

b. Cmo se convierte el N urico en urea y, viceversa
c. Grafique la interrelacin del ciclo de la urea con el ciclo de
Krebs.
d. Indique que enzimas actan en la mitocondria, y cules en el
citoplasma, en el ciclo de la rea.
e. Se requiere de ayuno para realizar la determinacin de rea en
sangre.

VI.FUENTES DE INFORMACIN.
a. Devlin T homas M. Bioqumica con Aplicaciones Clnicas.
tomos I y II. Barcelona. E Revert Colombiana. S A. 2000.
b. David LN, Cox M M. Lehninger Principios de Bioqumica .
Barcelona. Omega. 2001.
c. Lozano Galindo. Bioqumica para Ciencias de la Salud.
Espaa. McGraw - Hill- Interamericana.
d. Luque L y Hermoza A. Biologa Molecular e Ingeniera Gentica.
Barcelona. Hartcourt. 2001.
 PRACTICA 13

DETERMINACIN DE LAS CONCENTRACIONES DE CIDO RICO EN ORINA Y SUERO

SANGUNEO.

I. MARCO TERICO.

El cido rico es el metabolito de excrecin de las purinas.

II. COMPETENCIA.
Determina las concentraciones de cido rico tanto en suero sanguneo como en orina, por el
mtodo de la uricasa.

III. MATERIALES Y EQUIPOS.

a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga.
c. Bao Mara 37 C.
d. Gradilla.
e. Pipeta de 1, 5 y 10 mL.
f. Micropipeta de 10 a 50 uL
g. Micropipeta de 100 a 1000 uL
h. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
i. Ligaduras
j. Agujas 20 x 1
k. Tips azules y amarillos

Reactivos.

l. Solucin estndar de cido rico 10 mg/dL.

m. Reactivo Enzimtico
n. Alcohol etlico absoluto
o. Agua destilada.
p. Algodn

IV. FUNDAMENTO DEL MTODO:

La determinacin enzimtica de cido rico en suero sanguneo se realiza utilizando 2 enzimas:

uricasa y peroxidasa, cuyas acciones catalticas en presencia de apropiados reactivos qumicos,
permitirn la formacin de un compuesto coloreado que es directamente proporcional a la
glucosa existente en el medio de reaccin.

Uricasa
cido rico + H2O + 02 Alantona + H2O2
Peroxidasa
2 H2O2 + 4-AF + fenol quinona coloreada + 4 H2O
V. TCNICA OPERATORIA

Preparar los siguientes medios de ensayo:

B MP1 MP2 St

Suero o plasma ---- 10 L ----- -----

Orina diluida al 10 % ---- ---- 10uL -----
Standard ---- ---- ----- 10 uL
Reactivo de trabajo (mL) 1.0 1.0 1.0 1.0

Incubar en bao mara a 37 C durante 10 minutos y leer en el espectrofotmetro a 505 nm.

VI. RESULTADOS.
Utilizando el mtodo del factor de calibracin, determinar la concentracin de cido rico y
expresarla en mg/dL de suero, y por orina de 24 horas en el caso de la orina.

VII. CUESTIONARIO
1. Cules son los valores normales de cido rico?
2. En qu condiciones debe tomarse la muestra?
3. Como procedera si la lectura en el caso de la orina diluida fuera mayor a 2?

VIII. FUENTES DE INFORMACIN

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.
b. Devlin TM.Bioqumica . 4 ed. Barcelona. Reverte. 2004.
c. Lehninger .Principios de Bioqumica.4 ed. Barcelona. Omega . 2006.
d. Mathews CK, Van Holde KE Bioqumica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley. 2002.
 PRACTICA 14

DETERMINACION DE BILIRRUBINA TOTAL

Y FRACCIONADA SERICA

I. MARCO TERICO.
La vida del hemate es de 120 das, transcurridos los cuales las clulas del
sistema reticulo endotelial, especialmente del bazo , hgado y mdula
fagocitan a stos hemates liberando hemoglobina, la cual es catabolizada
y convertida en biliverdina, la misma que al reducirse se convierte en
bilirrubina. La bilirrubina se une a la albmina , y asi es transportada
desde las fuentes extrahepticas, a los sinusoides, el complejo bilirrubina-
albmina atraviesa las microvellosidades sinusoidales pasando a la clula
heptica. La albmina se separa y la bilirrubina por accin de los
glucornidos se convierte en diglucornido de la bilirrubina. La bilirrubina
no conjugada y los glucornidos de la bilirrubina son transportados a la
sangre

La conjugacin para la formacin del glucornido es un prerrequisito para

la eliminacin de la bilirrubina en la bilis, y sea un factor limitante en
el transporte. La bilirrubina conjugada se elimina ms rapido que la no
conjugada

II. COMPETENCIA.

Determina la concentracin de bilirrubina total y fraccionada en suero,

conceptualizando su importancia biolgica

III. EQUIPOS Y MATERIALES

a. Espectrofotmetro.
b. Centrifuga
c. Bao de Mara a 37C.
d. Jeringas descartables d x 5mL, con aguja hipodrmica
descartable N 20 x 1 .
e. Tubos de prueba de 13 x 100mm.
f. Micropipetas de 0a 50uL; punteras de color amarillo.
g. Pipetas de 1, 5 y 10 mL.
h. Gradillas; baguetas; ligaduras.

Reactivos.

a. Reactivo A: Acido sulfanilico al 0.5 % con 6 mL de HCL

b. Nitrito de sodio al 2%.
 c. Reactivo B. Se prepara en el momento de usar mezclando 10
mL. de Reactivo A con 0.3 mL. de nitrito de sodio.
d. Standard de bilirrubina de 5 mg/dL.
e. Metanol. G.R.
f. Alcohol medicinal.
g. Agua destilada.

IV. TCNICA OPERATORIA.

a. En una gradilla disponer 4 tubos de prueba rotulados con las letras B (

blanco
BD ( bilirrubina directa ) , BT ( bilirrubina total ) y S ( standard ) luego
proceder como sigue:
b. Mezclar y dejar en reposo 5 minutos.

B S BD BT
Suero mL 0.3 - 0.3 0.3
St. de bilirrubina 5 mg /dL, mL. - 03 - -
Agua destilada mL. 4.5 - 4.5 -
Metanol - 4.5 - 4.5
Reactivo A mL 05 - - -
Reactivo B mL. - 0.5 0.5 0.5

a. Leer en el espectrofotmetro a 525 nn.

b. Para obtener la concentracin de la bilirrubina y fracciones se aplican
las siguientes frmulas.

mg /dL de BT= lectura BT x 5 ; mg / dL de BD = lectura de BD x 5

Lectura S lectura de S

mg / dL de BI = BT - BD

V. CUESTIONARIO.
a. Describa el fundamento y las reaciones que ocurren en la
determinacin de bilirrubina. Porqu se utiliza metanol.
b. De qu otras fuentes que no sea los hemates envejecidos ,
proviene la bilirrubina.
c. Qu concentraciones sricas de bilirrubina puede tener un neonato
con Rh positivo , con el hecho de que la madre tenga sangre Rh
negativo.
 d. Ud. Determinara bilirrubina en un suero bemolizado. Porqu ?.

VI. FUENTES DE INFORMACIN.

a. Stryer l , Berg JM. Bioquimica. 5ta ed. Barcelona. Reverte. 2003.

b. Devlin TM.Bioqumica . 4 ed. Barcelona. Reverte. 2004.

c. Lehninger .Principios de Bioqumica.4 ed. Barcelona. Omega . 2006.

d. Mathews CK, Van Holde KE Bioqumica. 3a ed. Madrid.Addison Wesley.

2000