Guia de Laboratorio #1. Bioseguridad y Esterilizacion

Universidad de Pamplona
Pamplona - Norte de Santander - Colombia

Tels: (7) 5685303 - 5685304 - 5685305 - Fax: 5682750 - www.unipamplona.edu.co
UNIVERSIDAD DE PAMPLONA
FACULTAD CIENCIAS BASICAS
DEPARTAMENTO MICROBIOLOGIA
LABORATORIO MICROBIOLOGIA GENERAL
DOCENTE: NUBIA PILAR SARMIENTO
Presentacin de Informes
OBJETIVO GENERAL
Proporcionar a los estudiantes de la asignatura, los parmetros a seguir para la unificacin

de los informes de las prcticas realizadas en los laboratorios de microbiologa general.
INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES
Los informes de las prcticas de laboratorio deben ser presentados, siguiendo las pautas
de reaccin de artculos cientficos. Para tales efectos debern seguir las instrucciones
que se presentan a continuacin.
Los manuscritos deben ser presentados en papel blanco, tamao carta, a espacio
sencillo, con margen de 3cm.
El ttulo, los autores y resumen deben ser centrados en la pgina y los dems pasos de la
estructura del artculo deben estar escritos en las columnas.
El trabajo deber tener una extensin mxima de seis (6)paginas, incluidas figuras, tablas
y bibliografa. El lenguaje utilizado debe ser claro y preciso; el trabajo debe estar escrito en
un estilo impersonal. Se pueden utilizar las abreviaturas utilizadas internacionalmente y en
caso de utilizar ciclas poco comunes debern indicarse completas la primera vez que se
citan, seguida de la sigla entre parntesis.
La estructura del artculo debe tener en cuenta los pasos del mtodo cientfico as:
TITULO: Debe ser corto pero ilustrativo, centrado , sin exceder de 15 palabras, incluido
el nmero de la prctica. El ttulo del artculo no necesariamente debe ser el
consignado en la gua de la prctica, aunque debe conservar relacin con lo
dispuesto en cada uno de ellas.
AUTORES: Debe incluir los nombres completos, cada uno de ellos seguido del cdigo
correspondiente. Seguido a los autores se debe mencionar el Departamento y la
Facultad correspondiente as como la Universidad. Todos los parmetros antes
mencionados deben estar centrados.
Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 1

RESUMEN: debe ser conciso y contener informacin sobre: la justificacin, objetivos,

metodologa y resultados concretos de la prctica. Debe indicar las principales
conclusiones, haciendo nfasis en los logros alcanzados. No debe exceder de 250
palabras en un solo prrafo y estar referenciado.
PALABRAS CLAVES: Se debe colocar una lista mximo de cinco(5) palabras del
artculo que facilitan el entendimiento del contenido del mismo.
INTRODUCCIN: Debe describir el planteamiento general del tema, dando la
informacin necesaria en forma precisa haciendo referencia solo a la bibliografa
directamente relacionada y considerada indispensable para el desarrollo del tema.
MATERIALES: Deben describirse los materiales y equipos utilizados dentro de una
secuencia lgica al desarrollo de la prctica.
MTODOS: Deben describirse en una secuencia lgica al desarrollo de la prctica. Si
algunos mtodos han sido modificados, se deben incluir los detalles de la
modificacin.
RESULTADOS: Los resultados experimentales podrn presentarse entablas y figuras solo
cuando sea absolutamente necesario y estar explicados en forma sucinta pero
completa en el texto. Las tablas deben ser presentadas con ttulo y nmeros arbigos
continuos.Las figuras, fotografas, dibujos y grficos deben presentarse con ttulo
identificadas con nmeros arbigos.
DISCUSIN: Se debe incluir los anlisis respectivos de los resultados obtenidos. La
discusin debe ser breve y limitarse a los aspectos significativos de la prctica.
CONCLUSIN: Debe basarse en los resultados obtenidos; si es posible ofrecer una
solucin al problema planteado.
BIBLIOGRAFA: Se debe presentar en orden alfabtico y de la siguiente manera:
ARTICULO: Autor (es), ao, titulo del articulo, revista, volumen, nmero, pgina.
Ejemplo: Fajardo N.Manuel O. 2004. Gentica microbiana. Investigacin y ciencia.44.4.38-

45.
LIBRO: Autor, ao de publicacin, ttulo, nombre del editorial, lugar de impresin, pginas.
Ejemplo: Carreo J, Deluis L.1997. Hongos entomopatogenos. ICA. Bogot, Colombia. 38.
TESIS: Deben ser referenciadas como libros.

Practica N 1
BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACION EN EL LABORATORIO
OBJETIVOS
Puntualizar sobre aspectos bsicos de normas de bioseguridad y reglas generales de

trabajo en las actividades diarias para el trabajo en el laboratorio.
Identificar y preparar una solucin desinfectante seleccionando la concentracin
adecuada para su uso.
Reconocer y asociar la clasificacin de los agentes biolgicos y los laboratorios segn
el riesgo biolgico con los respectivos equipos de trabajo y su fundamento de manejo.
Aplicar algunos de los mtodos utilizados para la esterilizacin de medios de cultivo,
materiales, y accesorios utilizados en el laboratorio de Microbiologa.
El estudiante explicar verbalmente la forma de preparar el material de vidrio para
esterilizar.
Enumerara los diferentes mtodos que existen para realizar los procedimientos de
esterilizacin usados en microbiologa.
Siguiendo las indicaciones del tutor de laboratorio el estudiante preparara el material
asignado para esterilizar.
El estudiante deber aprender el correcto manejo del autoclave.
Finalmente realizar los procedimientos de esterilizacin.
INTRODUCCIN
El personal de los laboratorios de microbiologa trabaja por definicin con

microorganismos infecciosos o materiales que lo contienen, o pueden tenerlos. Algunos de
estos microorganismos son patgenos o tienen la posibilidad de serlo, en funcin de las
circunstancias y la dosis. Evitar la infeccin es un elemento primordial de la competencia
profesional del personal. La seguridad es una tcnica apropiada de la que se debe estar
orgulloso. Es preciso PROTEGERSE, evitar accidentes de laboratorio y contaminaciones de
procesos experimentales, lo cual podra invalidar el trabajo al dar falsos positivos.
NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO
El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.

El personal que trabaje en el laboratorio debe responsabilizarse con el cumplimiento
de las normas de bioseguridad.
Todas las reas estarn debidamente marcadas con la seal de riesgo biolgico y el
nivel de contencin.
Ingrese al laboratorio con bata manga larga, abotonada y limpia, una vez ingrese,
coloque los abrigos, libros, y dems en localizaciones especificadas pero NUNCA

sobre los bancos o mesones.

Las puertas y ventanas deben permanecer cerradas durante la sesin de laboratorio
para evitar contaminaciones por corrientes de aire.
Al comenzar y terminar la sesin, limpie la superficie de trabajo con una solucin
desinfectante.
El laboratorio debe permanecer LIMPIO Y ORDENADO, durante el trabajo o al trmino
del mismo coloque el material contaminado o limpio en sus respectivos lugares pero
NUNCA sobre os mesones.
Lave sus manos al entrar y al terminar cada sesin de trabajo, secndolas con toallas
de papel.
El personal con cabello largo debe recogerlo para trabajar dentro del laboratorio as
corno usar: bata, cofia, tapabocas, guantes y dems equipo de barrera de
proteccin segn el nivel de riesgo biolgico.
Comer, beber, fumar, aplicarse cosmticos (en especial pestaina, que acelera el
deterioro de los oculares del microscopio) y colocarse o usar lentes de contacto es
una actitud prohibida dentro del laboratorio. Es adecuado el uso de zapatos cerrados
durante el trabajo de laboratorio as como mantener las uas cortas limpias y sin
esmalte.
Esta prohibido pipetear con la boca, para ello emplee los dispositivos adecuados.
Hable en tono bajo y evite el movimiento innecesario alrededor del laboratorio con el
fin de evitar distracciones y accidentes.
Emplee los equipos segn las instrucciones o P.O.E. (procedimientos operativos
estandarizados) al igual que emplee los protocolos correspondientes a las practicas.
No manipule ni opere equipos sin la autorizacin respectiva o si no tiene claro los
P,O.E.
El transporte de muestras dentro o entre laboratorios se realizar de tal manera que,
en caso de cada, no se produzcan salpicaduras. Lo recomendable es hacerlo en
cajas hermticas o neveras transportables, las cuales debern ser rgidas, resistentes,
contar con materiales absorbentes en su interior, de fcil desinfeccin y no ser
empleadas para otros fines.
Todo personal debe poner especial cuidado en evitar el contacto de la piel con
materiales potencialmente infecciosos. Con este fin, debe usarse guantes para la
manipulacin de muestras o cultivos que contengan posibles patgenos. Los guantes
siempre sern desechados antes de salir del rea de trabajo, jams se saldr de la
misma con los guantes puestos, ni con ellos se coger el telfono, se tocarn los
volantes, etc.
Se usarn gafas protectoras y mascaras faciales si existe riesgo de salpicaduras y/o
aerosoles. Debe evitarse al mximo la formacin de aerosol es durante el trabajo de
laboratorio.
Cada estudiante debe contar con su equipo bsico de trabajo, el cual incluir entre
otros: lminas portaobjetos, lminas cubreobjetos(laminillas), jabn, tijeras, cinta de
enmascarar, lpiz o marcador de vidrio permanente, paos de papel absorbentes,
algodn, alcohol, frasco para descartar portaobjetos, asas bacteriolgicos y/o

micolgicas(*), guantes, pipeteador(esto puede ser por grupos de 3 o 4 estudiantes).

Trabajar cerca del mechero encendido.
No poner ningn elemento de trabajo en contacto con el cuerpo.
Esterilizar el material contaminado antes de desecharlo.
Informar inmediatamente cualquier accidente como cortaduras, quemaduras. En
caso de rompimiento de tubos con cultivos microbianos, cubrir el tubo con hipoclorito
de sodio al 2% o fenol al 5%, tapar con una hoja de papel peridico y dejar
sedimentar los aerosoles durante media hora. Luego recoger el material, envolverlo
en papel y llevarlo a esterilizacin antes de descartarlo.
No deambular con la bata de trabajo fuera del laboratorio.
Lavar la bata y gorro independiente de otra ropa.
Trapear el piso del laboratorio con un detergente, no barrer en seco para evitar
dispersar en el ambiente los microorganismos sedimentados.
AGENTES DESINFECTANTES DE EMPLEO COMN Y USO RESPECTIVO
AGENTE MECANISMO DE ACCIN Y OTROS USO
Componentes 1. Germicida, altera la estructura de las Desinfeccin: Solucin

fenlicos: protenas. al 5%.
2. Surfactante, precipita las protenas y
Fenol. daa la membrana celular.
3. Es irritante y txico.
Halgenos: 1. Efecto microbicida por la combinacin 1. Purificacin de

rpida con protenas . agua.
Compuestos 2. Los clorados reaccionan con el agua 2. Sanitizacin de
clorados para formar cido hipocloroso, el cual es utensilios en
(Hipoclorito de bactericida. industrias.
3. Oxidante corrosivo para metales, de 3. Microbicida.
sodio, NaOCl)
degradacin con el tiempo, se 4. Para limpieza de
recomienda almacenarlas en frascos superficies se
color mbar, guardar las soluciones en recomienda a una
frascos hermticamente cerrados, concentracin de
protegidos de la luz, el calor y la 1%. Las soluciones
humedad, preparar la cantidad para uso. pueden variar
entre 1000 y 10000
ppm.
Componentes 1. No se tiene claro el mecanismo de 1. Tintura de yodo es

de Yodo: accin. Se cree precipita las protenas. empleada como

2. Agente activo de superficies. antisptico ( de
Tintura de yodo uso cutneo).
2. Efectivo contra
Solucin de virus y esporas de
Povidona-yodo. hongos.
BIOSEGURIDAD
En los laboratorios designados a trabajos microbiolgicos deben seguirse normas de

seguridad e higiene que garanticen la proteccin contra infecciones del personal que
laboran en ellos, as como su extensin a la comunidad y el medio ambiente y que
adems aseguren la calidad de las tcnicas y la confiabilidad de los resultados.
Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en la muestras

procesadas en el laboratorio, el centro de control de enfermedades (CDE) y el instituto
nacional de salud(INS) han establecido cuatro niveles de seguridad biolgica y
determinado normas especficas para el trabajo en cada uno de ellos.
Nivel 1 se trabaja con microorganismos no patgenos bien conocidos y con

patgenos oportunistas, como los estudiados en laboratorios de fundamentos de
Microbiologa.
Nivel 2 se trabaja con microorganismos y muestras con un potencial de riesgo que va
de moderado a alto, como los estudiados en el laboratorio de enseanza, en
diagnstico microbiolgico, laboratorio de microbiologa, en un centro de atencin
primaria.
Nivel 3 se trabaja con microorganismos y muestras de alto riesgo, como los estudiados
en el laboratorio de diagnstico especializado.
Nivel 4 se trabaja con microorganismos de altsimo riesgo o que son exticos en el pas
y requieren mxima seguridad.
Los especmenes estudiados contienen un nmero relativamente pequeo de

microorganismos oportunistas o francamente patgenos los cuales se cultivan para
obtener poblaciones millones de veces mayores que la de la muestra original; por
consiguiente, el microbilogo o bacterilogo est expuesto permanentemente a graves
contaminaciones, al no cumplir con las normas de bioseguridad establecidas.
La seguridad biolgica se fundamenta en 3 elementos: tcnicas de laboratorio, equipo

de seguridad y diseo de las instalaciones. Se hace referencia a contencin a los
mtodos que hacen seguro el manejo de materiales infecciosos en el laboratorio. Se

diferencian 4 niveles de contencin o seguridad biolgica con base a los 3 elementos de

seguridad y las operaciones que se realizan, las vas de transmisin de los agentes
infecciosos que all se manejan y la funcin o actividad del laboratorio.
NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA
Para trabajar en Microbiologa se deben seguir cuidadosamente las normas de seguridad

biolgica, poner en prctica los conceptos tericos y concentrar la atencin en los
procesos realizados, centrar la atencin para obtener resultados confiables y evitar
accidentes microbiolgicos.
Antes de comenzar el trabajo se debe tener en cuenta lo siguiente:
Desinfectar con un detergente el rea de trabajo.

Poner una hoja de papel en el rea desinfectada sobre la cual se ubica el mechero y
la gradilla con los elementos de trabajo necesarios. La hoja se descarta al terminar el
trabajo en la bolsa establecida para material contaminado.
Prender el mechero antes de comenzar a trabajar.
Al utilizar el asa para siembras debe calentarse el alambre de ferronquel en toda su
extensin al igual que la base del mango, a la llama del mechero hasta que ponga
roja, este proceso debe realizarse antes y despus del uso; el flameado o proceso de
esterilizacin por esterilizacin o proceso de esterilizacin por incineracin destruye
cualquier forma de vida sobre la superficie del asa. (ver Fig. 1.1)
Fig. 1.1. . ESTERILIZACIN DEL ASA).
Del correcto manejo de los tubos depende el xito de los cultivos y por consiguiente
los resultados microbiolgicos. Obsrvese como se sostiene el tubo destapado entre el
dedo meique y la palma de la mano derecha, realizando el trabajo cerca de la
llama del mechero.

Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la

mano derecha sosteniendo entre el dedo meique, cerca de la llama del mechero,
con esta misma mano debe cogerse el asa entre el dedo ndice y el pulgar. (ver Fig.
1.2)
ver Fig. 1.2. ( MANEJO DE TUBOS).
Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlos a

tapar para evitar la formacin de aerosoles o la contaminacin del contenido del
tubo con bacterias del medio ambiente. (ver Fig. 1.3.)
Fig. 1.3. MTODO CORRECTO DE SOSTENER LOS TUBOS MIENTRAS SE HACE UNA
RESIEMBRA O PASE BACTERIANO).
Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la

mano izquierda abriendo la caja parcialmente cerca de la llama del mechero. Para
tener esta posibilidad la caja debe estar sobre la mesa con el medio hacia arriba, esta
se debe tomar con la mano izquierda y voltear para destaparla con la misma mano.
(ver Fig. 1.4)

ver Fig. 1.4.(MANEJO DE CAJAS DE PETRI).
Los bajalenguas y escobillones se deben quemar en llama del mechero, dejar enfriar y
descartar.
Todo el material que se use en microbiologa debe estar libre de toda forma de vida
es decir estril.
El material se debe marcar con cinta de enmascarar antes de llevarlo a la
incubadora. Las cajas de petri se marcan en el borde de la base para evitar que tape
la superficie de los cultivos. (ver Fig. 1.5). MARCACIN DE CAJAS DE PETRI)
(ver Fig. 1.5). MARCACIN DE CAJAS DE PETRI)
CONTROL DE CALIDAD
El objetivo del control de calidad es obtener la calidad ptima en todo proceso analtico
para que se produzcan informes de resultados confiables y oportunos al menor costo
posible, esto se logra por medio de una evaluacin sistemtica del trabajo para asegurar
que el producto final se ajusta, hasta un grado aceptable, a lmites de tolerancia
previamente establecidos. Un programa de control de calidad bsico incluye cierto

nmero de puntos especficos que deben considerarse cuando se implementa, como son:
materiales y medios de cultivo, reactivos, equipos, personal y documentacin; en un
sentido amplio, el control de calidad en microbiologa incluye adems temas intangibles
como sentido comn, buen criterio y constante atencin a los detalles.

1. Monitoreos de medio de cultivo, reactivos y suministros
Para que sea posible cubrir planes de reduccin de costos, muchas listas de verificacin
para el control de calidad de medios de cultivo permiten la aceptacin de los registros
documentados de los fabricantes proveedores de productos comerciales sin la necesidad
de una segunda evaluacin interna. Sin embargo, se aconseja no aceptar a ciegas todas
las afirmaciones del fabricante en cuanto al control de calidad de la totalidad de las
partidas preparadas de medio de cultivo sin un control peridico directo o indirecto.
Cada laboratorio debe establecer un ndice de aceptacin para cada medio preparado
por el fabricante y efectuar controles de calidad adicionales sobre una base individual.
Los microorganismos de stock para control de calidad pueden mantenerse en el

laboratorio por medio de subcultivo de aislamiento bacterianos recuperados como parte
del trabajo de rutina o microorganismos de stock desecados, como ATCC (American
Type Cultire Collection , 12301 Parklawn Dr., Rockville, MD), Bactrol disks (Difco Laboratories
, Detroit, MI) o Bact-Check disks (Roche Diagnostics, Division of Hoffmman-La Roche, Inc. ,
Nutley, NJ).
2. Monitoreo del equipo de laboratorio
Debe establecerse un programa de mantenimiento preventivo para asegurar el

funcionamiento apropiado de todo el equipo elctrico o mecnico en todos los
laboratorios de microbiologa. Los equipos deben controlarse en intervalos establecidos;
ciertas partes deben ser reemplazadas despus de lapso especifico de uso, aun cuando
no parezcan deterioradas.
3. Personal
Un laboratorio autorizado debe ser dirigido por un profesional del rea. El control de
calidad del personal requiere un efectivo programa de educacin permanente. El
entrenamiento prctico debe ser una actividad cotidiana. Debe alentarse al personal
para que participe en la forma ms frecuente posible en seminarios y grupos de estudios
locales, regionales y nacionales.
4. Protocolos
Estos presentan los objetivos y los mtodos usados en un estudio, indicando el

funcionamiento y ejecucin de una actividad.

5. Procedimientos operativos normalizados
Es una herramienta escrita donde se muestra paso por paso los elementos a tener en
cuenta, el control de la operacin y el tipo de registro. Se utiliza para minimizar los errores y
variables en los procesos cuando el procedimiento se realiza varias veces. Su preparacin
requiere una cuidadosa consideracin de los elementos y recursos en forma tal que se
anticipen y eviten los problemas potenciales.
ESTERILIZACION
El xito en el diagnstico microbiolgico y la confiabilidad de lo resultados dependen, en

gran parte, del proceso de lavado y esterilizacin del material utilizado, por consiguiente
es importante seguir las recomendaciones establecidas para este propsito. La
destruccin completa de todos los microorganismos presentes sobre cualquier material o
dentro de l, es indispensable en todos los procedimientos analticos como la preparacin
de medios de cultivo y otros materiales.
Para trabajar en microbiologa, el material que se utiliza debe estar completamente libre
de clulas microbianas vivas, por lo tanto ste debe ser lavado rigurosamente con
detergentes, enjuagado repetidamente, secado, envuelto en papel kraft y tapado el
orificio de entrada de los recipientes con algodn en rama para luego ser sometido a
esterilizacin, de acuerdo con las caractersticas de cada elemento.
MARCO TERICO
Esterilizacin es la destruccin o la eliminacin de todas las formas de vida; puede llevarse

a cabo por medio de un proceso fsico o qumico.
Desinfeccin es la eliminacin de todos los microorganismos vegetativos, pero no de

esporas bacterianas o micticas, de un objeto inanimado. Otros trminos relacionados
son de uso comn y merecen mencionarse.
Un germicida es un agente que destruye microorganismos, en especial patgenos, en

tejidos vivos u objetos inanimados.
Un antisptico es una sustancia aplicada en la piel u otro tejido vivo que previene o
detiene el crecimiento o la accin de microorganismos por inhibicin de su actividad o
por su destruccin.

La pasteurizacin se refiere al proceso de exponer un objeto a agua caliente (77C)

durante 30 minutos. Su propsito consiste en destruir todos los microbios patgenos,
excepto las esporas bacterianas.
Un saneador es una sustancia aplicada sobre objetos inanimados que reduce el nmero
de bacterias hasta niveles considerados seguros por los departamentos de salud pblica.
La limpieza es la eliminacin de material extrao (en especial orgnico) de los objetos.
La descontaminacin es la eliminacin de microorganismos patgenos de los objetos de

modo que sea seguro manipularlos.
La esterilizacin puede llevarse a cabo por medio de calor hmedo y calor seco, gases
(en especial xido de etileno), glutaraldehdo, irradiacin (ionizante, ultravioleta o con
microondas) y filtracin.
MTODOS FSICOS
CALOR SECO:
El calor seco produce desnaturalizacin de protenas, efectos txicos por desecacin de

la clula alcanzando niveles elevados de solutos, procesos oxidativos irreversibles, fusin y
desorganizacin de las membranas. Estos efectos de deben a la transferencia de calor
desde los materiales a los microorganismos que estn en contacto con stos.
El horno de aire caliente es el equipo utilizado en los laboratorios para esterilizar por calor
seco, se requiere mayor temperatura y tiempo de exposicin que los mtodos por calor
hmedo. La temperatura varia entre 120 y 180C, requirindose distintos tiempos de
exposicin. A 140 C se necesitan por lo menos 5 horas de exposicin, mientras que de
160C A 180C se requieren al menos 2 horas de exposicin, sirve para esterilizar material
de vidrio. Se recomienda no olvidar NO abrir la puerta del horno inmediatamente despus
del tiempo de esterilizacin, ello puede ocasionar rotura del material de vidrio. El papel y
algodn no pueden ser esterilizados a mas de 160C.
Ventajas del calor seco:
No es corrosivo para materiales e instrumentos.

Permite la esterilizacin de sustancias en polvo y no acuosas, y sustancias viscosas no
voltiles.

Desventajas:
Requiere mayor tiempo de esterilizacin, respecto al calor hmedo, debido a la baja

penetracin del calor.
FIGURA 2.1. UN TIPO DE HORNO DE ESTERILIZACIN PARA MICROBIOLOGA.
INCINERACIN: Se utiliza para destruir el material descartable contaminado. Eje. horno de

incineracin hospitalario, muflas, etc.
ACCIN DIRECTA DE LA LLAMA: se lleva al rojo el material de metal como asas, lancetas,
agujas de diseccin, etc.
CALOR HMEDO: el calor hmedo produce desnaturalizacin y coagulacin de protenas.

Estos efectos se deben principalmente a dos razones.
a. El agua es una especia qumica muy reactiva y muchas estructuras biolgicas (DNA,
RNA, Protenas, etc) son producidas por reacciones que eliminan agua. Por lo tanto
reacciones inversas podran daar a la clula a causa de generacin de productos
txicos. Adems las estructuras secundarias y terciarias de las protenas se estabilizan
mediante puentes de Hidrogeno intramoleculares que pueden ser reemplazadas y
rotos por el agua a altas temperaturas.
b. El vapor de agua posee un coeficiente de transferencia de calor mucho mas elevado
que el aire. Por lo que los materiales hmedos conducen el calor ms rpidamente
que los materiales secos debido a la energa liberada durante la condensacin.
El autoclave es el aparato mas comnmente utilizado en los laboratorios para esterilizar

cultivos y soluciones que n formen emulsiones con agua y no se desnaturalicen a
temperaturas mayores a 100C. una temperatura de 121C (una atmsfera de
sobrepresion) con un tiempo de exposicin mayor a 15 minutos sirve para destruir

microorganismos formadores de esporas. Es necesaria la accin combinada del calor,

tiempo y presin para conseguir la destruccin celular.
Ventajas del calor hmedo:
Rpido calentamiento y penetracin.

Destruccin de formas vegetativas y esporas en corto tiempo.
No deja residuos txicos.
Hay un bajo deterioro del material expuesto.
Es posible por este mtodo esterilizar materiales que no resisten el calor seco.
(material plstico).
Desventajas:
No permite esterilizar soluciones que formen emulsiones con el agua.

Es corrosivo sobre ciertos instrumentos metlicos.
MTODOS DE ESTERILIZACIN
Accin directa de la llama Esterilizacin al rojo
Flameado
CALOR SECO Incineracin.
Accin directa por los generadores de Estufa de calor seco

calor
Accin del agua caliente Bao de Maria hirviente
CALOR HMEDO Calentamiento repetido
Ebullicin directa
Accin del vapor de agua Autoclave.
Ionizantes
RADIACIONES Ultravioleta
Rayos Gamma y rayos X

INSTRUCCIONES PARA EL USO DEL AUTOCLAVE
1. Colocar agua en la olla hasta cubrir la resistencia (no colocar agua en la camisa), el
nivel del agua debe mantenerse en cada ciclo de esterilizacin.
2. Colocar el material a esterilizar dentro de la camisa, colocando previamente la rejilla
en el fondo.
3. Introducir la camisa.
4. Tapar la olla haciendo coincidir las flechas impresas en la tapa y la olla, insertando el
tubo flexible en el canal dispuesto en la pared interior de la camisa.
5. Apretar los tornillos haciendo cierre lateral simultneo y uniforme. No use llaves para
apretar y mantenga las superficies de contacto de la tapa y el borde interno de la
olla perfectamente limpio y lubricado.
6. Abrir la vlvula de seguridad colocndola en posicin vertical. El vapor generado en
la base del esterilizador, pasa hacia arriba y por fuera del recipiente y luego hacia
abajo a travs del tubo flexible de escape y la vlvula de seguridad, es importante
que la corriente de vapor elimine por completo el aire de la cmara de lo contrario la
temperatura alcanzada es mucho menor. cuando el vapor escapa vigorosamente se
debe colocar la vlvula en posicin horizontal.
7. A partir de entonces la presin y la temperatura empezaran a aumentar, los cual se
vera indicado en la aguja del manmetro.
8. Permitir que la aguja llegue a 121C y 15 libras de presin, es a partir de este momento
que se empieza a contabilizar el tiempo de esterilizacin.
9. De 10 a 15 minutos para material limpio.
10. De 30 a 40 minutos para material contaminado.
11. Al finalizar el periodo de esterilizacin, apagar el autoclave y permitir que el
manmetro baje a cero, levante la vlvula para que escape el vapor restante y
proceda a destapar la olla desenroscando los tornillos de manera enfrentada.
RADIACIONES
La energa se transmite a travs del espacio en gran variedad de formas, generalmente

llamadas radiaciones. Su accin depende de:
El tiempo de radiacin.
El tiempo de exposicin.
La dosis de radiacin.
La luz ultravioleta (UV tiene limitantes como: no penetrar el vidrio, la suciedad, el papel, la
pus, etc. Su efecto destructor se cumple cuando los rayos UV tienen contacto directo con
los microorganismos. Se usa para reducir la poblacin microbiana del aire de los
quirfanos, pabellones hospitalarios, laboratorios, etc. En microbiloga, es usada en
cmaras de repiques de cultivos y proceso de muestras. Su mecanismo de accin es el

dao del ADN, siendo entonces bactericida. Las radiaciones ultravioleta afectan a las
molculas de ADN de los microorganismos debido a que forman dmeros adyacentes
que inducen a errores en la duplicacin y por lo tanto la prdida de la viabilidad de las
clulas.
RADIACIONES IONIZANTES
Producen iones y radicales libres que alteran las bases de los cidos nucleicos, estructuras
protecas y lipdicas y componentes esenciales para la viabilidad de los microorganismos.
Tienen gran penetrabilidad y se les utiliza para esterilizar materiales termolbiles
(termosensibles), como jeringas, sondas, etc. Se utilizan a escala industrial por sus costos.
No se utilizan para medios de cultivo o soluciones proteicas por que producen
alteraciones de los componentes.
FILTRACIN
En algunas ocasiones es necesario esterilizar soluciones como cultivos de medios lquidos,

soluciones de sustancias sensibles al calor como azcares, aminocidos, antibiticos,
sales y similares sin someterse a temperaturas de esterilizacin. Para esto se utiliza la
tcnica de filtracin, que consiste en pasar las soluciones por filtros con poros de dimetro
finos a escala de micras que retienen por tamao a los microorganismos. Este mtodo
permite obtener productos solubles como toxinas, antigenos, antibiticos, etc.
Filtro de profundidad. Consiste en placas de papel, asbesto, o fibra de vidrio, cuyas

fibras se superponen y en ellas quedan atrapadas las partculas.
Filtro de membrana. Elaborados especialmente de acetato o nitrato de celulosa,
conocidos como filtros Milipore. Pueden obtenerse con dimensiones de poros muy
diversos, que van desde 0.45 hasta 0.01 micras. Las membranas porosas se colocan
dentro del recipiente, en el cual se pone el lquido que se va a esterilizar y ste pasa a
travs del filtro, recogindose en una fiola con presin negativa para acelerar el paso
del lquido a travs filtro. ( Vase figura 2.3).

Filtro de huella de enucleacin. Elaborados con delgadas pelculas de policarbonato de

10u de espesor, tratadas con radiacin nuclear y despus grabadas con una sustancia
qumica.
La radiacin causa daos localizados en la pelcula y la sustancia grabadora amplia estos

sitios causando agujeros. El tamao de estos se pueden graduar dependiendo del tiempo
que se deja actuar el grabado y de la fuerza de la solucin de grabado. Esos filtros son
empleados especialmente en microscopa electrnica.
TABLA 2. TIPOS DE FILTROS.
FILTROS BERKEFELD Constituidos por tierra de Diatomeas, poros: Intermedio (N),

fino (W) y ordinario (V). Despus de utilizarlo se cepilla y se
hierve en agua estril.
FILTROS CHAMBERLAND Constituidos por porcelana sin vidrio. Varios tamaos de

poro, el poro ms fino retiene los virus de mayor tamao.
FILTROS SEITZ Constituidos por filtros de asbesto insertados en un

recipiente metlico conectado a un erlenmeyer. Retienen
bacterias.
FILTROS DE VIDRIO Constituidos por filtros de vidrio insertados en un recipiente

metlico conectado a un erlenmeyer.
FILTROS DE MEMBRANA Constituidos de nitrato de celulosa, acetato de celulosa y

politetrafluoretileno. Los poros varan de 8 a 0.001 micras.
Normalmente se trabaja con presin positiva o negativa a
100 o 200 mm de Hg.
ESTERILIZACION EN FRIO: Utilizando xido de etileno, formaldehdo o perxido de

hidrgeno, en cmaras especiales. (Vese figura 2.3).

FIGURA 2.3. AUTOCLAVE PARA OXIDO DE ETILENO, DEBAJO DE LA PUERTA DE ACERO SE

OBSERVAN LOS RECIPIENTES PARA EL GAS Y UNA ENTRADA DE AGUA PARA MEZCLARSE
CON EL GAS ANTES DE INGRESAS A LA CAMARA DEL AUTOCLAVE.
LIMPIEZA Y LAVADO DE MATERIAL.
Material de vidrio nuevo. Los recipientes de vidrio que no se han utilizado anteriormente
son ligeramente alcalinos. Para neutralizarlos se deben sumergir en una solucin al 2% de
cido clorhdrico, durante 24 horas, despus se enjuagan abundantemente con agua del
chorro y luego con agua desmineralizada, para, finalmente, secarlos y esterilizarlos.
Material de vidrio usado. Cuando los recipientes de vidrio contienen medios de cultivos
contaminados se deben esterilizar en autoclave con las tapas flojas, para que pueda
circular el vapor dentro de los recipientes.
Dejar en remojo, en agua con detergente, de 2 a 3 horas, luego cepillar.

Enjuagar abundantemente con agua del chorro, dejar durante 30 minutos en un
recipiente con agua limpia para quitar cualquier resto de detergente y hacer el
enjuague final.
Dejar las pipetas contaminadas en un recipiente con fenol o hipoclorito de sodio al
2%, durante 24 horas, y luego continuar con el procedimiento anterior.
Dejar escurrir todo el material con la boca hacia abajo en canastillas metlicas, luego
secar ya sea en el horno a 60C o en un sitio soleado cubierto con una tela delgada.

Taponar la boca de los recipientes con algodn en rama y envolver las cajas y las
pipetas en papel kraft, para llevarlos al horno a esterilizacin.
Precaucin. La vidriera debe estar libre de retos de detergente para iniciar el proceso de
esterilizacin.
Material de plstico. Debe tenerse en cuenta la clase de plstico con el que estn
elaborados los elementos, para seguir el proceso de limpieza y esterilizacin adecuados.
Las caractersticas del material plstico son las siguientes:
POLIPROPILENO TRANSLCIDOS
POLICARBONATO CLARO
POLIESTIRENO CLARO
NITRATO DE CELULOSA CLARO
POLITETRAFLUOROETILENO OPACO
(TEFLN)
POLIETILENO OPACO
NYLN OPACO
El material translcido y claro no se puede autoclavar ni someter a calor intenso. El

material opaco, como las pipetas, probetas, tubos de centrfuga y de ensayo, es
reutilizable y tolera la esterilizacin.
Los frascos de polietileno pueden utilizarse para guardar en el congelador a menos 50C.
ELABORACION DE TAPONES
Cortar, presionar y enrollar longitudinalmente la tira de algodn en ramas. Los tapones

para recipientes de boca grande como balones y fiolas se envuelven en gasa hasta
mayor consistencia, se coloca un trozo de cinta, se cubre con papel kraft y se sujetan.
ENVOLTURA DE MATERIAL.
Para envolver pipetas de 1 y 5 ml se recortan tiras de papel kraft, de 60cm de largo X 5 cm

de ancho y para pipetas de 10ml, tiras de 60cm de largo X 5 cm de ancho.
Se comienza a envolver por la punta, las cual debe quedar totalmente protegida. La
pipeta se va rotando sobre la tira de papel de manera que ste cubra firmemente la
totalidad de la pipeta. Al finalizar, en la boquilla de la pipeta se enrolla el papel para
evitar que se desenvuelva.

Este mismo proceso se realiza con las bajalenguas y escobillones, cortando tiras de papel
de 30cm X 5 cm. (Vase figura 2.5)
FIGURA 2.5. PROCESO DE ENVOLTURA DE PIPETAS.
Las cajas de Petri, el material de caucho, el plstico, la tela y dems tambin deben ser
envueltos en papel kraft antes de someterlos al proceso de esterilizacin, para protegerlos
de la contaminacin ambiental despus de realizado el proceso.
PROCEDIMIENTO:
Dada una lista de materiales, usted debe indicar qu mtodo de esterilizacin es

adecuado en cada caso. Siguiendo la demostracin prctica dada por el profesor, usted
preparara el material para su posterior esterilizacin: cajas de petri, pipetas, erlenmeyers,
tubos de ensayo, asas, etc.
Lleve a esterilizar de acuerdo con el agente fsico adecuado.
MATERIALES
Caja de petri
Tubos de ensayo.
Pipetas.
Erlenmeyers.
Papel kraft
Autoclave.
Horno seco.
Cinta de enmascarar.
Gasa.
Algodn.
Asa bacteriolgica.
Mechero de Bunsen.
Hisopos.
Estufa elctrica.
Baja lengua

PROCEDIMIENTO N1
1. Recorte el papel para envolver material de acuerdo a las necesidades.

2. Tome el material correspondiente y envulvalo segn las instrucciones del tutor; por
ltimo colquele un trozo pequeo de cinta control de esterilizacin.
3. Llevelos al horno de aire caliente y encienda en la temperatura adecuada (180C) 350
F , una vez caliente empiece a contabilizar el tiempo de esterilizacin (2 horas).
4. Finalizado el proceso y luego de bajar la temperatura, verifique la cinta control.
PROCEDIMIENTO N2
1. Asegrese de que el nivel del agua sea el adecuado para el proceso, coloque la
rejilla y sobre ella la canasta y dentro de ella el material a esterilizar (medios de
cultivo, cultivos bacterianos, material biolgico).
2. Cierre correctamente la olla, encienda y controle las condiciones de esterilizacin.
Observe los colores del manmetro y no deje que la aguja llegue al rojo pues
ocurrira una explosin, esto lo puede controlar con el botn giratorio y la vlvula
de escape de vapor.
3. Una vez finalizado el tiempo proceda segn las instruccin del uso del autoclave.
CUESTIONARIO
1. Defina y d ejemplos de soluciones referentes al trmino

Antisptico:
Desinfectante:
Bacteriosttico:
Bactericida:
Germicida:
2. Qu son y cul es la utilidad de las Cabinas de Seguridad Biolgica.
3. Todo laboratorio debe estar provisto de un botiqun de primeros auxilios, situado en un
lugar fcilmente accesible. Especifique lo que el botiqun debe contener.
4. En caso de que ocurriese un corte o una quemadura, cite las provisiones que sirven
principalmente para este fin.
5. Qu es esterilizacin?
6. Dibuje un autoclave con sus partes y describa su funcin?
7. Qu medidas podra tomar usted para verificar la efectividad de la esterilizacin por
autoclavado?
8. Qu otros procesos fsicos permiten disminuir la carga microbiana?
9. Qu otros tipos de rayos a diferentes longitudes de onda se emplean para
esterilizacin?

Guia de Laboratorio #1. Bioseguridad y Esterilizacion

Încărcat de

Informații document

Descriere originală:

Titlu original

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Guia de Laboratorio #1. Bioseguridad y Esterilizacion

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universidad de Pamplona

Pamplona - Norte de Santander - Colombia

Proporcionar a los estudiantes de la asignatura, los parmetros a seguir para la unificacin

INSTRUCCIONES PARA LOS AUTORES

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 1

RESUMEN: debe ser conciso y contener informacin sobre: la justificacin, objetivos,

Ejemplo: Fajardo N.Manuel O. 2004. Gentica microbiana. Investigacin y ciencia.44.4.38-

TESIS: Deben ser referenciadas como libros.

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 2

BIOSEGURIDAD Y ESTERILIZACION EN EL LABORATORIO

Puntualizar sobre aspectos bsicos de normas de bioseguridad y reglas generales de

El personal de los laboratorios de microbiologa trabaja por definicin con

NORMAS GENERALES PARA EL TRABAJO DE LABORATORIO

El acceso al laboratorio estar limitado al personal autorizado.

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 3

sobre los bancos o mesones.

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 4

micolgicas(*), guantes, pipeteador(esto puede ser por grupos de 3 o 4 estudiantes).

AGENTES DESINFECTANTES DE EMPLEO COMN Y USO RESPECTIVO

AGENTE MECANISMO DE ACCIN Y OTROS USO

Componentes 1. Germicida, altera la estructura de las Desinfeccin: Solucin

Halgenos: 1. Efecto microbicida por la combinacin 1. Purificacin de

Componentes 1. No se tiene claro el mecanismo de 1. Tintura de yodo es

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 5

de Yodo: accin. Se cree precipita las protenas. empleada como

En los laboratorios designados a trabajos microbiolgicos deben seguirse normas de

Teniendo en cuenta la patogenicidad de los microorganismos presentes en la muestras

Nivel 1 se trabaja con microorganismos no patgenos bien conocidos y con

Los especmenes estudiados contienen un nmero relativamente pequeo de

La seguridad biolgica se fundamenta en 3 elementos: tcnicas de laboratorio, equipo

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 6

diferencian 4 niveles de contencin o seguridad biolgica con base a los 3 elementos de

NORMAS DE TRABAJO EN EL LABORATORIO DE MICROBIOLOGA

Para trabajar en Microbiologa se deben seguir cuidadosamente las normas de seguridad

Antes de comenzar el trabajo se debe tener en cuenta lo siguiente:

Desinfectar con un detergente el rea de trabajo.

Fig. 1.1. . ESTERILIZACIN DEL ASA).

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 7

Durante las siembras, el tubo debe mantenerse en la mano izquierda y el tapn en la

ver Fig. 1.2. ( MANEJO DE TUBOS).

Flamear la boca de los tubos despus de quitarles el tapn y antes de volverlos a

Destapar las cajas de petri manteniendo la base y la tapa simultneamente en la

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 8

ver Fig. 1.4.(MANEJO DE CAJAS DE PETRI).

(ver Fig. 1.5). MARCACIN DE CAJAS DE PETRI)

previamente establecidos. Un programa de control de calidad bsico incluye cierto

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 9

1. Monitoreos de medio de cultivo, reactivos y suministros

Los microorganismos de stock para control de calidad pueden mantenerse en el

2. Monitoreo del equipo de laboratorio

Debe establecerse un programa de mantenimiento preventivo para asegurar el

Estos presentan los objetivos y los mtodos usados en un estudio, indicando el

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 10

5. Procedimientos operativos normalizados

El xito en el diagnstico microbiolgico y la confiabilidad de lo resultados dependen, en

Esterilizacin es la destruccin o la eliminacin de todas las formas de vida; puede llevarse

Desinfeccin es la eliminacin de todos los microorganismos vegetativos, pero no de

Un germicida es un agente que destruye microorganismos, en especial patgenos, en

Una universidad incluyente y comprometida con el desarrollo integral 11

La pasteurizacin se refiere al proceso de exponer un objeto a agua caliente (77C)

La limpieza es la eliminacin de material extrao (en especial orgnico) de los objetos.

La descontaminacin es la eliminacin de microorganismos patgenos de los objetos de