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com/oncotarget/ Oncotarget Advance Publications, 2017

impactos localizacin del tumor respuesta inmune en modelos de ratn de cncer de colon

Zhao Xianda 1 , Lihua Li 1 , Timothy K. Starr 2 y Subbaya Subramanian 1,3

1 Departamento de Ciruga, Universidad de Minnesota Medical School, Minneapolis, MN, EE.UU.

2 Departamento de Obstetricia y Ginecologa y Salud de la Mujer de la Universidad de Minnesota Medical School, Minneapolis, MN, EE.UU.

3 Masnico Centro de Cncer de la Universidad de Minnesota, Minneapolis, MN, EE.UU.

Correspondencia a: Subbaya Subramanian, correo electrnico: subree@umn.edu

palabras clave: cncer colorrectal, perfiles inmunes, la inmunoterapia, los modelos de ratn de cncer, los modelos ortotpicos

Recibido: 21 de de marzo de, 2017 Aceptado: 23 de mayo de 2017 Publicado: 09 de junio de, 2017

Derechos de autor: Zhao et al. Este es un artculo de acceso abierto distribuido bajo los trminos de la licencia de Atribucin Licencia 3.0 (CC BY 3.0), que permite el uso

ilimitado, distribucin y reproduccin en cualquier medio, siempre que el autor original y la fuente se acreditan.

ABSTRACTO

Existente modelos preclnicos de cncer colorrectal humano (CRC) que se basan en los injertos subcutneos
singnicas son problemticas, debido a la creciente evidencia de que el microambiente inmunolgico en el tejido
subcutneo es significativamente diferente desde el tracto gastrointestinal. Del mismo modo, los modelos ortotpicos que
utilizan una laparotoma para establecer injertos son tambin problemtica existente, porque el procedimiento de los
resultados quirrgicos de inflamacin extensa, creando as un microentorno del tumor no fisiolgica. Para facilitar la
traduccin-banco-a la cabecera de las estrategias de inmunoterapia CRC, hemos desarrollado un modelo ortotpico novela
en ratones que utiliza microinyeccin endoscopia guiada de las clulas cancerosas singnicas. Cuando comparamos
infiltracin sistema inmune, se encontr que los tumores en el modelo subcutneo tuvieron menos clulas T, clulas B y
clulas asesinas naturales (NK), pero las clulas mieloides ms inmunosupresores; en contraste, los tumores en nuestro
modelo ortotpico tenan un mayor nmero de clulas infiltrantes de tumor T, clulas B y clulas NK, con menor nmero de
clulas mieloides inmunosupresores. El nmero de citocinas inmunoestimulantes, como la interleucina (IL) -2, IL-6, el
interfern (IFN) gamma, y la granzima B, tambin fue mayor en los tumores en nuestro modelo, en comparacin con el
modelo subcutneo. Esas diferencias resultaron en mayor sensibilidad a la terapia inmune puesto de control de bloqueo en
nuestro modelo ortotpico CRC guiada por endoscopia. Nuestro estudio indica que la localizacin del tumor afecta a la
respuesta inmune en modelos de ratn de CRC; elegir el modelo preclnico adecuada es importante cuando se prueba la
inmunoterapia en el CCR.

INTRODUCCIN Unidos, la eficacia de estas terapias era mucho menos notable

[7].
desarrollo de tumores en seres humanos est regulada por la respuesta Los estudios preclnicos de inmunoterapia CRC han dependido en

inmune adaptativa especficos de tumores [1]. Recientemente se han desarrollado gran medida de modelos de tumores subcutneos singnicos [8, 9]. Un

terapias que mejoran la respuesta inmune, tales como el receptor quimrico estudio reciente ha demostrado que la localizacin del tumor determina

antgeno (CAR) las clulas T y las terapias puesto de control de bloqueo inmunes reclutamiento especfica de tejido de de tumores macrfagos asociados en

(ICBTs), han dado lugar a resultados notables en ciertos tipos de cncer [2, 3]. Por el modelo de melanoma [10]. Por lo tanto, los modelos subcutneos

ejemplo, los anticuerpos de bloqueo de punto de control de orientacin PD1, PDL1 clsicos pueden no imitan el microambiente tumoral inmune de CRC

o CTLA4 han resultado en la mejora de forma significativa la supervivencia en humano real y pueden ser una barrera importante en los esfuerzos para

pacientes con melanoma avanzado resistente a los medicamentos, cncer de traducir los hallazgos en la inmunoterapia del laboratorio a la clnica [11].

pulmn, y cncer renal [4-6]. Sin embargo, en pacientes con cncer colorrectal Por otra parte, dos subtipos-inmunes infiltrado de CRC se han visto en

(CCR), que se encuentra entre las neoplasias ms comunes en los Estados pacientes humanos: el subtipo bien infiltrado y el subtipo mal infiltrado

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 [12, 13]. Sin embargo, los modelos de CRC subcutneas actuales estn
mal infiltraron [14]. Por lo tanto, es crtico para establecer un modelo
preclnico que recapitular microambiente del tumor primario y inmune
imitan bien infiltr caractersticas CRC humanos, especialmente de su
respuesta inmune lnea de base. Tal modelo sera complementario a los
modelos subcutneos clsicos y facilitara la investigacin de los
mecanismos de resistencia ICBT en diversos entornos clnicos [15].
modelos de tumores ortotpicos tienen varias ventajas sobre los
modelos tumorales qumicamente o genticamente inducidas. En general, los
trasplantes ortotpicos son ms fciles y ms rpido para establecer, y que se
encuentran dentro de un microambiente fisiolgico y comparable a la de las
enfermedades humanas [16]. En CRC, modelos de tumores ortotpicos han
requiere generalmente una laparotoma, que puede causar una fuerte respuesta
inflamatoria, que es un factor de confusin potencial de los resultados
experimentales, lo que es inadecuado para los estudios de inmunoterapia [17].
Hemos establecido un nuevo modelo ortotpico CRC que usa microinyeccin
endoscopy- guiado para establecer tumores ortotpicos en la pared del colon en
ratones [18]. Nuestro modelo CRC mnimamente invasiva no provoca una
respuesta inflamatoria y es particularmente adecuada para los estudios de
inmunoterapia. En este estudio, hemos investigado las caractersticas clave de
nuestro modelo, incluyendo la infiltracin inmune y las respuestas a ICBT. Se
compararon los tumores ortotpicos con tumores subcutneos establecidos de
las mismas lneas celulares de CRC y demostrar una diferencia significativa en
la respuesta inmune. Estos resultados ponen de manifiesto que influye en la
localizacin del tumor respuesta inmune en modelos animales de CRC y la
importancia de la seleccin del modelo en estudios preclnicos de
inmunoterapia.
RESULTADOS
Establecimiento de tumores colorrectales ortotpico en ratn
Para establecer un procedimiento estndar de la implantacin de clulas
tumorales en la pared del colon de ratn, hemos probado diferentes opciones de
anestesia. Hemos encontrado que los espasmos del colon y la secrecin
colnica, en respuesta a un examen endoscpico o puncin con aguja, eran los
problemas ms comunes que conducen al fracaso del implante. La frecuencia y
el grado de espasmos de colon y la secrecin de colon eran ms altas en ratones
anestesiados con Avertin; estas cuestiones fueron controlados cuando se
administr una combinacin de ketamina, xilazina, y atropina. Durante el proceso
de implantacin de clulas tumorales, una elevacin positiva de la mucosa
colnica en los sitios de implantacin se indica xito de la inoculacin celular
(Video complementario 1). Hemos alcanzado 80% de xito en la implantacin de
CRC tumores de ratn ortotpico.
Cuando se utiliz la endoscopia para controlar el crecimiento del tumor, vimos
protuberancias anormales en la luz del colon alrededor de 1 semana despus de la
inyeccin en algunos ratones (Figura 1A, i-ii); colnica posteriormente, el crecimiento
rpido del tumor inducida
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obstruccin (Figura 1A, iii). En otros ratones, como tumores invadieron la capa
submucosa y expandido hacia la serosa, no pudimos detectar el crecimiento
del tumor mediante endoscopia de luz brillante; Sin embargo, nos hicieron ver
rigidez, fragilidad, y sangrado intenso en la mucosa (Figura 1A, iv-vi). El
anlisis histolgico indic que los tumores ortotpicos fueron creciendo en la
capa submucosa y la invasin de la capa muscular (Figura 1A, vii). No se
detectaron tumores ortotpicos alrededor de 3 semanas despus de la
implantacin de los 10 5 clulas CT26- Luc (Figura 1B) por IVIS. Una correlacin
directa entre el volumen del tumor y el nmero de clulas tumorales inyectadas
se puede encontrar en nuestro modelo ortotpico (Figura 1C).
Se requieren menos clulas para establecer modelos subcutneos
en comparacin con los modelos ortotpicos
En ratones desnudos atmicos, inyeccin ortotpica de 10 3
clulas HT29 podan inducir la formacin de tumor a las 4 semanas en el modelo
subcutneo, pero no en el modelo ortotpico (Figura 1D). inyeccin ortotpico de
10 5 clulas HT29 era suficiente para inducir la formacin de tumores y la invasin a
las 4 semanas en el modelo ortotpico (Figura 1A). Se observaron resultados
similares en nuestros dos modelos de CRC ortotpico singnicos. Por ejemplo, la
inyeccin de 10 4 clulas CT26 indujeron la formacin de tumores a las 4 semanas
en el tejido subcutneo, pero no en la pared del colon en ratones BALB / c (Figura
1E; resultados confirmados por autopsia, datos no mostrados) y la inyeccin de 10 5
clulas MC38 indujeron la formacin de tumores a las 4 semanas en el tejido
subcutneo, pero no en la pared del colon en ratones C57BL / 6 (Figura 1F).
Tomados en conjunto, nuestros datos indican que se necesitan ms clulas para
iniciar la tumorignesis en el modelo ortotpico en comparacin con el modelo
subcutneo.
tumores ortotpicos tienen la infiltracin de clulas inmuno ms
adaptable que los tumores subcutneos
Mltiples estudios han demostrado que la infiltracin de clulas inmunes
en CRC es altamente variable entre los pacientes y aumento de la infiltracin de
clulas inmunes se asocia con un mejor resultados [19]. La inmunotincin con
marcadores de clulas T (CD3 y CD8) en muestras de CRC humanos, tambin
se observ dos subtipos de CRC, a partir de la infiltracin de clulas T:
as infiltrado- tumores (Figura 2A, i-iii) y pobremente infiltrado tumores (Figura
2A, iv). En las muestras de colon normal a partir de ratones BALB / c, el
microambiente que los tumores ortotpicos crecieron en, encontramos muy
pocas clulas T excepto en las placas de Peyer (Figura 2B). Esta observacin
puede ser el reflejo de las carencias de la exposicin al antgeno en estos
ratones y su entorno de alojamiento controladas [20]. En el tejido tumoral
ortotpico, encontramos las clulas T, tanto en los mrgenes (Figura 2C, i) y
las partes centrales (Figura 2C, ii) de los tumores; vimos tanto CD4 + (Figura
2C, iii) y CD8 + clulas (Figura 2C, iv). Por el contrario, en los tumores
subcutneos establecidos por la misma lnea celular, encontramos un nmero
muy pequeo de clulas T (Figura 2D). Citometra de flujo
2 Oncotarget
 Figura 1: la tumorignesis en modelos ortotpicos y subcutnea fue distinta. tumores ortotpicos fueron establecidos por endoscopia-gua microinyeccin en la pared del
colon de ratones BABL / c. En algunos ratones, los tumores y la obstruccin de colon causado-tumor se pueden ver directamente en la luz del colon ( A, I-III). En otras ratones,
movimiento anormal, rigidez, y el sangrado puede ser visto en el colon ( A, IV-VI).
Tincin H & E mostr tejido tumoral en la capa submucosa. El margen de invasin se puede ver en la muscular externa ( A, vii). Un en vivo
sistema de imagen se puede utilizar para la monitorizacin en nuestro modelo ortotpico ( SEGUNDO). La inyeccin de diferentes nmeros de clulas CT26 (10 5 y 10 6) dado lugar a una diferencia significativa en

el volumen tumoral en la autopsia ( DO). A las 4 semanas despus de la inyeccin de 10 3 clulas tumorales HT29, ya sea en la pared del colon o el tejido conectivo subcutneo de ratones desnudos atmicos (n
= 4 en cada modelo), la tumorignesis se produjo slo en el modelo subcutneo ( RE).
Las flechas indican los sitios de inyeccin de representacin en la pared del colon, pero no formaron tumores ( D, i-ii). A las 4 semanas despus de la inyeccin de 10 4 clulas CT26, ya sea en la pared
del colon ( E, I; n = 3) o el tejido conectivo subcutneo ( E, II; n = 4) de ratones BALB / c, tumores subcutneos forman
(E, I); sin embargo, no se detectaron tumores ortotpicos formado ( E, ii). La autopsia confirm los resultados de formacin de imgenes (datos no mostrados) ( MI). La inyeccin de 10 5 MC38 no indujo la
formacin de tumores en la pared del colon (n = 8) de ratones C57 / B6, mientras que caus la formacin de tumores subcutnea (n = 8) ( F).
H & E: hematoxilina y eosina. ** P < 0.01.

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 anlisis mostr las mismas tendencias de la infiltracin de clulas T en ambos
modelos. De ah se determin la proporcin de clulas T CD8 + en estos dos
modelos y no se encontraron diferencias. Puesto que las clulas B son importantes
en la presentacin de antgenos y la inmunidad adaptativa. Se verificaron nmero de
clulas B en estos dos modelos y encontramos el nmero de clulas B infiltrantes de
tumor fue mayor en los tumores ortotpicos que en los tumores subcutneos (Figura
2E). RT-qPCR anlisis mostr expresin de quimiocinas relacionadas con la
migracin de clulas T fue mayor en los tumores ortotpicos que en los tumores
subcutneos (Figura 2F).
clulas NK incrementaron y las clulas supresoras de origen
mieloide estn disminuidos en tumores ortotpicos
clulas inmunitarias innatas son tambin crtico en la regulacin de las
respuestas inmunitarias antitumorales. Por lo tanto, se compararon los perfiles
inmunes innatas entre estos dos modelos. Hemos observado altos niveles de
clulas NKp46 + en los tejidos de colon normales humanos (Figura 3AI). Sin
embargo, en muestras de pacientes de CRC, observamos niveles diferenciales
de clulas NKp46 +. (Figura 3Aii, 3Aiii). En las muestras de los ratones de tejido,
encontramos ms NKp46 + clulas en tumores ortotpicos que en los tumores
subcutneos (Figura 3B, 3C). anlisis RT-qPCR de los niveles de transcripcin
de genes que codifican citocinas o quimiocinas relacionadas con las funciones
de clulas asesinas naturales (NK), encontramos una mayor expresin de IL12,
IL15, IL18 y en los tumores ortotpicos que los tumores subcutneos (Figura
3D). Citometra de flujo anlisis mostraron ninguna diferencia en el nmero de
clulas dendrticas (DC) y los macrfagos entre los dos modelos (Figura 3E).
Hemos llevado a cabo la tincin para CD80 + (subtipo M1) y CD206 + (subtipo
M2) en ambos de nuestros modelos de CRC. Nuestros datos no mostraron
diferencias significativas en la proporcin de los subtipos M1 y M2 (Figura 2).
Sin embargo, hemos encontrado ms CD11b +, CD11c-, y + o clulas Ly6C
Ly6G + de origen mieloide supresores (MDSCs) en tumores subcutneos que
los tumores ortotpicos (Figura 3F).
respuesta inmune antitumoral global aument en los tumores
ortotpico
Nuestro anlisis indica una presencia de clulas inmunes ms robusto
en el modelo ortotpico. Adems, se determin la intensidad inflamatoria y la
respuesta inmune antitumoral en general mediante la medicin de las
concentraciones de IL-6, IL-2, IFN y granzima B. Se encontr que las clulas
CT26 y tejidos de colon normales no expresan IL6, IL-2, IFN y granzima B. Sin
embargo, comparado con tumores subcutneos, tumores ortotpicos que
crecan en el microambiente de colon mostraron una mayor expresin de
todas las citocinas ensayadas (Figura 4). Estos hallazgos apoyan nuestra
observacin de que los tumores ortotpico tienden a tener ms clulas
inmunitarias antitumorales y un menor nmero de clulas inmunosupresores,
lo que sugiere que los tumores tienen una fuerte orttropos
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respuesta inmune antitumoral general que los tumores subcutneos.
expresin punto de control inmune y la eficacia de ICBT
diferan entre los modelos ortotpicos y subcutnea
Adems del nmero de clulas inmunes, el estado de activacin de las
clulas inmunes citotxicas tambin es fundamental en la regulacin de la
respuesta inmune antitumoral. El estado funcional de las clulas inmunes en los
tumores se determin midiendo los niveles de expresin de los puestos de
control inmunes y marcadores de activacin de clulas T. Hemos generado
modelos ortotpicos y subcutnea CRC inyectando mismo nmero (10 5) de las
clulas. En los tumores subcutneos, observamos niveles ms altos de los
puestos de control inmunes tales como CTLA4 y PD1 sobre las clulas T en
comparacin con los tumores ortotpicos (figura 5A). Adems, la expresin
PDL1 tambin fue mayor en los tumores subcutneos que en los tumores
ortotpicos (figura 5A). Sin embargo, se observ ninguna diferencia significativa
en la expresin de marcadores de activacin de clulas T tales como CD62L,
CD44, y IFN en las clulas T infiltrantes de tumores tanto en modelos tumorales
(Figura 5B). Adems, investig si estos dos modelos de tumores con diferentes
perfiles inmunes tienen distintos respuesta a la terapia puesto de control de
bloqueo inmune (ICBT). Hacia esto, los ratones fueron tratados ya sea con IgG
o anti-PD1 ms anti-CTLA4 en seis dosis durante tres semanas (Figura 5C).
Este rgimen de tratamiento indujo respuesta en tumores tanto ortotpicos y
subcutnea (Figura 5D, 5E, 5F y). Despus de seis dosis de tratamiento, no se
observ ningn crecimiento tumoral en el modelo ortotpico (Figura 5D). Sin
embargo, en el modelo subcutneo, aunque los tumores respondieron a ICBT
(Figura 5E y 5F, complementario Figura 3), fueron todava observaron tumores
residuales. Para determinar la vascularizacin del tumor que puede tener un
potencial efecto de confusin sobre el tratamiento ICBT, teidas con CD31 en
dos de nuestros modelos de CRC. Nuestros patrones de tincin sugieren que
ninguna diferencia evidente de la densidad capilar en estos dos modelos (Figura
4).
DISCUSIN
Los estudios en ratones se utilizan con frecuencia para proporcionar el
fundamento para el ensayo de terapias anti-tumorales en fase 1 de pruebas clnicas
[21]. El enfoque tradicional, utilizando xenoinjertos humanos en ratones
inmunodeficientes, no es susceptible a los agentes anti-tumorales pruebas
inmunomoduladores debido a la ausencia de un sistema inmune fisiolgica. Los
modelos de ratn de tumores, incluyendo tumores de xenoinjertos humanos y tumores
singnicos, fueron adecuados para los estudios preclnicos que probaron frmacos
citotxicos [21]. Sin embargo, la inmunoterapia tiene un mecanismo diferente para la
eliminacin de tumores: mata las clulas tumorales mediante la mejora o la
reconstruccin de la respuesta inmunitaria antitumoral en los pacientes (en lugar de
por matar directamente las clulas tumorales) [1]. La eficacia de la inmunoterapia,
especialmente
4 Oncotarget
 ICBT depende en gran medida el microambiente inmunolgico de los tumores [22,
23].
Para maximizar las oportunidades de traducir novedosas estrategias
de inmunoterapia de los estudios preclnicos a la aplicacin clnica, se
necesitan modelos de ratn de CRC que puede imitar microambiente
fisiolgicamente relevante
[11]. En este estudio, se analizaron dos modelos inmunocompetentes usando
lneas murinas CRC celulares (CT26 y MC38) en sus anfitriones
inmunocompetentes coincidentes (BALB / c y C56BL / 6). Hemos demostrado
que estos modelos se pueden utilizar para probar la eficacia de la terapia de
bloqueo puesto de control, anti-CTLA4 y anti-PD1. Por otra parte, hemos
demostrado que

Figura 2: infiltracin de clulas inmunes adaptativas fue mayor en los tumores ortotpicos que en los tumores subcutneos. En las muestras de CRC humanos, ambos bien
infiltraron-( A, i-iii) y mal-infiltrado ( A, iv) Se encontraron tumores. En / c de colon normal de ratn BALB, clulas CD3 + se ven generalmente en los tejidos mucosa ganglios ( SEGUNDO). En los
tumores ortotpicos, se observaron clulas CD3 + en los mrgenes del tumor ( C, i) y en las partes centrales del tumor ( C, ii). Tanto CD4 + y CD8 + se observaron clulas en tumores ortotpicos ( C,
III-IV). En los tumores subcutneos, tambin se detectaron clulas CD3 +, pero no tantos como en los tumores ortotpicos ( RE). Citometra de flujo El anlisis indic ms clulas B y ms clulas T
en los tumores ortotpicos que en los tumores subcutneos. La proporcin de clulas T CD8 + fue la misma en los dos modelos ( MI). En los tumores ortotpicos, la expresin de ARNm de CXCR3,
CXCL9, CXCL10, y CXCL11 fue mayor. El nivel de expresin se present como factor de cambio, se refiere a la expresin ms baja ( F). N: normal; T: tumor. (% Total se refiere a nmero total de
clulas en el tejido tumoral) *** P < 0.001; **** P < 0,0001.

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 perfiles y la respuesta inmune son diferentes en un microambiente del tumor
ortotpico comparacin con los tumores subcutneos.
De acuerdo con estudios anteriores, observamos subtipos CRC
humanos con clulas inmunes bien y pobremente
tumores infiltrados [12, 19]. Las clulas inmunes pobremente infiltraron
tumores son insensibles a ICBT [24], mientras que los tumores bien
-infiltrated son ms sensibles a ICBT [25]. Nuestra investigacin de perfiles
inmunitarias adaptativas de tumores ortotpicos y subcutnea en ratones
representa una

Figura 3: infiltracin de clulas inmunes innata en modelos ortotpicos y subcutnea era distinto. En las muestras de colon humano, se encontr que las clulas NKp46 + en colon
normal y en algunos casos de CCR ( UN). En modelos de tumores, las clulas NKp46 + fueron ms frecuentes en tumores ortotpicos que en los tumores subcutneos ( ANTES DE CRISTO). la expresin
de ARNm de IL-12, IL-15, IL-18, y CCL5 (todos ellos relacionados con las clulas NK) fue mayor en los tumores ortotpicos. El nivel de expresin se present como factor de cambio, se refiere a la
expresin ms baja ( RE). La citometra de flujo mostr ninguna diferencia en el nmero de pases en desarrollo y los macrfagos en los dos modelos ( MI). Sin embargo, ms MDSCs, clulas
inmunosupresores importantes, fueron encontrados en tumores subcutneos ( F). Una mayor proporcin de clulas CD11b + CD11c- se encontraron en tumores subcutneos ( F). La proporcin de Ly6C + y
clulas Ly6G + (en la poblacin CD11b + CD11c-) era el mismo en los dos modelos (datos no mostrados). IL: interleucina; N: normal; T: tumor. (% Total se refiere a nmero total de clulas en el tejido
tumoral) * P < 0.05.

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 paso clave en la imitacin de diferentes situaciones clnicas en modelos de ratn. Los
dos modelos de tumores CRC producen diversos fenotipos inmunes en trminos de
la infiltracin de clulas T. tumores ortotpicos fueron mejor infiltrados con clulas T
que los tumores subcutneos, misma tendencia tambin se observ con clulas B.
Resultados similares se observaron tambin en un modelo ciego [26], en el que se
detect una mayor frecuencia de clulas T CD8 + en las placas de Peyer en
respuesta al desafo tumoral. Adems, los estudios han demostrado que el regulador
de clulas T (Treg) inhibe la funcin de clulas T citotxicas y selectivamente mata
las clulas presentadoras de antgenos, incluyendo las clulas B [27]. Sin embargo,
en nuestro estudio, la proporcin de clulas T reguladoras entre todas las clulas T
fue similar en los modelos de CRC ortotpicos y subcutnea (datos no mostrados).
Esto sugiere que la infiltracin de Treg no se ve afectada por la localizacin del
tumor.
las clulas inmunes innatas, dependiendo de su diferenciacin y el
estado funcional, ya sea suprimidos o promueven la formacin de tumores
[28]. NK de clulas es la mayor
tipo de clula en la inmunidad innata que tienen funciones antitumorales [29]. Mejora
de los efectos antitumorales de clulas NK a travs de una sola cadena fragmentos
variables biespecficos heterodimricos (scFv) de encaje asesinas ha sido muy
prometedores en modelos preclnicos [30]. En muestras de tejido de CRC humanos,
se observ un subconjunto de muestras con clulas NK infiltradas. En los ratones,
los tumores ortotpicos tenan ms infiltracin de clulas NK que los tumores
subcutneos. En un modelo de ciego, los niveles ms altos de clulas NK fueron
fundadas en los ganglios linfticos mesentricos (MLN) de grupo de tumor en
comparacin con MLNs de grupos de control [26]. Notablemente, los tumores
subcutneos tenan ms clulas inmunosupresores tales como MDSCs, en
comparacin con los tumores ortotpicos. Por otro lado, nos encontramos la misma
proporcin de clulas presentadoras de antgeno, tales como las DC y los
macrfagos en estos dos modelos de tumores. En trminos de expresin de IL2,
IL6, IFN y granzima B, los tumores ortotpicos mostraron niveles relativamente ms
altos que los tumores subcutneos. Tomados en conjunto, tanto de adaptacin y

Figura 4: Expresin de IL2, IL6, granzima B, y IFN vari en los tumores ortotpicos y subcutnea. Usando el ensayo de inmunoabsorcin ligado a enzimas mtodo
(ELISA), que mide la expresin de algunos proinflamatorias y citotxicas citoquinas, tales como IL-2 ( UN), IL-6 ( SEGUNDO), granzima B ( DO), y IFN- ( RE). En la cultura de clulas
tumorales CT26 y en tejido de colon normal en ratones BALB / c, esas citoquinas no pudieron ser detectados. Pero en ambos tumores ortotpicos y subcutneos en ratones, se
detect expresin de esas citoquinas: expresin fue mayor en los tumores ortotpicos que en los tumores subcutneos. IFN-: interfern-gamma; IL: interleucina. * P < 0,05; ** P < 0.01.

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 respuesta inmune innata son ms fuertes en el modelo ortotpico que en
modelo subcutneo. Al igual que en nuestra observacin, otro estudio
demostr que los tumores en el flanco tuvieron respuesta inmune pobre en
comparacin con tumores en la regin dorsal del pie [31]. Por otro lado, la
fuerte respuesta inmunitaria observada en tumores ortotpicos puede
explicar por qu se requiere un mayor nmero de clulas tumorales
para establecer modelo ortotpico CRC de los tumores subcutneos.
Otros estudios para descifrar los mecanismos moleculares que regulan
la respuesta inmunitaria en estos modelos.
Mediante la comparacin de los dos modelos de ratn, se encontr que las
protenas de punto de control inmunes inhibitorias, tales como CTLA4, PD1, y PDL1
se expresaron a niveles ms bajos

Figura 5: Perfil del puesto de control inmune y la respuesta a ICBT diferan en tumores ortotpicos y subcutnea. Expresin de los puestos de control inmunes inhibitorias
PD1 y CLTA4 fue mayor en las clulas T infiltrantes de tumores en tumores subcutneos ( UN). Expresin del puesto de control inmunolgico estimuladora CD28 tambin fue mayor en las clulas T
infiltrantes de tumores en tumores subcutneos, pero la diferencia no fue estadsticamente significativa (P = 0,057) ( UN). Expresin de PDL1 fue mayor en los tumores subcutneos ( UN). Expresin
de marcadores de clulas T de activacin / funcin (IFN-, CD62L y CD44) fue el mismo en las clulas T infiltrantes de tumor en los tumores subcutneos y ortotpicos ( SEGUNDO). Para
comparar la sensibilidad a los frmacos de los 2 modelos, se administr anti-CLTA-4 y anti-PD1 con una intensidad moderada ( DO). En el punto final, los tumores ortotpicos mostraron una mejor
respuesta; fueron bloqueados a fondo por ICBT, mientras que, los tumores subcutneos slo pueden ser controlados en parte por ICBT ( DF). ICBT: Terapia de bloqueo puesto de control
inmunolgico; IFN-: interfern-gamma; T: tumor. * P < 0,05; ** P < 0.01.

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 en los tumores ortotpicos en comparacin con tumores subcutneos. Tales puntos
de control son factores importantes en la regulacin de la activacin de clulas
inmunitarias adaptativas, especialmente clulas T [32, 33]. Tambin vimos una
tendencia (p <0,057) en direccin a una mayor expresin de la estimuladora puesto
de control inmune CD28 en tumores subcutneos. Estos resultados sugirieron que se
activaron clulas T en tumores subcutneos, pero bajo una fuerte supresin de
factores inmunosupresores incluyendo puesto de control inmunolgico. Estos datos
estn en lnea con nuestros resultados que los tumores subcutneos tienen una
respuesta inmune dbil.
Respuesta a ICBT en estos dos modelos tambin fue investigado.
ICBT protocolos mltiples con grandes diferencias en la intensidad del
tratamiento se han reportado en los estudios preclnicos [34-36]. Tambin se
ha demostrado que la doble bloqueo de las vas de PD1 y CTLA4 aument
los efectos antitumorales a travs de la mejora de la relacin de clulas T
inmunes de clulas efectoras / regulador en un modelo animal [37]. Teniendo
en cuenta que los tumores CT26 fueron relativamente sensibles a ICBT [38],
que administramos bloqueos de punto de control inmunes con una intensidad
moderada. Este plan de tratamiento descarta efectos positivos o negativos
falsos debido a la dosis teraputica apropiada. Hemos encontrado que los
tumores en ambos modelos respondieron a ICBT. Pero ortotpico tumores
eran ms sensibles: estaban totalmente bloqueadas por ICBT. tumores
subcutneos respondieron a
Figura 6: Resumen de las comparaciones entre la novela modelo ortotpico CRC y el modelo clsico subcutnea CRC.
tumores ortotpicos requieren un mayor nmero de clulas tumorales para la tumorignesis, pero mostraron una capacidad ms fuerte invasin, la respuesta inmune antitumoral, y la sensibilidad a ICBT.
ICBT: terapia de bloqueo puesto de control inmunolgico.
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ICBT, basado en el crecimiento reducida; sin embargo, al final de nuestro
perodo de estudio, los tumores subcutneos pequeos todava estaban
presentes. No haba ninguna diferencia observada en los niveles de CD31
entre estos dos modelos de tumor de CRC que sugieren que la densidad
capilar no influy en la entrega de ICBT. Tomando todos los datos
conjuntamente, el modelo subcutneo imita una pobre inmune infiltrado y el
fenotipo fuertemente inmunosupresora, mientras que el modelo ortotpico
puede imitar relativamente infiltrado CRC en un microambiente
fisiolgicamente relevante bien inmune.
Como requisito previo para que las estrategias de inmunoterapia
innovadores del banco a la cama, se necesitan modelos de tumores
experimentales apropiadas para imitar con precisin diferentes
situaciones clnicas. Nuestro estudio investig las caractersticas clave de
un nuevo modelo de CRC ortotpico, y mostr diferencias significativas
entre el modelo ortotpico y el modelo subcutneo en perfiles inmunes y
ICBT. Nuestro estudio indica que sigue habiendo un papel para el modelo
subcutnea en los estudios de inmunoterapia, ya que son fciles de
establecer, son muy estables, y que imitan un microambiente
inmunolgico relativamente escasa. Nuestro modelo ortotpico, por otro
lado, proporciona otra opcin til, que mejor imita CRC tumores con
niveles ms altos de infiltracin inmune en pacientes humanos (Figura 6).
Tomados en conjunto, nuestro estudio
9 Oncotarget
 identifica la influencia de la localizacin del tumor en la respuesta inmune en
modelos de ratn de CRC. Por otra parte, se destaca la importancia de la
seleccin del modelo en estudios de inmunoterapia, y demostramos un papel
para nuestra novela guiada modelo ortotpico CRC que podran complementar
los modelos subcutneos actuales para aumentar el potencial de traslacin de
los estudios preclnicos inmunoteraputicos CRC endoscopy-.
MTODOS Y MATERIALES
lneas celulares de CRC
CT26, una lnea celular de CRC generados a partir de ratones
BABL / C, se adquiri de la American Type Culture Collection (ATCC,
Manassas, VA) y se cultiv en medio RPMI-1640 con 10% de suero
bovino fetal (FBS) y 1% de penicilina estreptomicina (pen-strep). MC38,
una lnea celular de CRC generados a partir de ratones C57BL / 6, fue un
regalo del Dr. Nicholas Haining (Universidad de Harvard) y se cultiv en
medio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) con 10% de FBS y 1%
pen-strep. HT29, una lnea CRC humano, se adquiri de ATCC y se
cultivaron en medio 5A de McCoy con 10% de FBS y 1% pen-strep. por en
vivo
experimentos de imagen, hemos generado una lnea de clulas CT26 transfectadas de
forma estable con la luciferasa de lucirnaga (CT26-Luc). Las lneas celulares
obtenidas a partir de recursos ATCC fueron autenticados por el vendedor.
Ratones
ratones BALB / c (6-8 semanas de edad, Jackson Laboratory, Bar Harbor,
ME) fueron utilizados para injertos utilizando clulas CT26 y CT26-Luc. / B6 ratones
C57 (6-8 semanas de edad, Charles River Laboratories, Wilmington, MA) fueron
utilizados para injertos MC38. ratones atmicos desnudos (6-8 semanas de edad,
Charles River Laboratories) se utilizaron para injertos HT29. Todos los ratones se
mantuvieron en una instalacin especfica libre de patgenos y tuvieron acceso sin
restricciones a agua y comida y un ciclo de da-noche 12-hr controlada. Los estudios
con animales fueron aprobados por el comit de cuidado de los animales y el uso
institucional de la Universidad de Minnesota.
la implantacin del tumor
Actuar en vivo colonoscopias de alta resolucin, que utilizan el sistema de
mini-endoscpica Mainz Coloview (Karl Storz Endoskope, Tuttlingen, Alemania).
Para la implantacin de clulas tumorales ortotpico en la pared del colon, que
anestesiados ratones con ketamina (100 mg / kg) en combinacin con xilazina (10
mg / kg) mediante inyeccin intraperitoneal. Para minimizar el movimiento colon,
contraccin, y la secrecin, se administr atropina (0,04 mg / kg, por va
intraperitoneal). Despus de la implantacin de clulas tumorales, los ratones se
pusieron sobre una almohadilla caliente hasta que est completamente
recuperado. Al supervisar los tumores, que anestesiados ratones con Avertin (250
a 500 mg / kg, por va intraperitoneal) 5 minutos antes del procedimiento, a
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minimizar la duracin de la anestesia. Para la implantacin de clulas tumorales
subcutnea, suspendimos clulas tumorales en una matriz de Matrigel, luego se inocul
la suspensin en el flanco de las piernas.
brazo de tratamiento
Despus de la implantacin de clulas tumorales, los ratones fueron
separados al azar en un grupo de tratamiento y un brazo de control. En el brazo de
tratamiento, los ratones fueron inyectados con anti-ratn PD1 (Clon: RMP1-14, 10
mg / kg, dos veces por semana) y CLTA4 anti- ratn (Clon: UC10-4F10-11, 5 mg /
kg, dos veces por semana) (ambos de BioCell Technology LLC, Newport Beach,
CA). En el brazo de control, los ratones fueron inyectados con un isotipo de IgG (15
mg / kg, dos veces por semana) (BioLegend, San Diego, CA).
En vivo imgenes
Para supervisar CRC tumores ortotpicos establecidos por las
clulas CT26-Luc, se utiliz el IVIS Spectrum en vivo
sistema de imagen (PerkinElmer, Waltham, MA); 10 minutos antes de formacin
de imgenes, inyectamos ratones con D-luciferina, GoldBio (150 mg / kg,
intraperitonealmente) y luego
ellos anestesiados con isoflurano. Para todos los ratones, fijamos tiempo de exposicin
de formacin de imgenes como 60 seg.
Citometra de flujo
La citometra de flujo se utiliz para medir los marcadores de infiltracin
celular y la activacin inmune. tejido tumoral cosechado se digiri en una
solucin de colagenasa IV (5 mg / ml) y desoxirribonucleasa (DNasa, 50
unidades / ml) a 37 C durante 1 hora y se filtr a travs de un filtro de clulas
de 40 m. Las clulas se centrifugaron y se resuspendieron en tampn de lisis
de glbulos rojos durante 10 minutos, seguido de otra ronda de centrifugacin.
Los siguientes anticuerpos fueron adquiridos de BioLegend o BD
Biosciences (San Jose, CA): CD3 (17A2), CD19 (6D5), CD4 (GK1.5), CD8
(53-6.7), CD11b (M1 / 70), CD11c ( N418), CD28 (37.51), PD1
(29F.1A12), CTLA4 (UC10-4B9), PDL1 (10F.9G2), CD44 (IM7), CD62L
(MEL-14), interfern-gamma (IFN, XMG1.2 ), Ly6C (HK1.4), Ly6G (1A8),
F4 / 80 (BM8), y yo-Ad (AMS-32.1). Las clulas se tieron con anticuerpos
de marcadores de superficie primera, y despus se fijaron y se
permeabilizaron para la tincin con marcadores intracelulares. Los datos
fueron analizados utilizando el software FlowJo (rbol Star, Inc., Ashland,
Oregn).
Histologa e inmunotincin
Inmediatamente despus los ratones fueron sacrificados, el tejido
tumoral se fij en formalina al 10% antes de la inclusin en parafina. Los
procedimientos estndar se utilizaron para hematoxilina y eosina (H & E)
tincin. Para la inmunotincin, formalina fijo, tejido incluido en parafina se
trat con xileno,
10 Oncotarget
 rehidratada con etanol, y se calent en un horno de microondas con tampn
ctrico para recuperar antgenos. Para el bloqueo propsito, los tejidos se
incubaron durante 30 minutos, con tampn de albmina de suero bovino 5%.
Seguido de incubacin durante la noche a 4 C, con anticuerpos primarios:
anti-CD3 anticuerpo, anticuerpo anti-CD4 y anti-NKp46 anticuerpo (Abcam,
Cambridge, Reino Unido) a 1: 100 diluciones, anti-CD8 anticuerpo (Novus
Productos Biolgicos, Minneapolis, MN) a una dilucin de 1:20, anti-CD31
(Novus Productos Biolgicos, Minneapolis, MN) a 1: 100, anti-F4 / 80
(sistema de I + D Minneapolis, MN) a 1: 100, anti-CD206 (sistema de I + D
Minneapolis , MN) a 1: 100, as como anti-CD80 (Novus Productos
Biolgicos, Minneapolis, MN) a 1: 100. Despus del lavado, los tejidos se
incubaron con anticuerpos secundarios de fluorescencia conjugado a
temperatura ambiente durante 1 hr. Los portaobjetos se prepara con antifade
MOUNTANT con 4' , 6-diamidino-2- fenilindol (DAPI).
RT-qPCR
El kit de aislamiento de mirVana microRNA (miRNA) se utiliz para
extraer el ARN. Se utiliz 500 ng de ARN total para el anlisis en tiempo real
de reaccin en cadena de la polimerasa con transcriptasa inversa cuantitativa
(RT-qPCR) con el QuantiTect Reverse Transcription Kit (Qiagen, Hilden,
Alemania). Para medir muestras de cDNA, se utiliz el 480 Instrumento
LightCycler (Roche Ciencias de la Vida, Indianapolis, IN) normalizado a 18S
RNA ribosomal (rRNA) de expresin. Las secuencias de cebadores se
incluyen en la Tabla Suplementaria 1.
ELISA
ELISA se realizaron para medir la granzima B, IFN, IL6 e IL2
usando kits de ELISA de Affymetrix (Santa Clara, CA) segn el protocolo
del manufaturer. Todas las muestras se normalizaron en base a las
concentraciones de protena medidos utilizando un ensayo de protena BCA
(Pierce Chemical Company, Dallas, TX).
anlisis estadstico
Para todos los anlisis estadsticos, se emple GraphPad Prism
6.0 (GraphPad Software, San Diego, CA). Para comparar el grupo de
tratamiento y el grupo de control, se utiliz el Estudiante t prueba. Para los datos
de grupo mltiple, se utiliz el anlisis unidireccional mtodo de la varianza
(ANOVA) de; para mltiples comparaciones por parejas, se realiz un ajuste de
Bonferroni post hoc. Todos los datos se representan como la media
desviacin estndar (SD). Bilateral PAG valores <0,05 se consideraron
estadsticamente significativos.
Contribuciones de autor
XZ y SS contribuido a la concepcin y diseo de la obra; XZ
y LL fueron los responsables de los datos
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coleccin; XZ, LL, TS y SS contribuido en el anlisis e interpretacin de
datos, la redaccin del artculo, y la aprobacin final de la versin que se
publicar.
EXPRESIONES DE GRATITUD
Agradecemos a Makayla Maile til para los debates y la formacin con
el pequeo endoscopia animal. Agradecemos al Dr. Mary Knatterud y Leeanne
Dongses para ayudar en la preparacin de manuscritos. Agradecemos al Dr.
Lalitha Belur y nuestros miembros del laboratorio Dr. Anne Sarver, Ce Yuan y
Nidhi Desai por su apoyo durante este proyecto.
CONFLICTOS DE INTERS
Los autores reportan ningn conflicto de intereses.
FONDOS
Este proyecto fue apoyado por el fondo de inicio proporcionada a
la SS por el Departamento de Ciruga de la Universidad de Minnesota.
TKS es apoyado por el Fondo Mezin-Koats Colon Cancer Research, el
Departamento de Defensa (W81XWH-16-1-0427), y el Centro del Cncer
masnico (Proyecto NCI / NIH subvencin P30-CA77598). becas para
graduados de XZ es apoyado por el Departamento de Ciruga beca de
investigacin GI.
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