TECHNIQUES EN

IMMUNOLOGIE

NJIKI BIKO Jacky

PhD student
Medical Immunology and
Cancerology
Faculty of Medicine and Biomedical
Sciences
 INTRODUCTION
Mettre en vidence la raction Ag-Ac

Si lantigne est molculaire et soluble,

les complexes Ag/Ac forment un
prcipit,
si lantigne est particulaire ou
cellulaire (bactries, hmaties, billes de
latex ), les complexes immuns
forment un agglutinat.
 INTRODUCTION
1- METHODES NUTILISANT PAS DE MARQUEURS
Observation directe:
- Agglutination
- Prcipitation
- Neutralisation
- Immunochromatographie
 INTRODUCTION
2- METHODES UTILISANT UN
MARQUEUR
Observation indirecte:
- Radioimmunologie
- Immunoenzymologie
- Immunofluorescence
 IMMUNOPRECIPITATION
Si lAg est molculaire et soluble; les complexes Ag/Ac
forment un precipit
Ag solubles, Ac polyclonaux (IgM/IgG):prcipitines
Lecture lil, turbidimtre (absorption de la lumire
par les complexes immuns) ou nphlmtre
(dviation de la lumire par les complexes immuns)
Prcipitation en milieu liquide ou glifi
 PRECIPITATION EN MILIEU
LIQUIDE
Test de lanneau: test
qualitatif. Ag et Ac
introduits dans un tube.
Repos. Diffusion lent dans le
milieu et cration de
gradients de concentration.
A quivalence, formation de
complexes et prcipitation.
 PRECIPITATION EN MILIEU
LIQUIDE
Technique de Heidelberg et
Hendal: vieille technique, mais qui
dmontre bien l'quivalence.
On verse dans plusieurs tubes une
quantit constante d'anticorps, et
une quantit croissante d'antignes.
On centrifuge les tubes, et on compare
la quantit de prcipit en fonction
de la concentration.
PRECIPITATION EN MILIEU
LIQUIDE
 PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
Sur gel dagarose. Molcules diffusent
dans toutes les directions. Formation
darc de prcipitation l o il y a
quivalence

Autant darc de prcipitation, autant

de complexes Ag/Ac
 PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
1- Mthode de Oudin: Dans un tube deux
gloses contenant chacune des antignes et des
anticorps. Les molcules vont diffuser et former
un arc de prcipitation l'quivalence.

La position des arcs de prcipitation dpend des Ag

et des Ac
concerns qui diffusent en fonction de leur taille et
de leur structure.
Varie aussi avec la concentration. Plus Ag concentr,
plus il devra diffuser avant d'atteindre
l'quivalence.
De plus au cours du temps, l'arc de prcipitation va
descendre jusqu' une certaine hauteur pour
rester une densit qui lui correspond.
PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
 PRECIPITATION EN
2- Technique MILIEU GELIFIE
d'Ouchterlony (Immunodiffusion double): Technique
basee sur la double diffusion Ag et Ac dans un gel en fonction de leur
PM. Elle permet lanalyse qualitative dun mlange dAg en solution.
Puits dans la glose que l'on remplit de Ag et Ac. On observe alors des
arcs de prcipitation qui sont diffrents en fonction Ag et Ac prsents.
PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
 PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
3- Technique de Mancini (Immunodiffusion Radiale):
Elle permet lanalyse qualitative dun mlange dAg
en solution. remplissage des puits avec un antigne
de concentrations diffrentes, dans une glose
remplie d'anticorps contre cet antigne.
On observe des cercle de prcipitation dont le
diamtre est proportionnel la concentration
d'antigne. On peut alors doser l'antigne.
PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
 PRECIPITATION EN
MILIEU GELIFIE
3- Mthode de Laurell (lectrophorse en
fuse) : permet de doser lAg Cette technique
permet daccelerer le temps de diffusion en
obligeant lAg migrer sous leffet dun champ
lectrique, dans un gel contenant lAc.
Technique beaucoup plus sensible que celle de
Mancini. La taille des arcs de prcipitation est
proportionnelle la concentration de lAg.
IMMUNOAGGLUTINATION
Ag particulaire et multivalent. Ac au moins bivalent (les
IgM sont plus agglutinant que les IgG)
Les Ac dits agglutinants (IgM en majorit) sont capables
de produire une agglutination des particules en
suspension dans un milieu salin de [NaCl] = 0,15 M.
Les non-agglutinants sont incapables de provoquer une
agglutination dans ces conditions.

Les Ag ; il existe une relation entre lagglutinabilit et :

- le nombre de sites antigeniques
- leur localisation
IMMUNOAGGLUTINATION
Ag situ la surface dune particule (globules rouges,
globules blancs, plaquettes, spermatozodes, micro-
organismes, billes de latex ou de sepharose).
Phnomne complexe o les Ac sunissent aux Ag ports
par la particule formant ainsi des ponts spcifiques
entre ces particules, permettant leur runion en amas.
 IMMUNOAGGLUTINATION
Agglutination directe et active :
- agglutination active : lAg pour lequel on
recherche les Ac est dj particulaire
- agglutination directe si lAc est
directement agglutinant (IgM)

Srogroupages bacteriens (Salmonella,

Shigella, E. coli, entrophathognes)
Groupage sanguin ABO - preuve de Beth-
Vincent. Recherche des Ag ports par les
hmaties.
 IMMUNOAGGLUTINATION
Agglutination indirecte
Ac pas agglutinant (certaines IgG ). On utilise alors un 2me ractif
= anticorps antiglobulines qui provoque l'agglutination.

Phnotypage Rhesus
Recherche d'Ac non agglutinants (Ac anti Rh) = test de Coombs
indirect.
Raction en 2 temps :
- Ractif = GR Rh+, en prsence de srum (si Ac anti Rh : fixation)
- ajout d'une antiglobuline (anti IgG humaine) : si srum + :
agglutination.
 IMMUNOAGGLUTINATION
Agglutination passive : lAg est soluble, on le fixe artificiellement sur
une particule.
Raction en 2 temps :
- Ag soluble fix sur billes de latex ( = "sensibilisation des billes de latex")
- Ag particulaire + srum anti Ag : agglutinantion

Recherche du facteur rhumatoide (reaction de Waaler Rose ; IgG lapin anti-GR

de mouton + GR mouton

Test de grossesse, detection de lhormone gonadotrophine chorionique (HGC)

dans lurine ; GR recouverte dhormone mise en
contact des Ac anti-HGC et lurine de la femme suspecte dtre
enceinte. Les [GR-HGC] et [Ac anti-HGC] sont optimums pour lagglutination.
 NEUTRALISATION
Ag: enzyme ou hmagglutinine virale
Ac neutralisant, plus IgA

Mthode ASLO
Srologie virale (grippe, rubole)
 IMMUNODOSAGE AVEC
MARQUEUR
Raction Ag-Ac revele avec Ag ou Ac marqu
par un traceur.
Diffrenciation entre traceur libre/traceur li
Nombreuses techniques:
- Nature du traceur: isotopique, enzymatique,
luminescent, fluorescent
- Procd: comptitif, indirect ou sandwich
 IMMUNOENZYMOLOGIE
Les techniques immuno-enzymatiques reposent sur
lutilisation dune enzyme pour dceler les complexes
immuns.

Les techniques EIA et ELISA :

recherche fondamentale et applique (reconnaissance
des pitopes protiques, des haptnes)
analyse mdicale, pour le dosage de nombreuses
substances (Ag, Ac, hormones, marqueurs tumoraux,
mdicaments)

Systmes biologiques
Ag : liquide biologique, une prparation brute ou purifie
de lAg ou de lhaptne.
Ac : immunosrum total, des Ig purifies ou des Acm
(vite les ractions croises).
 ELISA
Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay
Le complexe Ag-Ac est revel par un ractif sur
lequel une enzyme est fixe.

Marqueurs: Phosphatase alcaline proxydase Ac

ou Ag marqu par une enzyme

Rvlation: substrat chromogne,

spactrophotomtre

Mthodologie: comptitif, indirect, sandwich

Techniques drives: Western blot - Elispot

 ELISA
Dosage des antignes
Par comptition : Vis vis dAc prsents en
quantit limite, et fixs sur un support, il y a
comptition entre lAg doser et lAg marqu (de
mme spcificit) ajout en quantit dfinie dans le
mme temps.
Mthode en sandwich : Sapplique aux Ag
possdant au moins 2 pitopes (identiques ou non)
Dosage des anticorps
ELISA
directe avec Ag marqu:
Indirecte avec Ac secondaire marqu

 ELISA
Applications
Dosage des protines : la 2m, drogues, hormones
(insuline, glucacon), mdicaments, enzymes
(nolase, lipase), les facteurs rhumatodes,
vitamines, IgE
Diagnostic srologique : parasitaire, bactriologique
par titrage dAc (Brucella, Salmonelle, Treponema),
virologique (HIV, rubole, hpatite A-B, varicelle,
herps, grippe)
Maladies auto-immunes : recherche et dosage des
FR, des Ac anti-ADN, anti-histones, anti-Dsg1/3
 WESTERN BLOT
Immunotransfert ou immuno-
empreinte
Cette technique combine le pouvoir de
sparation de llectrophorse et la
grande sensibilit de
limmunodtection, ce qui en fait un
outil performant pour lidentification
dun Ag ou dun Ac.
 WESTERN BLOT
Sparation des Ag par SDS-PAGE
Les protines dun extrait tissulaire ou cellulaire ou
des protines recombinantes dnatures et
charges ngativement, migrent dans un gel
dacrylamide sous laction dun champ lectrique.
Elles sont spares en fonction de leur PM.
Le transfert des protines sur membrane
Les protines contenues dans le gel sont transfres
sur une membrane (de nitrocellulose) sous laction
dun champ lectrique.
WESTERN BLOT
La rvlation
immunologique
Les protines transfres,
incubes avec des Ac. Les
protines ayant form des
complexes Ag /Ac ragissent
ensuite avec des Ac (de
chvre) dirigs contre les
IgG de lespce dorigine du
srum test.
 WESTERN BLOT
Ces Ac 2aires sont coupls la peroxydase (ou la
phosphatase alcaline). La peroxydase oxyde le
luminol qui va mettre de la lumire permettant
la rvlation autoradiographique des complexes.

Test de confirmation du VIH

 ELISPOT
Dnombrement de cellules partir de leur
scrtion.
Son principe consiste capturer la scrtion
de molcules par des cellules
(immunoglobulines, anticorps, antignes ou
cytokines) sur un support solide sensibilis.
Aprs limination des cellules,
limmuncomplexe est rvl par une mthode
Elisa utilisant un substrat chromogne
insoluble dont la prcipitation localise gnre
des taches colores ou immunospots.
 ELISPOT

Principe de
l'Elispot appliqu
la dtection de
cellules scrtrices
de virions et
d'antignes VIH.
 IMMUNORADIOLOGIE
La radio-immunologie fait appel la physique nuclaire
radioactivit et l'immunologie, pour le
dveloppement de la mthode de dosage radio-
immunologique.
Technique trs sensible, repose sur lutilisation:
Raction Ag-Ac et mthodes radioactives, combinaison
responsable de la spcificit et de la sensibilit du
DRI .
2 groupes selon les proportions relatives dAc et dAg:
- Le dosage R.I. classique : RIA ou dosage par
comptition, en dfaut dAC
- Le dosage immuno-radiometrique : IRMA, en
excs dAC
 RIA
Radio-Immuno
Assay
- Indirect
- Sandwich
- Comptitif
La phase
htrogne: il
faut isoler les
Ag-Ac forms
des Ac ou Ag
rests en
solution.
 RIA
Les mthodes pour sparer le constituant
libre et le constituant li dans le
complexe Ag-Ac sont nombreuses et font
appel diffrentes techniques de
prcipitation:
* soit immunologique (mthode du
double Ac) : le complexe Ag-Ac est
prcipit par un srum anti-
gammaglobuline;
* soit physico-chimique : par les solvants
organiques (alcools...), le sulfate
d'ammonium demi-saturation (Test de
 RIA
Test de Farr utilise de lADN double brin marqu par un radio-
isotope (125I).
Elle se droule en 4 tapes:
- Incubation du srum du patient(Ac anti ADN) avec lADN double
brin marqu
- Sparation des complexes immuns par prcipitation et
centrifugation
- Elimination de lADN double brin marqu non li l Ac
- Mesure de la radioactivit (proportionnalit entre la radioactivit
mesure et la quantit danticorps prsents dans le srum)
 IRMA
Immuno-RadioMetric Assay
Depuis lavnement des Ac monoclonaux, lIRMA a
remplac la mthode par comptition.
Elle se distingue par: - prsence dun excs dAc
- utilisation dun 2eme Ac marqu- 2 Ac dirigs
contre 2 pitopes suffisamment loigns sur la
molcule dAg
La molcule tester est prise en sandwich entre
les deux Ac
La radioactivit lie est proportionnelle la
quantit dAg
IRMA
 IMMUNOFLUORESCENCE
Limmunofluorescence classique permet de
dceler une raction Ag/Ac sur des cellules
en suspension, des frottis cellulaires, des
microorganismes ou des coupes dorgane.
- Directe
- Indirecte
- Sandwich
Fluoresceine, rhodamine, phycorytrine
Phase htrogne
 IMMUNOFLUORESCENCE
Analyse de la fluorescence utilise un microscope
optique quip d'un systme UV
 IMMUNO
FLUORESC
ENCE

Cytomtrie en
flux
FACS
(Fluorescenc
e Activated
Cell Sorter)