Manual de Tcnicas Analticas en el Laboratorio de Toxicologa

Manchas de Semen
Autor:
Dr. Rodolfo Nieto, Perito del Laboratorio de Toxicologa y Qumica Legal de la Asesora Pericial dependiente
del Poder Judicial de la Provincia de Buenos Aires.
Introduccin
En los casos de violacin es comn contar con muestras de semen secas asentadas sobre diversos
soportes, o bien hisopados obtenidos de la vctima. A su vez, este tipo de delitos sexuales,
constituyen un grupo de hechos sumamente difciles de comprobar, de all, que el procesamiento de
los materiales citados adquiera gran importancia ya que con las tcnicas actuales podra demostrarse
de manera fehaciente la intervencin de un determinado individuo.
Se define el esperma como un lquido compuesto por dos fracciones, el lquido seminal y los
espermatozoides, revistiendo ambos gran importancia desde el punto de vista pericial.
En el primero encontramos bases orgnicas tales como la colina, la espermina y la espermidina,
sustancia este ltima a la cual debe su olor el esperma. Tambin posee en su composicin protenas
entre las cuales se pueden mencionar, por su importancia, la fosfatasa cida prosttica, el antgeno
prosttico especfico (PSA), la fosfoglucomutasa (PGM), peptidasa A (Pep A) y la Glioxilasa I (Glo I).
Debe mencionarse tambin la presencia de sustancias similares a los antgenos del sistema ABO, los
cuales estarn presentes en aquellos individuos secretores y que permitirn la determinacin del
mismo en este fluido. En tal sentido, se conoce que entre el 75 y el 80% de la poblacin tiene esta
caracterstica y, por lo tanto, todos sus fluidos corporales contienen este tipo de sustancias.
1. Estudio de las manchas de semen
Un modo prctico para el estudio de las manchas de semen es el que se detalla en el siguiente
cuadro:
Visual

Localizacin Tctil

U.V.

de hisopo o cm 2 de mancha Mancha o hisopo

+ 250 l de Solucin Fisiolgica

visualizacin de espermetazoides
centrifugar a bajas revoluciones (2.000 rpm)

ABO
Sobrenadante Pellet

Fosfatasa cida prosttica (FAP) Observacin microscpica PGM Pep A

PSA

2. Localizacin de la mancha
Las manchas de semen pueden presentarse sobre diversos soportes pero, los ms comunes son
la ropa interior de la vctima y las prendas de cama. Un dato a tener en cuenta sern las
caractersticas del material a examinar, entre las cuales se destaca la capacidad de absorcin del
mismo, su color, etc.
De todos modos, en general, puede decirse que las manchas de semen presentan un color blanco
grisceo que va tornando hacia el amarillento con el paso del tiempo, adquiriendo, en especial
sobre las telas, una consistencia apergaminada, caracterstica que resulta de utilidad para su
ubicacin por medio del tacto. El empleo de luz U.V. constitua un mtodo prctico para localizar
este tipo de manchas, pero los daos que sta puede causar al material gentico ha hecho que
caiga en desuso. La misma se basaba en la propiedad fluorescente de las manchas de esta clase.
3. Observacin de Espermatozoides
La visualizacin de espermatozoides completos constituye, por s sola, la nica prueba irrefutable
de la presencia de semen en una mancha.
De all que, previo a detallar las tcnicas a emplear para tal fin, es importante repasar
someramente su estructura. Los espermatozoides son clulas mviles compuestos bsicamente
por cabeza (en la cual se encuentra el ncleo), cuello, cuerpo y cola. Su longitud oscila entre 40 y

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50 m, mientras que con respecto a su forma la cabeza, vista de frente, es oval, mientras que de
perfil es aguzada (Fig. 11.1).

Fig. 11.1: espermatozoide

Para su estudio, tal como puede verse en el esquema precedente, hay dos posibilidades. Una de
ellas es trabajar directamente sobre el material motivo de pericia y la otra sobre el pellet obtenido
en la centrifugacin de un macerado en solucin fisiolgica de la mancha a estudiar. Cualesquiera
sea la metodologa empleada, un hecho para tener en cuenta es que los espermatozoides son
elementos sumamente lbiles, de modo tal que la cabeza y la cola se separan muy fcilmente. De
all que mltiples factores que hacen a la conservacin de la muestra dificultan, cuando no
imposibilitan, la observacin de estos elementos en forma completa. Paralelamente, esto implica
un sumo cuidado en el procesamiento del material a estudiar.
Por otra parte debe tenerse en cuenta que ciertas enfermedades afectan, de forma diversa, la
cantidad de espermatozoides que produce un individuo. As, en la oligozoospermia, su
concentracin est disminuda, mientras que en la azoospermia no se encuentran presentes en el
semen.
Visualizacin directa: para tal fin, un trocito de la mancha en estudio se coloca en el
centro de un portaobjetos, adicionando sobre el mismo una gota de solucin
fisiolgica y otra de una solucin al 0,5% de eritrosina en NH3 al 5% y se comprime
el material con ayuda de dos agujas de diseccin, con el objeto que los componentes
de la mancha pasen a la solucin. Luego se retira la muestra, se coloca un
cubreojetos y se observa al microscopio con ocular de 40X. Los espermatozoides se
vern con la cabeza teida de color rosa.

Visualizacin previa centrifugacin: en este caso, y tal como se indica en el esquema,

se emplea el sedimento de la centrifugacin de un macerado de la mancha en
solucin fisiolgica.
Para tal fin, de un hisopo o un cuadrado de 0,5 cm de lado de tela manchada se coloca en un
tubo de centrfuga al cual se adicionan 250 l de solucin fisiolgica. Luego, con sumo cuidado, se
presiona el material contra las paredes del tubo con ayuda de una varilla de vidrio a fin que el
material presente en el mismo pase a la solucin.
Posteriormente, de retira el material presionando de modo tal que escurra el lquido casi en su
totalidad. Luego se centrifuga a baja velocidad (1.500 a 2.000 rpm) durante 3 a 5 minutos. El
sobrenadante se transfiere con sumo cuidado a otro tubo y sobre el sedimento se procede a
investigar la presencia de espermatozoides, previa resuspensin del mismo agitando suavemente,
empleando la coloracin descripta precedentemente.
En ese sentido, diversas son las tcnicas que pueden utilizarse, siendo una de ellas la
desarrollada por I.C. Stone.
Para ello se prepara las siguientes soluciones:
a) Solucin Kernechtrot; disolver 5g de Al2(SO4)3 (grado analtico) en 100 ml de agua
destilada hirviendo. Inmediatamente adicionar 0,1g de Nuclear Fast Red y agitar con ayuda
de una varilla de vidrio. Enfriar y filtrar a travs de papel de filtro. Esta solucin es estable
de 3 a 6 meses a 8C.
b) Solucin picroindigocarmn (PICS); adicionar 4g de cido pcrico (grado analtico) a 300 ml
de agua destilada, en un vaso de precipitado. Tapar el recipiente y dejar durante toda la
noche a temperatura ambiente a fin de obtener una solucin saturada. Luego disolver 1g
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de ndigo-carmn, filtrar y guardar. Unos pocos cristales de cido pcrico pueden

permanecer en la solucin.
Procedimiento: una gota del pellet se coloca en un portaobjetos y se adiciona sobre sta una
gota de solucin a), dejando 15 minutos debajo de un vaso de precipitado adecuado (600 ml)
invertido. A continuacin, con una pipeta limpia adicionar en un lateral del portaobjetos 1 2 gotas
de agua deionizada de modo tal que no toque la mezcla. Inclinar con cuidado el portaobjetos y
quitar el excedente con papel de filtro. No tocar el rea original de la gota muestra con el papel.
Repetir esta operacin hasta que el agua de lavado resulte incolora.
Luego, agregar una gota de la solucin b) sobre el sector donde se haba colocado la muestra y
emplear la misma tcnica de lavado descripta anteriormente, pero empleando etanol absoluto. Al
observar al microscopio, los espermatozoides se visualizarn teidos de la siguiente manera: la
cabeza de color rojo, la parte central roja y verde y la cola de color verde. De existir clulas de la
mucosa se observarn teidas de color azul con su centro rojo.
En muestras mal conservadas los espermatozoides pueden aparecer plidos o descoloridos e,
inclusive, de una tonalidad verdosa o violeta. Debe tenerse presente que ste fenmeno tambin
puede ocurrir en casos de sobrecoloracin con la solucin b).
Si los espermatozoides no se observan completos, el autor refiere que pueden reconocerse las
colas, aunque debe recordarse aqu la importancia, por el grado de certeza, de observar estos
elementos completos. Una variante ms sencilla de realizar esta tcnica es la siguiente: una gota
del sedimento se fija a un portabjetos mediante la accin del calor (30 minutos a 60C).
Luego, cubrir el preparado con una gota de Nuclear Fast Red y dejar al menos 10 minutos. Lavar
con agua destilada. A continuacin, adicionar una gota de picroindigocarmn y rotar el preparado
durante 15 30 segundos (pero no ms). Lavar con etanol, secar y observar a 400X, usando
aceite de inmersin de ser necesario.
Otras metodologas a emplear seran Papanicolau, May Grnwald Giemsa, azul de Loeffler, etc.
Cualesquiera fuera la metodologa empleada, se coloca una gota del sedimento en un
portaobjetos, se hace un extendido y se lo deja secar al aire, pudiendo recurrir eventualmente y
con precaucin, a una fijacin con ayuda de calor muy suave.
4. Fosfatasa cida prosttica
Como hemos dicho anteriormente, los espermatozoides son elementos sumamente lbiles, motivo
por el cual en los Laboratorios Forenses resulta muy frecuente no poder observarlos completos. A
este hecho debe sumarse que, tal como se mencion anteriormente, diferentes patologas pueden
disminuir su nmero e incluso estar ausentes en el fluido seminal.
Es en estos casos cuando evidenciar la presencia de semen se torna ms dificultosa aunque,
diversos marcadores, permiten arribar con un grado de certeza muy importante a tal objetivo.
Para tal fin se debe demostrar en la mancha la existencia de componentes habituales del plasma
seminal, tales como colina, espermina, fosfatasa cida prosttica (FAP) y el antgeno prosttico
especfico (PSA), siendo los dos ltimos los ms empleados hoy en da.
Para ello, se puede trabajar con el sobrenadante de la centrifugacin o bien con el lquido
obtenido luego de adicionar al material en estudio solucin fisiolgica. La primera alternativa
posee como ventaja la limpieza de la solucin a emplear.
La FAP es una enzima presente en el semen en concentraciones tan elevadas como en ningn
otro fluido biolgico. Si bien es cierto que la misma no se encuentra exclusivamente en dicho
fluido, la caracterstica enunciada sumado a que es inhibida por el cido L (+) tartrico, han
permitido el desarrollo de tcnicas destinadas a su investigacin.
Una de ellas es la de Sivaram la cual por su practicidad, rapidez, sencillez y la posibilidad de
realizar varios ensayos simultneamente, resulta de suma utilidad para el estudio de esta enzima.
Los reactivos a emplear son los siguientes:
Buffer citrato-ctrico pH 4,9: disolver 1,89 g de cido ctrico monohidrato en 50 ml de H2O
destilada. Adicionar a la solucin resultante 18ml de NaOH 1 N y 10 ml de HCl 0.1 N, ajustando el
pH a 4,9. Completar a 100 ml y conservar en heladera.
Tartrato de Sodio 0,4 M: disolver 0.6g de cido L (+) tartrico en 5 ml de agua destilada y
luego adicionar 3.5 ml de NaOH 2 N. Ajustar el pH a 4.9 y completar el volumen a 10 ml con agua
destilada. Conservar en heladera.
Los reactivos siguientes se deben preparar en el momento de usar:
Reactivo I: alfa-naftil fosfato disdico (5 mg) se disuelven en 5 ml de buffer citrato y a
continuacin se le adicionan 5 mg de Fast Blue B. Disolver.
Reactivo II: 5 mg de alfa-naftil fosfato disdico se disuelven en 4,5 ml de buffer citrato y
0,5 ml de tartrato 0,4 M, adicionando, a continuacin, 5mg de Fast Blue B.
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Observar que la diferencia entre los dos ltimos reactivos consiste en la presencia del inhibidor en
el segundo de ellos.
Tambin se cuenta con reactivos comerciales.
4.1 Ensayo de orientacin
El mismo tiene como utilidad descartar, o no, la presencia de la enzima en el material en estudio.
Para su realizacin, la mancha se comprime con un papel de filtro hmedo y se adiciona sobre el
mismo gotas del reactivo I que de ser positivo, se observa en forma prcticamente inmediata, la
aparicin de un color prpura.
Es aconsejable la realizacin de un ensayo en blanco empleando para tal fin un sector no
manchado del material en estudio. El mismo tiene por objeto descartar la presencia de
interferencias.
4.2 Ensayo de confirmacin
En caso de obtener resultado positivo en el ensayo precedente, se procede a efectuar la prueba
definitiva, la cual se realiza de la siguiente manera: en el primer pocillo de una policubeta de Kline
se coloca una gota de solucin obtenida de modo similar a aquella del material en estudio, pero
empleando una zona del mismo no maculada (blanco).
En los dos pocillos contiguos adicionar una gota del macerado o sobrenadante en estudio (ver fig.
11.2)

Fig.11.2 1 gota blanco 1 gota muestra problema

Posteriormente, se adiciona a los dos primeros pocillos una gota del Reactivo I y, al tercero, una
gota del Reactivo II. Al cabo de un minuto, aproximadamente, deber observarse la aparicin de
un color prpura en el segundo pocillo, permaneciendo inalterables los otros dos en caso de una
reaccin positiva, mientras que de ser negativa no se observar la aparicin de dicha tonalidad.
Eventualmente, puede apreciarse una cierta tonalidad en el tercer pocillo, pero su intensidad
deber ser considerablemente menor que aquella del primero. Este hecho se debe a que la
concentracin de la enzima presente es muy elevada y por lo tanto, rebasa la capacidad inhibitoria
de cido L (+) tartrico. De todos modos, el primer pocillo deber permanecer siempre inalterable,
ya que la aparicin de color indicar la presencia de algn tipo de interferencia originado en el
soporte de la mancha.
5. Antgeno Prosttico Especfico (PSA)
Este marcador consiste en una glicoprotena intracelular (PM 34.000 dalton), sintetizada
exclusivamente por la glndula prosttica, siendo, por lo tanto un componente normal del plasma
seminal.
Para su estudio pueden emplearse diferentes metodologas, entre las cuales el kit comercial
PSA-check 1 provisto por la firma Veda-lab ofrece muy buenos resultados, siendo adems un
mtodo prctico y rpido.
Se trata de un ensayo inmunocromatogrfico, el cual emplea una nica combinacin de conjugado
colorante-anticuerpo monoclonal y anticuerpo policlonal en fase slida, permitiendo as identificar
el antgeno con un aceptable grado de sensibilidad (lmite de deteccin 4 mg/ml).
De este modo, el antgeno se combina con el anticuerpo monoclonal, fluye por la placa por
capilaridad y se combina con los anticuerpos anti-PSA fijos, originando un complejo coloreado
visualizado en forma de banda, que indicar una reaccin positiva.
Tcnica: 5 gotas (aproximadamente 250l) del macerado de la mancha o del sobrenadante
se dejan caer en el sector de la placa destinado a tal efecto, se deja unos 10 minutos y luego se

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lee el resultado. La aparicin de dos bandas de color indicarn una reaccin positiva mientras que
la aparicin de una sola banda indicar un resultado negativo (fig.11.3).

Sector agregado macerado banda control banda que indica presencia de PSA

Fig. 11.3: determinacin por inmunocromatografa de PSA (Veda-lab)

La banda control debe observarse en todos los casos, ya que de no ser as, indica la existencia de
algn inconveniente, siendo aconsejable repetir la prueba empleando otra placa.
Electroforesis empleando anti-P30:
La protena P30 es una glicoprotena caracterstica del semen y cuyas caractersticas coinciden,
exactamente, con aquellas del antgeno prosttico especfico, no obstante lo cual ser designada
con el nombre de la tcnica original.
El antisuero empleado, anti-P30 provisto por los Laboratorios SERI, es especfico de P30 y no
muestra reaccin cruzada con ningn otro fluido corporal. Este reacciona con mxima sensibilidad
(semen diluido 1:3.000) usando la tcnica de cross-over y de all que sea la misma la aconsejada.
Un hecho a tener en cuenta, es que la protena a investigar est formada por cuatro fracciones y
se requiere, por lo tanto, una correcta combinacin de los valores de endosmosis y pH para que
las mismas permanezcan unidas.
Reactivos:
Buffer de corrida: disolver 25,2 g de Tris base ms 2,5 g de EDTA (libre de cido) y 1,9 g
cido brico en 1 litro de agua destilada. Ajustar a pH 9,1 con solucin de NaOH al 20%.
Buffer Gel: Idem buffer de corrida.
Gel de Agarosa 1%: disolver 0,08g de Agarosa en 8ml de Buffer Gel
Coomassie Blue 0,2% disolver el colorante en una mezcla de solventes formada por: 50 ml
de metanol, 50 ml de agua y 10 ml de cido actico.
Procedimiento:
Emplear placas de 3 x 2 pulgadas (1 pulgada = 2,54 cm). Con un sacabocados realizar hoyuelos
en la placa tanto del lado andico como catdico y sembrar el antisuero y las muestras y testigos
del segundo.
Varios autores aconsejan el empleo de testigos de semen y flujo vaginal, pudiendo mencionarse
que los Laboratorios SERI proveen estndares de semen (SERI lyophilized semen std R563).
La corrida electrofortica se realiza a temperatura ambiente y bajo las siguientes condiciones:
voltaje 120 V durante 20 minutos. Luego, leer con luz reflejada sobre un fondo oscuro. La lectura
puede completarse de la siguiente manera: lavar la placa en una solucin salina 1 Molar durante
toda la noche. A continuacin cubrir con papel de filtro Wahtman N1 y secar a 60C.
Luego emplear una solucin colorante de Coomassie Blue al 0,2% sumergiendo la placa durante
15 minutos. Lavar con solucin salina 1M hasta que el fondo sea claro.
6. Determinacin de Grupo ABO en manchas de semen
Una vez establecida la presencia de semen, el paso siguiente es la determinacin del grupo
sanguneo ABO y luego de las isoenzimas PGA y Pep A. Si bien es cierto que las modernas
metodologas para estudio del ADN han superado ampliamente (por su poder de discriminacin) a
las tcnicas mencionadas, el autor considera que, al menos en lo que respecta al estudio del
grupo, sigue constituyendo por su simplicidad y costos, una interesante alternativa que permite
descartar a un sospechoso.
En ese sentido, un hecho de fundamental importancia ser la cantidad de muestra disponible de la
que depender, por razones obvias, cuales sern las pruebas a efectuar.
En cuanto a la presencia de los antgenos ABO en plasma seminal, fue establecida por Yamasani
y Shirai (1926), siendo el ttulo de los mismos igual o mayor que aquel observado en saliva.
La tipificacin de individuos secretores mediante la tcnica de absorcin inhibicin (ver captulo
Manchas de sangre) no resulta dificultosa y ofrece buenos resultados, mientras que aquella de
absorcin elucin puede arrojar falsos negativos para la presencia de un antgeno. Esta
situacin se debe a que las sustancias secretadas son solubles y, por lo tanto, podran ser
eliminadas en los pasos de lavado. Por tal motivo, la ltima de las tcnicas no es aconsejable para
procesar este tipo de muestras.

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Un hecho a tener muy en cuenta en la interpretacin de los resultados obtenidos, deriva de la

siempre posible contaminacin del semen presente con flujo vaginal (lo cual ocurre
invariablemente en hisopados vaginales) y/o sangre de la vctima.
En ese caso, algunos autores desaconsejan la determinacin del grupo y, de efectuarlo, tener muy
presente que, en el resultado obtenido, bien pudo haber influido la presencia de dichos fluidos.
Resultando de suma utilidad el conocimiento del grupo sanguneo de la vctima y, de ser posible,
el del sospechoso, al igual que el carcter secretor o no de los mismos.
7. Otras determinaciones
Dos sustancias cuya determinacin suele investigarse en el anlisis de manchas de semen, ya
sea por que son solicitadas por la instruccin o bien por la influencia que en los resultados de las
pericias podran tener, son la saliva y la materia fecal.
7.1 Investigacin de saliva
Si bien la misma no posee un marcador caracterstico, una elevada concentracin de la enzima
amilasa sugerira la presencia de este fluido.
Reactivos:
Buffer pH 6.9: disolver 2,7 g de NaPO4H2 ms 3,9 g de Na2PO4H y 0,2 g de NaCl (7 mM)
en 500 ml de H2O deionizada
Gel: disolver 0,1g de agarosa y 0,02g de Almidn soluble en 10 ml de Buffer pH 6.9
Procedimiento:
Volcar la solucin del gel en una cpsula de Petri plstica de 15 x 100 mm y dejar en reposo hasta
que se forme el gel. Luego practicar en el mismo, con ayuda de una Pipeta Pasteur o similar,
hoyuelos separados por una distancia de, al menos, 1,5 cm y luego sembrar las muestras y
controles con cuidado de no rebalsar los orificios. Los ltimos pueden ser, por ejemplo, saliva sin
diluir y en diluciones 1:500 y 1:1.000, los cuales, adems, servirn para tener una idea
aproximada de la concentracin de saliva en la muestra en estudio, a partir de la medida de los
dimetros obtenidos.
Tapar la cpsula e incubar a 37C toda la noche. Luego adicionar a la placa una dilucin 1:100 de
una solucin de yodo saturada. La presencia de crculos claros en torno a un hoyuelo indica
reaccin positiva para la presencia de la enzima en la muestra en cuestin.
7.2 Investigacin de materia fecal
Para tal fin, se analiza la presencia de urobilingeno. Este test se basa en la formacin de un
complejo verde fluorescente zinc urobilina. El urobilingeno es oxidado a urobilina la cual es
soluble en alcohol, y as, en presencia de una sal neutra de zinc en solucin alcohlica se forma el
mencionado complejo.
Procedimiento: preparar un extracto acuoso de la mancha en un tubo pequeo. Colocar la misma
cantidad de agua en un segundo tubo como control. Adicionar a cada tubo 3 gotas de una
solucin saturada de cloruro mercrico en etanol.
Adicionar un volumen igual de una solucin saturada de cloruro de zinc en etanol y agitar. Luego
observar bajo luz U.V. Una fluorescencia estable de color verde indica la presencia de
urobilingeno.

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Bibliografa

Manchas de esperma.Ctedra de Toxicologa y Qumica Legal. Garca Fernndez, J.C.

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