DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA

FOSFATASA CIDA DE GERMEN DE TRIGO Y

PROPIEDADES CINTICAS DE LA FOSFATASA CIDA DEL
GERMEN DE TRIGO

Profesores: Hegaly Mendoza Vilches.

Nicols Pacheco Camus.
Autores: Diego Bienzobs D.
ngelo Gonzlez C.
Fecha de Entrega: 29/09/17
INTRODUCCIN
Una enzima es una protena que cataliza una reaccin qumica especfica, disminuyendo la
energa de activacin de las reacciones metablicas, por lo que aumentan la velocidad y
permiten que se produzcan a temperaturas, presiones y condiciones en las que normalmente
estas reacciones no se produciran.
Al realizar un ensayo enzimtico se debe elegir el mejor mtodo, el ms adecuado para lo
que se quiere obtener.
Ensayo de tiempo fijo: Se detiene la reaccin en un tiempo determinado y se calcula
la concentracin de sustrato consumido o de producto originado.
Ensayo Cintico: Se toma una serie de tiempos continuos muy prximos entre si y se
miden las concentraciones de sustrato o producto.
En el siguiente prctico se realiz una curva de calibracin para la formacin de p-nitrofenol
y se determinar la actividad de la fosfatasa cida de germen de trigo mediante el sustrato
artificial p-nitrofenil fosfato. Se cuantifica este sustrato liberado fotomtricamente segn el
grado de hidrlisis. Se trabajar en una solucin bsica donde la longitud de onda de
absorcin corresponde a 405 nm.

Curva de calibracin: Se basa en la existencia de una relacin en principio lineal

entre un carcter medible (por ejemplo, la absorbancia en los enfoques
de espectrofotometra) y la variable a determinar (concentracin).
Rango lineal: El rango lineal de un detector cromatogrfico es el intervalo de
concentracin o flujo msico de una sustancia en la fase mvil, dentro del cual la
sensibilidad del detector es constante, con una variacin determinada,
Cintica de Michaelis-Menten: Describe la velocidad de reaccin de una enzima
Doble Reciproco: Consiste en el inverso de los valores de la curva de Michaelis-
Menten para as poder graficar linealmente.
MATERIALES
Amortiguador citrato de sodio 0,1 M; EDTA 0,15 M pH 5.0.
Sustrato de p-nitrofenil fosfato de sodio (NPP) 2,5 mM.
Solucin de p-nitrofenil 60 M en NaOH 0.02 M.
Solucin de 0,02 M NaOH.
Solucin stock de enzima 5 mg/ml en BSA 0.1 diluida 1:20.
Bao termoregulado a 37 C.
Vaso precipitado de 50 ml.
Tubos de ensayo.
Micropipetas de 100-1000 l; 10-100 l.

METODOS

A. DETERMINACIN DE ACTIVIDAD ENZIMTICA DE LA FOSFATASA CIDA

DE GERMEN DE TRIGO.
EXPERIENCIA A:
1. Prepare 6 tubos que contengan 0; 1.00; 2.00; 3.00; 4.00; 5.00 mL de una solucin de
pnitrofenol 60 M y enrase cada uno de los tubos con NaOH 0.02 M a 6.00 mL, de
volumen final.
2. Transfiera a la cubeta y lea absorbancia a 405 nm.
3. Como tubo blanco utilice el tubo que no contiene p nitrofenol y calibre el equipo.
4. Grafique A405 versus los moles de pnitrofenol en cada uno de los tubos.

EXPERIENCIA B:
1. Prepare un tubo que contenga 2.0 mL de amortiguador citrato de sodio 0.1 M; EDTA
0.15 M, pH 5.0 y 2.0 mL de sustrato NPP 2.5 mM.
2. A continuacin, preincube el tubo en un bao termoregulado a 37C por un par de
minutos y luego agregue 1.0 mL de la dilucin de la enzima (1:20).
3. Mezcle e inmediatamente saque una alcuota de 0.5 mL adicinelo a un tubo que
contenga 5.5 mL de una solucin de NaOH 0.1 M. (tiempo cero)
4. En paralelo prepare otros tubos que contengan la misma mezcla de reaccin que el
tiempo cero, agregue 1.0 mL de 27 enzima e incube respectivamente 15 y 30 min.
5. luego saque una alcuota de 0.5 mL de cada uno de los tubos y adicinela a los tubos
que contengan 5.5 mL de NaOH 0.1 M.
6. Finalmente determine la absorbancia (405nm) de cada uno de los tubos utilizando
como blanco el tiempo cero.
B. PROPIEDADES CINTICAS DE LA FOSFATASA CIDA DEL GERMEN DE
TRIGO
EXPERIENCIA C:
1. Prepare una serie de tubos que contengan: 0.0 mL, 0.05 mL, 0.1 mL, 0.2 mL, 0.5 mL,
1.0 mL de sustrato NPP 2.5mM.
2. Agregue 2.0 mL del amortiguador citrato de sodio 0.1 M pH 5.0 a cada tubo y enrase
con agua destilada a 4.5 mL final.
3. Preincube los tubos a 37 C por 2 minutos y adicione 0.5 mL de la solucin de enzima.
4. Mezcle bien e incube 15 minutos a 37 C en un bao termoregulado.
5. Luego detenga la reaccin en cada tubo, sacando una alcuota de 0,5 mL y adicinela
a otro tubo que contenga 5,5 mL de NaOH 0.1 M.
6. Luego detenga la reaccin en cada tubo, sacando una alcuota de 0,5 mL y adicinela
a otro tubo que contenga 5,5 mL de NaOH 0.1 M.