Utilizacin de la metodologia CRIPR-Cas9 para la reasignacin de iniciacin del

plasmido GATA1 en clulas k562.

Estas clulas fueron las primeras en clulas humanas que se estudiaron de la

leucemia, son de tipo eritrileucemia, y por lo tanto son clulas de carcter
cancergeno.

El problema con las clulas K562, y muchos otros tipos de clulas cancerosas, es
que hay una sobre abundancia de aurora quinasas. Estas quinasas juegan un papel
en la formacin de husos, separacin de los cromosomas, as como la citocinesis.
Estas funciones son necesarias en las clulas con el fin de dividir y regenerar los
tejidos, y desempean un papel de mantenimiento en funciones homeostticas,
pero la sobreabundancia de aurora quinasas permita la divisin celular
incontrolada, lo que resulta en cncer. La inhibicin de estos es un mecanismo de
regulacin importante de cncer, ya que evita que las clulas se muevan a la
mitosis.

La protena GATA1 es un importante factor

de transcripcin implicado en el
crecimiento celular y cncer. Esta protena
pertenece a la familia de factores de
trascripcin GATA y juega un papel
importante en el desarrollo de los eritrocitos
regulando el paso de la hemoglobina fetal
a la hemoglobina adulta. Se han asociado
mutaciones en este gen con anemia
diseritripoyectica asociada al cromosoma X
y con trimbocitopenia.
Ilustracin 1: estructura tridimensional de la protena GATA1

Patologas asociadas

En 2002 Wechsler J. y colaboradores demostraron que ciertas mutaciones del exn

2 del gen GATA1 se encontraban presentes en casi todos los casos de leucemia
megacarioblastica aguda asociada al sndrome de Down. En 2004 Shimada y
colaboradores demostraron que la mutacin est presente en el feto, lo que
sugiere una accin temprana en el proceso de leucemogenesis.

Por lo cual para este proyecto se usara el sistema CRISPR-Cas9 para reconocer la
mutacin del exn 2 GATA1, que es lo que causa la mielodisplaca que al progresar
se convierte en leucemia mieloide.
 Ilustracin 2 mapa de secuenciacin de el gen GATA1 (Obtenida de www.addgene.org)

Hasta la fecha no hay una metodologa por la cual se pueda llegar a un

tratamiento para eliminar esta mutacin.

La localizacin en la secuencia gentica que produce la mutacin GATA1 y se

toma de 20 nucleotidos. Como se muestra mas adelante.

Ilustracin 3: localizacin de sitio activo.

Se tomaran 20 nucletidos ms la secuencia PAM(en rojo):

5GCCGGAATTCGCCACCATGGACGG 3

RNA: CGGCCUUAAGCGGUGGUACCU

El espaciador complementario a la del blanco seria:

5CGGCCTTAAGCGGTGGTACCTGCC 3
El siguiente paso por concretar es la propuesta del trackRNA en el cual se deben
de agregar minimo 65 nucleotidos correspondientes, por lo cual se propone:

5-
GGACCUCGACCUCAGGCUAACGGCUAAGUCUGGUCGUCUCCACAAGCCGUC
ACGGUCGGUCUUGU-3

El resultado rpopuesto es el siguiente gRNA:

5GCCGGAATTCGCCACCATGGACGG linker-
GGACCUCGACCUCAGGCUAACGGCUAAGUCUGGUCGUCUCCACAAGCCGUC
ACGGUCGGUCUUGU-3

El plasmido a utilizar es pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro (ilustracin 4) en la seccin

marcada en azul, esto para corregir o inhabilitar la mutacion y asi que no se
desarrolle la leucemia.

Ilustracin 4: plasmido pSIN4-EF1a-GATA1-IRES-Puro

Referencias:

Lum, S. H.; Choong, S. S. Singapore Med J. 2016, 57 (6), 320324.

Seif AE. Pediatric leukemia predisposition syndromes: clues to understanding
leukemogenesis. Cancer Genet 2011; 204:227-44.
Roy A, Roberts I, Vyas P. Biology and management of transient abnormal
myelopoiesis (TAM) in children with Down syndrome. Semin Fetal Neonatal Med
2012; 17:196-201.