NDICE

I.- INTRODUCCIN

II.- OBJETIVO

III.-CONTENIDO:
Tcnica baica y herramienta utilizada por la gentica molecular humana.
Adn recombinante
Enzima de restriccin
Vectores
Genoteca
Anlisis de acidos nucleicos
Transferencia de southern
Tranferencia de northen
Reaccin en cadena de la polimerasa
Secuencia del adn
Microarrays

IV.-CONCLUSIONES
V.- REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
I.- INTRODUCCION:
La gentica molecular (no confundir con la biologa molecular) es el campo de
la gentica que estudia la estructura y la funcin de los genes a nivel molecular, las cuales
utiliza diversas tcnicas y herramientas del laboratorio que se usan para aislar ADN o
extraerlo en alta pureza, visualizarlo para ver su estado, cortarlo y pegarlo (nacimiento de la
Ingeniera gentica), amplificar una regin en una enorme cantidad de molculas (clonacin
de fragmentos en bacterias u otros vectores como virus y PCR), corte de una determinada
regin con enzimas de restriccin para ver si por una mutacin se gana o se pierde un sitio
de restriccin (anlisis de mutaciones por RFLP o Restriction fragment lengt polymorphism),
que significa: diferencias en los tamaos de los fragmentos de restriccin debido a
polimorfismos en el ADN entre otras.
Todas estas tcnicas tiene diversas aplicaciones generalmente en el diagnstico
de enfermedades hereditarias, bsqueda de alelos ms o menos frecuentes asociados a una
caracterstica que nos interesa seleccionar, diagnstico de contaminacin bacteriana en
alimentos, diagnstico viral o de infeccin viral, seleccin de marcadores moleculares para
asistir en el mejoramiento gentico de una especie, test de paternidad, diagnstico de
identidad forense, etc.
La primera tcnica que todas las dems necesitan es la extraccin del ADN, y para
ello es necesario purificarlo desde cualquier tejido aunque usualmente se hace a partir de
sangre. Se basa en una serie de lavados de la muestra y agregado de proteincinasas que
eliminan las protenas del medio, detergentes para eliminar las membranas plasmticas y
luego ir purificando el ADN de esa mezcla de ARN protenas y restos celulares.
II.- OBJETIVO:

a) Describir la importancia de la Recombinacin gentica

b) Describir y explicar la importancia de las enzimas de restriccin
c) Conocer loS dos mtodos que permiten identificar la secuenciacin de nucletidos
en la cadena de ADN
TCNICA BSICA Y HERRAMIENTA UTILIZADA POR LA GENTICA
MOLECULAR HUMANA

ADN recombinante

El advenimiento de la tcnica del ADN recombinante en los aos setenta marca

el hito inicial de la historia de la biotecnologa y de la comercializacin de la investigacin
acadmica. Una tcnica y una comercializacin que tuvieron su centro de arranque en la
comunidad cientfica del rea de la baha de San Francisco. El patronazgo de la investigacin,
las fuerzas del mercado y los progresos legales desde finales de los aos sesenta hasta
comienzos de los ochenta influyeron en la evolucin de la tcnica y reconfiguraron las
coordenadas morales y cientficas de la investigacin en biomedicina. Qu aconteci en esos
aos?

Cuando se habla del ADN recombinante y de la ingeniera gentica, se alude, por

lo comn, a la tcnica de clonacin de Stanley Cohen. En 1957, Arthur Kornberg acept la
creacin y direccin del departamento de bioqumica de Stanford. Para levantarlo se llev
consigo a Robert Lehman, Paul Berg, Melvin Cohn, A. Dale Kaiser, David Hogness y Robert
Baldwin. El ncleo del grupo de investigacin de Kornberg sobresali en el metabolismo
qumico de los coenzimas y cidos nucleicos. Despuntaron en aspectos moleculares clave del
gen (replicacin del ADN y sntesis de protenas).

Kornberg, que recibi el premio Nobel en 1959 por su investigacin sobre la sntesis
de ADN, haba trabajado con Severo Ochoa en la Universidad de Nueva York y con Carl y
Gerty Cori en la de Washington. Se entreg al estudio de las enzimas, que consideraba la
fuerza motriz de la biologa. Se empe en la bsqueda de una enzima que sintetizara la
cadena polinucleotdica de ADN. En 1957, su artculo sobre la sntesis de ADN a partir de
sus precursores por la ADN polimerasa fue rechazado por The Journal of Biological
Chemistry. En la primavera del ao siguiente, un nuevo editor repar en ese trabajo y lo
public. En la enzimologa de la replicacin del ADN seguira trabajando los siguientes
treinta aos.

En la distribucin del trabajo, Kornberg y Lehman se ocuparon de la sntesis

bioqumica y replicacin del ADN mediante la polimerasa; a Berg, Hogness y Kaiser les
correspondi la regulacin gentica de clulas bacterianas y virus para sondear la funcin
gentica y bioqumica del ADN. Y, no menos importante, el departamento estableci su
propio cdigo moral acadmico, con particular atencin a la produccin, intercambio y
propiedad del conocimiento y materiales de investigacin. Haba trasiego constante de
resultados, de becarios y doctorandos, de mtodos y herramientas (centrfugas o microscopio
electrnico). Quienes trabajaban, por ejemplo, en regulacin gnica bacteriana, el grupo de
Kaiser, reciban enzimas crticas para manipular e investigar la actividad biolgica del ADN,
de los laboratorios de Kornberg y Lehman, y acceder a sus tcnicas enzimticas. Ese sistema
compartido les permita alcanzar economas de escala. Adems, facilitaba el dilogo y el
debate sobre observaciones y datos de inters. El secreto y la apropiacin excluyente se
consideraban inmorales.

A finales de los sesenta, Berg y Hogness exploraron nuevas direcciones en la biologa

de los organismos superiores. Berg adopt el sistema experimental de virus tumorales
animales para explorar la expresin y regulacin gnica en clulas de mamfero; ello propici
el advenimiento de la tcnica del ADN recombinante como herramienta de trabajo para la
cartografa gnica. La posibilidad de crear, mediante ese mtodo, organismos transgnicos
signific el comienzo de un cambio epistemolgico en la investigacin biomdica. En el
otoo de 1970, el laboratorio de Berg se encontraba en la avanzadilla de la tcnica del ADN
recombinante. David Jackson y Robert Symons lograban all, un ao ms tarde, la sntesis in
vitro de molculas de ADN recombinante mediante combinacin de dos genes
forneos,empleo entonces empleo un Fragmento de ADN en eucariotas ( ADN ribosomial -
--------- xenopus laevis)

En ese clima de efervescencia de nuevas ideas se iban acometiendo hibridaciones

experimentales que ahondaban en la transformacin bacteriana y en la clonacin gnica.
Contemporneamente, Stanley Cohen y Herbert Boyer demostraban experimentalmente la
clonacin molecular del ADN recombinante a travs de una serie de experimentos, en alguno
de los cuales intervino John Morrow, del laboratorio de Berg. La relacin de Cohen con los
bioqumicos llegaba hasta el uso compartido de sus instrumentos, una interaccin crtica para
convertir a los plsmidos en herramientas de trabajo.

En su empeo por introducir un plsmido circular en bacterias, Cohen acuda a

menudo a Peter Lobban. En un principio, solo los bioqumicos de Stanford posean los
recursos tcnicos y enzimticos para sintetizar molculas de ADN recombinante. Por eso, la
solicitud de patente sobre el ADN recombinante por Cohen y Boyer, aqu expuesta con
minucioso detalle, desat una controversia dursima sobre la prioridad y propiedad de los
avances cientficos en asuntos biolgicos, controversia que todava persiste. El imperativo
tico sera uno de los sellos distintivos del departamento de bioqumica. En julio de 1974
firmaron, con otros, una carta en la que solicitaban una moratoria en la investigacin sobre
ADN recombinante para conjurar el miedo de la sociedad a la creacin de plagas, la alteracin
de la evolucin humana o la degradacin del entorno.

a) Enzimas de restriccin
Importantes avances sobre enzimas de restriccin para el anlisis de las alteraciones
genticas responsables de la progresin del cncer.

a.1.-Antecedentes
 Los mtodos diagnsticos moleculares estn siendo utilizados cada vez con ms
frecuencia para examinar detenidamente los cambios genticos que acompaan la formacin
tumoral. Estos mtodos pueden ser habitualmente confusos para los profesionales no
especialistas ya que incluyen pasos moleculares complejos. Esto puede reducir la utilidad
que este tipo de datos moleculares debera tener para los mdicos. Los autores intentaron
ayudar en la interpretacin de estudios moleculares en general a partir de la presentacin de
una revisin comprehensiva de un mtodo de diagnstico molecular, es decir, el uso de
enzimas de restriccin para estudios moleculares de desarrollo tumoral.
a.2.-Mtodo:
Se llev a cabo una revisin de estudios moleculares que haban utilizado enzimas
de restriccin para la investigacin de cncer gastrointestinal. Estos estudios haban
utilizado enzimas de restriccin para analizar el punto de induccin de la mutacin, el
estado de metilacin del gen y la deleccin del lugar cromosmico. Adems, se puso
especial nfasis sobre algunas de las consideraciones importantes para el anlisis molecular
de los tumores que pueden afectar los datos moleculares obtenidos.
a.3.-Resultados:
La digestin de la enzima de restriccin ha jugado y continua jugando un papel
fundamental en el anlisis de los cambios genticos del cncer. Muchas adaptaciones de
metodologas de enzima de restriccin bsica han mejorado la aplicacin de esta
perspectiva diagnstica en la gentica del cncer.
a.4.-Conclusin:
La disponibilidad de 200 enzimas de restriccin diferentes, cada una de las cuales
reconoce distintas secuencias del ADN, no ha sido evaluada en los estudios sobre la
gentica del cncer. Se espera que los avances actuales en ingeniera proteica faciliten en el
futuro la creacin de novedosas enzimas de restriccin con especificidades secuenciales
hechas a medida. Esto podra mejorar la aplicabilidad de las enzimas de restriccin en la
gentica del cncer.

b) VECTORES:
El vector es un portador, una molcula de DNA cuya misin es unirse con el fragmento de
DNA que se quiere clonar para facilitar su entrada en la clula anfitriona y su replicacin. En
general, el vector tiene un tamao pequeo, es fcil de aislar y caracterizar, se conocen su
secuencia y su mapa de restriccin, es fcil de introducir en la clula anfitriona y una vez all
posee capacidad de replicacin autnoma, es decir, independiente de la replicacin del
genoma de la clula anfitriona. Es conveniente que el vector posea la mayor variedad posible
de sitios de restriccin, para facilitar su unin con el fragmento de DNA que se quiere clonar,
y que incluya al menos un gen marcador (por ejemplo, un gen de resistencia a un antibitico)
que permita identificar o seleccionar las clulas que llevan el DNA recombinante. Lo comn
es que los vectores naturales no posean todas estas caractersticas, por lo que habitualmente
se emplean vectores modificados (a su vez, obtenidos por tcnicas de DNA recombinante,
pero ya disponibles comercialmente con todas las prestaciones deseadas). Para poder unir
con facilidad el vector con el fragmento de DNA que se quiere clonar (llamado entonces
inserto) se debe cortar el vector con las mismas enzimas de restriccin que se utilizaron para
escindir el DNA de la muestra, o bien con enzimas que proporcionen extremos compatibles;
de ese modo, sus secuencias complementarias pueden asociarse y ser unidos por la ligasa,
dando lugar a una sola molcula de DNA bicatenario, que recibe el nombre de DNA
recombinante (rDNA). En funcin de los objetivos de la clonacin (amplificacin y
expresin), se suele hablar de dos grandes grupos de vectores. Por un lado, los vectores de
clonacin, que se emplean nicamente para amplificar el DNA de inters; tambin se
denominan a veces vectores de insercin o vectores de propagacin. Tericamente, slo
incorporaran el inserto de inters. Por otro lado, se encuentran los vectores de expresin, que
poseen, adems, caractersticas que facilitan la expresin del DNA de inters por parte de la
clula anfitriona. En este caso deber incorporarse, adems del DNA que se quiere clonar, el
ya mencionado inserto auxiliar que proporciona una regin de control de la expresin. En la
prctica, los vectores de expresin comerciales suelen incluir ya una regin de control,
comnmente un promotor potente que se induce fcilmente bajo condiciones experimentales
controlables, vlido para expresar cualquier inserto de inters que se site tras l en el rDNA.

Tipos de vectores
Los vectores empleados para la clonacin de insertos de DNA son muy variados. Pueden
clasificarse segn varios criterios, tales como:
Su procedencia procaritica o eucaritica.
El tamao de inserto que admiten.
El tipo de molcula a partir de la que se preparan:
Plsmidos: bacterianos, de levadura o de plantas.
Virus: que infectan bacterias (bacterifagos o simplemente fagos), plantas, invertebrados o
vertebrados.
Cromosomas artificiales: derivados de elementos cromosmicos de fagos (PAC), de
bacterias (BAC) o de levaduras (YAC).
Quimeras, es decir, molculas formadas combinando partes de otras cuyo origen es
diferente. Normalmente, quimeras de plsmido y fago: csmidos, fagmidos, fsmidos.
El tipo de clula anfitriona en la que se puede luego incorporar el DNA recombinante
producido
 El gen de resistencia incluido en el vector para su posterior deteccin o seleccin

c) GENOTECAS
Se llama genricamente genoteca o biblioteca de DNA a una coleccin de clones preparada
con todos los fragmentos de DNA obtenidos previamente por escisin del genoma de una
especie o de un tejido. Es decir, se hace la clonacin en paralelo de todos los fragmentos de
DNA que componen un genoma. En el caso de la clonacin celular, cada uno de estos
fragmentos se presenta integrado, bajo la forma de rDNA, en un vector incorporado a uno de
los clones celulares que componen la genoteca. En la clonacin acelular se presentan como
fragmentos individuales independientes (al no existir vector ni clula anfitriona).
Dependiendo de si las muestras de partida para la clonacin son fragmentos del DNA
genmico o molculas de mRNA, se distingue entre genotecas genmicas y genotecas de
cDNA. Es importante indicar que la informacin proporcionada por ambas genotecas no es
idntica, pues slo las primeras incluyen tanto las regiones codificantes como las no
codificantes; adems, las genotecas de cDNA son diferentes segn el tejido particular con el
que se han preparado, pues slo contienen las regiones codificantes que se expresan en ese
tejido, tipo celular, etapa del desarrollo o diferenciacin, entorno bioqumico, etc.
Una vez preparada una genoteca, sta se convierte en el punto de partida para la bsqueda de
cualquier regin del DNA o de genes concretos, y para su estudio mediante clonacin
adicional (que recibe el nombre de subclonacin), secuenciacin, expresin, etc. Con
respecto al uso de las genotecas como fuente para otros estudios, el problema genrico que
se plantea es la localizacin en la genoteca del clon que contiene el DNA buscado. Para ello
se acude a los distintos mtodos de deteccin y seleccin, previamente comentados al
describir la clonacin de un solo fragmento
Genotecas genmicas
El concepto original de genoteca corresponda estrictamente al de genoteca genmica,
representativa del genoma completo. El nmero de clones componentes debe ser, en la
prctica, suficiente para abarcar todo el genoma, incluyendo tanto el DNA codificante como
el no codificante. La preparacin del DNA de partida se realiza por escisin del genoma con
enzimas de restriccin bajo condiciones de rotura parcial, es decir, que no permitan la
actuacin exhaustiva de la enzima sobre todos los sitios de restriccin presentes en el DNA.
La rotura se produce en cada molcula aleatoriamente sobre el conjunto de sitios de
restriccin, de forma que aparecen un nmero menor de fragmentos y estos son de mayor
tamao, respecto a lo tericamente posible, y diferentes de una a otra molcula. Tambin se
favorece este resultado usando enzimas cortadoras infrecuentes, aquellas cuya secuencia
diana aparece pocas veces en el genoma.
A partir del tamao del genoma completo y el tamao medio de los insertos se puede calcular
el mnimo nmero de clones necesario para que la genoteca represente al genoma completo.
Sin embargo, el carcter aleatorio de la preparacin de fragmentos y del proceso de clonacin
hace que, para tener certeza de que una genoteca contiene cualquier regin del genoma, se
requiera en la prctica un nmero de clones muy superior al terico. Este nmero de clones
reales dividido por el nmero de clones tericos define el parmetro conocido como
equivalente genmico, que debe alcanzar valores de 10 para asegurar un 99% de probabilidad
de cobertura completa.
Genotecas de DNA complementario
A diferencia del caso anterior, las genotecas de cDNA representan de manera exclusiva a la
parte codificante del genoma. Son especialmente tiles en eucariotas, donde una clula
expresa una fraccin muy pequea de su genoma (menos del 3% en humanos), lo que reduce
el tamao del material gentico necesario para construir la genoteca y, por tanto, el nmero
de clones. El material de partida, el mRNA de la clula, comprende menos de 20.000
molculas diferentes, con un tamao medio de 2 a 3 kb. Por otro lado, dado que el nmero
de copias de los distintos tipos de mRNA es muy variable en eucariotas, su representacin
en la genoteca no ser uniforme. Puesto que los cDNA carecen de seales de expresin,
cuando se pretenda la expresin del gen clonado es imprescindible incluir en el vector de
expresin un potente promotor adecuado para la clula anfitriona, de modo que sta exprese
la protena codificada por el cDNA respectivo.
Las secuencias de cDNA son a menudo preferibles a las genotecas genmicas como fuente
de genes donados debido a que:
a) El clon obtenido contiene solamente los exones de un gen, es una representacin directa
de la secuencia codificante de un gen, sin los intrones ni otras secuencias promotoras.
b) Los diversos conjuntos de cDNA que representan los transcritos de un nico gen pueden
presentar diferencias entre s, lo que indica que se estn utilizando promotores
o sitios de poliadenilacin alternativos, o bien que se est produciendo un corte y empalme
en sitios diferentes (<<splicing alternativo>>), de manera que algunos exones pueden quedar
incluidos o excluidos en algunos transcritos
c) El uso de una fuente especfica de mRNA a menudo enriquece sustancialmente por las
secuencias derivadas de un gen especfico que se sabe que se expresan de manera selectiva
en un tejido concreto.
Por ejemplo, los pocos pares de bases del gen de la -globina estn representados slo en una
parte por milln en una genoteca de DNA genmico, pero constituyen uno de los transcritos
de mRNA ms abundantes en los hemates. Por tanto una genoteca de cDNA preparada a
partir de hemates es una excelente fuente de donacin para aislar segmentos de cDNA
correspondientes al mRNA de la B-globina. De igual forma, una genoteca de cDNA de
hgado. o de msculo, es una buena fuente de clones para genes de los que se sabe que se
expresan de manera preferente o exclusiva en esos tejidos.
Sin embargo, un cO A slo contiene los exones de un gen,
pero no las secuencias de los intrones o el promotor. Adems,
un cDNA no proporciona ninguna indicacin sobre el tamao o el nmero de los exones ni
de la secuencia de los lugares de empalme 3' y 5.
La donacin del cDNA est basada en la accin de la transcriptasa inversa, una DNA
polimerasa dependiente de RNA derivada de retrovirus, que puede sintetizar una cadena de
cDNA complementaria de una plantilla de RNA. Despus, esta cadena nica de cDNA se usa
como plantilla para la DNA polimerasa, que convierte la molcula de cadena nica en una
molcula de doble cadena que, a su vez, se puede ligar en un vector apropiado para crear una
genoteca de cDNA representativa de todos los transcritos originales de mRNA que se
encuentran en la clula o el tejido originales. Un cDNA que represente a un mRNA individual
en su totalidad tiene una utilidad especial debido a que ofrece la longitud completa de la
secuencia de codificacin de un gen. Algunos vectores hbilmente construidos, denominados
vectores de expresin, contienen seales de transcripcin y de traduccin adyacentes al lugar
de insercin del cDNA, de manera que es posible transcribir y traducir en bacterias, hongos
o clulas en cultivo un cDNA de longitud completa para que produzca la protena que
codifica.
Hasta el momento se han construido miles de genotecas de cDNA a partir de muchos tejidos
distintos o de fases diferentes del desarrollo de muchos organismos diferentes, y estas
genotecas han demostrado ser una fuente de enorme valor de cDNA para una amplia gama
de transcritos de mRNA. La construccin de una genoteca de gran tamao incrementa las
posibilidades de que cualquier mRNA de inters, con independencia de que sea muy Mtodos
de anlisis de los cidos nucleicos
El anlisis del ADN y del ARN de un gen concreto requiere la detencin de segmentos de
ADN o molculas de ARN determinados entre otros muchos segmentos de ADN o molculas
de ARN presentes en una muestra celular o tisular. Cuando se analiza el ADN genmico, el
problema es encontrar y examinar el fragmento de ADN de inters entre una mezcla compleja
de ADN genmico que contiene varios millones de fragmentos de ADN. Con muestras de
ARN, el problema es detectar y medir la cantidad y calidad del ARNm especfico en una
muestra. La solucin es encontrar una secuencia mediante electroforesis en gel para separar
las molculas de ADN o ARN y despus realizar una hibridacin de cido nucleico con una
sonda para identificar la molcula de inters.

La hibridacin de cidos nucleicos (ADN ARN) es un proceso por el cual se combinan dos
cadenas de cidos nucleicos antiparalelas y con secuencia de bases complementarias, en una
nica molcula de doble cadena, que toma la estructura de doble hlice, donde las bases
nitrogenadas quedan ocultas en el interior. Los nucletidos se unirn con sus
complementarios bajo condiciones normales:

A=T; A=U; CG; GC; T=A U=A

As que dos cadenas perfectamente complementarias se unirn la una a la otra rpidamente.

Por el contrario, debido a las diferentes geometras de los nucletidos, una simple variacin
de las parejas anteriores lleva a inconsistencias entre las cadenas y dificultar la unin.
El proceso de hibridacin se puede revertir simplemente calentando la solucin que contiene
a la molcula. El porcentaje de GC dentro de la cadena condiciona la temperatura de
alineamiento y de desnaturalizacin ya que G se une a C mediante tres puentes de hidrgeno
y A se une a U o T mediante dos puentes de hidrgeno; por tanto, y dado que se requiere ms
energa para romper tres enlaces que para romper dos, dicha energa se traduce en una mayor
temperatura.

En biologa molecular experimentalmente se llevan a cabo dos tipos diferentes de

hibridacin: Tipo Southern, para uniones ADN-ADN y tipo Northern, para uniones ADN-
ARN.

La velocidad de hibridacin es un indicativo de la similaridad gentica entre las dos muestras,

el porcentaje de similaridad genmica y la velocidad de hibridacin son directamente
proporcionales.

Anlisis de los cidos nucleicos: Transferencia de Southern y Northern

Existen diferentes tcnicas que emplean la separacin en gel por electroforesis como primer
paso para identificar la presencia de determinadas molculas dentro de una muestra.
Estas dos tcnicas consisten en una electroforesis seguida de transferencia y emplean
secuencias especficas (sondas) complementarias a la molcula de cido nucleico a
identificar. Es decir, ambas utilizan la hibridacin de cidos nucleicos para la deteccin de
las molculas buscadas. Los principios generales son los mismos, pero hay diferencias en el
procedimiento debidas principalmente a que el ARN se degrada mucho ms fcilmente que
el ADN; esto hace necesario tomar muchas ms precauciones.

Tcnica de transferencia de Southern

El mtodo tipo Southern o Southern blot fue desarrollado por E. M. Southern para la
deteccin de genes especficos en el ADN celular.

El ADN es digerido con una enzima de restriccin y los fragmentos son separados por
tamaos mediante una electroforesis en un gel. A continuacin los fragmentos de ADN de
doble cadena son desnaturalizados mediante un proceso qumico separando las dos hebras
componentes de ADN en sus cadenas sencillas. Posteriormente, el ADN inserto en el gel es
transferido a un filtro de nitrocelulosa, con lo que en el filtro queda representada una rplica
de la disposicin de los fragmentos de ADN presentes en el gel. A continuacin el filtro se
incuba durante un tiempo con la sonda marcada (radiactivamente o con un fluorocromo);
durante la incubacin la sonda se va hibridando a las molculas de ADN de cadena sencilla
de secuencia complementaria (o muy parecida). La sonda unida al fragmento de ADN
complementario se puede visualizar en el filtro de una forma sencilla mediante una
exposicin a una pelcula de rayos X para el caso de sondas radiactivas o con una pelcula
sensible a la luz, para el caso de sondas.
La huella dactilar de ADN, tambin conocida como anlisis del perfil de ADN, se basa en el
uso de la
tcnica de transferencia e hibridacin de Southern para analizar regiones polimrficas del
ADN humano.

Fases
En primer lugar se asla el ADN de una fuente accesible. Cualquier clula del cuerpo
puede utilizarse como fuente de ADN, excepto los eritrocitos maduros que no tienen
ncleo.
Separacin electrofortica: La separacin de los fragmentos, de cidos nucleicos
de ADN, puede hacerse fcilmente mediante electroforesis. La velocidad de
migracin electrofortica vara en funcin del tamao de los fragmentos
pequeos mediante electroforesis en gel de agarosa o de acrilamida, sustancias
porosas en la que los fragmentos pequeos se mueven a travs del campo
elctrico con ms rapidez que los grandes. Cuando el ADN genmico aparece
como una extensin uniforme de material fluorescente en uno de los carriles del
gel, con los fragmentos ms pequeos en la parte inferior y los ms grandes en
la superior. El ADN aparece como una extensin debido a que hay demasiados
fragmentos como para separarse uno de otros.

Desnaturalizacin: Una cadena de doble hlice se desnaturaliza cuando la

separacin de ambas cadenas es completa.

Transferencia: Las molculas de ADN, ahora de cadena simple, son transferidas

del gel a un soporte slido del nylon o nitrocelulosa, que es ms resistente y
manejable que un gel; esta transferencia se da por capilaridad. La transferencia
crea una rplica del gel en el soporte slido (llamado filtro) ya que mantiene la
posicin relativa que tenan los fragmentos en el gel.

Hibridacin: En este proceso dos cadenas de cidos nucleicos que son

complementarias se unen para dar una molcula bicatenaria.

Deteccin: Un pequeo fragmento es capaz de identificar los fragmentos de una

mezcla compleja que contienen secuencias complementarias del mismo. Por este
motivo estos pequeos fragmentos se denominan SONDAS, pero una sonda no
es de gran utilidad si no lleva algn tipo de marcaje que permita detectar la
presencia del ADN.

Tcnica de transferencia de Northern

El segundo mtodo, tipo Northern o Northern blot, se utiliza para identificar
las cadenas de ARN de secuencia semejante al ADN que se usa como sonda;
a diferencia del tipo Southern que se utiliza para identificar ADN, el mtodo
Northern sirve para identificar ARN. Una tcnica de laboratorio que se utiliza
para identificar y localizar las secuencias de ARNm que son complementarias
a un fragmento de ADN o ARN llamado sonda.
El ARN se extrae y se fracciona en tamaos variables mediante ua
electroforesis en gel de poliacrilamida en unas condiciones que mantenga las
cadenas de ARN en estado desnaturalizado. El proceso contina de forma
semejante a la hibridacin de tipo Southern. El mtodo del Northern se utiliza
muy frecuentemente para realizar estudios de expresin gnica; para conocer
qu genes estn activos formando ARN mensajero en qu condiciones, en
qu tejidos o tipos celulares.

Tcnica de transferencia de Western

El Western blot fue desarrollado en el laboratorio de George Stark, en
la Universidad de Stanford. El nombre (Western, occidental en ingls) le fue
dado por W. Neal Burnette , y consiste en un juego de palabras con una
tcnica anloga pero que usa DNA, el Southern (sureo) blot, que en este
caso debe su nombre a su descubridor, Edwin Southern. Otras tcnicas que
fueron nombradas siguiendo esta chanza son el Northern blot (en el que se
separa e identifica RNA), el Eastern blot, el Southwestern blot.
El Western blot, o inmunoblot, es una tcnica analtica usada para
detectar protenas especficas en una muestra determinada (una mezcla
compleja de protenas, como un extracto tisular). Mediante una electroforesis
en gel se separan las protenas atendiendo al criterio que se desee: Peso
molecular, estructura, hidrofobicidad. Luego son transferidas a
una membrana adsorbente (tpicamente de nitrocelulosa o de PVDF) para
poder buscar la protena de inters con anticuerpos especficos contra
ella. Finalmente, se detecta la unin antgeno-anticuerpo por actividad
enzimtica, fluorescencia. De esta forma se puede estudiar la presencia de la
protena en el extracto y analizar su cantidad relativa respecto a otras
protenas.
 Los resultados que nos informa el laboratorio son tres: un resultado positivo
es cuando aparecen mltiples bandas, un resultado negativo es cuando no
aparece ninguna banda y un resultado indeterminado es cuando slo aparece
alguna o algunas bandas pero que no son suficientes para ser considerado
como positivo.
Esta tcnica es hoy en da imprescindible en varios campos de la biologa,
como la biologa molecular, la bioqumica, la biotecnologa o la
inmunologa. infrecuente, est representado al menos una vez en dicha
genoteca.

REACCIN EN CADENA DE LA POLIMERASA (PCR):

Actualmente sabemos que la misin de la PCR es copiar millones de veces una
secuencia especfica de ADN blanco mediante una poderosa catlisis llevada a cabo
por una enzima conocida como ADN polimerasa, de tal manera que cantidades
pequeas de ADN pueden ser sintetizadas y copiadas fielmente para analizarse con
diferentes fines. El desarrollo de esta tcnica permiti estudiar y manipular mejor al
ADN, facilitando el establecimiento de protocolos
La reaccin en cadena de la polimerasa es una reaccin enzimtica in vitro que
amplifica millones de veces una secuencia especfica de ADN durante varios ciclos
repetidos en los que la secuencia blanca es copiada fielmente. Para ello, la reaccin
aprovecha la actividad de la enzima ADN polimerasa que tiene la capacidad de
sintetizar naturalmente el ADN en las clulas. En la reaccin, si usamos como sustrato
ADN genmico, entonces tpicamente hablamos de una PCR, pero si usamos ADN
complementario (ADNc) proveniente del ARNm (cido ribonucleico mensajero) se
le conoce como RT-PCR (Reverse Transcription-PCR, por sus siglas en ingls). Esta
conversin se logra mediante una reaccin conocida como transcripcin reversa y
controlada por la enzima transcriptasa reversa, capaz de convertir el ARNm en una
molcula de ADNc. Este mtodo fue copiado de los retro virus que usan una
transcriptasa reversa para convertir su genoma de ARN en ADN duplicarse en
millones de partculas virales. El ADNc se utiliza cuando analizamos la expresin del
ARNm de algn gen de inters. Los elementos importantes en la reaccin son el
templado o molde (ADN o ADNc), la enzima, los oligonucletidos o primers, los
desoxirribonucletidos trifosfatados (dNTPs: adenina, timina, citosina y guanina), el
in magnesio (Mg +), una solucin amortiguadora o buffer y H2 O. Todos estos
elementos interactan en tres etapas principales de las que se compone la PCR:
desnaturalizacin, hibridacin y extensin. Los equipos en donde se realiza la
reaccin son llamados termocicladores, los cuales estn diseados para establecer un
sistema homogneo en donde las condiciones de temperatura y tiempo necesarios no
se modifiquen en cada uno de los ciclos. Al final de la reaccin, para corroborar si se
amplific la secuencia blanco de inters, los productos de la PCR o tambin llamados
amplicones son analizados en geles de agarosa para confirmar si la reaccin fue
exitosa.
 El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza qumica ofrece ventajas
para su manipulacin. Para entrar en contexto, es importante recordar que la molcula
de ADN est formada por tres componentes: un azcar (desoxirribosa), un grupo
fosfato y una base nitrogenada (adenina, timina, guanina o citosina) que es
complementaria con la base de otra cadena (Figura 1), de tal forma, que el ADN se
estructura en una doble hlice.3 La complementariedad entre las bases est dada por
puentes de hidrgeno e interacciones hidrofbicas, generando estabilidad a la doble
hlice, la carga elctrica del ADN es negativa y est dada por los grupos fosfatos. En
la PCR, el templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde
para que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de
inters.

Componentes:

Cebadores:
Se llama as a las molculas cortas que inician la sntesis del ADN. Estn
diseados de forma que uno de ellos es complementario a una cadena de una
molcula de ADN en uno de los lados de la secuencia diana, y el otro es
complementario a la otra cadena de la molcula de ADN en el lugar opuesto de
la secuencia diana. Su lado 3 est dirigido hacia la secuencia diana que se
amplificar.

Enzimas (Polimerasas):
ADN POLIMERASA: Se encarga de la catlisis de la reaccin,
sintetizando las nuevas cadenas de ADN que llevan la secuencia blanca.
Sintetiza dos nuevas cadenas de ADN usando como plantilla la secuencia
que se localiza entre los cebadores. Las cadenas sintetizadas de ADN son
entre s complementarias y pueden formar una segunda copia de la
secuencia diana original.
Taq: Es la ms utilizada en el PCR, requiere la presencia del magnesio
como cofactor, su temperatura ptima es de 72 C, carece de actividad
exonucleasa 3 5 que tienen otras polimerasas. Proviene de una
bacteria termfi la llamada Thermus aquaticus, la cual vive en
condiciones de temperatura muy altas y por eso su ADN polimerasa es
capaz de soportar ese tipo de temperaturas.

ADN: El elemento principal en la PCR es el ADN, cuya naturaleza qumica

ofrece ventajas para su manipulacin. Para entrar en contexto, es importante
recordar que la molcula de ADN est formada por tres componentes: un azcar
 (desoxirribosa), un grupo fosfato y una base nitrogenada (adenina, timina,
guanina o citosina) que es complementaria con la base de otra cadena (Figura 1),
de tal forma, que el ADN se estructura en una doble hlice.3 La
complementariedad entre las bases est dada por puentes de hidrgeno e
interacciones hidrofbicas, generando estabilidad a la doble hlice, la carga
elctrica del ADN es negativa y est dada por los grupos fosfatos. En la PCR, el
templado son las cadenas de ADN que se separan y funcionan como molde para
que la enzima sintetice las nuevas cadenas que llevan la secuencia blanco de
inters.
Puede utilizarse relativamente impuro, incluso es posible utilizar clulas o
bacterias completas; pero es recomendable usarlo puro porque asegura el buen
funcionamiento de la reaccin. Las cantidades necesarias son pequeas, no
deben superar los 100 a 200 ng por reaccin.

Fases:
Desnaturalizacin: En esta etapa, las cadenas de ADN son calentadas y
separadas a una temperatura de 95 C durante 20-30 segundos; el tiempo
depende de la secuencia del templado, es decir, si la cantidad de G-C es alta, ser
necesario ms tiempo para romper sus uniones debido a que el apareamiento de
estas bases est formado por tres enlaces, uno ms que las bases de A-T. Adems,
depende de la velocidad en la que el termociclador aumenta la temperatura, esto
vara de acuerdo al modelo del equipo. Al final de esta etapa tendremos las
cadenas separadas que servirn como templado para el siguiente paso.
Hibridacin: En esta etapa, los primers se alinean al extremo 3 del templado
previamente separado e hibridan con su secuencia complementaria. Para que se
forme el complejo templado-primers, es importante que la temperatura de
hibridacin o temperatura melting (Tm) sea la ptima; sta generalmente oscila
entre 50-60 C. Si el diseo de los primers es el correcto y la temperatura es la
adecuada, la estabilidad y especificidad del complejo ser eficiente.
Extensin: En esta etapa, la Taq polimerasa acta sobre el complejo templado-
primers y empieza su funcin cataltica a una velocidad muy rpida; agrega
dNTPs complementarios para crear las cadenas completas de ADN. La
extensin de las cadenas es en direccin de la sntesis del ADN, es decir, de 5 a
3. La temperatura ptima para la reaccin es de 72 C, ya que a esa temperatura
la enzima es funcional. Al final del ciclo, se habrn formado los amplicones con
un tamao dictado por el nmero total de pares de bases (pb) que deber ser
conocido por el investigador.

Origen de la reaccin en cadena de la polimerasa:

 Este novedoso y revolucionario proceso fue ideado en 1985 por Karry B. Mullis, un
investigador de la Cetus Corporation, en Emerville, California. Ese mismo ao otros
investigadores del grupo de Mullis perfeccionaron la tcnica y la aplicaron al
diagnstico clnico de la anemia de clulas falciformes.9 Desde entonces la aparicin
de artculos que tratan sobre aplicaciones de esta metodologa en diferentes reas de
la biomedicina ha sido exponencial, tambin la nueva tecnologa ha tenido su efecto
en bola de nieve sobre el avance del conocimiento cientfico de otras disciplinas
como la criminalstica y la paleontologa, as como en el estudio de la evolucin y
de las plantas.10

Los primeros ensayos de la Reaccin en Cadena de la Polimerasa se realizaron en

forma manual, utilizando para la amplificacin al fragmento Klenow del ADN
polimerasa I de la bacteria E. coli, los cambios de temperatura que exigen cada paso
en los diferentes ciclos se lograban utilizando varios baos de agua a la temperatura
deseada. Luego de cada paso de desnaturalizacin era necesario aadir nueva
cantidad de enzimas que reemplazara a la incluida inicialmente, ya que la alta
temperatura requerida en este paso la inactivaba, con la nueva adicin de enzimas.
Tambin se incluan en la muestra otras sustancias que acompaaban a la preparacin
enzimtica (Glicerol) y que al final terminaban inhibiendo la enzima lo que limitaba
la eficiencia cataltica de la ADN polimerasa I.4 Todo esto haca el proceso costoso,
muy laborioso y complejo adems de ser poco eficiente.

Aplicaciones de la reaccin en cadena de la polimerasa.

Las aplicaciones de la tcnica de PCR han sido mltiples desde su aparicin en la

deteccin de enfermedades. Una de las variantes ms utilizadas, es la amplificacin
de fragmentos de ARNm. En este caso en vez de utilizar ADN como molde para la
amplificacin, se usa una molcula de ADN que es copia de un ARNm, obtenida en
el proceso de retrotranscripcin, gracias a la transcriptasa reversa de la polimerasa de
algunos virus. Esta variante es conocida como RT PCR (retrotranscripcin PCR)
que es muy utilizada cuando se quiere trabajar con las secuencias de los genes ya
procesados, prescindiendo de los intrones.
 SECUENCIACIN DEL ADN

Es una tcnica en la que se hace un anlisis ms detallado de la estructura del ADN y consiste
en un conjunto de tcnicas y mtodos bioqumicos que nos permiten determinar el tipo y
orden de los nucletidos (A, C, G y T) en un oligonucletido de ADN. Los esfuerzos iniciales
para secuenciar cidos nucleicos dieron pocos resultados. Hasta la dcada de 1970 era difcil
y costoso secuenciar incluso fragmentos de slo 5 a 10 nucletidos. Fueron los mtodos
qumico de Maxam y Gilbert (1977) y enzimtico de Sanger (1980) los que abrieron el
camino a dicho gran objetivo. Se consigui secuenciar molculas mayores de DNA y se
definieron algunas secuencias concretas como las del fago fX174 (5,4 kb), mitocondria
humana (16,5 kb), fago lambda (48,5 kb) y virus animal de Epstein-Barr (170 kb).
DESARROLLO

METODOS DE SECUENCIACION DE ADN

El mtodo de degradacin qumica (Maxam and Gilbert, 1977).

En este mtodo, un fragmento de ADN de cadena doble o sencilla se marca en los
extremos 5 o 3 de una o ambas hebras con 32P. Despus, la muestra de ADN se
divide en cuatro alcuotas y se fragmenta en cuatro reacciones qumicas distintas.
Posteriormente, los fragmentos de ADN generados pueden ser separados por
electroforesis en cuatro carriles distintos con base en su tamao. Conociendo el
nucletido en el que se realizaron los cortes, se puede inferir la secuencia de la
molcula original (figura 4). Las reacciones qumicas que se utilizan para fragmentar
la molcula de ADN son las siguientes:

Figura 1. El mtodo de Maxam y Gilbert para secuenciar ADN. Los nmeros de los carriles
en el gel corresponden a los distintos tipos de corte que se describen en el texto (De Necochea
& Canul, 2004).

Metodologa de mtodo Maxam Gilbert

1. Corte de las purinas. Las purinas adenina y guanina se metilan con dimetil sulfato (DMS).
Despus, la reaccin es tratada en condiciones alcalinas; la molcula de ADN se fragmenta
en las purinas metiladas. Como resultado, se obtiene una serie de bandas oscuras que
corresponden a las guaninas (las cuales se metilan 5 veces ms rpido), y bandas claras que
corresponden a las adeninas. Para interpretar fcilmente el patrn de bandas 18 generadas, se
puede comparar contra un tratamiento que favorezca el corte de las adeninas (De Necochea
& Canul, 2004).
 2. Corte de adeninas. Esta reaccin es una variacin de la anterior. Las purinas metiladas
se tratan inicialmente con un cido diluido. Esto favorece el corte de las adeninas metiladas.
Despus de un tratamiento alcalino las guaninas tambin son cortadas. Este tratamiento
genera una serie de bandas oscuras y claras que tambin corresponden a las adeninas, y las
guaninas, respectivamente (De Necochea & Canul, 2004).

3. Corte de pirimidinas. Esta reaccin utiliza el reactivo hidracina, que corta las bases
citosina y timina. Posteriormente, se trata con piperidina para completar la reaccin.

4. Corte de citosina. La presencia de NaCl 2M inhibe la reaccin de hidracina con tiamina,

y el tratamiento posterior con piperidina, produce solamente fragmentos que terminan en
citosina

Desde que se report este mtodo, no se han encontrado reactivos qumicos especficos que
corten las bases A o T, por lo que se utiliza la estrategia de corte descrita en la figura 4. Esta
estrategia permite distinguir entre los nucletidos que se encuentran al final de cada corte y
deducir la secuencia de ADN (De Necochea & Canul, 2004).

El mtodo enzimtico (Sanger et al., 1977).

El mtodo enzimtico o de Sanger es la base de las variantes que se han utilizado

exhaustivamente durante aos para la secuenciacin a gran escala del DNA. Slo en la dcada
posterior a la finalizacin del Proyecto Genoma Humano ha comenzado a ser desplazado por
mtodos ms modernos. En l no se degrada el DNA como en el mtodo qumico, sino que
se acude a la interrupcin controlada de la sntesis de una hebra complementaria durante una
replicacin in vitro. Esta sntesis, catalizada por una DNA polimerasa, define el carcter
enzimtico del mtodo. El mtodo se apoya en dos conceptos fundamentales: la sntesis a
cargo de una DNA polimerasa y el uso de nucletidos terminadores.
El mtodo puede describirse en tres secciones: sntesis enzimtica, anlisis de los fragmentos
y automatizacin.

Sntesis de un DNA complementario de longitud variable

Dado que se emplea una DNA polimerasa para sintetizar hebras complementarias a la que se
quiere secuenciar, una primera caracterstica del mtodo es la necesidad de un cebador, un
oligonucletido diseado para que se hibride con el extremo 3 de la regin que se quiere
secuenciar. La segunda, y principal, caracterstica de este mtodo de secuenciacin es el uso
de didesoxinucletidos, anlogos estructurales de los desoxinucletidos pero que provocan
la detencin de la reaccin de sntesis de DNA. Por ello, el mtodo se conoce tambin como
secuenciacin didesoxi o de terminacin de cadena.
La razn por la que se emplean didesoxinucletidos es que compiten con los
desoxinucletidos en la reaccin de sntesis. La DNA polimerasa utiliza el ddNTP como
sustrato, por su analoga estructural con el dNTP, y queda incorporado a la hebra en
crecimiento como ddNMP, pero a partir de l la cadena no se puede elongar debido a la falta
de grupo -OH en 3, que impide que forme enlace fosfodister con el siguiente nucletido.
Los ddNTP, por tanto, detienen la sntesis de la molcula a la que se incorporan.

Separacin de los fragmentos y anlisis

Para analizar las mezclas de molculas obtenidas, se separan todos ellas de acuerdo con su
tamao, empleando electroforesis. El tamao de cada molcula marcada indica directamente
la posicin en la secuencia del didesoxinucletido responsable de la interrupcin de su
sntesis.
 Automatizacin

La posibilidad de usar un fluorocromo distinto en cada una de las reacciones de sntesis

permite automatizar el mtodo, de forma que se lean simultneamente las hebras
marcadas componentes de las mezclas. Adems, esta lectura de la fluorescencia se puede
hacer en continuo, con lo que la electroforesis sigue transcurriendo, las molculas de menor
tamao, ya detectadas, salen por el extremo inferior del gel, y se sigue consiguiendo la
separacin de molculas mayores en el gel, de modo que se ampla el nmero de nucletidos
que es posible secuenciar en un solo experimento.
16:16

APLICACIONES DE LA SECUENCIACIN DEL ADN

Proyecto de secuenciacin del genoma humano

Uno de los factores principales que motiv el desarrollo de la tecnologa de las

secuenciadoras automticas fue el proyecto de secuenciacin del genoma humano. Tal vez
ningn proyecto de secuenciacin genmica ha recibido tanta atencin como ste,
concebido en Estados Unidos en 1988 (Olson, 1993). En ese tiempo, la tecnologa de
secuenciacin automatizada estaba en sus primeras etapas de desarrollo, y era muy
ambicioso intentar secuenciar un genoma de miles de millones de pb. Sin embargo, el
comienzo de este proyecto se anunci oficialmente en 1990 por los departamentos de Salud
y Energa con un presupuesto de 3 mil millones de dlares y la meta de completar la
secuencia en 15 aos (Venteret al., 2001).
De qu nos sirve la informacin de la secuencia de un genoma? De una forma muy general,
los objetivos principales del proyecto de secuenciacin del genoma humano eran los
siguientes (Olson, 1993):

a) Mejorar la infraestructura de la investigacin gentica - La secuencia del genoma

humano permitira la ampliacin del conocimiento gentico de nuestro organismo. Se
pueden utilizar tcnicas como el PCR para analizar detalladamente ciertos segmentos
del genoma. Conociendo su secuencia, se pueden disear oligonucletidos que
reconocen y se unen a secuencias complementarias en el ADN.

b) Comparar el papel de una secuencia de ADN en los humanos y en los organismos

modelo Se pueden comparar las secuencias de los genes identificados en el genoma
humano con los genes de otros organismos y conocer el grado de similitud o
diferencia que existe entre dos especies. Tambin se puede inferir la funcin de ciertos
genes con base en los conocimientos de otro gen similar, identificado en otro
organismo.

c) Mejorar la bioqumica analtica del ADN - Este era el reto ms grande cuando se
anunci el inicio del proyecto de secuenciacin del genoma humano, ya que se refera
a mejorar las herramientas para el anlisis de ADN. ste era un reto tcnico, ya que
para obtener la secuencia completa del genoma humano en el tiempo propuesto era
necesario desarrollar la estrategia y las mquinas de secuenciacin con capacidad de
secuenciar dos Mpb por ao.
La secuencia del genoma humano se report en el 2001, cuatro aos antes de la fecha
prevista (Venteret al., 2001). Esto se debe en parte a los esfuerzos de ms de 20 grupos
internacionales que colaboraron para completar la secuencia, y a los avances en la
tecnologa de las secuenciadoras automaticas (la mayor parte de la secuencia se
obtuvo con mquinas ABI PRISM 3700; figura 9). Pero la razn principal por la que
se logr completar la secuencia fue un cambio en la estrategia de secuenciacin
(Internacional Human GenomeSequencingConsortium, 2001). La necesidad de tener
una buena estrategia para secuenciar fragmentos grandes de ADN (e.g, un
cromosoma), fue evidente en el proyecto de secuenciacin del genoma humano.
 MICROARRAYS

La palabra microarray deriva del griego mikro (pequeo) y del ingls array (distribucin
ordenada). Podramos decir que las micromatrices o microarreglos permiten el depsito
de miles de puntos conteniendo genes o parte de genes sobre un portaobjetos para su
estudio. De esta manera es posible tener una visin instantnea de la actividad de genomas
completos o de un grupo selecto de genes.

1. Antecedentes histricos

La tecnologa del chip de ADN tiene su origen en una tcnica muy usada en biologa
molecular, el Southern blot. En la era pre-genmica la biologa estudiaba los genes
individualmente, uno a uno, por lo que los poda estudiar a fondo. Lo que caracteriza la
era post-genmica no es lo que se puede medir sino la cantidad de mediciones simultneas
que se pueden realizar. Para cumplir este objetivo y poder estudiar muchos genes a la vez
fue necesario un cambio de paradigma: con los mismos recursos, obtener una imagen de
menor resolucin pero con una perspectiva ms general.

Para poder clasificar los microarrays se debe dejar claro que target (blanco) es la
molcula libre, y que probe (sonda) es la molcula inmovilizada.

2. Tipos Microarrays:

1. Microarrays de cidos nucleicos

Microarrays de cDNA

Las sondas son producidas en laboratorios mediante la amplificacin selectiva

de cDNAs (100-3000 nucletidos) por PCR en placas de 96 pocillos. Estos
amplicones se purifican, se verifica su calidad y cantidad y se depositan por
 capilaridad en portaobjetos de vidrio mediante costosos robots que requieren
un ambiente libre de partculas.
Microarrays de oligonucletidos

Las sondas son porciones de DNA sinttico de cadena simple que pueden ser
cortas (15-25 nucletidos) o largas (50-120 nucletidos). Estos fragmentos
pueden ser pre-sintetizados y depositados en portaobjetos por robots o
sintetizados in situ y depositados por fotolitografa (DNA chips).
2. Microarrays de protenas

Las sondas son anticuerpos fijados a portaobjetos de vidrio y los blancos son
muestras de suero o tejido. Esta tcnica se ve por el momento restringida por
varios puntos que requieren de tiempo para esclarecerse. Entre ellos podemos
mencionar la dificultad de fabricar e inmovilizar estructuras 3-D como son las
protenas y detectar interacciones de protenas plegadas, sin olvidar mencionar
que no se dispone an de colorantes fluorescentes que permitan cuantificar
eficientemente a estas molculas.

3. Microarrays de tejidos (TMA)

Esta tcnica trata de resolver uno de los problemas principales y limitantes en

anlisis moleculares de tejidos: el tamao limitado de la muestra. Se utiliza una
aguja hueca par tomar muestras milimtricas de las regiones de inters de tejidos
embebidos en parafina, en especial biopsias. Luego se depositan de manera
ordenada en un nuevo bloque de parafina y se cortan con un micrtomo entre 100-
500 veces y se reordenan sobre portaobjetos de vidrio donde se realizarn pruebas
mltiples a nivel DNA, RNA y protenas (inmunohistoqumica, hibridizacin in
situ).
4. Comparative Genomic Hybridization (CGH)

Es un mtodo citogentico molecular que permite monitorear anomalas

cromosmicas. Las alteraciones se clasifican en prdidas, ganancias y
amplificaciones de DNA, incluyendo mutaciones a nivel de cromosomas
completos y por loci. Permite monitorear tumores y defectos congnitos a partir
de cromosomas en metafase o DNA genmico. La tcnica se basa en la
hibridizacin competitiva donde se colorea el DNA tumoral con un marcador
fluorescente y el DNA blanco con otro. Permite el estudio de material de archivo
como muestras congeladas o embebidas en parafina con el fin de correlacionar la
evolucin clnica con aberraciones cromosmicas.
 3. APLICACIN DE LOS MICROARRAYS

Los chips de ADN se han aplicado al estudio de casi cualquier tipo de problema biolgico.
El nmero de publicaciones anuales es muy alto y contina creciendo. Algunas de sus
aplicaciones ms frecuentes son :

Estudio de genes que se expresan diferencialmente entre varias condiciones

(sanos/enfermos, mutantes/salvajes, tratados/no tratados).
Clasificacin molecular en enfermedades complejas. Identificacin de genes
caractersticos de una patologa (firma o signature).
Prediccin de respuesta a un tratamiento.
Deteccin de mutaciones y polimorfismos de un nico gen (SNP).
 IV.CONCLUIONES:

a) La importancia radica en la capacidad del ADN recombinante para atenuar

enfermedades y/o diversas enfermedades.
b) La mas grande importancia de las enzimas es la atenuacin de una gran
enfermedad llamada Cancer.
c) La secuenciacin es una tcnica en la que se hace un anlisis mas detallado de la
estructura de ADN y consiste en un conjunto de mtodos bioqumicos que nos
permiten averiguar la secuencia exacta de nucletidos presentes en la
informacin biologica

V. REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS: