LA RECHERCHE N309 Mai 1998

PATRICE COURVALIN est responsable du Centre national de rfrence sur les

mcanismes de rsistance aux antibiotiques et dirige l'Unit des agents antibactriens de
l'Institut Pasteur.

PLANTES TRANSGENIQUES ET ANTIBIOTIQUES

Alors mme que les bactries dveloppent une rsistance de plus en plus efficace tous les antibiotiques,
l'introduction grande chelle de plantes transgniques risque-t-elle de leur faciliter la tche. Nombre de ces
OGM comportent en effet, intgr leur gnome, un gne de rsistance aux antibiotiques, qui sert de marqueur.
Ce risque a t bien lgrement vacu par les experts. Il est d'autant plus srieux que, paralllement, on favorise
la rsistance des bactries pathognes en utilisant largement les antibiotiques dans l'alimentation des animaux
d'levage. Avant de rpandre des OGM dans l'environnement, il serait opportun d'effectuer des constructions
gntiques qui n'utilisent pas ces gnes de rsistance.

Les OGM risquent-ils d'aggraver le problme crucial de la rsistance bactrienne?

La construction et la production grande chelle de plantes gntiquement modifies gnrent beaucoup d'espoir
mais suscitent galement de nombreuses interrogations. L'une des plus srieuses porte sur ce que l'on nomme la
rsistance et recouvre deux questions distinctes. D'une part, la rsistance au produit du gne transfr dans la
plante : cette question relve de comptences autres que la mienne(I). D'autre part, la rsistance aux
antibiotiques. Celle-ci pourrait se rpandre en raison des gnes bactriens utiliss pour mener l'opration de
transgense et qu'on a laiss subsister dans la plante transgnique o ils n'ont plus d'utilit. On ne peut exclure
que ces gnes de rsistance aux antibiotiques puissent migrer de la plante transgnique aux bactries. Cet
ventuel retour l'envoyeur risque-t-il fortement d'accrotre le phnomne de rsistance aux antibiotiques
chez les bactries pathognes pour l'homme?

La transgense consiste introduire dans le gnome d'un organisme vivant un gne tranger, appel transgne,
dont on suppose qu'il va confrer un avantage cologique, nutritionnel ou autre son nouvel hte, appel OGM
(organisme gntiquement modifi). L'isolement et la purification du transgne d'intrt s'effectuent au
laboratoire par clonage chez une bactrie, gnralement Escherichia coli . Le clonage exige l'emploi de
vecteurs , qui vont permettre d'introduire le gne dans la plante (voir l'encadr La technique de la transgense
). Les vecteurs de clonage bactrien comportent des caractres de rsistance aux antibiotiques pour faciliter la
slection des constructions gntiques. Dans certains OGM, ces gnes bactriens sont transfrs avec le
transgne, bien qu'ils ne soient d'aucune utilit dans la plante elle-mme. Il s'agit donc de rsidus d'une des
tapes de la construction gntique. Selon le type de construction effectue, ces gnes sont exprims ou non. Ils
s'expriment par exemple dans la tomate mise au point par Calgne, mais le plus souvent, comme dans le mas de
Novartis, ils ne sont pas exprims.

Pour survivre en prsence d'antibiotiques, les bactries ont dvelopp divers mcanismes de rsistance(1). Un
des plus efficaces et des plus rpandus est la synthse d'enzymes qui inactivent les antibiotiques. La production
de ces enzymes est gnralement due l'acquisition de gnes provenant d'autres bactries, par transfert
horizontal (c'est--dire d'une bactrie une autre bactrie appartenant une espce ou un genre diffrent, par
opposition au transfert vertical d'une gnration la suivante). L'incidence leve de la rsistance aux
antibiotiques chez les bactries pathognes est principalement due au fait qu'elles ont dvelopp des systmes de
transfert d'ADN extrmement efficaces et trs large spectre d'hte. Le transfert s'opre par diffrents
moyens(2): la conjugaison, qui implique un contact physique direct entre bactrie donatrice et bactrie
rceptrice, et par laquelle le plasmide passe de l'une l'autre ; la transformation, par laquelle une bactrie dite "
comptente " incorpore de l'ADN nu prsent dans l'environnement ; et la transduction, au cours de laquelle
l'ADN est vhicul par un bactriophage..

Ce sont prcisment certains de ces gnes de rsistance qui sont utiliss lors de la construction de plantes
transgniques. Les deux critres qui ont prsid au choix, parmi les trs nombreux gnes de rsistance aux
antibiotiques sont soit leur incidence leve dans la nature, soit le fait qu'ils confrent la rsistance des
antibiotiques qui ne sont plus utiliss en clinique humaine. Comme nous allons le montrer, ces choix,
particulirement malheureux, dnotent une ignorance de l'cologie de la rsistance aux antibiotiques(3) et
attestent de connaissances superficielles sur les mcanismes de rsistance et de leur volution(4).

L'introduction de la pnicilline G en clinique au milieu des annes 1940 a t trs rapidement suivie par
l'mergence de souches pathognes rsistant cet antibiotique. Les souches rsistaient par production d'une
enzyme, la pnicillinase, qui hydrolysait* l'antibiotique. Deux pistes ont t suivies par les chimistes de
l'industrie pharmaceutique pour contourner ce mcanisme. Tout d'abord, la synthse de molcules drives de la
pnicilline G et rfractaires l'action de l'enzyme. Ensuite, la synthse d'inhibiteurs de l'enzyme qui restaurent la
sensibilit aux pnicillines des souches productrices de pnicillinase et sont donc utiliss en association avec ces
antibiotiques.

Le gne nomm blatem-1 trs utilis dans la modification gntique des plantes comme le mas de Novartis
rcemment autoris, et en biologie molculaire en gnral. Il commande la production d'une pnicillinase
capable de dgrader trs efficacement les pnicillines (pnicilline G, ampicilline, amoxycilline, etc.). Il confre
donc la rsistance l'une des classes d'antibiotiques les plus utilises en thrapeutique humaine. On sait que des
altrations de ce gne peuvent largir considrablement le spectre de rsistance que confre l'enzyme dont il
dirige la synthse, et allonger ainsi la liste des antibiotiques rendus inefficaces. En effet, des mutations
ponctuelles (c'est--dire le changement d'une paire de bases) en de nombreux sites de ce gne peuvent confrer
l'enzyme la proprit soit d'inactiver les cphalosporines* les plus rcentes(5), soit d'tre rfractaire l'action des
inhibiteurs de pnicillinases(6). Ainsi, le plus simple vnement gntique que l'on puisse concevoir dans ce
gne, et dont la survenue est inluctable une frquence relativement leve*, est capable de ruiner des dizaines
d'annes d'effort de l'industrie pharmaceutique et de confrer une rsistance efficace des antibiotiques
particulirement utiliss en clinique, notamment lors d'infections graves, et de loin les plus prescrits dans le
monde.

Le gne blatem-1 est rpandu chez les entrobactries* responsables notamment d'infections acquises l'hpital,
dites nosocomiales. Il est galement prsent chez environ la moiti des Escherichia coli , bactries commensales
du tube digestif qui, dans certaines conditions, peuvent provoquer des infections. Il est en revanche inexact de
prtendre, que ce gne est prsent chez 50 % des bactries pathognes du tube digestif (3) . Sa prvalence
chez les bactries pathognes responsables de diarrhe (salmonelles, shigelles, Escherichia coli producteurs de
certains facteurs de virulence et Vibrio cholerae ) varie selon les espces mais ne dpasse gure quelques pour-
cent. De plus, la production de pnicillinases n'a pas encore t dtecte en Europe chez l'entrocoque, bactrie
intestinale pathogne pour les sujets immunodprims, et que l'on isole de plus en plus frquemment en
pathologie humaine, alors que de telles souches ont dj t dcrites en Amrique du Nord et du Sud. Le gne
blatem-1 n'est donc ni anodin ni ubiquiste chez les bactries pathognes pour l'homme.

D'autres gnes bactriens ont t utiliss pour la modification gntique des plantes. Le gne aph3'-2, galement
connu sous la dsignation NPTII, est l'un des plus utiliss : on le retrouve par exemple dans la tomate de
Calgne, dans un colza de PGS et un colza de Calgne, etc. Il confre la rsistance certains antibiotiques de la
famille des aminosides, notamment la kanamycine et la nomycine. Du fait de leur toxicit, ces antibiotiques
sont peu utiliss en thrapeutique humaine. Mais l'instar du gne blatem-1 , une mutation ponctuelle dans ce
gne peut confrer la bactrie qui l'hberge la rsistance un driv de la kanamycine, l'amikacine(7). Cet
aminoside est largement utilis pour le traitement d'infections nosocomiales et connat de nouvelles indications
dans le traitement de la tuberculose : on sait que le bacille de Koch rsiste de plus en plus aux antibiotiques
habituellement utiliss contre lui.

Le gne aph3'-3 (8) , apparent au prcdent, spcifie quant lui, d'emble, la rsistance l'amikacine ; une
rsistance d'autant plus embarrassante qu'elle est indcelable par les techniques usuelles d'tude de la sensibilit
in vitro des bactries aux antibiotiques, utilises dans les laboratoires de bactriologie.

Un quatrime gne de rsistance utilis dans les constructions d'OGM, aad3''9 , utilis dans une autre varit de
coton de Monsanto, confre la rsistance la streptomycine et la spectinomycine. Si ce dernier antibiotique est
utilis exclusivement, et de moins en moins, dans le traitement de la gonorrhe, la streptomycine connat un
regain d'intrt en dpit d'effets secondaires indsirables (toxicit, douleur au point d'injection). Cet aminoside,
en effet, ne prsente pas, par opposition aux autres membres de cette famille, de rsistance croise avec la
gentamicine chez les bactries Gram positif* (staphylocoques, streptocoques et entrocoques). La rsistance
la gentamicine tant de plus en plus frquente chez les entrocoques, la streptomycine retrouve donc des
indications, en association avec les pnicillines, dans des infections svres comme l'endocardite (infection
bactrienne, essentiellement localise aux valves cardiaques)(9).
Le risque principal de la prsence de gnes de rsistance dans les plantes modifies gntiquement est de
contribuer la dissmination de la rsistance aux antibiotiques chez les bactries pathognes. Alors que les
transgnes d'intrt agricole (rsistance la toxine de Bacillus thuringiensis ou aux herbicides par exemple)
pourraient dissminer par voie sexue des espces proches, le transfert de la rsistance aux antibiotiques des
plantes vers les bactries pourrait rsulter d'un transfert horizontal d'ADN.

Les connaissances sur le transfert d'information gntique entre organismes trs loigns sur le plan
phylogntique sont rcentes et parcellaires ; notre savoir est en pleine volution. Si l'existence d'un flux de
gnes des cocci Gram positif vers les bacilles Gram ngatif(10) et l'existence d'un systme de transfert
gntique des bactries vers les plantes(11) dans les conditions naturelles sont connues depuis maintenant quinze
ans, la dmonstration au laboratoire d'un transfert d'ADN des bacilles Gram ngatif aux cocci Gram
positif(10), des bactries aux champignons(12) ou aux cellules de mammifres, y compris humaines(13), est
beaucoup plus rcente.

Il est dsormais avr que les transferts d'ADN peuvent concerner les rgnes les plus loigns. Le transfert
inverse, qui nous proccupe aujourd'hui, des eucaryotes aux procaryotes, est donc tout fait concevable et a t
propos dans quelques cas, notamment, de faon trs convaincante, pour le gne Pgi , codant une enzyme,
l'isomrase du glucose phosphate(14), et pour les gnes des domaines de type III des protines fibronectines(15).
Le transfert direct d'ADN des plantes aux bactries, qui n'a pas fait l'objet d'tudes extensives, n'a pas t
reproduit. Ce rsultat ngatif n'autorise pas considrer que la question de son ventuelle survenue n'a pas lieu
d'tre pose (16) . Il faut conserver constamment prsent l'esprit que les opportunits d'change de matriel
gntique entre organismes vivants dans la nature sont immenses et que la reconstitution de ces conditions au
laboratoire, et mme sur le terrain, peut tre plus difficile, voire impossible actuellement. Ceci souligne la faible
prdictibilit des expriences conduites au laboratoire.

Du fait des tapes requises, chacune ayant une probabilit de survenue faible, et de l'existence de la barrire
d'espce, la possibilit d'un transfert de gnes des plantes aux bactries, s'il existe, est, au moins en thorie,
probablement rare ; sauf si, comme nous allons le voir, on s'ingnie multiplier les constructions et les
circonstances qui le favorisent. Enfin, il est inluctable, contrairement ce qui a t prtendu(3), que la culture
intensive d'une plante hbergeant un gne de rsistance, aboutissant l'augmentation du nombre de copies de ce
gne dans la nature, favorise son volution et sa dissmination.

La dissmination horizontale d'information gntique implique trois tapes : le transfert de l'ADN, sa

stabilisation chez le nouvel hte (requise pour assurer sa transmission la descendance) et son expression.

Le retour d'un gne de rsistance aux antibiotiques d'une plante gntiquement modifie vers des bactries
pourrait se produire dans deux types de circonstances. La premire serait un transfert dans le tube digestif des
animaux ou de l'homme aux bactries commensales du tube digestif. La stabilit thermique de l'ADN est telle
que, dans un certain nombre de cas, les gnes de rsistance ne seront pas dnaturs par la prparation que
subissent les ali-ments avant ingestion. Dans l'cosystme intestinal, des bactries appartenant une multitude
d'espces, la plupart encore non dcrites, sont prsentes en nombre extrmement lev et dans des tats
physiologiques varis. Un certain nombre d'entre elles peut tre en tat de comptence, c'est--dire apte
incorporer l'ADN de la plante libr au cours de la digestion - notamment le fragment porteur du gne de
rsistance blatem-1 qui, compte tenu de sa petite taille (858 paires de bases), risque fort d'tre rest intact. De
plus, les bactries tant en contact trs intime les unes avec les autres, le tube digestif reprsente un cosystme
extrmement favorable aux changes gntiques entre bactries appartenant des genres diffrents(17). Dans ces
conditions, le gne de rsistance pourrait tre rcupr par transformation par une bactrie naturellement
comptente, transmis verticalement sa descendance lors des divisions cellulaires mais galement
horizontalement d'autres micro-organismes. L'tude de l'volution de la rsistance bactrienne aux
antibiotiques au cours des vingt dernires annes nous a enseign qu'tant donn la taille gigantesque des
populations concernes un vnement, mme extrmement rare, peut survenir pour peu que les condi-tions de
slection adquates soient prsentes(18).

De ce point de vue, l'utilisation massive des antibiotiques comme promoteurs de croissance dans l'alimentation
animale cre les conditions les plus favorables la slection du transfert puis la dissmination de la rsistance.
Des travaux rcents propos de l'utilisation d'antibiotiques comme supplments dans l'alimentation animale ont
dmontr la possibilit de colonisation du tube digestif de l'homme par les bactries d'origine animale et la
possibilit de transfert de gnes de rsistance aux antibiotiques de ces micro-organismes aux bactries
commensales de l'homme. Comme le mas transgnique est principalement destin l'alimentation animale, la
conjonction de l'utilisation des antibiotiques dans l'alimentation animale et des OGM ne peut qu'accrotre le
risque de dissmination.

La deuxime circonstance possible de retour des gnes est le passage aux bactries du sol d'ADN de plantes
transgniques en dcomposition, et notamment de leurs racines. Cette ventualit est favorise par le fait que
l'ADN, contrairement aux ides reues et vhicules encore rcemment(4), est une molcule extrmement stable
dans les sols et que certaines espces bactriennes telluriques peuvent spontanment et efficacement incorporer
de l'ADN(19). Or, ces micro-organismes, tels les Acinetobacter , font partie des bactries responsables
d'infections chez les malades immunodprims qui reprsentent une fraction croissante de la socit (patients
atteints du sida, prsentant une leucmie ou un cancer sous chimiothrapie, ayant subi une transplantation ou
hospitaliss en service de ranimation, personnes ges).

Outre le retour du gne, il faut, pour sa transmission la descendance et son expression continue, que l'ADN
entrant se stabilise dans la nouvelle cellule hte. Cette stabilisation s'effectue par recombinaison homologue
entre les squences flanquant le gne de rsistance et l'ADN de la bactrie rceptrice ; le procd est d'autant
plus efficace que les zones d'homologie interagissant sont tendues. Or, de nombreuses plantes transgniques, y
compris celles rcemment autorises la culture en France, rsultent de l'acquisition, par lectrotransformation
(application d'un champ lectrique) ou par biolistique (bombardement des cellules avec des microbilles
recouvertes du transgne), non seulement du gne de rsistance aux antibiotiques mais galement de larges
rgions flanquantes d'ADN bactrien, voire de la quasi-totalit du plasmide de dpart. Il s'agit donc de
constructions non seulement " inesthtiques(3) ", mais " gntiquement incorrectes " car rsultant d'approches
trs grossires. Lors de sa stabilisation, le gne peut s'intgrer soit dans le chromosome - il fait alors partie du
gnome de la bactrie et est transmis de faon stable sa prognie -, soit, et de faon plus proccupante, dans un
lment gntique mobile(2), tel un plasmide ou un transposon : il sera alors transmis non seulement
verticalement mais galement horizontalement, de bactrie bactrie, par conjugaison, mobilisation ou
transformation.

La troisime et dernire tape ncessaire au transfert consiste en l'expression du gne de rsistance chez la
bactrie hte. Pour les gnes de rsistance l'ampicilline, la streptomycine et la spectinomycine, rests dans
les constructions sous contrle d'un promoteur* bactrien, l'expression sera totale et immdiate chez les bactries
Gram ngatif. En ce qui concerne le gne de rsistance la kanamycine, la situation est plus complexe dans la
mesure o son expression est lie son intgration en aval d'un promoteur bactrien. Ceci est d au fait que les
constructions gntiques ont plac ce gne sous contrle d'un promoteur eucaryote qui est a priori non
fonctionnel chez les bactries. La probabilit d'expression du gne de rsistance la kanamycine y est donc
beaucoup plus faible que celle des autres gnes de rsistance.

Quand bien mme l'efficacit de transfert horizontal de gnes des plantes aux bactries est, trs
vraisemblablement, sans commune mesure avec celle des systmes d'changes gntiques dvelopps par les
bactries, il reste s'interroger.

Est-il opportun de laisser subsister dans les plantes transgniques des gnes qui leur sont inutiles et qui confrent
la rsistance des familles majeures d'antibiotiques ou des antibiotiques qui connaissent un regain d'indications
? De laisser des gnes qui font partie de constructions gntiques bcles qui accumulent les structures
favorables un retour ventuel vers les bactries ? Et ce, alors mme que l'on dispose de techniques autorisant
des constructions gntiquement correctes , parfaitement dfinies et faisant l'conomie de ces gnes de
rsistance.

Est-il opportun de ne pas appliquer le principe de prcaution en autori- sant la dissmination de constructions
de premire gnration , peut-tre utiles l'avancement des techniques de transgense, mais impropres
l'utilisation sur le terrain ? Et ce alors mme que le systme de biovigilance sera dans l'impossibilit d'valuer
l'impact de ces constructions sur la dissmination de la rsistance aux antibiotiques, l'origine d'un gne non
marqu tant totalement intraable dans les conditions naturelles(II) ?

Est-il opportun de crer un prcdent susceptible d'inciter les producteurs de semences ngliger les prcautions
les plus lmentaires ?

Tout ceci est-il opportun, alors que depuis plus de vingt ans aucune nouvelle famille d'antibiotiques n'a t
introduite en clinique ?
BACTRIOLOGIE