Culture in vitro des Vgtaux

Les premires tentatives de culture in vitro datent de la fin du 19me sicle. A l'poque l'un des
principaux problmes est la destruction des plantes par les virus.
Ce n'est qu'en 1950 que l'on dcouvre que les mristmes sont indemnes de virus. Utilisant cette
proprit, on met en culture in vitro des mristmes de dahlia, de pomme de terre.... Depuis, la culture
de mristmes a t applique la plupart des espces vgtales.

1. Bases biologiques de la culture in vitro

1.1. Croissance des vgtaux
a) la multiplication
La croissance des plantes se fait en plusieurs tapes qui permettent le dveloppement d'une graine en
une plante capable de se reproduire.
Pour cela, il faut d'abord une prolifration cellulaire par mitose qui se ralise au niveau de tissus
spcialiss : les mristmes (= zone de prolifration cellulaire).
Ils sont situs :
mristmes primaires: apex des racines, extrmit des tiges, bourgeons apicaux,
mristmes secondaires: dans les tissus plus anciens responsables de l'paississement des
tissus.
Une fois la croissance ralise, il y a diffrenciation de cellules qui serviront les unes la circulation des
sves (phlome, xylme), les autres la photosynthse (feuilles), la nutrition (racines). C'est donc un
phnomne complexe qui dpend de facteurs externes et internes.

b) les substances de croissance

Le dveloppement vgtal est rgul par des facteurs de croissance qui, par leur action distance du
lieu de production sont appels PHYTOHORMONES. Ces substances peuvent agir en synergie ou en
antagonisme. Les principales hormones vgtales sont :
les auxines : cf. cours sur les hormones.
les gibbrellines : elles sont constitues par un ensemble de composs drivs des terpnes.
Elles activent l'allongement des entre-nuds par longation et prolifration cellulaire.
Elles favorisent la croissance des feuilles et lvent la dormance.
les cytokinines : elles drivent de l'adnine et sont synthtises par l'apex et les racines.
Elles favorisent les divisions cellulaires.
autres hormones : cf doc. sur les hormones.

c) effets biologiques des doses hormones

Au cours des cultures in vitro, deux hormones sont utilises : l'auxine et la BAP (cytokinine).
si auxine / BAP 1 : croissance importante du cal cellulaire.
si auxine / BAP >> 1 : croissance plutt des racines.
si auxine / BAP << 1 : croissance plutt des bourgeons et des feuilles.

1.2. Application la culture in vitro

a) micropropagation ou multiplication vgtative
C'est une culture de mristmes situs au niveau des tiges, des racines de fragments de feuilles, ... etc.
La multiplication se produit et il y a DEDIFFERENCIAT1ON des cellules : les cellules redeviennent
totipotentes et rgnreront une plante entire.

Chronologie de la mthode :
1) mise en culture de l'explant.
2) formation d'un cal ( = amas de cellules ddiffrencies en division),
3) multiplication avec apparition de bourgeon.
4) chaque bourgeon est repiqu sur un milieu de propagation.
5) les bourgeons redonnent des plantes.
Cette mthode prsente les avantages suivant :

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 taux de multiplication trs lev,
possibilit de propagation de plantes rfractaires au bouturage,
multiplication durant toute l'anne,
obtention de plants dpourvus de virus,
constitution de collection de pieds mres.
Quelques limites sont signaler : risque de mutation au stade de formation du cal, difficult ou
impossibilit de mettre au point un milieu de culture adapt aux plantes multiplier.

La micropropagation connat beaucoup d'applications :

production grande chelle de plante pour les fleuristes (Saint Paulia, Phylodendron, rosier nain,
Chrysenthme),
culture d'arbres prcieux (noyer, merisier) ou de reboisement (pin),
culture de plantes ayant des proprits pharmacologiques (production de mdicaments).

b) embryogense ou culture d'embryons

Chronologie de la mthode :
1) mise en culture d'un organe et obtention d'un cal.
2) dissociation des cellules du cal en une suspension cellulaire.
Dans certaines conditions les cellules redonnent des cals avec un mristme caulinaire et un mristme
racinaire appels embryon somatiques.

c) haplomthode
Cette mthode consiste mettre en culture des gamtes mles ou femelles afin d'obtenir une plante
gnome haplode. Puis ces plantes sont traites chimiquement afin de rcuprer la diplodie. On
fabrique ainsi des plante homozygotes. Ce procd est intressant pour l'amlioration des espces et
des varits.

d) culture de protoplaste
Un protoplaste est par dfinition une cellule vgtale ayant perdu sa paroi et donc de forme sphrique. Il
cultive en milieu liquide.
La culture de protoplastes permet d'introduire facilement de nouveaux gnes dans le gnome de la
plante. On obtient des plantes transformes.

2. Aspect technique de la culture vgtale

Quelque soit la technique, la culture in vitro requiert des conditions de culture prcises.

2.1. Milieu de culture

II existe pour chaque espce vgtale 3 milieux :
- un milieu d'activation,
- un milieu de multiplication,
- un milieu d'enracinement.
Tous ces milieux sont constitus de sels minraux, de substances organiques de phytohormones
et d'extraits naturels ( lait de coco, jus de fruit, hydrolyst de casine).

Pour la plupart des plantes suprieures les sels minraux sont de 2 types :
- les macro lments (N, P, K, S, Mg et Ca),
- les micro lments ou oligo-lments (B, Mn, Zn, Cu, Ni, Co, Mo, Al, I, Fe). Ces derniers n'en
sont pas moins indispensables, c'est par exemple le cas de fer sans lequel on n'obtient pas de
croissance.
De nombreuses formulations ont t proposes et les plus utilises sont celles de MURASHIGE et
SKOOG, GAMBORG, KNOP, WHITE et GAUTHERET (cf tableau 1).
L'quilibre minral mis au point en 1962 par MURASHIGE et SKOOG est largement rpandu. Dfini
pour des travaux sur la croissance de cals de tabac, il donne de bons rsultats pour beaucoup de
cultures mais il n'est pas universel.

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 2.2. Environnement
a) besoin de lumire
Chez les plantes cultives in vitro, la photosynthse n'est pas une activit ncessaire puisque l'nergie
est fournie par les glucides du milieu. Cependant, mme rduite la photosynthse persiste dans les
tissus. De plus la lumire est indispensable au dclenchement et au bon droulement de certains
processus morphogntiques : ncessit de jours longs pour obtenir des boutons floraux par ex.
La puissance lumineuse fournir dpend de la dure de l'clairement et de la qualit spectrale de la
lumire reue par la culture. On exprime l'intensit lumineuse en W.m -2, intensit mesure au niveau de
la culture. On obtient gnralement 100 150 W.m-2 pour des tubes fluorescents placs 20cm au
dessus des rcipients de culture.

b) rle de la temprature
La temprature est gnralement rgule 20/25C en continu. Il ne faut pas ngliger que la
temprature dans les flacons de cultures peut tre suprieure de 2 4C la temprature de la pice
cause de l'clairage.

c) hygromtrie
Elle doit atteindre les 100% d'humidit relative dans les flacons. Cependant, il faut veiller ne pas noyer
les explants par un excs de condensation la surface du milieu.

d) strilit
Le propre de la culture vgtale est qu'il s'coule un laps de temps important entre les repiquages
(jusqu' 3 mois). Comme les milieux sont riches et les conditions de cultures chaudes et humides, toutes
les conditions d'un dveloppement bactrien ou fongique sont runies. Les causes d'infection sont
nombreuses. Il faut donc manipuler dans des conditions d'asepsie rigoureuses :
- matriels passs l'alcool ou flambs,
- dsinfection des plantes la Javel puis rinage l'eau distille avant l'extraction de l'explant.

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Les cinq familles d'hormones vgtales
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