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1. OBJETIVO
Este mtodo es utilizado para estimar la densidad de bacterias del grupo coliformes y conocer la
calidad sanitaria en aguas crudas

2. CAMPO DE APLICACIN Y ALCANCE

Este procedimiento se aplica a aguas crudas y agua de mar

3. FUNDAMENTO
Los mtodos utilizados en la determinacin de E. coli, coliformes totales y coliformes fecales
como microorganismos indicadores de la calidad sanitaria de agua, se basan en la fermentacin
de la lactosa. El mtodo de nmero ms probable NMP, es un mtodo estadstico, compuesto
por una etapa presuntiva y confirmativa. El ensayo consiste en sembrar diluciones seriadas de la
muestra en medios lquidos. Basndose en la combinacin de tubos positivos se puede estimar
el nmero de microorganismos presentes con el uso de la tabla estadstica aportada por la
referencia

4. REFERENCIAS
4.1 Standard Methods for the Examination of Water and Wastewater. 21 Ed.2005.
Captulo 9. 9221 B y 9221 E.1 pgina 9-49, 9-50 y 9-51.

5. TERMINOLOGA
5.1 Grupo coliformes
El grupo coliformes incluye bacilos gram negativos, aerbios y anaerbios facultativos,
no esporulados, que fermentan la lactosa formando cido y gas dentro de 48 hrs.a 35C.
Este grupo incluye a los gneros: Escherichia, Citrobacter, Klebsiella y Enterobacter.

5.2 Grupo coliformes fecales

Coliformes fecales se definen como bacilos gram negativos aerbios y anaerbios
facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa formando cido y gas dentro de
24 hrs. a 44,5 0,2C.
En la actualidad se utiliza el grupo coliformes fecales, especialmente para calificar
sanitariamente la calidad del agua.
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6. MATERIALES, INSUMOS Y EQUIPOS

6.1 EQUIPOS
6.1.1 Incubadora a 35 0,5C
6.1.2 Bao de agua termorregulado con agitacin a 44,5 0,2 C
6.1.3 Termmetros calibrados con graduaciones de 0,1C

6.2 CEPAS CONTROL

6.2.1 Control positivo :cepa de Escherichia coli ATCC 25922
6.2.2 Control negativo :cepa de Staphylococcus aureus. ATCC 6538
6.2.3 Control negativo coliformes fecales: cepa Enterobacter aerogenes ATCC 13048.

6.3 MATERIALES
6.3.1 Pipetas graduadas de 1, 5 y 10.
6.3.2 Tubos o botellas de dilucin, de vidrio borosilicato con tapas hermticas.
6.3.3 Tubos de fermentacin de 18 x 180 mm y 16 x 160 mm
6.3.4 Asa de 3 mm de dimetro.
6.3.5 Propipeta

6.4 MEDIOS DE CULTIVO Y REACTIVOS

6.4.1 Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) doble concentracin (10 mL) distribuidos en tubos
con tapa caps de 18x180mm o 16x160mm.
6.4.2 Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST) concentracin simple (10 mL) distribuidos en tubos
con tapa caps de 18x180 16x 160mm.
6.4.3 Caldo Bilis Verde Brillante 2% (BVB).
6.4.4 Caldo EC.
6.4.5 Agua peptonada 10 % o agua de dilucin buffer fosfato Butterfields con MgCl2.
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7. DESARROLLO
7.1 TEST PRESUNTIVO
En el test Presuntivo se utiliza caldo LST con tubos de fermentacin y como diluyente,
agua de dilucin buffer fosfato Butterfields estril.

7.1.1 Previo a la inoculacin, la muestra y diluciones, deben agitarse vigorosamente 25 veces.

Mezclar por agitacin suave las porciones de muestra en el medio.
7.1.2 Inocular 5 tubos de caldo LST doble concentracin con 10 mL de muestra cada tubo.
7.1.3 Inocular 5 tubos de caldo LST concentracin simple con 1 mL de muestra cada tubo.
7.1.4 Transferir 1 mL de muestra a un tubo que contenga 9 mL de diluyente para obtener la
dilucin 1:10.
7.1.5 Inocular 5 tubos de caldo LST concentracin simple con 1 mL de la dilucin 1:10.
7.1.6 Transferir 1 mL de muestra en dilucin 1:10 a un tubo que contenga 9 mL de diluyente
para obtener la dilucin 1:100.
7.1.7 Inocular 5 tubos de caldo LST concentracin simple con 1 mL de la dilucin 1:100.
7.1.8 Incluir como control positivo una cepa de Escherichia coli y como control negativo una
cepa de Staphylococcus aureus. Incluir tubos de medios de cultivo sin inocular para
controlar la esterilidad de los medios de cultivo y placas Petri abiertas y cerradas para
control de ambiente.
7.1.9 Agitar la gradilla suavemente para mezclar la muestra y el medio de cultivo e incubar
los tubos inoculados a 35 0,5 C y observar la formacin de gas en cada tubo a las 24
2 hrs.
7.1.10 Transferir todos los tubos que resulten positivos, para realizar el test confirmativo. Los
tubos que no presentan gas, se incuban nuevamente y se observa la formacin de gas a
las 48 3 hrs., y se transfieren si resultan positivos.
7.1.11 Anotar la presencia o ausencia de gas en cada tubo en el registro RG-712.00-025. La
formacin de gas se reconoce por la aparicin de burbujas en la campana Durham y
significa un test presuntivo positivo para coliformes. La ausencia de gas al trmino de
48 3 hrs de incubacin, significa un test presuntivo negativo para coliformes.
Anotar los cultivos control en el registro RG-712.00-004, el control de esterilidad de
los medios en el registro RG-712.00-006 y los controles ambiente en el registro RG-
712.00-050.
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7.2 TEST CONFIRMATIVO PARA COLIFORMES Y COLIFORMES FECALES

Todos los tubos de fermentacin del test Presuntivo, que muestren formacin de gas al
trmino de las 24 o 48 hrs. de incubacin deben someterse a las pruebas confirmativas.
Cuando aparece una activa fermentacin en los tubos, antes de completar el perodo de
24 hrs., es aconsejable transferirlos sin esperar el tiempo total de incubacin.

7.2.1 Mezclar el tubo de fermentacin del test presuntivo por agitacin suave y transferir con
un asa de 3 mm. de dimetro o un stick de madera, un inculo de cultivo viable a tubos
de caldo EC conteniendo tubos de fermentacin. Colocar los tubos EC en el bao
termorregulado dentro de 30 minutos despus de la inoculacin.
7.2.2 Simultneamente transferir una asada de cultivo a tubos de fermentacin conteniendo
caldo BVB para confirmar coliformes.

Cuando se transfiere con asa, se deben tener las precauciones de: inocular primero el
caldo EC y luego el caldo BVB y de enfriar bien el asa para transferir un inculo de
cultivo viable. Incluir un tubo de caldo bilis verde brillante con una cepa de
Escherichia coli como control positivo y otro con una cepa de Staphylococcus aureus
como control negativo.

7.2.3 Incubar los tubos de caldo EC inoculados, en un bao de agua cubierto a 44,5 0,2 C
por 24 2 hrs. El nivel de agua en el bao debe sobrepasar el nivel de caldo dentro de
los tubos.
7.2.4 Incluir un tubo de caldo EC con una cepa de Escherichia coli como control positivo de
y otro con una cepa de cepa Enterobacter aerogenes como control negativo.
7.2.5 Los tubos de caldo BVB inoculados se incuban a 35 0,5 C, por 24 a 48 horas.
7.2.6 Observar la formacin de gas en los tubos de caldo EC y los tubos de caldo BVB, al
trmino de los perodos de incubacin correspondientes. La presencia de gas en los
tubos de fermentacin de caldo BVB, significa un test positivo para coliformes,
ausencia de gas indica test negativo.
La presencia de gas en los tubos de fermentacin de caldo EC, significa un test positivo
para coliformes fecales, ausencia de gas indica test negativo.

7.2.7 Anotar los resultados de las muestras en el registro RG-712.00-025 y de las cepas
control en el registro RG-712.00-004 y RG-712.00-005.
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7.3 CALCULO
7.3.1 La combinacin de tubos positivos obtenidos se refiere a la Tabla NMP, y los
resultados se expresan como NMP por 100 de muestra.
7.3.2 Si en vez de las porciones de muestra de 10-1-0,1, se utiliza 1-0,1-0,01, se lee el
resultado en la Tabla NMP y se multiplica por 10, y si las porciones de muestra son 0,1-
0,01-0,001, el resultado de la Tabla NMP se multiplica por 100 y as sucesivamente si
se utilizan diluciones ms altas.
7.3.3 Cuando se utilizan ms de 3 series de diluciones decimales, se considera el resultado de
3 series, eligiendo la dilucin ms alta que da resultados positivos en los 5 tubos
ensayados y las dos diluciones siguientes. Utilizando el resultado de estas 3 series, leer
en la Tabla de NMP (Ver Ejemplos)

Ejemplos de determinacin de NMP en series de 5 tubos

Ejemplo Cantidad muestra (.) Lectura NMP
10 1 0,1 0,01 0,001
a 5/5 5/5 5/5 2/5 0/5 5 2 0 4900
b 5/5 5/5 4/5 2/5 0/5 5 4 2 2200
c 0/5 1/5 0/5 0/5 0/5 0 1 0 1,8 2
d 5/5 5/5 3/5 1/5 1/5 5 3 2 1400
e 5/5 5/5 5/5 3/5 2/5 5 3 2 14000
f 5/5 5/5 5/5 5/5 0/5 5 5 0 24000
g 0/5 0/5 0/5 0 0 0 < 1,8 < 2
h 5/5 5/5 5/5 5/5 5/5 5 5 5 >160000
Nmero de tubos positivos / nmero de tubos inoculados
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7.4 EXPRESION DE RESULTADOS

Los resultados se expresan como NMP/100 mL de muestra.

8. REGISTROS
8.1 Registro cepas control de incubadoras
8.2 Registro cepas control de baos de agua para anlisis de coliformes fecales
8.3 Registro control de esterilidad de medios de cultivo utilizados en el anlisis de
coliformes, coliformes fecales y Escherichia coli
8.4 Registro control de ambiente laboratorio Enterobacterias
8.5 Registro de resultados anlisis de coliformes y coliformes fecales en muestras de
agua.

9. ANEXOS
No Aplica