Investigacin de un brote de intoxicacin alimentaria por estafilococos en un postre de

Chantilly, en Umbra (Italia)

Abstracto

El 28 de agosto de 2015, se produjo un brote de intoxicacin por estafilococos en Umbria,

Italia, afectando a 24 de los 42 clientes que cenaban en un restaurante local. Alrededor de 3
horas despus de ingerir una variedad de alimentos, los clientes manifestaron sntomas
gastrointestinales. En el plazo de 24 horas de la notificacin del departamento de urgencias del
hospital, los Inspectores Sanitarios de la Unidad de Salud Pblica local realizaron una
investigacin epidemiolgica. Se realiz un estudio retrospectivo de cohorte entre los clientes.
Se recogieron muestras alimentarias y ambientales. Debido al rpido inicio de los sntomas
(vmitos, diarrea), se analizaron las muestras de alimentos para detectar la presencia de
bacterias toxignicas y sus toxinas; se recogieron hisopados nasofarngeos de los camareros y
cocineros. Entre los alimentos probados, slo se detectaron altos niveles de estafilococos
coagulasa positivos (CPS) (3.4 108 UFC / g) y enterotoxinas estafiloccicas (2.12 ng SEA / g)
en el postre de Chantilly. CPS tambin se detectaron en la superficie de una mesa de la cocina
(10 UFC / swab), y cinco manipuladores de alimentos fueron positivos para Staphylococcus
aureus. En total, se recuperaron cinco aislamientos enterotoxignicos de S. aureus de tres
manipuladores de alimentos, una superficie de cocina y el postre de crema Chantilly. Estos
aislados se caracterizaron adicionalmente por biotipado, electroforesis en gel de campo
pulsado y ensayos de multiplex de reaccin en cadena de la polimerasa para la deteccin de
once genes codificantes de enterotoxina (seb, se, se, sei, sej, sep, y ser) y tres genes implicados
en la resistencia a los antibiticos (mecA, mecC y mupA). Tres cepas positivas para el mar,
aisladas del postre, el medio ambiente y uno de los cocineros, tenan el mismo perfil de
electroforesis en gel de campo pulsado y pertenecan al biotipo humano, lo que sugiere que la
contaminacin causante del brote probablemente se origin en un manipulador de alimentos.
Adems, el almacenamiento inadecuado del postre, a temperatura ambiente durante
aproximadamente 5 horas, permiti el crecimiento microbiano y la produccin de SEA. Este
estudio subraya la importancia de las pruebas de laboratorio y los datos epidemiolgicos para
la investigacin de brotes.

Introduccin

Los brotes oodborne (FBOs) debido a las toxinas bacterianas son una de las enfermedades ms
comunes conectadas con

enfermedad alimentaria.

De acuerdo con los datos publicados por la Autoridad Europea de Seguridad Alimentaria y el
Centro Europeo para el Control de Enfermedades (EFSA y ECDC, 2016), las toxinas bacterianas
eran responsables del 19,5% de todas las OBF en 2015 y representaban el tercer agente causal
la Unin Europea. En 2015, 16 Estados miembros (EM) notificaron 434 brotes de intoxicacin
alimentaria causados por toxinas estafiloccicas. Esto representa el 9,9% de todos los brotes,
un pequeo aumento en comparacin con 2014.

Las enterotoxinas estafiloccicas (SE) son producidas por cepas de estafilococos coagulasa
positivos (CPS), principalmente por Staphylococcus aureus, que, como bacterias
omnipresentes, pueden colonizar la piel y la mucosa humanas. Hasta la fecha, se han
publicado 23 SE en la literatura (Ono et al., 2015). La presencia de una cepa enterotoxignica
de S. aureus en el tracto nasofarngeo u orofarngeo de un manipulador de alimentos est
frecuentemente asociada con FBOs (Todd et al., 2008, Gallina et al., 2013) . La intoxicacin
alimentaria se produce despus de la ingestin de alimentos contaminados con enterotoxinas
producidas por

S. aureus; el inicio de los sntomas ocurre unas pocas horas (2-8) despus de la ingestin del
alimento contaminado y la preparacin inadecuada, la manipulacin o el almacenamiento
(Schelin et al., 2011). Las nuseas, vmitos y diarrea son los sntomas ms relevantes; la
gravedad de la enfermedad depende de la cantidad de toxina ingerida y la salud del
consumidor. En la mayora de los casos despus de 24 h, hay remisin de los sntomas; slo
unos pocos casos de intoxicacin, que oscilan entre 0,03% y 4,4%, son mortales en nios y en
personas de edad avanzada (Doyle et al., 2007).

S. aureus puede frecuentemente colonizar la piel y la mucosa de un alto porcentaje de seres

humanos sanos: alrededor del 50% de los adultos sanos pueden propagar S. aureus a travs de
sus mucosas nasales (Kluytmans y Wertheim, 2005). Un estudio llevado a cabo por Lues y Van
Tonder (2007) indic que

S. aureus estaba presente en el 88% de las manos y el 48% de los delantales de los
manipuladores de alimentos que trabajan en las secciones de delicatessen de una tienda
minorista. Estos datos indican que la contaminacin humana con cepas enterotoxignicas
durante la preparacin y procesamiento de alimentos desempea un papel importante como
fuente de contaminacin de los alimentos.

En este estudio se describe una FBO debido a SEs que ocurrieron en una cena en el restaurante
de un equipo deportivo e identificar la fuente de contaminacin como uno de los trabajadores
del restaurante que llevan la misma cepa enterotoxgena de S. aureus que la que se encuentra
en los alimentos, positivo para SE tipo A.

Materiales y mtodos

Fondo

El 28 de agosto de 2015, la Unidad de Salud Pblica local fue notificada por el servicio de
urgencias del hospital de Gubbio, Perugia (Italia), de una sospechosa FBO. El da anterior, 24
miembros de un equipo deportivo fueron ingresados en la sala de emergencias con quejas de
dolor abdominal, nuseas, emesis y diarrea; todos los pacientes reportaron haber cenado en el
mismo restaurante local 3 horas antes. No coman juntos en ningn otro restaurante el da en
que se enfermaron. Once de estos pacientes necesitaban atencin mdica. De 8.30 a 9.30
p.m., se sirvieron un total de 42 comidas y a las 11.30 p.m., el primer grupo de clientes
comenz a manifestar sntomas gastrointestinales. Se realizaron anlisis microbiolgicos de
muestras biolgicas, ambientales y alimentarias, y se realiz una investigacin epidemiolgica
para caracterizar el brote, identificar la fuente probable e implementar medidas de control.
Investigacin epidemiolgica

Despus de la notificacin, los Inspectores Sanitarios de la Unidad de Salud Pblica local

realizaron una investigacin epidemiolgica del posible brote. Con base en la informacin
obtenida de los pacientes, los Inspectores plantearon la hiptesis de que el brote podra estar
asociado con el consumo de un plato especfico de comida servido durante la cena. Para
probar esta hiptesis, se realiz un estudio retrospectivo de cohorte. Se compararon las
variables cualitativas de exposicin (comidas consumidas) entre las personas enfermas y las
que no coman en el restaurante. Se pidi a los 42 clientes que rellenaran un cuestionario para
recopilar informacin sobre la exposicin de los alimentos y los principales sntomas. Se
calcularon las tasas de ataque especfico de alimento (AR) y las relaciones de riesgo (RR) con
intervalos de confianza (95%). p-Valores <0,05 se consideraron significativos. Adems, los
manipuladores de alimentos que trabajaban en el restaurante fueron entrevistados por los
Inspectores Sanitarios sobre los mtodos de preparacin de las comidas servidas a los clientes.

Investigacin de laboratorio

Funcionarios de la Unidad de Salud local realizaron investigaciones medioambientales en el

restaurante al da siguiente de la cena. Se recogieron informacin detallada sobre la comida
servida, los procedimientos de preparacin y los manipuladores de alimentos. Los camareros y
cocineros se sometieron a recoleccin de hisopo nasofarngeo. Adems, se recolectaron y
transportaron tres muestras ambientales y cuatro de alimentos en refrigeracin al Istituto
Zooprofilattico Sperimentale de Umbria y Marche (IZ-SUM), para anlisis microbiolgicos.

Las muestras de comida consistieron en sobras refrigeradas de dos salsas de pasta diferentes
(una hecha de tomates, championes y carne y una hecha de queso de leche de oveja), un
plato tradicional italiano (sopa de tomate con cerdo y frijoles) y un postre (crema Chantilly) .
No se dispone de informacin sobre el posible proceso de pasteurizacin del queso de oveja
utilizado para la salsa. Debido a la rpida aparicin de los sntomas, se analizaron las muestras
de alimentos para determinar la presencia de bacterias toxignicas y sus toxinas, que suelen
estar implicadas en la intoxicacin alimentaria (EFSA y ECDC, 2016).

Enumeracin e identificacin bacteriana

- Los especmenes de alimentos se sometieron a enumeracin de Bacillus cereus y CPS

utilizando las normas UNI EN ISO 7932: 2005 (UNI, 2005) y UNI EN ISO 6888-2: 2004 (UNI,
2004),

respectivamente. La enumeracin de Clostridium perfringens se realiz con un mtodo

interno, utilizando medio de agar de tripsina-sulfito-cicloserina (TSC, Oxoid, Basingstoke,
United

Reino) para el crecimiento anaerobio de bacterias reductoras de sulfito y los sistemas API
(bioMe'rieux) para identificar los aislamientos.

- Las muestras ambientales incluyeron tres hisopos recogidos de las superficies de dos mesas
de cocina y de un estante de sala fra, respectivamente. Estas muestras fueron investigadas
slo para la enumeracin de CPS de acuerdo con el protocolo UNI EN ISO 6888-2: 2004.

- Se analizaron las cepas CPS aisladas de muestras alimentarias y ambientales para determinar
la presencia de S. aureus, inoculndolas en placas de agar de sangre de oveja al 5% (Oxoid) e
identificndolas utilizando sistemas API (BioMe'rieux). Los hisopos hu- manos se colocaron en
placas de agar de sal de manitol (MSA, Oxoid). Despus de 18-24 horas de incubacin, las
colonias amarillas tpicas de MSA se subcultivaron en placas de agar de sangre de oveja al 5%,
y se identificaron aislados presuntivos de S. aureus usando las pruebas de catalasa y coagulasa
(Han et al., 2007).

Anlisis de la reaccin en cadena de la polimerasa de cepas de S. aureus

- Se detectaron aislamientos de diferentes orgenes (alimentos, medio ambiente y seres

humanos) como S. aureus utilizando un ensayo multiplex de reaccin en cadena de la
polimerasa (PCR) (Zhang et al., 2004) que permite la deteccin simultnea de 16S rRNA
(gnero especfico) y nuc (especies especficas). En este ensayo se dirigen dos genes
adicionales, esto es, mecA (resistencia a la meticilina) y mupA (resistencia a la mupirocina)

- Todas las cepas aisladas de S. aureus fueron ensayadas para los genes que codifican SEs,
utilizando dos ensayos de multiplex PCR, de acuerdo con el mtodo EURL para CPS (De Buyser
et al., 2009a). Adems, estas cepas se caracterizaron tambin por la presencia de mecA, mecC
(Zhang et al., 2005) y los genes de leucocidina (PVL) de Panton-Valentine, LukS-PV / lukF-PV
(Lina et al., 1999) y fueron biotipado (Devriese, 1984, Ke'rouanton et al., 2007).

Electroforesis en gel de campo pulsado

La caracterizacin molecular adicional de los aislamientos de S. aureus se realiz con

electroforesis en gel de campo pulsado (PFGE), de acuerdo con el mtodo EURL para CPS
(Marault et al., 2011). Los fragmentos de restriccin se separaron usando el CHEF-

Mapper (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA). El gel se ti con tincin SYBR Safe ADN
(Invitrogen, Carlsbad, CA), y las bandas de ADN fueron

visualizado con el transiluminador UVIsave (UVItec, Cambridge, Reino Unido). Las imgenes
en gel fueron enviadas al Laboratorio Nacional Italiano de Referencia para CPS (It-NLR,

Turn) y se analiz con el software BioNumerics (Applied-Maths, Sint-Martens-Latem, Blgica).

Ensayo cualitativo (mtodo de cribado europeo) para la deteccin del SE

Las SE se detectaron slo en la crema de Chantilly, donde se detectaron altos niveles de CPS
utilizando el mtodo europeo de screening (ESM) (Ostyn et al., 2016). Brevemente, la muestra
se someti primero a una etapa de extraccin de protena seguida de la concentracin de
dilisis. La deteccin se realiz

a partir del extracto de protena utilizando los kits validados, VIDAS SET2 (bioMe'rieux, Marcy
l'E'toile, Francia) y RIDASC-

REEN SET Total (R-Biopharm AG, Darmstadt, Alemania) (Ostyn et al., 2011), que pueden
detectar simultneamente SEA a SEE en matrices alimentarias sin diferenciar las cinco SE
(Hennekinne et al., 2007; Nia et al. , 2016).
Ensayo inmunoenzimtico cuantitativo para la cuantificacin SE

La identificacin y cuantificacin del tipo de enterotoxina presente en la crema de Chantilly se

realiz utilizando un ensayo inmunoenzimtico inmunoenzimtico (ELISA). Brevemente, la
cuantificacin de SE se realiz utilizando un ELISA de tipo sndwich indirecto cuantitativo. Se
utiliz un tipo de sndwich nico para SEB, mientras que se usaron tipos de ELISA de doble
sndwich para SEA, SEC y SED. Se usaron anticuerpos especficos disponibles comercialmente
(Toxin Technology, Sarasota, FL) como recubrimiento (ref SLAI101, SLBI 202, SLCI 111, SLDI
303) y anticuerpos de sondeo (ref LAI101, LBC 202, LCI 111 y LDI 303). La presencia de entero
toxinas se revel mediante inmunoglobulinas acopladas a peroxidasa de rbano (anticuerpos
de cabra anti-conejo acoplados a peroxidasa) y determinadas mediante una medicin
colorimtrica a 405/630 nm tras la adicin del sustrato ABTS-H2O2 (KPL).

Las curvas de calibracin se generaron a partir de soluciones de reserva SE compradas de Toxin

Technology (lote 120794A para SEA, 61499B1 para SEB, 113094C2 para SEC y 12802D

para SED) y se construyeron a partir de los valores de absorbancia cruda (AU) obtenidos para la
gama de patrones ensayados por duplicado. Para cada anlisis, se prepararon controles
internos positivos y negativos a partir de extracto de leche y se analizaron de la misma manera
que la muestra.

Los lmites de cuantificacin (LOQ) se estimaron de la siguiente manera:

0.048 ng / mL para SEA, 0.204 ng / mL para SEB, 0.044 ng / mL para SEC y 0.374 ng / mL para
SED. Este mtodo se utiliz en el contexto de varios estudios sobre la deteccin de SE en los
alimentos.

Resultados

Investigacin epidemiolgica

Los 42 clientes del restaurante que asistieron a la cena rellenaron el cuestionario (tasa de
respuesta, 100%). Los resultados del estudio de cohortes retrospectivo (Tabla 1) implicaron la
crema de Chantilly como el vehculo ms probable de intoxicacin alimentaria. El AR de los
clientes que comieron el postre fue del 63% y el RR fue de 2,2. Aunque los intervalos de
confianza demostraron que los valores de RR no fueron estadsticamente significativos para
ninguno de los alimentos servidos, estos datos son an sugerentes del papel central del postre
en la intoxicacin alimentaria (Figura 1). La crema Chantilly no era un producto alimentario
comercialmente preparado, pero fue hecho por el restaurante cocina y sirvi como postre slo
a los clientes. La informacin obtenida de la entrevista con los trabajadores de la cocina revel
un almacenamiento inadecuado de alimentos; en particular, la crema de Chantilly no se
refriger despus de la preparacin, sino que se mantuvo a temperatura ambiente (que
aument por encima de 25 C) durante aproximadamente 5 h, permitiendo as el crecimiento
microbiano y la produccin de SE. Por otra parte, la inspeccin de la inocuidad de los alimentos
en el restaurante revel una mala aplicacin de las prcticas bsicas de higiene:
almacenamiento inadecuado de alimentos crudos y cocidos en los refrigeradores y ausencia de
separacin entre reas de cocina sucias y limpias, lo que podra conducir a contaminacin
microbiana cruzada.
Investigacin de laboratorio

Los resultados microbiolgicos sobre los alimentos y los hisopos ambientales se muestran en la
Tabla 2. Entre las muestras de alimentos probadas, la contaminacin por CPS slo se detect
en el postre de Chantilly (3,4 a 108 UFC / g). Adems, se obtuvieron resultados positivos
mediante la deteccin cualitativa de inmunoensayos (ensayos VIDAS SET2 y RIDASCREEN SET
Total), indicando la presencia de al menos uno de los cinco siguientes

toxinas: SEA, SEB, SEC, SED y SEE (Tabla 3). El uso del mtodo ELISA cuantitativo basado en
anticuerpos especficos para SE confirm la contaminacin de la muestra (ausencia de
reacciones cruzadas o efecto de interferencia) y la presencia de SEA a una concentracin de
2.12 ng / g. Los CPS tambin fueron detectados en la superficie de una mesa de la cocina (10
UFC / hisopo).

En total, se aislaron siete cepas de S. aureus: una de la muestra de postre, una de la superficie
de la mesa y cinco de la mucosa nasofarngea de los manipuladores de alimentos sanos. Las
muestras de nafaringe de cinco manipuladores de alimentos resultaron positivas para CPS y
fueron confirmadas como S. aureus. Se detectaron genes que codificaban SE en tres de cinco
aislados humanos: una cepa albergaba genes de mar, seg y sei, una cepa transportada seg, seh
y sei, y una slo era positiva al mar. Los aislamientos medioambientales y alimentarios
tambin fueron positivos slo para el gen marino. Adems, estas cepas positivas para el mar
obtenidas de las muestras humanas, ambientales y de alimentos pertenecan al biotipo
humano. Ninguna de las cepas alberg los genes pvl, mecA, mupA y mecC (Tabla 4).

Las cinco cepas de S. aureus que portaban los genes de enterotoxina fueron analizadas por
PFGE y todas mostraron bandas claras que permitieron la comparacin de perfiles de PFGE. Las
tres cepas que slo llevaban mar demostraron el mismo perfil de PFGE (coeficiente de
similitud del 100%) (Fig. 2).

Discusin

Este estudio subraya la importancia del uso combinado de anlisis microbiolgicos,

inmunolgicos y moleculares para apoyar los datos obtenidos de una investigacin
epidemiolgica. En particular, en nuestro estudio, los anlisis de laboratorio permitieron
identificar la fuente definitiva de intoxicacin alimentaria, a pesar de que los datos
epidemiolgicos del estudio de cohortes carecan de una fuerte significacin estadstica. De
hecho, los anlisis microbiolgicos demostraron la presencia de CPS en la crema de Chantilly,
el uso de PCR permiti la identificacin de

S. aureus portadoras del gen mar y los ensayos inmunoenzimticos mostraron la capacidad
toxinognica de las cepas en los alimentos y confirmaron la presencia del SEA de la toxina. Las
an- lisis microbiolgicas, moleculares e inmunoenzimticas estuvieron de acuerdo y la crema
de Chantilly y la toxina SEA podran ser incriminadas en esta FBO. Debe destacarse que el uso
tanto del ensayo de deteccin cualitativa (ESM) de las SE como del ELISA cuantitativo interno
(ELISA especfico) permiti descartar cualquier duda sobre la presencia del efecto de
interferencia.
En la literatura, el predominio de la EAE est bien documentado en diferentes pases. Un
estudio de 359 estafilococos de FBO, que ocurri en el Reino Unido entre 1969 y 1990, y 31
FBO estafiloccicos, que ocurrieron entre 1981 y 2002 en Francia, revel que> 70% de las
cepas aisladas de S. aureus produjeron EAE (Ke 'rouanton et al., 2007, Argud'n et al., 2010).
Sin embargo, durante la investigacin de FBO estafiloccicas, las concentraciones SE
raramente se midieron, lo que impidi el establecimiento de una respuesta a la dosis. En este
estudio, se pudo estimar una concentracin de la enterotoxina contaminante (es decir, SEA a
2,12 ng / g) utilizando el mtodo ELISA cuantitativo.

Utilizando un enfoque multiparamtrico para la investigacin de laboratorio, se pudo obtener

la identificacin del agente causal con evidencia fuerte. De hecho, los datos de la EFSA y de la
ECDC ponen de manifiesto la dificultad de obtener una fuerte evidencia epidemiolgica de los
brotes causados por las SE. En 2015, 16 EM reportaron 434 brotes transmitidos por alimentos
causados por toxinas estafiloccicas. Esto representa el 9,9% de todos los brotes, un pequeo
aumento en comparacin con 2014. En 95 brotes (6 de fuerte evidencia y 89 de baja
evidencia), se inform a un "manipulador de alimentos infectado" como factor contribuyente
(EFSA y ECDC, 2016).

Son raros los estudios de FBO en los que se aislaron cepas enterotoxignicas de pacientes,
alimentos y manipuladores de alimentos. La falta de datos completos sobre la epidemiologa
de los brotes de SE est potencialmente ligada a mltiples factores que pueden ocurrir durante
la recoleccin de muestras o anlisis de laboratorio (Hennekinne et al., 2012; Mossong et al.,
2015).

Aunque la presente investigacin careca de la recogida de muestras de heces y emesis de los

pacientes, debido al rpido alivio sintomtico tras el tratamiento mdico, la caracterizacin
molecular de los isole- ros de S. aureus de diferentes muestras puso de relieve la relacin
entre los seres humanos los transportistas, el medio ambiente y la contaminacin de los
alimentos. Adems, la informacin detallada recogida durante la inspeccin y los anlisis de
laboratorio demuestra cmo se produjo la contaminacin estafiloccica del postre y cuando se
produjo la SEA. Teniendo en cuenta que tres aislamientos de S. aureus de diferentes muestras
mostraron el mismo biotipo humano, el mismo patrn gentico y el mismo pulstipo, se puede
suponer que el portador humano representaba la fuente ms probable de esta FBO. La
contaminacin de los alimentos se produjo directamente durante el procesamiento de
alimentos o indirectamente a travs de la superficie de la mesa. El almacenamiento
inadecuado de alimentos en condiciones no refrigeradas fue la causa ms probable de
proliferacin de CPS y produccin de enterotoxina.

Conclusiones

Los resultados de este estudio indican que tanto los datos epidemiolgicos como la
investigacin de laboratorio juegan un papel importante en la elucidacin de las OBF. La
investigacin epidemiolgica inmediata y precisa de una FBO representa una herramienta til
para una rpida asociacin entre los informes de enfermedad y el consumo de un alimento
especfico, lo que conduce a anlisis de laboratorio especficos. La realizacin de estos anlisis
es de gran importancia para la identificacin de los contaminantes microbianos y su fuente,
como se ilustra en este estudio. En este estudio, tambin se proporcion informacin sobre la
concentracin de SE en los alimentos contaminados. Dichos datos siguen siendo escasos en la
literatura y son necesarios para determinar dosis txicas de SE que causan intoxicacin por
alimentos estafiloccicos.

Adems, este brote subraya la utilidad de cumplir con los principios fundamentales de Buenas
Prcticas de Higiene y Buenas Prcticas de Manufactura para prevenir las OBFs debido a las SE
(Gallina et al., 2013). Los manipuladores de alimentos deben estar debidamente capacitados
en procedimientos de higiene de los alimentos, comprender la importancia del saneamiento y
la limpieza del equipo de cocina y el mantenimiento de la cadena de fro durante la produccin
y el almacenamiento de los alimentos (Schmid et al.

Expresiones de gratitud

Los autores agradecen a todo el personal del Departamento de Prevencin de Higiene y

Nutricin de los Alimentos, USL Umbra1 por la asistencia tcnica, en particular al Dr. Giuseppe
Cistaro por su apoyo cientfico. Los autores agradecen a Viviana Bazzucchi y Valeria Scorpioni
(IZSUM) por la asistencia tcnica con anlisis microbiolgico y Sabine Messio (Anses) para la
asistencia tcnica con el anlisis SE.