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ISSN: 1794-1237
revista@eia.edu.co
Escuela de Ingeniera de Antioquia
Colombia
RESUMEN
Se utiliz un modelo cintico para estudiar la velocidad de reaccin en la hidrlisis de protenas de plasma
de bovino con alcalasa 2,4 L en un reactor batch. Se estudi la influencia de variables como la concentracin
inicial de sustrato y enzima sobre el grado de hidrlisis y se determinaron los parmetros cinticos de la ecuacin
de velocidad, analizando su relacin con las variables de trabajo. Se ajust un modelo cintico de orden cero y
desactivacin enzimtica por sustrato, de segundo orden, as como la relacin directa entre la fraccin enzima-
-sustrato y la tasa de formacin de productos de hidrlisis.
PALABRAS CLAVE: hidrolizados proteicos; hidrlisis enzimtica; cintica enzimtica; modelos bioqumicos.
* Ingeniero Agroindustrial, Universidad Popular del Cesar; Magster (c) en Ciencias Farmacuticas: Alimentos, Facultad
de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia. Medelln, Colombia. omfimo22@gmail.com
** Ingeniero Qumico, Universidad de Antioquia; Doctor en Biotecnologa, Universidad de Granada, Espaa. Docente
de Planta, Departamento de Alimentos, Facultad de Qumica Farmacutica, Universidad de Antioquia. Medelln,
Colombia. jedgar_4@yahoo.es
*** Ingeniero Mecnico, Universidad Industrial de Santander; Doctor en Ingeniera, Universidad Pontificia Bolivariana,
Sede Medelln. Docente, Universidad Popular del Cesar. Valledupar, Colombia. gailgutierrez@unicesar.edu.co
ABSTRACT
A kinetic model was used to study the reaction rate of hydrolysis of bovine plasma proteins and alcalase 2.4 L,
in a batch reactor. The influence of variables, such as the concentration of initial enzyme substrate and the degree
of hydrolysis was studied, and kinetic parameters of the rate equation were determined by analyzing its relationship
with the work variables. A zero-order kinetic model and enzyme deactivation by substrate was found, as well as the
direct relationship between the fraction of enzyme-substrate and the rate of formation of hydrolysis products.
KEY WORDS: protein hydrolysates; enzymatic hydrolysis; enzymatic kinetics; biochemical models.
RESUMO
Utilizou-se um modelo cintico para estudar a velocidade de reao na hidrlise de protenas de plasma
de bovino com alcalasa 2,4 L em um reator batch. Estudou-se a influncia de variveis como a concentrao
inicial de substrato e enzima sobre o grau de hidrlise e determinaram-se os parmetros cinticos da equao de
velocidade, analisando sua relao com as variveis de trabalho. Ajustou-se um modelo cintico de ordem zero
e desativao enzimtica por substrato, de segunda ordem, bem como a relao direta entre a frao enzima-
substrato e a taxa de formao de produtos de hidrlise.
PALAVRAS-CDIGO: hidrolisados proteicos; hidrlise enzimtica; cintica enzimtica; modelos bioqumicos.
En la hidrlisis de un enlace amido a pH alcalino, se siguen las siguientes etapas (Guadix, 2002):
3. RESULTADOS Y DISCUSIONES
1b)
3.1 Modelo cintico
Donde B = volumen consumido de base
Los resultados obtenidos al estudiar el com-
(en litros), Mp = masa de la protena (en kg),
portamiento del GH con respecto al tiempo, a
NB = normalidad de la base (eqv/L).
diferentes concentraciones iniciales de enzima y de
En 1b, es el grado de disociacin de los gru- protena, se muestran en las figuras 1 y 2, en las cuales
pos -NH2 (grupos aminos liberados en la reaccin). se puede observar que al principio de la reaccin el
Para la estimacin del promedio del grado de GH aumenta con el tiempo y luego tiende a valores
disociacin de los grupos -NH2 liberados en la reac- constantes, que son directamente proporcionales a
cin, es necesario conocer el valor del pK medio y e0 e inversamente a S0.
establecer de esta forma la relacin entre el consumo Algunos autores (Gonzlez-Tello et al., 1994;
de base y el grado de hidrlisis. Mrquez y Vzquez, 1999) han indicado que en la
En la tabla 1, se muestran los valores del grado hidrlisis enzimtica de protenas, cuando se tienen
de disociacin de protenas en funcin del pH y la curvas de declinacin exponencial de la dGH/dt en
temperatura de reaccin (Adler-Nissen, 1986). funcin del tiempo, se puede ajustar un modelo de la
forma de la ecuacin 2 para el estudio cintico de la
Tabla 1. Valores de para distintas temperaturas reaccin, tal como se muestra en la figura 3, donde
y pH (Adler-Nissen, 1986) se pone en evidencia la disminucin exponencial de
la velocidad de la reaccin (d(GH)/dt ) con el GH.
T (C) pH
Por otro lado, el GH de la reaccin aumen-
50 7,5 0,71
ta cuando se trabaja a concentraciones iniciales
50 8,0 0,89 ms altas de enzima (vase figura 1), lo cual es
60 7,5 0,80 un comportamiento tpico en cintica enzimtica
60 8,0 0,93 de protenas (He, Qi y He, 2002), debido a que la
reaccin de hidrlisis est ligada a la formacin del
complejo enzima-sustrato, que a su vez depende de
2.4 Modelo matemtico la concentracin de la enzima activa.
1,40 R = 0,9719
So= 4 g/L
1,20
R = 0,9997
So= 6 g/L
1,00
dGH/dt (min1 )
R = 0,9991
0,80 So= 8 g/L
0,60
0,40
0,20
0,00
0,00 2,00 4,00 6,00 8,00 10,00 12,00 14,00
GH (%)
mientras que los rendimientos inferiores se registran Esto se prueba de forma experimental, adicionando
con concentraciones menores de enzima (vase figu- enzima fresca a un hidrolizado despus de 30 minu-
ra 1). Unas investigaciones anteriores (Gonzlez-Tello tos de reaccin, al producirse un aumento notable
et al., 1994; Mrquez y Vzquez, 1999; Qi y He, 2006) en el grado de hidrlisis, lo que pone en evidencia
indican que la disminucin en la tasa de hidrlisis de el fenmeno de desactivacin indicado, como se
la reaccin responde, por lo general, a tres factores: observa en la figura 4.
(a) Disminucin en la concentracin de enlaces pep-
Se considera que la velocidad de hidrlisis a
tdicos susceptibles a la hidrlisis por las proteasas,
pH y temperatura constantes est dada por la ecua-
(b) posible inhibicin de las enzimas causada por el
cin 3 (Gonzlez-Tello et al., 1994):
sustrato de hidrlisis; (c) desnaturalizacin trmica
de la enzima (Gonzlez-Tello et al., 1994).
(3)
Analizando las figuras 1 y 2, para todos los
niveles de enzima y sustrato hidrolizados, se observa
Separando variables e integrando la ecuacin
la tendencia del grado de hidrlisis hacia valores
3, para el caso en que no hay desnaturalizacin
lmites distintos, por lo que es claro que el factor
enzimtica (Gonzlez-Tello et al., 1994):
controlante en la velocidad no es la disminucin
de enlaces peptdicos disponibles. Por otro lado, el
fenmeno de desactivacin enzimtica demostr ser (4)
influyente en la disminucin de la tasa de hidrlisis.
16
y = 8E-10x6 + 1E-07x5 - 4E-05x4 + 0,0026x3 - 0,0779x2 + 1,2205x
R = 0,9974
14
12
10
GH (%)
8
GH (%)
0
0 10 20 30 40 50 60 70
Tiempo (min)
Figura 4. Efecto de la adicin de enzima fresca (alcalasa 2,4 L) durante el proceso de hidrlisis de plasma
a pH = 8,0, T = 55 C, e0 = 0,3885 AU/L y S0 = 4 g/L.
K +K2
-1
|E|= (12)
S0
K K
e=E0act exp 3 m GH (13)
K2
Modelamiento de la cintica de hidrlisis enzimtica...
K3 Km
e=E0act exp GH (13)
K2
Donde B*S0 es la fraccin de sustrato ligada al Entonces
d(gh) una ecuacin de velocidad
K3para
Km el
inhibidor y E0act es la concentracin de enzima inicial r= s0 puede=k
sistema (e0 -S
expresarse 0 )EXP
como sigue: GH
dt 2 K2
E0act
real activa en el e0E-S
= sistema, e0 -S0(9)para la reaccin.
0act0=disponible (9) d(gh) K3 Km
Segn la aproximacin de Briggs-Haldane (Tzafriri y r= s0 =k (e0 -S0 )EXP GH (14)
(14)
dt 2 K2
Edelman, 2007), la constante de Michaelis-Menten
Km es: Es decir, llega a un modelo general de la
E0act = e0 -S0 (9) forma de la ecuacin 2, obtenindose para a y b las
(10) siguientes expresiones:
k02/S[(e
a =ak2=[(e 0 )-]
/S )-]
0 0 (15)
(15)
Km =
K +K2
K +K(10)
-1 a = k2 [(eo/S0 )-B] (15)
-1 2
Un balance de masa
m enKel
K1
K =
estado estacionario (10) k3 km
1 b= k k (16)
para el complejo ES indica que bk2 = 3 m
k2
(16) (16)
|E||S|
(11) (10)
|ES|= K = K-1+K|E||S|
2 (11)
Kmm K1 |ES |= (11) 3.2 Determinacin de los parmetros
Km
Sustituyendo la ecuacin 11 en la (8) y supo- cinticos
< S0: niendo que la concentracin
|E||S| de sustrato [S] = S0
|ES|= (11) Los datos obtenidos en los ensayos experimen-
Km << S0: y Km << S0: Km e Km
tales se ajustaron a un modelo general de la forma
|E|= (12)
S0 Km e de la ecuacin 2. El ajuste del modelo con los datos
|E|= (12)(12)
0 y Km << S0: S0 experimentales fue satisfactorio y los parmetros a
Km e y b estimados estn de acuerdo con el mecanismo
|E|=
De las ecuaciones (12)se obtiene
(6), (7) y (12) propuesto (tabla 2).
S0
por integracin una expresin para e, donde el lmite
K K Se aprecia que los valores de a aumentan con
0act exp K GH
e=Ede
inferior integracin3esmla enzima inicial(13)
realmente
activa E0act: 2 la relacin e0/S0, mientras que los valores del pa-
K3 Km
e=E0act exp GH (13)rmetro b permanecen en torno a un cierto valor,
K2
K3 Km
GH para el rango de concentracin de sustrato y enzima
e=E0act exp (13)
(13)
K2 evaluados, con un promedio de (0,255 0,038) min-1.
d(gh) K3 Km
r= s0 =k (e0 -S0 )EXP GH (14)
dt 2 K2
d(gh) K3 Km
r= s0d(gh) =k (e0 -S0 )EXPK3K GH (14)
r=Tabla
s0 2.dt =k (e
2 0 -S
Valores
m
GH
K2
)EXP a evaluado
del0parmetro (14)
y recalculado arec a distintas relaciones enzima-sustrato
dt 2 K2
con su correspondiente coeficiente R2
Figura 7. Variacin de los diferentes valores de a*b con (e0 /S0)- (AU/g.
Lmite de confianza del 95 % y R2= 0,938
12 0,0647 AU/g
0,0971 AU/g
10
8
GH (%)
0
0 10 20 30 40 50 60
t (Minutos)
Figura 8. Comportamiento del GH en funcin del tiempo a diferentes e0 /S0 (La lnea continua representa los
valores predichos por el modelo y los marcadores representan los datos experimentales), pH=8,0, T=55 C
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