Cuantificacin de cido Indol-actico (AIA) por la tcnica colorimtrica de

Salkowski.
El cido indol actico (AIA) es una auxina natural presente en la mayora de las plantas.
Las auxinas son hormonas vegetales que regulan diversos procesos del desarrollo vegetal,
por lo que su aplicacin en Agricultura es muy frecuente. Frente a la actual utilizacin de
auxinas obtenidas por sntesis qumica, la sntesis microbiolgica de estas sustancias
resulta de gran importancia ya que la aplicacin de caldos de fermentacin que contienen
auxinas, puede constituir una alternativa viable en el contexto de una agricultura
ecolgica. En este trabajo se muestra el estudio realizado para cuantificar el AIA presente
en caldos de fermentacin obtenidos a partir de la bacteria Rhyzobium sp. 3. Utilizando un
procedimiento de anlisis de fitohormonas mediante HPLC desarrollado previamente, se
ha puesto a punto un mtodo para cuantificar AIA usando cido indol propinico (AIP)
como estndar interno. Se ha utilizado la tcnica de supresin inica que evita la
necesidad de obtener un derivado del compuesto a analizar. La deteccin se realiz por
fluorescencia a una sensibilidad baja. Las muestras de caldos analizados mostraron un
valor medio de AIA en el extracto de 29,0 1,3 mg/mL. El mtodo utilizado result ser
lineal, sensible, preciso y exacto en el intervalo de concentracin estudiado, por lo que se
considera adecuado para la cuantificacin de AIA a los niveles encontrados en los caldos
fermentados.

Las auxinas son naturalmente sintetizadas por la planta, son ampliamente utilizadas en el
cultivo de hortalizas (Rodrguez y Martin. 2009) La auxina ms comn es el cido Indol-
actico (AIA), que est ntimamente relacionada con los tropismos de la planta, como
inclinaciones, giros o curvaturas del tallo; adems, estimula el desarrollo del sistema
radical de la planta, interviene en los procesos de divisin celular, estimula el desarrollo
de frutos y nmero de hojas (Franco. M 2008). Las rizobacterias que sintetizan auxinas
pueden producir AIA, a partir de triptfano que es exudado por la raz de las plantas, este
acta como un precursor en la sntesis del AIA. (Loredo et al. 2004).

Las bacterias, pueden sintetizar el cido Indol-actico mediante una ruta metablica que
transforma el triptfano en Indol 3-acetamida (IAM) por accin de la triptfano mono-
oxigenasa, y posteriormente a cido 3-Indol-actico por accin de la Indol 3-acetamida
hidrolasa (Taiz y Zeiger. 2010).

La tcnica colorimtrica de Salkowski es el mtodo ms utilizado para hacer estimaciones

cuantitativas y cualitativas en la determinacin de cido Indol-actico (AIA). El reactivo de
Salkowski originalmente lleva en su composicin cido perclrico, este cido oxida las molculas
de indol presentes en el AIA, generando una coloracin que va de rosado a fucsia, sin embargo
algunas modificaciones hechas al reactivo han permitido sustituir el cido perclrico que es de alto
costo por cido sulfrico, obtenindose coloraciones semejantes. La tcnica colorimtrica de
Salkowski se basa en la cantidad de energa electromagntica que absorbe el AIA, se ha
determinado que la longitud de onda a la que ocurre la mayor absorbancia de una solucin de AIA
es a 530 nanmetros, esto ha permitido hacer detecciones de esta auxina en caldos microbianos
suplementados con triptfano (Celis y Gallardo 2008) 17 La deteccin de AIA con HPLC tambin se
ha realizado con xito en caldos de fermentacin microbianos, este mtodo permite alta
sensibilidad, linealidad y especificidad, no obstante su mayor limitante es el factor econmico
porque requiere de recursos costosos. (Castillo et al. 2005; Tien et al. 1979).

Metodologa
Para la cuantificacin de cido Indol-actico (AIA) se sigui la metodologa descrita por
Celis y Gallardo (2008). Las bacterias seleccionadas para evaluar la produccin AIA como
fitohormona estimulante del crecimiento vegetal, fueron cultivadas en agar nutritivo y el
hongo levaduriforme en agar papa dextrosa (PDA). Se realiz una curva patrn tomando
concentraciones de 5, 10, 15, 20 25 y 30 g/ml de AIA (Sigma), a partir de una solucin
stock de 100 g/ml. Luego se tom 1 ml de cada una de las soluciones y se le adicion 2
ml del reactivo de Salkowski preparado a partir de cido sulfrico (H2SO4) 7,9 M y cloruro
frrico (FeCL3) 40 mM. Se dej reposar por 30 minutos a temperatura ambiente y se
leyeron las absorbancias de los patrones a 530nm en un espectrofotmetro Pharo 300 de
Merck, con los valores obtenidos se hall la ecuacin que relaciona la concentracin de
AIA en funcin de la absorbancia. Luego se realiz la medicin de cido Indol-actico
producido por cada microorganismo, para ello se prepar una suspensin de cada cepa
microbiana en solucin salina al 0.85%, leyendo a una longitud de onda de 540
nanmetros se ajust la absorbancia de esta solucin a 0,20, lo que es equivalente a una
concentracin de 108 cel/ml. Se hizo una dilucin en caldo tripticasa de soya para
favorecer la produccin de auxinas, hasta obtener una concentracin de 106 cel/ml, este
procedimiento se realiz por triplicado para cada cepa. Las cepas microbianas se
incubaron a 30oC y la cepa levaduriforme se incub a temperatura ambiente, se
mantuvieron en agitacin constante a 120rpm durante 96 horas, tiempo en el cual se
producen los picos mximos de produccin de AIA para estos microorganismos (Celis y
Gallardo, 2008). Para realizar las mediciones de AIA, pasadas las 96 horas de incubacin se
tomaron 2 ml de cada caldo de cultivo y se centrifugaron por 10 minutos a 5000 rpm o 30
minutos a 3000 rpm, posteriormente se tom 1ml del sobrenadante y se mezcl con 2ml
del reactivo de Salkowski, se dej reposar por 30 minutos a temperatura ambiente y se
ley la absorbancia a 530 nm para determinar la concentracin de AIA producida por los
microorganismos seleccionados. Una vez cuantificada la produccin de AIA de cada
microorganismo, se realiz un anlisis estadstico mediante la prueba de Duncan para
determinar entre los microorganismos el mayor productor de AIA, y evaluar el efecto de
su inoculacin en la germinacin y desarrollo de semillas de tomate (Solanum
lycopersicum) variedad Santa Clara.

Curva de calibracin.

Citas consultadas

http://www.herbario.encb.ipn.mx/pb/pdf/pb29/cyno.pdf

https://www.um.es/analesdebiologia/numeros/27/PDF/16-CUANTIFICACION.pdf

http://repositorio.ucm.edu.co:8080/jspui/bitstream/handle/10839/578/Cristian%20Alonso%20Rodriguez%20Gonzalez.pdf?sequence=1