SEPARACINYCUANTIFICACIN

DEPROTENASPLASMTICAS

Objetivos
Separaralbminayglobulinaapartirdeunamuestradesangre.
Determinar cuantitativamente por medio de una curva estndar la
concentracindeprotenastotales,albminayglobulinaspresentesenel
plasmaporelmtododeBiuret.

Antecedentesacadmicos
Mtododeobtencindemuestrasangunea.
Diferenciasentresueroyplasmasanguneo.
Caractersticasgeneralesdeanticoagulantes.
Clasificacindelasprotenasplasmticas
Funcionesdelaprotenasplasmticas
Concentracinplasmticadelasprincipalesprotenas
Principalestcnicasdeseparacinycuantificacindeprotenas.

Introduccin
La sangre es el fluido corporal ms utilizado con fines analticos. Los tres
procedimientos habituales para obtener sangre son: puncin cutnea,
puncinvenosaypuncinarterial.
La composicin de la sangre venosa vara segn la actividad metablica del
organismo o tejido perfundido por lo que el punto en el que se extrae la
muestra puede influir en la composicin de la sangre venosa. La sangre

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

venosa tiene menos oxgeno que la arterial, pero tambin se diferencia de

staporelpH,suconcentracindedixidodecarbonoysuhematocrito.A
veces tambin varan las concentraciones de glucosa, cido lctico, cloro y
amonio.
Las protenas plasmticas constituyen un grupo de aproximadamente
cincuentaprotenascontenidasenelfluidosanguneo,paradiferenciarlasde
las que pueden aparecer de forma transitoria deben cumplir los siguientes
requisitos:

a) Sersecretadasactivamentealasangre
b) Noderivardelesionesnialteracionesdetejidosoclulas
c) Ejercersufuncinfundamentalenelsistemavascular
d) Presentarmayorconcentracinenelplasmaqueencualquierotro
tejido.

Laconcentracinpresentedecadaunadelasprotenasplasmticasesmuy
variable oscilando desde los 0.01 g/100mL hasta los 5g/100mL, siendo el
contenido total de protenas en el plasma de 68 g/100mL. Las protenas
plasmticas por su importancia se clasifican en tres grupos principales:
albmina,globulinasyfibringeno.
Para la obtencin y separacin de las protenas plasmticas se hace uso de
varias tcnicas basadas en sus propiedades caractersticas, como son:
tamao, solubilidad, forma molecular, especificidad inmunolgica y carga
elctrica,entreotras.
Deacuerdoasupatrndeagrupamientoenlamigracinelectrofortica,las
protenasplasmticaspuedenagruparseen:

a) albmina(constituyeel55%deltotaldelasprotenasplasmticascon
unacantidadaproximadade4g/100mL).
b) 1globulinas:1glicoprotenacida,1antitripsina,1fetoglobulina,
1antiquimiotripsina, transcortina, inhibidor inter1 de la tripsina,
protena transportadora de retinol, 1lipoprotenas, 1B y 1T
glicoprotenas(5%deltotal,de0.30.6g/100mL).
c) 2globulinas: haptoglobina, 2macroglobulina, ceruloplasmina,
hemopexinaytransferrina(9%deltotal,de0.40.9g/100mL).

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 Separacinycuantificacindeprotenasplasmticas

d) globulinas: globulina ligadora de esteroides, 2microglobulina,
fibringeno, 1glicoprotena especfica del embarazo, lipoprotenas
yprotenaCreactiva(13%deltotal,de0.61.1g/100mL).
e) globulinas: IgG, IgM, IgA, IgD, IgE (11% del total, de 0.71.5
g/100mL).

La albmina se sintetiza en forma de proalbmina en el retculo

endoplasmtico del hgado. Transporta tanto sustancias aninicas como
catinicas,entrelasquecabedestacarlabilirrubina,frmacoscomoelcido
acetilsaliclico, aminocidos como el triptfano y algunas hormonas
esteroides y tiroideas. Su otra gran funcin es la del mantenimiento del
volumenvascular,aellasedebeel80%delapresinosmticadelplasmaal
existir unas 17 cargas negativas en su estructura a pH fisiolgico1. Las
globulinasenconjuntorepresentanaproximadamenteel38%deltotaldelas
protenasplasmticasyentresusfuncionesdestacaneltransportedelpidos
ylasecrecindeanticuerpos.

En la presente prctica obtendremos de forma directa la concentracin de

protenas totales y albmina mediante el mtodo de Biuret, el cual se basa
en la formacin de un compuesto de color violeta provocado por la
formacindeuncomplejodecoordinacinentrelosionesCu2+ylosparesde
electrones no compartidos del nitrgeno que forma parte de los enlaces
peptdicosenmedioalcalinopresentandounmximodeabsorcina540nm.
Para obtener la albmina eliminaremos las globulinas con la tcnica de
precipitacinporsalado(saltingout),ladiferenciadelcontenidodeprotenas
totales y albmina ser la cantidad aproximada de globulinas que fueron
eliminadas.

MaterialyEquipo
Probetagraduadade10mL.
Vasosdeprecipitadosde100mL.
Gradilla.
Termmetro.

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

TuboVacutainerconanticoagulante(EDTA).
AgujaparaVacutainer.
Papelparafilm.
Tubosdeensayode13X100.
Marcadorindelebledepuntaextrafina.
Micropipetasp20.p200,p1000yp5000,microlitros.
Pipetasde0.2,1y5mL
Puntasnuevasparalasmicropipetas.
PipetasPasteur.
Centrfuga.
Balanzaanaltica.
Espectrofotmetro.
Parrilladecalentamientooestufa.
BaoMaraa35C.

Reactivos
Solucindesulfatodesodioal23%P/Venagua.
Eteretlico.
NaOH0.1N
Solucinestndardealbmina350mg/100mLdeNaOH0.1N.
NaOH1N.
ReactivodeBiuret.
o Pesar4.5gdetartratodobledesodioypotasio,2.5gdeyoduro
depotasioy1.5gdesulfatodecobrepentahidratado.Disolver
por separado en vasos con aproximadamente 50 mL de agua
destilada. De ser necesario calentar para disolver. Una vez
disueltos los tres reactivos dejar enfriar. Colocar en un matraz
aforado de 500 mL, 100 mL de NaOH 1N, despus agregar en
orden cada una de las soluciones (el cobre al final) mezclar
cuidadosamente despus de cada adicin y aforar con agua
destilada.Seconservaenunfrascombar.

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 Separacinycuantificacindeprotenasplasmticas

Mtodo
1. Obtener una muestra sangunea (35 mL) por venopuncin con un
sistemaVacutainerusandocomoanticoagulante(EDTA).
a. Prepararelmaterial:tubos,ligadura,torundas,jeringas(cuando
seanecesario)agujaestrilydispositivoVacutainerparafijarla
b. Identificareltubo
c. Colocaradecuadamentealdonador
d. Solicitar al paciente que cierre al puo para que las venas
resultenmspalpables
e. Seleccionarlavenaadecuadaparalapuncin
f. Limpiarlazonadelapuncinconunatorundahumedecidacon
alcoholisoproplicoal70%,oyodopovidonaal1%.Secomienza
en el punto de la puncin y se prosigue la limpieza hacia fuera
siguiendounmovimientoenespiral
g. Aplicar si es necesario un torniquete varios centmetros por
encimadelazonadepuncin.Nodejarlomsdeunminuto.
h. Fijar la vena tanto, por encima como por debajo del lugar de
puncin, con ayuda de los dedos pulgar y medio o ndice y
pulgar.
i. Realizar la venopuncin penetrando la piel con la aguja
formando un ngulo de 15 con el brazo y con el bisel hacia
arriba se sigue la direccin de la vena; introducir la aguja con
suavidadperoconrapidezparareducirlasmolestias.Nohayque
enterrarlaaguja.Siseutilizaunajeringa,setirahaciaatrsdel
mbolo,contensinlentayuniformeamedidaquelasangreva
fluyendoensuinterior.Siseutilizauntuboalvaco,encuantola
aguja haya penetrado en la vena se dirigir el tubo todo lo
posible hacia delante apoyndose en el dispositivo de sujecin
(de la misma forma en que se introduce el mbolo de una
jeringa).Almismotiempomantengafirmementelaagujaensu
lugar.Unavezquesehayallenadoeltubo,seretiratomndolo
porsuextremoytirandosuavementedel.Semezclalasangre
conelanticoagulanteporinversinsuave.Silamuestrahasido
extrada con jeringa se transferir a los tubos correspondientes
despusderetirarlaaguja.

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

j. Cuando la sangre comience a fluir se libera el torniquete. Una

vezobtenidalamuestra,hayqueindicaralpacientequerelajeel
puoyquenobombeeconlamano.
k. Coloque suavemente una torunda de algodn estril sobre el
puntodepuncin.Seextraelaaguja(conunmovimientorpido)
y a continuacin se ejerce presin sobre la zona. NO aplique
masaje.2

2. Centrifugar el tubo a 3000 rpm durante 5 minutos y separar con
cuidadoelplasma.

3. Colocar0.25mLdeplasmaenunvaso,adicionar4.75mLdesulfatode
sodioal23%P/V.Taparymezclarporinversintresveces.Tomar1mL
de la suspensin y colocarlo en un tubo, etiquetar como protenas
totales.Agregar1.5mLdeteretlicoalrestodelasuspensin,tapary
mezclar por inversin (sin agitar), centrifugar a 2000 rpm durante 10
minutos.

4. Despus de la centrifugacin, tomar 1 mL de la capa inferior y
colocarlosenuntubo,etiquetarcomoalbminas.

5. Preparar 7 tubos y numerarlos de 1 al 6 y a otro nombrarlo blanco.
Agregaracadaunoloindicadoenelcuadro1.

6. Leerenelespectrofotmetroa540nmyregistrarlosvalores.

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 Separacinycuantificacindeprotenasplasmticas

Cuadro1.SEPARACINYCUANTIFICACINDEPROTENASPLASMTICAS
TuboconmL Blanco 1 2 3 4 5 6 7
de:
Solucin
patrnde 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0
protenas
Agua 1 0.8 0.6 0.4 0.2
destilada
Solucinde
protenas 1
totales
(problema)
Solucinde
albminas 1
(problema)
Reactivode 2 2 2 2 2 2 2 2
Biuret
Coloquelostubosenbaomaraa3035C,durante10minutos
Dejarreposaratemperaturaambientedurante5minutos.
Determinelaabsorbanciadecadaunodelostuboscontraelblancoa540nm

Resultados
de
absorbancia



Resultados
Grafiquelacurvaestndarconlosresultadosdeabsorbanciadelostubos3
al7,contralaconcentracindealbminaenmasacontenidaenlosmismos.
Interpolelasabsorbanciasdelostubosdeprotenastotalesyalbminapara
obtenersuconcentracinenmasadentrodecadatubo.
Determine la concentracin de protenas totales y albmina contenida en
100mLdeplasmatomandoencuentalasdilucionesdelamuestra.

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BioqumicaCelularydelosTejidosI

Calcule la concentracin de globulinas que fueron eliminadas de las

protenastotales.

Cuestionario
1. Mencionelasfuncionesdelasprincipalesprotenasplasmticas.
2. SiutilizaraelmtododeLowryparadetectarlasprotenasplasmticas
diluiramslamuestra?Sionoyporqu.
3. DibujelareaccindelcobrecontenidoenelreactivodeBiuretconel
nitrgenodelosenlacespeptdicosenunmedioalcalino.
4. Qu propiedades de las globulinas se utilizan para separarlas de las
protenastotales?
5. Mencione dos tcnicas diferentes a las usadas para determinar
protenasyexpliquesusfundamentos.

Referencias
1. AguilarSantelises L, Garcadel Valle A, CoronaOrtega MT, Rangel
Corona R, CruzMilln M. Antologa del laboratorio de Bioqumica
Celular y de los Tejidos I (complemento). Material en CD e impreso.
Mxico:FESZaragoza;2008.
2. DevlinTM.BioqumicaTomoIyII.4taed.Espaa:Ed.Revert;2004.
3. Harper HA, et al.Bioqumica de Harper. 28a ed. Mxico: Mc GrawHill
Interamericana;2010.
4. Henry J. B. (ToodSanfordDavidsohn). Diagnstico y tratamientos
clnicosporellaboratorio.Tomo1.8ed.Espaa:Salvat;1988.
5. MornL.Obtencindemuestrassanguneasdecalidadanaltica.1ed.
Mxico:Panamericana;2001.

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