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Portada

3 Polifenoles en Alimentos
PRIMERA EDICIN

POLIFENOLES
EN ALIMENTOS
BIODISPONIBILIDAD Y MTODOS ANALTICOS DE
EVALUACIN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE

ISABEL J. GARCA GARCA


JOS G.CRDENAS MURILLO

Portada

4 Polifenoles en Alimentos
PRIMERA EDICIN

POLIFENOLES
EN ALIMENTOS
BIODISPONIBILIDAD Y MTODOS ANALTICOS DE
EVALUACIN DEL POTENCIAL ANTIOXIDANTE

ISABEL J. GARCA GARCA


JOS G.CRDENAS MURILLO

Portada

5 Polifenoles en Alimentos
Polifenoles en alimentos

Primera Edicin, Mayo 2016


Autora: Isabel J. Garca Garca
Co - autor: Jos G. Crdenas Murillo

REVISIN TCNICA
Alicia Casariego Ao
Doctora en Ciencias de los Alimentos
Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad
de La Habana.

Fulgerio Marn Iniesta


Doctor en Ciencias
Facultad de Veterinaria,
Universidad de Murcia, Espaa.
El Telgrafo EP

Edicin
Cuidado Editorial
Diseo y Diagramacin
Impresin

Derecho del autor emitido por el Instituto Ecuatoriano de Propiedad Intelectual - IEPI,
el 11 de mayo de 2016. Registro No.: GYE-007229 Cmara Ecuatoriana del Libro - ISBN:
978-9978-59-110-9

Quedan rigurosamente prohibidas, bajo las sanciones en las leyes, la produccin o


almacenamiento total o parcial de la presente publicacin, incluyendo el diseo de la
portada, as como la trasmisin de la misma por cualquiera de sus medios, tanto si es
electrnico, como qumico, mecnico, ptico, de grabacin o bien de fotocopia, sin la
autorizacin de los titulares del copyright.

Guayaquil-Ecuador 2016

Portada

6 Polifenoles en Alimentos
DEDICATORIA
Agradecemosde manera especial al Proyecto Prometeo de la Secre-
tara de Educacin Superior, Ciencia, Tecnologa e Innovacin de la
Repblica del Ecuador por el patrocinio de este trabajo.

Portada

7 Polifenoles en Alimentos
CONTENIDO
Introduccin11

Captulo 1.
Estrs Oxidativo (EO), Especies Reactivas de Oxgeno
(ERO) y caracterizacin de Antioxidantes (AO)15
1.1. Estrs oxidativo 17
1.2. Caracterizacin de AO19
1.3. Polifenoles (PF), flavonas y antocianinas20
1.4. Sntesis de la estructura y su influencia
en la actividad antioxidante de los polifenoles23
1.5. Beneficios de los polifenoles de los alimentos
en los procesos de prevencin del estrs oxidativo 24
1.6. Los alimentos ricos en polifenoles25
1.7. Los compuestos polifenlicos del vino y sus efectos26
1.8. Los fitoqumicos alimentarios (FQA) y afectaciones
por procesamiento y/o coccin de los alimentos29
1.9. Factores relacionados con el procesamiento de alimentos 30
Bibliografa33

Captulo 2.
Biodisponibilidad de los polifenoles47
2.1. Biodisponibilidad de los polifenoles (PF)49
2.2. Distribucin y contenido de PF en alimentos50
2.3. La biodisponibilidad de PF, su absorcin y bioactividad51
2.4. Interaccin de los PF con otros compuestos de los alimentos o del
organismo51
2.5. Estructura qumica de los PF52
Bibliografa55

Captulo 3.
Mtodos analticos para la evaluacin de las propiedades antioxidantes
de los polifenoles de fuente alimentaria 63
3.1. Introduccin65
3.2. Proceso de oxidacin en macromolculas66
3.2.1. Peroxidacin Lipdica 66
3.3.2. Peroxidacin lipdica en alimentos67
3.4. La carne y productos crnicos68
3.5. La carne de pescado68
3.6. La leche69
3.7. Los vegetales69
3.8. El proceso de fritura y los lpidos oxidados (LO)69
3.9. Biomarcadores (BM) de evaluacin de procesos o productos de oxidacin70
3.9.1. Biomarcadores del dao a lpidos71

Portada

8 Polifenoles en Alimentos
3.10. Tcnicas de deteccin de oxidacin72
3.10.1. Inhibicin de la peroxidacin lipdica en homogenado de
cerebro de rata72
3.10.2. Determinacin de MDA como ndice de peroxidacin lipdica72
3.10.2.1. El N-metil-2-fenil-nidol72
3.10.3. Actividad de inhibicin de la peroxidacin
lipdica. Sustancias Reactivas al cido Tiobarbitrico (TBARS)73
3.10.4. Dienos conjugados (DC)73
3.10.5. Poder reductor de los grupos sulfidrilos (SH). Protenas con
grupos SH74
3.11. Uso de los antioxidantes (AO) en alimentos74
3.11.1. Caracterizacin de antioxidantes AO75
3.12. Procesamientos de muestras para la
determinacin de propiedades Antioxidantes78
3.12.1. Alimentos: frutas, vegetales, y bebidas naturales y espirituosas78
3.12.1.1 Extraccin de compuestos de origen fenlico en las frutas
frescas78
3.12.1.2. Preparacin de las muestras de alimentos79
3.12.1.3. Determinacin de peso seco de los alimentos frescos79
3.13. Tcnicas Analticas para la determinacin de Actividad
Antioxidante Total. Determinacin del Estado Antioxidante Total (TAS)80
3.13.1. Procedimiento de la tcnica TEAC80
3.13.2. Mtodos para la determinacin de la
reactividad y potencial antioxidante total83
3.13.3. Determinacin de la capacidad reductora del
hierro como medida del poder antioxidante (FRAP)86
3.13.4. Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno. ORAC86
3.13.4.1. Mtodo del ORAC con microplacas87
3.13.5. Ensayo de la determinacin del poder de
atrapamiento de radicales por DPPH87
3.14. Cuantificacin de polifenoles en alimentos88
3.14.1. Determinacin de Fenoles Totales89
3.14.2. Tcnicas de evaluacin de flavonoides totales89
Bibliografa91

Portada

9 Polifenoles en Alimentos
INTRODUCCIN

Este libro est dirigido, especialmente, a quienes precisan de un


manual resumido que abarque las distintas tcnicas analticas
para poder evaluar el estrs oxidativo, sus biomarcadores, la
concentracin y actividad de antioxidantes de los contenidos
polifenlicos de diferentes alimentos o fracciones de los mismos,
con vistas a su empleo y uso en la industria alimentaria; ya sea
como conservantes o en la evaluacin de nuevas fuentes naturales
portadoras de estas propiedades. La informacin recopilada aqu
ser til para poder estructurar una metodologa de trabajo bsica,
necesaria para emprender una escala de ascenso en el posible empleo
de diferentes alimentos o fracciones de estos, como complementos en
la elaboracin de alimentos de produccin nacional, con propiedades
funcionales vlidas en la profilaxis contra enfermedades crnicas no
transmisibles.

De manera particular se han resumido de forma breve los aspectos


ms relevantes de determinados frutos cultivados en el Ecuador,
atendiendo a sus propiedades antioxidantes, para dar cobertura
y sustentar las acciones que faciliten el estudio de nuevas fuentes
alimenticias portadoras de polifenoles de productos de la regin, con
el propsito de incorporar o aumentar su consumo.

La gran variedad de la flora del pas permite disponer de mltiples


frutos de diverso origen endmico, de los cuales se tienen algunos
antecedentes reportados de sus propiedades antioxidantes, las
cuales se muestran aqu. Tal es el caso del pltano, el cacao y
el maracuy, que precisan de mayor profundidad de estudios
para lograr la caracterizacin antioxidante, al igual que para la
evaluacin de mltiples plantas con valor medicinal, ricas tambin
en fitoqumicos.

Portada

10 Polifenoles en Alimentos
Para establecer una prueba concluyente de la efectividad de
los polifenoles en la prevencin de enfermedades y la mejora
de la salud humana, se trabaja actualmente en el mundo en
determinar la distribucin de estos compuestos en nuestra dieta,
estimar su contenido en cada comida, e identificar cules mezclas
de los cientos de los polifenoles existentes es ms probable que
proporcionen los mejores efectos beneficiosos en el contexto de la
nutricin preventiva.

La biodisponibilidad de los polifenoles, por tanto, es un concepto


importante para conocer de forma fehaciente qu propiedades
antioxidantes antimicrobianas o antiinflamatorias conservan
estos compuestos despus de ser ingeridos y absorbidos en nuestro
organismo. Por ello se decidi desarrollar un captulo del libro sobre
la biodisponibilidad de los polifenoles, para conocer los elementos
bsicos necesarios a la hora de evaluar in vivo de forma definitiva su
valor funcional en el organismo.

Es manifiesto que el contenido de este libro se ubica dentro del


marco de los lineamientos y objetivos del programa del Buen Vivir
del Ecuador, facilitando su materializacin en esta rea sensible
de la poblacin, como es la salud. La intencin es cooperar en la
caracterizacin de productos provenientes de los frutos, para su
empleo como valor agregado por sus propiedades antioxidantes, en
la elaboracin de alimentos funcionales y la identificacin de plantas
medicinales y comestibles de la flora ecuatoriana.

As se resume la meta del libro para un uso til en los laboratorios de


biotecnologa de alimentos y control de calidad del pas que realicen
investigaciones en la bsqueda de nuevas fuentes de antioxidantes
naturales.

Nuestra aspiracin es que este esfuerzo estimule a los profesores


e investigadores del pas a la evaluacin de productos naturales
ecuatorianos, en busca de valores agregados a productos bsicos
que estimulen la industria alimentaria en el cambio de la matriz
productiva.

Portada

11 Polifenoles en Alimentos
Se aspira, adems, a incentivar a los estudiantes universitarios
al estudio de la metodologa cientfica; a la formacin de nuevos
investigadores con perspectiva innovadora, a la preparacin de
nuevos productos con valor agregado. Igualmente a contribuir con
los propsitos del desarrollo de la ciencia y la tcnica en el Ecuador,
y sus fines de mejoras en la poblacin y el medio ambiente.

Todo este trabajo ha sido auspiciado por la Secretaria Nacional de


Educacin Superior, Ciencia y Tecnologa e Innovacin del Ecuador
a travs del proyecto Prometeo, por lo cual agradecemos su esfuerzo
a todos los involucrados.

Los autores

Portada

12 Polifenoles en Alimentos
1
Captulo

Captulo

Captulo

ESTRS OXIDATIVO (EO),


ESPECIES REACTIVAS
DE OXGENO (ERO)
Y CARACTERIZACIN
DE ANTIOXIDANTES (AO)

Portada

13 Polifenoles en Alimentos
Captulo 1. Estrs Oxidativo (EO), Especies
Reactivas de Oxgeno (ERO) y caracterizacin
de Antioxidantes (AO)

1.1. Estrs oxidativo

La vida en la Tierra surgi primeramente en una atmsfera reductora.


No fue hasta la aparicin de las algas con capacidad fotosinttica
que el oxgeno comenz a aparecer en la atmsfera en cantidades
apreciables. Esto represent una presin evolutiva muy seria al crearse
una atmsfera oxidante con concentraciones de O2 determinantes. Por
otra parte, la aparicin del oxgeno en la atmsfera de nuestro planeta
permiti el desarrollo de organismos ms complejos que utilizaban
esta molcula para la produccin de energa de una forma mucho ms
eficiente. Si bien ms del 95% del O2 consumido por los organismos
aerobios es reducido completamente a H2O durante la respiracin
mitocondrial, un pequeo porcentaje (< 5%) es convertido a especies
semi-reducidas, conocidas como Especies Reactivas de Oxgeno (ERO).1

Las ERO pueden ser altamente txicas e iniciar reacciones en cadena


que pueden comprometer la vida de la clula. En la actualidad es
difcil no encontrar en una revista biomdica o de nutricin algn
artculo donde se discuta el papel de las ERO en dismiles estados
fisiopatolgicos o en los alimentos, ya que la oxidacin de diferentes
nutrientes es la segunda causa de deterioro de los alimentos, precedidos
por la contaminacin microbiana.

Se denomina estrs oxidativo a aquella situacin en la que las


clulas estn expuestas a un ambiente prooxidante y los mecanismos
defensivos antioxidantes son superados de forma que se llega a afectar
el estado redox celular.

En los sistemas biolgicos las especies reactivas prooxidantes


provienen en su mayora del oxgeno, las ERO. El reconocimiento de
los efectos txicos del oxgeno sobre los seres vivos se remonta al ltimo
tercio del siglo XVIII. Sin embargo, no es hasta bien avanzado el siglo
XX que una gran cantidad de trabajos increment el conocimiento de
los efectos dainos del oxgeno y de otros txicos oxidantes sobre los
procesos biolgicos que constituyen la vida.

Portada

14 Polifenoles en Alimentos
En el ao 1969, se comprueba la generacin de estas especies reactivas
como subproductos de las reacciones biolgicas en las clulas. En ese
ao,2 se descubre la existencia en humanos de la superoxidodismutasa
(SOD), enzima que cataliza la reaccin de anin radical superxido
(O2-) a perxido de hidrgeno. La existencia de la enzima implicaba
la presencia del O2- como elemento formado durante el metabolismo
oxidativo celular. Desde entonces se ha verificado la formacin
de diversos elementos reactivos derivados del oxgeno, durante el
metabolismo oxidativo y su participacin en procesos fisiolgicos y
fisiopatolgicos.

Como ERO se incluyen a los radicales libres (RL) de oxgeno y a


otros compuestos de oxgeno que, si bien no pueden clasificarse
qumicamente como RL, s son altamente prooxidantes y capaces de
generar RL durante su metabolismo.

Un RL se puede definir como aquella especie qumica que posee un


electrn (e-) desapareado. Esta situacin le confiere una alta capacidad
de reaccin, prcticamente con cualquier principio activo, lo que
tambin condiciona su corta existencia.

Los RL se pueden formar a partir de tomos o molculas por tres vas:

1. Por la ruptura homoltica del enlace covalente de una molcula, con


la retencin de 1 e- del par de e- compartidos por cada fragmento.

2. Por la prdida de 1 e-

3. Por la adicin de 1 e-.

Con excepcin de circunstancias inusuales, tales como altas


temperaturas, radiaciones ionizantes y luz ultravioleta, los RL
se generan en las clulas fundamentalmente por reacciones por
transferencia de e-. Estas pueden ser mediadas por la accin
enzimtica o producirse sin la intervencin de enzimas, a menudo con
la colaboracin de iones metlicos de transicin como hierro y cobre
reducidos (reacciones de Fenton y Haber Weiss).

El trmino Especies Reactivas de Oxgeno es una denominacin que


engloba los RL (tomos, iones o molculas con uno o ms e- no pareados
en el orbital ms externo) y a molculas derivadas del oxgeno que
tengan una alta capacidad reactiva.3
Portada

15 Polifenoles en Alimentos
Despus del descubrimiento del xido ntrico (NO) y de la formacin
de otras especies derivadas del nitrgeno con capacidad reactiva, ha
surgido la denominacin de Especies Reactivas de Nitrgeno (ERN),
un trmino que muchos investigadores consideran inapropiado
debido a que en todas las especies reactivas est presente el tomo
de oxgeno y que el e- no pareado se deslocaliza entre los tomos de
nitrgeno y oxgeno.

1.2. Caracterizacin de AO

Antes del empleo a gran escala de compuestos naturales o sintticos


como antioxidantes profilcticos, es necesario un estudio profundo de
las propiedades anti o pro-oxidantes de la molcula que se propone. Con
estos fines se han diseado diferentes metodologas experimentales.
El desarrollo de estas metodologas es un factor crtico de gran
importancia en las estrategias de formulacin de un suplemento
antioxidante y tambin en la elaboracin de alimentos fortificados.

El resultado de los ensayos preliminares in vitro e in vivo tiene un


papel predictivo sobre los fenmenos que pudieran tener lugar en los
organismos aerbicos. Sin embargo, una estrategia de investigacin
coherente debe dar respuesta a interrogantes bsicas que deben ser
satisfechas durante el desarrollo de un AO con fines teraputicos o
como aditivo en alimentos.

Atendiendo a la diversidad de variantes experimentales y sistemas


de ensayo, diseados para el estudio de un AO, resulta de inters
examinar las premisas bsicas que permitieran considerar a un agente
cualquiera como AO, as como la racional para su estudio.

Un antioxidante es aquella sustancia que presente, en muy bajas


concentraciones comparadas con la sustancia oxidable, retarda o previene
la oxidacin de esta ltima. El trmino sustancia oxidable incluye
cualquier tipo de molculas producidas por los organismos vivos.4

Desde el punto de vista fisiolgico est bien establecida la participacin,


en los mecanismos de defensa antioxidantes, de las enzimas superxido
dismutasa (SOD), Glutatin peroxidasa, (GPx), Catalasa (Cat) y de
otras protenas como la ceruloplasmina.

Existen muchas referencias acerca de la actividad antioxidante de la


vitamina E; tambin se han evaluado como AO diferentes compuestos
Portada

16 Polifenoles en Alimentos
como los -carotenos, albmina, metalotionena, carnosina, mucus,
cido ftico, taurina, bilirrubina, cido rico, creatinina, ergotionena,
cido dihidrolipoico, ovotiol, coenzima Q, poliamidas, retinol,
flavonoides y otros fenoles, cido ascrbico (tambin referido como
pro-oxidante bajo ciertas condiciones de reaccin) y frmacos como los
antiinflamatorios no esteroidales, desferroxamina y n-acetilcistena.

En la evaluacin de la posible accin antioxidante de una sustancia in


vivo es necesario dar respuesta a las interrogantes que se sealan en
la Tabla 1.1. En este sentido se han diseado diferentes bateras de
ensayo in vitro.

Qu biomolcula se supone que protege el compuesto?

Est el compuesto presente in vivo cerca de esa biomolcula a una concentracin suficiente?

Cmo ocurre la proteccin: secuestrando ERO, previniendo su formacin o por reparacin de daos?

La molcula tiene un papel biolgico primario o secundario como antioxidante?

Si el antioxidante secuestra ERO, puede el radical derivado de esta interaccin per se originar daos
biolgicos?

Puede la sustancia AO causar daos en sistemas biolgicos diferentes a aqullos donde ejerce su
proteccin?

Tabla 1.1. Interrogantes a responder durante la evaluacin de una sustancia propuesta


como AO in vivo de Halliwell4

Diferentes metodologas de evaluacin de AO se muestran en el


captulo 3 del libro.

1.3. Polifenoles (PF), flavonas y antocianinas

Los polifenoles abarcan una amplia variedad de compuestos, presentes


en frutas y verduras, vino, t, aceite de oliva virgen extra, entre
otros alimentos. Las ms importantes subclases de los PF de la dieta
incluyen a las flavonas, flavanonas, isoflavonas y antocianinas.5, 6

Cada uno, y de conjunto, por sus mecanismos diferentes de accin,


neutralizan los efectos de los RL y el EO. Estas acciones pueden darse
en el conjunto de los AO presentes y provocar reacciones de interaccin
y sinergismo, amplificando el poder antioxidante.

Portada

17 Polifenoles en Alimentos
Las frutas son usualmente ms ricas en PF que los vegetales, con un
contenido total de fenol tan alto como 1-2 g/100 g peso fresco para
algunas frutas, tales como la ciruela y el nspero.7 Ellas frecuentemente
contienen altas cantidades de proantocianidinas (manzana, ciruela,
uva, y nspero) y antocianinas (cerezas y otras frutas rojas) no
comnmente encontrados en vegetales con la excepcin de la berenjena
y legumbres secas.8, 9

En alimentos y bebidas tales como vino tinto, t, chocolate o cerveza,


los flavonoides ms abundantes son los flavanoles (catequinas y
proantocianidinas), antocianinas y sus productos de oxidacin.8

La actividad AO que poseen las flavonas se produce por diferentes


mecanismos de accin desde el atrapamiento de RL y quelacin
de iones metlicos hasta con la inhibicin de enzimas como las
lipoxigenasa, cicloxigenasa y la fosfolipasa A2 o a travs de una accin
antiinflamatoria.10, 11

La accin AO de una sustancia depende de numerosos factores,


desde las variaciones en estructura qumica que sufre despus de
los procesos de elaboracin y/o coccin y almacenamiento, hasta las
posibilidades de absorcin y metabolismo de la sustancia que definirn
las cantidades que llegan al organismo a estar prximo a la sustancia
a proteger de la oxidacin.

Las antocianinas se consideran el grupo de pigmentos acuosos


ms abundante del reino vegetal y facilitan la coloracin del rojo
al anaranjado y del azul al violeta de muchas frutas y vegetales.
Su habilidad para formar cationes flavium los hace diferentes a los
otros flavonoides.12

Los alimentos que contienen mayores cantidades de antocianinas


son los frutos como las cerezas, moras, bayas azules, uvas moradas y
el vino tinto.13 Los estudios sobre su actividad biolgica demuestran
sus propiedades AO,14 antimicrobianas, antiinflamatorias y
anticancerosas.15-17

La accin AO de las antocianinas de los alimentos referidos arriba


tiene lugar por su accin directa de atrapamiento de los electrones
desapareados de los RL, inhibiendo la peroxidacin lipdica y

Portada

18 Polifenoles en Alimentos
quelacin de iones metlicos.18 Existen estudios que han demostrado
la correlacin positiva entre la concentracin de antocianinas en el
suero de voluntarios que consumieron arndanos y la capacidad AO
del suero.19, 20

Las evidencias de la actividad antioxidante y CI50 (M) de vitaminas,


flavonoides, antocianidinas, flavonoles, flavononas, hidroxicinamatos
de frutos, bebidas y alimentos, han sido previamente documentadas
junto con la de los AO sintticos de amplio uso en la industria de
alimentos.21, 22

CI50
Antioxidante Fuente AAT (mM)
(M)
Vitaminas
Vit. C Frutas y vegetales 1,0 0,02 1,45
CI50
Antioxidante Fuente AAT (mM)
(M)
Vit. E Granos, nueces y aceites 1,0 0,03 2,40
-caroteno Zanahoria, calabaza - 4,30
Antioxidantes sintticos
Hidroxianisolbutilado (BHA) - - 0,18
Hidroxitoluenobutilado (BHT) - - 0,27
Trolox - - 1,26
Flavonoides, antocianidinas
Cianidina Uvas, frambuesa y fresas 4,4 0,12 0,21
Flavonoles
Cebollas, piel de
Quercetina manzanas, uva negra, t 4,7 0,10 0,22
y brcoli
Kaemferol 1,3 0,08 1,82
Rutina 2,4 0,12 0,51

CI50
Antioxidante Fuente AAT (mM)
(M)
Epigalocatequinas T 3,8 0,06 0,10
Epigalocatequingalato T 4,8 0,06 0,08
Epicatequingalato T 4,9 0,02 0,14
Flavanoles

Portada

19 Polifenoles en Alimentos
Epicatequinas Uvas negras/ vino tinto 2,4 0,02 0,19
Hesperitina Jugo de naranja 1,4 0,03 3,66
Naringenina Frutas ctricas 1,5 0,05 >16,0
Taxofolin Frutas ctricas 1,9 0,05 0,34
Hidroxicinamatos
Uvas blancas, olivo,
cido cafico 1,3 0,01 0,24
calabaza, esprragos
Manzanas, peras, tomate,
cido clorognico 1,3 0,02 0,30
melocotn
Uvas blancas, tomate,
cido cumrico 2,2 0,06 >16,0
calabaza, esprragos
cido tnico Vinos, t - 0,15

Tabla 1.2. Actividad antioxidante total (AAT) y concentracin a la inhibicin lipdica


CI50 de vitaminas y flavonoides de fuentes alimentarias

Tomado de Rice-Evans y col. y Vinson y col. 21, 22

1.4. Sntesis de la estructura y su influencia en la


actividad antioxidante de los polifenoles

La estructura qumica de los PF gobierna su absorcin, metabolismo,


biodisponibilidad, y en consecuencia su actividad antioxidante e
interacciones especficas con receptores celulares y enzimas endgenas.5

La capacidad AO de atrapamiento de diferentes especies de radicales


tambin vara, dependiendo de la reactividad qumica de cada
sustrato y el nmero de tomos/electrones de hidrgeno que pueden
ser donados. Estos mecanismos igualmente estn influenciados por
factores estructurales distintos de los descritos, tales como la presencia
o ausencia de restos glicosdico en el PF, en el sitio de glicosilacin, y el
nmero y posicin de los grupos de hidroxilo libre y esterificado.

Los flavonoides tienen un esqueleto bsico C6-C3-C6, que comprende


dos anillos aromticos y un anillo heterocclico que contiene un
tomo de oxgeno. En diversas etapas de la biosntesis, los grupos
hidroxilo le son introducidos a estos anillos. Los grupos libres de
hidroxilo son, pues, esenciales para la capacidad antioxidante
de los flavonoides.23 Tambin se sabe que algunos de flavonoides
quelantes metales trazas que desempean un papel importante en
el metabolismo del oxgeno y la generacin de los radicales.

Portada

20 Polifenoles en Alimentos
La quelacin del hierro por los flavonoides es predominantemente
un resultado de la fraccin catecol del anillo B y la estructura del
6,7 dihidroxi.24 Debido a su bajo potencial redox, los flavonoides
termodinmicamente reducen especies altamente oxidantes, tales
como los RL peroxilo, hidroxilo, alcoxilo y superxidos.25 La estructura
O-dihidroxicatecol presentes en la hoja del olivo, le confiere propiedades
antioxidantes que previene, entre otras estructuras fenlicas, los efectos
nocivos de agentes oxidantes que llegan a las plantas.26

1.5. Beneficios de los polifenoles de los alimentos en los


procesos de prevencin del estrs oxidativo

Los PF derivados y/o ismeros de flavonas, isoflavonas, flavonoles,


catequinas y cidos fenlicos se encuentran en diversas fuentes de
alimentos, por lo que las dietas que contienen estos alimentos son
ricas en PF y poseen propiedades AO; as que pueden ser importantes
en la prevencin del EO, fenmeno que incide en diversos procesos
negativos para la salud, como la activacin inducida de las plaquetas
y consecuente riesgo de produccin de trombos asociados con procesos
como la ateroesclerosis.

El EO produce un aumento de la actividad de las plaquetas y de la


inflamacin pudiendo ser causa principal del desarrollo de muchos
de estos trastornos, incluyendo las enfermedades cardiovasculares
(ECV), la trombosis, la diabetes mellitus tipo 2 (DM2), la
hipercolesterolemia y la aterosclerosis.27-30

El EO en la Diabetes M231 provoca una baja captacin de la glucosa


en el msculo daado,32 la oxidacin de lpidos y el dao celular del
endotelio vascular o su disfuncin, dando lugar al riesgo de trombosis
y complicaciones cardacas.

Numerosos estudios epidemiolgicos demuestran el papel de proteccin


de los AO provenientes de la dieta rica en frutas y verduras, donde
abundan los PF, contra procesos degenerativos celulares.33-35

Hung y col.36 recomendaron consumir cinco o ms porciones de frutas


y verduras al da para disminuir el riesgo de ECV, tras los resultados
positivos de un amplio estudio cohorte. Igualmente revisiones recientes
del tema han destacado el papel de los PF como efectos quimo preventivos
y anticancerosos37, 38 y propiedades contra el VIH/SIDA. 39

Portada

21 Polifenoles en Alimentos
La importancia que revisten los AO, y en particular los PF, para la
proteccin y atenuacin de estos trastornos determinan la necesidad de
su evaluacin en la composicin de las distintas fuentes de alimentos,
tanto in vitro como in vivo para poder dar criterios para la confeccin
de dietas o para la industria alimentaria, donde la elaboracin de
alimentos funcionales enriquecidos con estos PF tiene actualmente
una mayor disponibilidad como herramienta para la salud y un valor
agregado adicional.

1.6. Los alimentos ricos en polifenoles

La principal fuente de AO de la dieta se deriva de materiales vegetales.


Los fitoqumicos fenlicos (FQF) se encuentran en todo el reino vegetal.
Las tres categoras diferentes de fitoqumicos dietticos incluyen
los cidos fenlicos, polifenoles y los flavonoides. As la capacidad
antioxidante (CA) de los FQF indica que pueden ser tiles para el
desarrollo de alimentos funcionales.

Existen numerosos estudios de evaluacin de las frutas y verduras


utilizando mediciones de su CA, cuantificada mediante las tcnicas de
ensayo que se describen en el captulo 3.

La actividad antioxidante total evaluada en los alimentos fuentes de


AO, es generalmente la resultante de la combinacin, principalmente,
de vitamina C, carotenoides y polifenoles, permitiendo una evaluacin
integral de la realidad antioxidante que tiene en cuenta la interrelacin
y el sinergismo entre los componentes AO.40 Mediante este tipo de
tcnicas, como la Capacidad de Absorcin de Radicales de Oxigeno
(ORAC), se han clasificados algunos de los alimentos representativos de
las ms ricas fuentes de antioxidantes fenlicos, apareciendo en orden:
brcoli, t verde, soja, col rizada, remolacha roja, arndanos, cacao,
mora, uva roja, ciruelas pasas, ajo y ctricos.41, 42

De estas fuentes de AO se ha sealado un gran valor para los autctonos


de reas tropicales y subtropicales como es el caso de la guayaba
reportada con gran contenido de AO.43

En estudios realizados en Ecuador se demostr que la cascarilla de


cacao aporta una buena fibra diettica44 y esta fibra tiene un contenido
alto en polifenoles como la epicatequina, que son absorbidos tras su
ingesta contribuyendo a la actividad antioxidante en sangre.45

Portada

22 Polifenoles en Alimentos
En el maracuy, otro de los frutos importantes de la flora en la
regin que se consume en fresco o en jugo, adems de su alto valor
nutritivo como fuente de nutrientes, se ha reportado su riqueza
en compuestos fenlicos (8,646 0,08 mg EAG/g), especialmente
pigmentos antocinicos 0,0940,01 (mg EAG/g) de demostrada
actividad antioxidante con relacin entre el contenido fenlico
total y la actividad AO.46 Igualmente en evaluaciones mediante
determinacin de AO de extractos de residuos agroalimentarios, la
cscara del pltano aparece con un 24,6% de su peso en contenido de
fenoles totales.47

Muchos de estos frutos (arndano, fresa, papaya, la baya del acai,


moras, frambuesa y ciruelas) han sido administrados en humanos
en diferentes estudios de investigacin para evaluar sus efectos
con amplia documentacin al respecto.42, 48, 49, 20 En la Tabla 1.3 se
observan relaciones de AF y sus propiedades AO y afines. As se
demostr que las personas que consumen dietas ricas en frutas y
verduras pueden experimentar aumento de las concentraciones en
sus tejidos de AO (polifenoles, vitamina C, carotenoides).50

1.7. Los compuestos polifenlicos del vino y sus efectos

La hiptesis oxidativa de la aterognesis, y las propiedades benficas


in vivo de los polifenoles sealadas por Steinberg y col.,71 posee una
mayor vigencia en la actualidad, ya que permite explicar numerosas
observaciones sobre los factores de riesgo y sobre las relaciones
entre nutricin y arteriosclerosis que promocionan el papel de los
AO y puntualmente el de los PF. Esta propone esencialmente que
el proceso de formacin de las placas ateromatosa de las arterias
se desencadena cuando en la pared arterial del subendotelio, los
macrfagos captan descontroladamente las lipoprotenas de baja
densidad (LDL), ricas en colesterol, transformndose en clulas
espumosas que se van acumulando all.72 En ese espacio subendotelial
los macrfagos captan las LDL, pero, lo esencial es que solo captan las
LDL previamente oxidadas. Las captan porque estas clulas tienen
receptores especficos, llamados receptores de limpieza o receptores
multiligandos. Se desarrolla as, la placa o ateroma, elemento central
en la lesin vascular arteriosclertica.73, 28

En cada partcula de LDL, junto a una molcula de protena muy


grande, hay aproximadamente 1.700 molculas de colesterol y 2.700 de
cidos grasos de los cuales la mitad son cidos grasos poliinsaturados
Portada

23 Polifenoles en Alimentos
Alimentos Funcionales Propiedades Referencias
Capacidad para reducir las concentraciones de ROS,
inhibe la proliferacin vascular del msculo liso, previene
La vitamina C/ascorbato la disfuncin endotelial, reduce colesterol LDL oxidado 51, 52
en condiciones aterosclerticas y la presin arterial
disminuye la concentracin de PRC.
AO, anti-inflamatorio, y quimiopreventivo de actividad
Moras, frambuesa hipoglucemiante; inhibicin de la abiognesis, mejora de
53-57
(antocianinas) los factores de riesgo de ECV y la capacidad de inducir
saciedad/contrarrestar sobre peso.
Alta actividad AO y la disminucin de los niveles de
Carica papaya 58, 59
peroxidos en sangre.
Alimentos Funcionales Propiedades Referencias
Alto potencial antioxidante; exhibe buena actividad de
Ciruela
atrapamiento para radicales hidroxilos y pirxilo derivados 60, 61
(antocianinas)
del oxgeno.
Reducen los perfiles de colesterol en placas
Arndanos
aterosclerticas tienen un efecto neutro sobre el control 62
(antocianinas)
glucmico en sujeto que toma hipoglucemiante oral.
Propiedades antioxidantes y antiinflamatorias; disminuye
Arndano salvaje
significativamente la constriccin arterial, que puede estar 63
(antocianinas)
relacionada con la regulacin de.
Mejora la funcin vascular en pacientes con insuficiencia
Chocolate rico en
cardaca coronaria; mejora perfil de lipoprotenas, mejora 64-66
flavanoles
la funcin plaquetaria y reduce EO.
Oligmeros de cacao Flavonoides dietticos y oligmeros de procianidina de
67
(Procianidinas) cacao (Teobroma cacao) inhiben la funcin plaquetaria.
Tarta de cerezas Minimiza el dolor muscular despus de la carrera. 35
Alimentos Funcionales Propiedades Referencias
Jugo Marula (taninos,
Reduce el colesterol total y aumenta el colesterol HDL. 68
catequinas)
Aceite de oliva
El aceite de oliva mejora la funcin endotelial, reduce
epigalocatequina3- 69
parmetros inflamatorios.
galato

Tabla 1.3. Beneficios para la salud proporcionado por Alimentos Funcionales ricos
en Antioxidantes

PRC, Protena reactiva C; ECV enfermedad cardiovascular; HDL,


lipoprotena de alta densidad; LDL, lipoprotena de baja densidad; ROS,
especies reactivis de oxgeno. Tabla segn Santhakumar y col.70

Portada

24 Polifenoles en Alimentos
(AGPU). Para evitar la oxidacin, cada partcula LDL protege sus
casi 5.000 molculas lipdicas con solo seis molculas de a-tocoferol
y cantidades mucho menores de carotenoides y otros AO. Cuando los
AO de las LDL se agotan, los cidos grasos se fragmentan y oxidan
produciendo dao en la protena de la partcula.

El dao de la protena modifica sus cargas de superficie y se hace


reconocible por los receptores de limpieza de los macrfagos,
simultneamente irreconocible a los receptores para LDL nativa o que no
estn oxidadas, presentes en general en todas las clulas, con excepcin
de los macrfagos. As la sensibilidad de la LDL al dao oxidativo, clave
para el desarrollo del proceso, depende de un balance adecuado entre
la cantidad de AGPU y la concentracin de los AO en la pared de vaso
sanguneo donde puede instaurarse la placa ateromatosa.74

Est demostrado que el vino tiene propiedades AO y que estas se


deben a sus componentes polifenlicos,75 y ya en estudios de Abu-
Amsha y col.76 se haba demostrado que los vinos que quedaban
libres de PF o carecan de estos perdan esta actividad AO.

El contenido total de polifenoles de un vino se correlaciona directamente


con su capacidad AO.72, 21 Por otro lado, est tambin completamente
demostrado que los componentes fenlicos del vino inhiben la
susceptibilidad de las LDL a la oxidacin in vitro y tienen efecto
protector sobre las clulas bajo condiciones celulares de EO.78-80

Estudios in vivo de consumo agudo demuestran que la ingestin de vino


tinto est asociada a un aumento de la capacidad AO del plasma.81-83
Tambin en estudios de intervencin en humanos, de consumo
moderado de vino tinto durante mediano plazo, se ha demostrado una
menor susceptibilidad de las LDL a la oxidacin en los voluntarios que
haban bebido vino comparativamente con los que no.84-86

El consumo regular de vino tinto aumenta la resistencia de las LDL


a la oxidacin, constituyendo una muy buena evidencia para explicar
el efecto del vino segn la hiptesis oxidativa de aterognesis.
Resultan pues evidentes las propiedades AO del vino y el beneficio
de su consumo, aunque est condicionado a que no debe tener un
consumo mayor a dos copas al da por el componente alcohlico
presente en su composicin.

Portada

25 Polifenoles en Alimentos
1.8. Los fitoqumicos alimentarios (FQA) y afectaciones
por procesamiento y/o coccin de los alimentos

Los factores nutricionales son ampliamente considerados en la


actualidad como esenciales para la promocin y mantenimiento
de la salud humana. Existen sobradas evidencias de estudios
epidemiolgicos que indican que las dietas ricas en frutas y
vegetales estn asociadas con el bajo riesgo de varias enfermedades
degenerativas.

Sin embargo, la capacidad promotora de salud de tales alimentos


va a depender de su procesamiento. Este aspecto no ha sido
profundamente considerado en estudios epidemiolgicos desde el
punto de vista nutricional, ante la gran complejidad de las variables
que inciden al respecto. El procesamiento y la coccin de los alimentos
conllevan efectos sobre el contenido, la actividad y biodisponibilidad
de los FQA, por lo que es necesario para el mejor conocimiento del
papel y destino de antioxidantes naturales y procesados, o ambos,
evaluar las acciones fsicas y qumicas sobre los FQA. As, conocer la
estabilidad del alimento y su efecto sobre la salud humana acarrea
la necesidad de ms investigaciones en ese sentido.

La oxidacin de los AGPI genera numerosas molculas de


degradacin, que alteran tanto las caractersticas organolpticas
como las nutritivas de los alimentos ricos en AGPI, por lo que se hace
necesario la adicin de sustancias AO que prevengan la inhibicin
de la oxidacin; ya sea su iniciacin, propagacin o neutralizacin.87
Los AO pueden ser sensibles a la temperatura y otros factores del
procesamiento de los alimentos por lo que es necesario tener en
cuenta las afectaciones por procesos industriales y de coccin o
almacenamiento.

El consumidor de hoy da desea que aquellos AO presentes en los


alimentos, sean naturales que adems de estabilizar los alimentos
lipdicos, tambin puedan ser absorbidos a travs del intestino
delgado y protejan los lpidos sanguneos de la oxidacin. Este efecto
es relativamente evidente en el caso de los tocoferoles o el cido
ascrbico; pero es mucho menor para los AO de mediana polaridad
tales como flavonoides, romero oleoresinas o las catequinas del t
verde o negro.

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26 Polifenoles en Alimentos
Otras sustancias fenlicas presentes en los alimentos que no tienen
por s mismas actividad AO pueden en cambio incrementar la de
los AO fenlicos, trabajando como fenoles sinergistas. Los cidos
orgnicos polivalentes, aminocidos, fosfolpidos, lecitina y otros
agentes quelantes forman parte de este grupo.

1.9. Factores relacionados con el procesamiento de


alimentos

Diferentes mtodos de procesamiento trmico causan una reduccin


significativa en el contenido de fenoles totales y sus actividades
antioxidantes, en los granos88 y las legumbres.89 Sin embargo,
Rocha-Guzmn y col. 90 informaron de un aumento significativo en
la actividad antioxidante en frijol (Phaseolus vulgaris ) cocidos a 121
C. Del mismo modo, Khatun y col.91 observaron que el contenido
fenlico total y la actividad antioxidante aumentaron despus del
tratamiento trmico de varias especies.

En los aceites de oliva virgen extra, la concentracin de hidroxitirosol,


cido elenlico, decarboxi metil oleuropena aglicona y oleuropena
aglicona disminuy ms rpidamente que otros compuestos fenlicos,
despus del tratamiento trmico.92

En general, la cocina y los mtodos de preparaciones culinarias


tienen un efecto notable sobre el contenido de polifenoles,93
afectando tambin su biodisponibilidad y bioactividad. Miglio y
col.94 demostraron claramente que los parmetros fsico-qumicos y
las cualidades nutricionales de verduras (zanahorias en particular,
los calabacines y brcoli) son modificados por las prcticas de cocina
comunes. Se determin que las zanahorias perdieron completamente
sus polifenoles despus de hervir. Mientras, la coccin por vapor y
por fritura tuvo un efecto menos negativo (43% y 31% de prdida,
respectivamente).

Para el brcoli y los calabacines, los procesos de hervido y fritura


determinaron una mayor prdida de fenoles totales que por el
proceso al vapor. Sus resultados sugieren que para cada vegetal,
puede haber un mtodo de coccin preferencial para preservar o
mejorar sus cualidades nutricionales.

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27 Polifenoles en Alimentos
Tambin el almacenamiento afecta el contenido de polifenoles.
La conservacin de los zumos de manzana durante once meses
provoc una disminucin en los cidos fenlicos del 5% al 21%.95
En las frambuesas rojas congeladas tambin se observ una
disminucin en el contenido de cido p-cumrico libre.96 El brcoli
perdi aproximadamente el 75% de sus polifenoles despus del
almacenamiento en fro.97

Se estudi el contenido de polifenoles en vinos tintos durante el


almacenamiento de ms de siete meses en la oscuridad: el contenido
de antocianinas disminuy 88%, mientras que no ocurrieron
variaciones significativas en los contenidos totales de flavonoles.98

Procesos tecnolgicos, como la homogeneizacin de verduras,


podran aumentar la biodisponibilidad de los polifenoles por la
alteracin de la matriz del alimento, como se ha demostrado para el
licopeno y para -caroteno, dos de los carotenoides ms importantes.
De hecho, se ha demostrado que el pur de tomate y jugos obtenidos
por coccin del fruto son fuentes ms biodisponibles de licopeno que
el tomate crudo.99

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28 Polifenoles en Alimentos
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Portada

29 Polifenoles en Alimentos
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40 Polifenoles en Alimentos
2
Captulo

Captulo

Captulo

BIODISPONIBILIDAD
DE LOS POLIFENOLES

Portada

41 Polifenoles en Alimentos
Captulo 2. Biodisponibilidad de los polifenoles

2.1. Biodisponibilidad de los polifenoles (PF)

Los compuestos fenlicos en los alimentos, desde la dcada de los


aos 90, han atrado gran inters, debido a la creciente evidencia
de sus efectos beneficiosos sobre la salud humana. El inters fue
estimulado principalmente por estudios epidemiolgicos (EE) que
indican una asociacin inversa entre la ingesta de alimentos ricos
en estos compuestos y la incidencia de enfermedades, tales como
enfermedad cardiovascular, diabetes mellitus y el cncer, todas
dentro de las enfermedades crnicas no transmisibles ubicadas entre
las primeras causas de fallecimientos en adultos.1-5

El asesoramiento diettico actual para la salud, sugiere un consumo


ptimo de al menos cinco porciones de frutas y verduras todos los
das, y cada porcin con un mnimo de 80 gramos.6, 7 La evidencia
epidemiolgica para el beneficio de consumir una dieta rica en alimentos
que contienen PF es muy alta. Por el contrario, la evidencia de la fruta
o verdura especfica, y compuestos fenlicos especficos, no ha resultado
tan convincente, por lo que es ms aconsejable recomendar se consuma
tanta variedad de frutas y vegetales como sea posible.

Gran parte de la evidencia sobre los efectos beneficiosos de los PF


de la dieta se deriva de experimentos realizados in vitro e in vivo
en modelos animales, y mediante el uso de concentraciones mucho
mayores que las usualmente contenidas en la dieta humana. Adems,
a menudo los compuestos ensayados fueron agliconas de polifenol o
sus conjugados de azcar en lugar de sus metabolitos activos.

Puesto que los compuestos fenlicos en fuentes dietticas exhiben


potentes propiedades de atrapamiento de radicales, se pensaba que
su funcin principal era su papel antioxidante (AO), participando
en la proteccin contra la peroxidacin lipdica. Sin embargo, en la
ltima dcada, el modo de accin de estos compuestos ha resultado
ser ms complejo de lo que originalmente se esperaba.8-11

Los PF podran ejercer otros efectos biolgicos especficos. Ellos


pueden inhibir la proliferacin de clulas carcinognicas y participar
en la absorcin de colesterol,12, 13 modular diferentes enzimas
incluyendo la telomerasa14 ciclooxigenasa15, 16 y la lipoxigenasa,17, 19 e
interactuar con varias vas de transduccin de seales.20-24
Portada

42 Polifenoles en Alimentos
El trmino biodisponibilidad fue originalmente utilizado en
farmacologa para definir el concepto de velocidad y el grado en que
un medicamento llega a su sitio de accin. Aunque se han sugerido
varias definiciones de la biodisponibilidad, el ms apropiado parece
ser cuando un compuesto ingerido alcanza la circulacin sistmica y
los sitios especficos donde puede ejercer su accin biolgica.25

Para establecer una prueba concluyente de la efectividad de los PF en la


prevencin de enfermedades y la mejora de la salud humana, es esencial
determinar la distribucin de estos compuestos en nuestra dieta,
estimar su contenido en cada comida, e identificar cules de los cientos
de PF existentes son probables de proporcionar los mejores efectos
beneficiosos en el contexto de la nutricin preventiva. Finalmente, es
necesario conocer la biodisponibilidad de los PF y sus metabolitos, para
evaluar su actividad biolgica en los tejidos diana.25

2.2. Distribucin y contenido de PF en alimentos

Las fuentes de alimentos ms importantes son las de aquellos que son


consumidos en grandes cantidades, como: frutas y verduras, el t verde y
el negro, el vino tinto, el caf, el chocolate, las aceitunas y el aceite de oliva
virgen extra. Las hierbas y especias, frutos secos y las algas tambin son
potencialmente significativas para el suministro de ciertos PF.26

Los alimentos en general contienen mezclas complejas de PF.27


Las manzanas, por ejemplo, contienen monmeros u oligmeros de
flavanoles, cido clorognico y pequeas cantidades de otros cidos
hidroxicinmicos, varios glucsidos de quercetina, y dos glucsidos de
floretina y antocianinas.28 El perfil de PF para todas las variedades
de manzanas es prcticamente idntico, pero las concentraciones
pueden diferir significativamente. Ellos pueden variar desde 0,1 g de
polifenoles totales/kg de peso fresco a 10 g/kg en ciertas variedades
de manzanas para sidra.29, 30

Los vinos tambin contienen una compleja mezcla de PF, la mayora


de los cuales se originan en la baya de la uva. Incluyen flavonoles,
flavanoles, proantocianidinas, antocianinas, cidos fenlicos,
hidroxicinamatos y estilbenos.31, 32 Entre estos compuestos, el trans-
resveratrol es uno de los ms estudiados debido a que se considera
que es el compuesto principal responsable de los beneficios del vino
tinto para la salud humana.33-37 Sin embargo, la concentracin de
este estilbeno en el vino tinto vara considerablemente.38, 39
Portada

43 Polifenoles en Alimentos
Hay mucha variacin tambin en la composicin y concentracin de
compuestos fenlicos entre los aceites de oliva virgen. Contienen al
menos 36 compuestos fenlicos estructuralmente distintos,40 cuya
concentracin total va de rangos de 0,02 a 600 mg/kg.41, 42

2.3. La biodisponibilidad de PF, su absorcin y


bioactividad

La metodologa general para estudiar la biodisponibilidad de los PF


tiene que ser respetada. El enfoque ms acertado de estudio es in
vivo, utilizando principalmente el diseo con una sola dosis. Se trata
de la ingesta de una porcin de alimento que contiene el PF a evaluar.
El aumento de la concentracin en la sangre refleja principalmente
la capacidad del organismo para absorber PF de la matriz del
alimento. Por lo tanto, el aumento observado en sangre es el paso
necesario para la captacin tisular y bioactividad del compuesto.

En condiciones de ingesta regular, incluso cantidades de PF bajas


pueden ser repetidamente absorbidas y aumentar significativamente
las concentraciones, tanto en el plasma como a nivel celular.43
Conclusiones definitivas sobre la biodisponibilidad y bioactividad de
un compuesto fenlico en particular son difciles de obtener, debido
a los efectos sinrgicos de la mezcla de PF contenidos en cada matriz
alimentaria ensayado.

2.4. Interaccin de los PF con otros compuestos de los


alimentos o del organismo

Otro factor que afecta la biodisponibilidad es la interaccin de los


PF con otros compuestos presentes en el alimento o durante la
absorcin y presencia en el organismo. La capacidad de los PF y sus
metabolitos para unirse a protenas debe considerarse al determinar
la bioactividad en general. Existen estudios publicados acerca de
la existencia de enlaces intermoleculares entre la albmina srica
y metabolitos de quercetina, que afirma su lenta eliminacin del
organismo.43 Del mismo modo, epigalocatequina-3-O-galato posee
una alta afinidad por protenas de la sangre44 que, potencialmente,
podra prolongar su vida media en la sangre. La unin de los PF a la
albmina y otras protenas de la sangre pueden tener consecuencias
en la disponibilidad de estos compuestos y sus metabolitos para su
utilizacin en las clulas y tejidos del organismo.

Portada

44 Polifenoles en Alimentos
Por otra parte, las interacciones con otros compuestos fenlicos
con mecanismos similares de absorcin pueden influir en la
biodisponibilidad de los PF. Se ha demostrado recientemente que,
tras el calentamiento, el oleocantal, sufri una ligera disminucin
en la concentracin del 16%, lo cual fue suficiente para provocar una
disminucin significativa en su actividad biolgica.45

2.5. Estructura qumica de los PF

Uno de los factores principales que influye en la biodisponibilidad


de los PF es su estructura qumica. En los alimentos la mayora de
estos compuestos existen como polmeros o en formas glicosiladas:
el grupo azcar es conocido como glicona y el polifenol se conoce
como la aglicona. Los PF en sus estructuras naturales no pueden
ser absorbidos, deben ser hidrolizados por las enzimas intestinales
o por la microflora del colon antes de la absorcin. Las antocianinas
representan una excepcin, ya que los glucsidos intactos pueden ser
absorbidos como tal y han sido detectados en sangre.46

La explicacin de este mecanismo puede basarse en la inestabilidad


de la forma aglicona o en un mecanismo especficos de absorcin,
segn sugieren varios estudios.47, 48 La estructura qumica especfica
de PF, as como el tipo de azcar en el glucsido, determina la
velocidad y la extensin de absorcin intestinal.

Los PF de la dieta se modifican ampliamente durante la absorcin,


en seres humanos. Los glicsidos pueden ser hidrolizados en el
intestino delgado o en el colon, y las agliconas liberadas podran ser
absorbidas. Los PF se someten a otras modificaciones estructurales
debido al proceso de conjugacin, principalmente en el hgado.
Todas estas modificaciones afectan de forma sensible a la actividad
biolgica de los polifenoles.49-51 En consecuencia, los compuestos que
llegan a clulas y tejidos son qumicos, biolgicos y, en muchos casos,
funcionalmente diferente de la forma original que poseen en la dieta.

El inters actual en PF ha sido impulsado principalmente por muchos


EE. La epidemiologa es una herramienta valiosa y necesaria, cuyo
objetivo es establecer una asociacin estadsticamente vlida entre
la salud de una poblacin y uno o ms factores que influyen en ella.
Sin embargo, la demostracin de una relacin estadstica altamente

Portada

45 Polifenoles en Alimentos
significativa no establece relacin causa-efecto, aunque puede
sugerir la causalidad.

Para demostrar la causalidad que es esencial para definir una cadena


lgica de eventos basados en la bioqumica, la qumica y la fisiologa,
y para apoyar esta, hay que realizar estudios de intervencin.

Los estudios de intervencin son muy difciles de llevar a cabo, por


lo que en muchos casos el apoyo adicional viene inevitablemente por
los estudios in vitro y en animales. Cuando la sustancia de ensayo es
ms efectiva para el tejido, se obtienen resultados interesantes y las
extrapolaciones que siguen son mucho ms fiables.

La dosis utilizada para el estudio in vivo debe reflejar la vida real: las
concentraciones ensayadas comnmente van desde concentraciones
de mol/L a mmol/L, mientras que las concentraciones de metabolitos
en plasma, despus de una ingesta diettica normal, rara vez exceden
nmol/L.52-54 El empleo de dosis elevada en estudios in vitro se puede
utilizar para forzar una respuesta, pero tales resultados deben
extrapolarse con gran cautela.

Una idea s est clara y es que la ingesta de un PF especfico de forma


frecuente hace que las clulas estn expuestas constantemente a la
misma, por lo que permite producir efectos significativos, a pesar de
que las concentraciones del PF en cuestin sean bajas.

Los estudios en animales proporcionan informacin muy valiosa,


y superan algunas de las dificultades asociadas con los ensayos
de intervencin humana. Por ejemplo, los animales pueden ser
utilizados en un estudio de tres generaciones, lo que permite la
investigacin sobre los efectos reproductivos y sobre la descendencia,
algo que requiere ms de 60 aos en los seres humanos y, obviamente,
impracticable por muchas razones.

Los datos sobre la distribucin tisular de los PF se derivan


principalmente de los estudios en animales,55-57 pero las diferencias
entre los genomas de humanos y animales tambin pueden conducir
a problemas fallidos por extrapolacin.

La mayora de los resultados en seres humanos presentados en la


literatura sobre la biodisponibilidad se refieren solo a la liberacin de
los PF a partir de la matriz del alimento y su consiguiente absorcin
Portada

46 Polifenoles en Alimentos
(es decir, la concentracin en la sangre o en la orina).

La determinacin de la biodisponibilidad de los PF en los tejidos


diana va ms all que el conocimiento de sus concentraciones
plasmticas.28 An es bastante difcil evaluar la acumulacin y la
actividad biolgica de los PF en los tejidos humanos, y los estudios in
vivo son todava muy escasos, aunque han aumentado rpidamente
en los ltimos aos58-60.

La evaluacin de la biodisponibilidad de los PF ha ganado


recientemente un creciente inters debido a que la industria
alimentaria est involucrada continuamente en el desarrollo de
nuevos productos, que se definen como alimentos funcionales, en
virtud de la presencia de PF especficos. A pesar de la creciente
cantidad de datos disponibles, las conclusiones definitivas sobre la
biodisponibilidad de la mayora de los PF son difciles de obtener y
son necesarios ms estudios.

Al menos deben ser exploradas tres lneas fundamentales de la


investigacin para obtener una comprensin clara de los PF de la
dieta en relacin a sus efectos beneficiosos para la salud.

1. Investigar de forma ms exhaustiva el potencial de actividad biolgica de los metabolitos de muchos


polifenoles de la dieta.

2. Se deben desarrollar estrategias para mejorar la biodisponibilidad de los polifenoles.

3. Los beneficios para la salud de los polifenoles de la dieta deben ser demostrados en modelos
animales apropiados de la enfermedad y en los seres humanos en dosis reales de consumo.

Tabla 2.1. Tres lneas fundamentales de la investigacin para obtener una


comprensin clara de los PF de la dieta vs efectos beneficiosos para la salud

Estos son pasos importantes a desarrollar para la comprensin


del papel de los PF en la salud humana y para la optimizacin
de asesoramiento diettico a la poblacin. Tambin resultan
fundamentales para la industria alimentaria y su participacin en
este contexto a travs de la produccin de alimentos funcionales,
suplementos y alimentos fuentes de PF y sus procesamientos ms
adecuados.

Portada

47 Polifenoles en Alimentos
BIBLIOGRAFA

Portada

48 Polifenoles en Alimentos
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Portada

54 Polifenoles en Alimentos
3
Captulo

Captulo

Captulo

MTODOS
ANALTICOS PARA
LA EVALUACIN DE
LAS PROPIEDADES
ANTIOXIDANTES DE
LOS POLIFENOLES
DE FUENTE
ALIMENTARIA

Portada

55 Polifenoles en Alimentos
Captulo 3. Mtodos analticos para la
evaluacin de las propiedades antioxidantes
de los polifenoles de fuente alimentaria

3.1. Introduccin

En el estado normal del metabolismo de los organismos aerobios, los


niveles de oxidantes y antioxidantes deben mantenerse en equilibrio,
lo cual es importante para conservar las condiciones fisiolgicas
ptimas del mismo.1 El desbalance con el predominio del estado
oxidativo en determinadas condiciones puede producir un dao a
diferentes biomolculas principalmente a lpidos, ADN, y protenas
lo que puede estar implicado en el desarrollo de enfermedades
degenerativas como el cncer, arteriosclerosis y problemas
cardiovasculares, primeras causas de muerte en el mundo.

La presencia de antioxidantes provoca un efecto protector a las


macromolculas susceptibles de la oxidacin, como pueden ser
algunas vitaminas y polifenoles (PF), los cuales llegan al organismo
principalmente a travs de la dieta. As el eje fundamental de este
proceso resulta del balance entre la generacin de radicales libres
(RL) y la defensa antioxidante para evitar el dao celular (Grfico 3.1).

Grfico 3.1. Balance entre generacin de RL y defensa AO


Portada

56 Polifenoles en Alimentos
Al provenir los alimentos de un sistema aerobio las posibilidades de
un desbalance oxidativo pueden estar presentes en los mismos, por
lo que resultan tambin importantes los cuidados en su recoleccin,
elaboracin y conservacin para ser consumidos en ptimas condiciones
como fuente de sustancias nutricionales y funcionales.

3.2. Proceso de oxidacin en macromolculas

3.2.1. Peroxidacin Lipdica

La peroxidacin lipdica (POL) es un proceso inducido por especies


reactivas del oxgeno (ERO), el cual ha sido ampliamente estudiado.
La presencia de una elevada concentracin de fosfolpidos en las
membranas de las clulas vegetales o animales, las lipoprotenas de baja
densidad (LDL) en sangre, los alimentos como grasas de fritura, huevo
deshidratado, alimentos ricos en cidos grasos poliinsaturados (AGPI)
entre otros, son blancos muy sensibles a la oxidacin.

Las fuentes principales por las cuales nuestro organismo puede ser
portador de sustancias oxidantes son las producidas endgenamente
(a travs de la cadena respiratoria de las mitocondrias y por accin de
los leucocitos) o importarla a travs de los alimentos alterados por va
oxidativa, que continan en el organismo su cadena de reaccin, o por la
polucin del ambiente.

La exacerbacin de las reacciones oxidativas por encima de las


posibilidades de la acciones de los antioxidantes puede provocar el
establecimiento del estrs oxidativo (EO), siendo los AGPI de nuestro
organismo blancos altamente susceptibles a la peroxidacin (PO).

El proceso de peroxidacin oxidativa trascurre en forma de reacciones en


cadena. Como resultado de estas reacciones se forma una gran cantidad
de productos de degradacin, alguno de los cuales tienen per se efectos
biolgicos y pueden actuar como segundos mensajeros del dao por ERO.

La peroxidacin lipdica (POL) conduce a un aumento considerable de


la permeabilidad de las membranas celulares, que origina alteraciones
irreversibles de las propiedades funcionales de la clula que pueden
conducir a su lisis total.2

Portada

57 Polifenoles en Alimentos
En resumen la POL puede disminuir la fluidez de las membranas
biolgicas, inactivar enzimas y receptores asociados a la membrana
celular y aumentar la permeabilidad al Ca .
2+

3.3.2. Peroxidacin lipdica en alimentos

La ingestin de grasas oxidadas a travs de grasas de fritura


u otra alteracin oxidativa de los lpidos de los alimentos en
forma de perxidos, pueden ser eliminadas por transformaciones
gastrointestinales a alcoholes y otros compuestos, y pueden ser
rpidamente excretadas; por lo que la toxicidad de los perxidos, en
particular, por va exgena no tiene tanta repercusin.

En el Grfico 3.2. se muestra la cadena de reacciones responsables


de la POL. En la fase de iniciacin un radical de elevada reactividad
como el hidroxilo extrae un tomo de hidrgeno de un cido graso
insaturado produciendo el radical lipdico, el cual se reorganiza
y forma dienos conjugados que en su reaccin con el O2 dan lugar
al radical peroxilo, con suficiente reactividad como para atacar
otro lpido, conduciendo a la propagacin de la POL. En la fase de
terminacin y en presencia de hierro se producen aldehdos y otros
compuestos que son utilizados como marcadores biolgicos del dao
a los lpidos.

R H2O

+ OH Lpido radical
H
Iniciacin

Lpido insaturado O2
Propagacin

R R R

+
OOH H OO

Lpido perxido Lpido peroxil radical

Grfico 3.2. Secuencia de reacciones durante la peroxidacin lipdica


Portada

58 Polifenoles en Alimentos
3.4. La carne y productos crnicos

La presencia en carnes y productos crnicos, de hierro ferroso (Fe+2),


en la hemoglobina (Hb) y mioglobina (Mb) pueden catalizar la PO de
sus lpidos, hacindolas muy susceptibles a este tipo de deterioro.

La presencia de las enzimas lipoxigenasas tambin puede contribuir


al proceso de oxidacin en lpidos de productos crnicos. El tejido
muscular tambin es ms susceptible a la oxidacin por la presencia
de fosfolpidos y el contenido de grasa en general, principalmente en
las membranas de las clulas. Los productos finales de la oxidacin
lipdica pueden interactuar con las protenas, dando lugar a productos
finales ms txicos.

Las carnes trituradas son ms propensas a la oxidacin si se conserva


a 5 oC de 2 a 10 das, teniendo en cuenta la ruptura celular y el rea
de exposicin al O2. Tampoco debe conservarse la carne despus de
cocida debido a la desnaturalizacin de la Hb y Mb y la liberacin del
hierro ferroso. La carne de aves tiene menor contenido de hierro pero
poseer mayor cantidad de fosfolpidos, por lo que es tambin muy
sensible a la oxidacin.

Uno de los AO utilizados para prevenir la oxidacin en carnes es el


polifosfato en concentraciones de 0,01-0,1% y la vitamina C al 0,1%
en forma de palmitato de ascorbilo.

3.5. La carne de pescado

En el pescado el alto contenido de cidos grasos poliinsaturados


(AGPI) y la Mb presente hace que sus grasas sean muy susceptibles
a la oxidacin.

Las lipoxigenasas del pescado actan tambin a temperaturas


de refrigeracin, por lo que es conveniente la conservacin de
pescado despus de una ligera coccin y el uso de vitamina C como
antioxidante.

El pescado, al ser una carne blanca, tiene menor propensin a la


oxidacin que las carnes rojas teniendo en cuenta el contenido de
hierro ferroso, pero sus grasas son muy sensibles a cualquier agente
oxidante. Por esto como lmite solo se permite una concentracin de
malondialdehdo MDA de 1,4 mg/kg en el pescado.
Portada

59 Polifenoles en Alimentos
3.6. La leche

En la leche fresca la oxidacin de los AGPI, principalmente de los


fosfolpidos de membrana del glbulo graso (<1% de los lpidos totales)
es muy viable. Existe un porcentaje bajo de rancidez catalizada por
trazas de Fe y Cu y vitamina C.

La leche deshidratada, particularmente la leche entera, debido


al contenido principalmente de sus fosfolpidos y triglicridos, se
oxida con rapidez, formndose aldehdos como el bisaconal, por lo
que se aconseja su empaque al vaco o N2(g), y conservarse a 10o C,
alcanzndose la mxima proteccin a 0 oC.

3.7. Los vegetales

Los vegetales poseen altas concentraciones de fosfolpidos, por lo que


se utiliza para su conservacin el empaque al vaco o se emplea N2 (g)
para evitar el contacto con el O2; tambin se adicionan antioxidantes.
Generalmente se emplea como paso previo el proceso de escaldado
para la eliminacin de la enzima lipoxigenasa.

3.8. El proceso de fritura y los lpidos oxidados (LO)

La probabilidad de oxidacin de los cidos grasos insaturados (AGI)

cido Oleico (18:1) 1 W9


cido Linolico (18:2) 12 W6
cido Linolnico (20:3) 100 W3

La grasa de fritura es la va principal para ingerir lpidos oxidados.


Las grasas sometidas a altas temperaturas y en presencia de oxigeno
poseen una probabilidad alta de oxidacin.

El proceso de fritura se lleva a cabo dentro de los 175 oC-180 oC.


Cuando el alimento que se fre alcanza los 100 oC, el agua comienza
a liberarse por evaporacin; de esta manera, cuando la grasa
va aumentando la temperatura entre 100 oC a 180 oC, se produce
la penetracin de la grasa en el alimento. El cambio de agua por
grasa y la formacin de la cobertura en forma de costra aumentan la
palatabilidad de los alimentos fritos.

Portada

60 Polifenoles en Alimentos
Cuando la fritura se lleva a cabo correctamente la cantidad del aceite
ingerido no es mayor que en otros procesos culinarios donde se utilizan
grasa o aceite. Esto se evidencia cuando el alimento frito no mancha de
grasa el papel donde se deposita.

Las alteraciones organolpticas de las grasas producto del deterioro


por fritura son ya tardas en relacin a las reacciones iniciadas de la
oxidacin, por lo que es necesaria la determinacin de parmetros
qumicos-fsicos, durante el proceso, en tiempos establecidos, segn el
alimento y el tipo de grasa.

El olor y sabor a rancio, la excesiva formacin de humo y espuma, el


oscurecimiento del color y la formacin de residuos viscosos que provocan
rechazo, son indicativos de un deterioro anterior solo detectable por
evaluaciones analticas.

El calentamiento de las grasas a elevadas temperaturas origina


compuestos qumicos no voltiles que permanecen en ellos y se
incorporan a los alimentos con la posibilidad de provocar efectos txicos.

El proceso principal de dao provocado por la oxidacin de los AGPI,


en presencia de O2 y altas temperaturas, se produce al convertirse los
hidroproxidos no voltiles a aldehdos y cetonas que son inodoras pero
no inspidas.

3.9. Biomarcadores (BM) de evaluacin de procesos o


productos de oxidacin

Para el estudio de los daos que originan las ERO se hace necesario
contar con biomarcadores que permitan monitorear su participacin
en la patognesis de una enfermedad, desorden o en la toxicidad de
un xenobitico, o nutriente oxidado.

Un biomarcador debe reflejar modificaciones en un sistema biolgico


relacionado con la exposicin o el efecto de un agente externo o factor
txico.

Existen diferentes tipos de biomarcadores:

Biomarcadores de monitoreo ambiental (BM a una exposicin potencial),


BM de monitoreo biolgico, BM del efecto biolgico y BM de vigilancia
de salud.3
Portada

61 Polifenoles en Alimentos
Los BM del efecto biolgico (BEB) estn relacionados con la medicin
de un efecto temprano o tardo de una sustancia qumica u otro factor
en un sistema fisiolgico, rgano u organismo. Los BM del balance
redox van a clasificarse dentro de esta categora. La medicin de un
BEB persigue monitorear o identificar a individuos o poblaciones
de riesgo, frente a un efecto daino a la salud y tomar las medidas
preventivas necesarias.

Un BM ideal debe reunir las caractersticas siguientes:

1. Alta especificidad para el efecto de inters.

2. Ser reflejo de un efecto temprano.

3. Su deteccin debe ser fcil y de bajo costo.

4. Factibilidad de realizacin con muestras tomadas de forma no


invasivas.

5. Bajo nivel de interferencia con el fluido biolgico de inters.

6. Correlacin entre los niveles de exposicin y la respuesta del BM.

7. Debe existir correlacin entre la magnitud del dao y la respuesta


del biomarcador.

3.9.1. Biomarcadores del dao a lpidos

Existen mltiples ensayos para el estudio de la peroxidacin sobre


lpidos y fosfolpidos; los ms empleados utilizan homogenados de
cerebro (de ratas o bovino), liposomas de fosfolpidos, cidos grasos,
entre otros. La oxidacin se genera por va enzimtica, catalizada por
adicin de metales o generando en el medio alguna ERO. El agente
en estudio se coloca en el sistema y se calculan los porcentajes de
inhibicin de la oxidacin.4

Los grupos principales de productos derivados de los procesos de


la POL que tienen utilidad como BM son: hidrocarburos voltiles,
derivados de la oxidacin del cido araquidnico (AA), aldehdos,
hidroperxidos y dienos conjugados.

Portada

62 Polifenoles en Alimentos
3.10. Tcnicas de deteccin de oxidacin

3.10.1. Inhibicin de la peroxidacin lipdica en


homogenado de cerebro de rata

La determinacin de la (CI50) expresa la cantidad de muestra,


(alimento, xenobitico, suero y otros), que es capaz de inhibir el 50%
de la oxidacin del homogenado de cerebro de ratas.5

El homogenado de cerebro de rata se prepara utilizando 16 g de cerebro


y 64 mL de PBS helado, el cual se homogeniza en un homogenizador
a 16.000 r.p.m., por dos veces durante 15 segundos y alternando
un min. en bao de hielo. Posteriormente se centrifuga a 1.000 g
por 15 minutos y se conserva el sobrenadante en viales de 2,5 mL
almacenados a temperatura de -20 oC hasta el momento del ensayo.

Procedimiento

Para el ensayo se toma por cada vial de 2,5 mL de homogenado, 7,5


mL de PBS pH=7,4 10 mM, y en cada determinacin se adiciona 1
mL de homogenado diluido y diferentes cantidades de la muestra a
analizar, as como un blanco con PBS. Todas las muestras de ensayo
se mantienen a 37 oC durante 1 h para el desarrollo de la reaccin
de oxidacin. Para la determinacin de los productos de oxidacin se
emple la tcnica de la determinacin de MDA.

3.10.2. Determinacin de MDA como ndice de


peroxidacin lipdica

3.10.2.1. El N-metil-2-fenil-nidol

Este mtodo colorimtrico se basa en la reaccin entre el N-metil-


2-fenil-nidol con el MDA (aldehdo producto en la oxidacin de los
lpidos) a 45 oC. Una molcula de MDA reacciona con dos de N-metil-
2-fenil-nidol rindiendo un cromforo estable que absorbe a 586 nm.6

Procedimiento

Se aade 650 L de la solucin N-metil-2-fenil-nidol y 200 L de cada


muestra, obtenida en la tcnica anterior, se agita en un agitador y
se adiciona 150 L de cido clorhdrico 35%, se tapan y se incuban
a 45 oC durante 60 minutos. Finalmente, se enfra a temperatura
Portada

63 Polifenoles en Alimentos
ambiente, centrifugndose por 15 minutos a 3.000 r.p.m. y se lee a
586 nm contra el blanco reactivo.

Para los clculos se emplea la siguiente expresin:

nmol de MDA/mL (muestra60) - nmol de MDA/mL (muestra t=0) 100


CI=
nmol de MDA/mL (control60) - nmol de MDA/mL (controlt=0)

3.10.3. Actividad de inhibicin de la peroxidacin lipdica.


Sustancias Reactivas al cido Tiobarbitrico (TBARS)

Se provoca la peroxidacin de los cidos grasos de la muestra de


homogenado de cerebro o de AGPL, a travs de la accin prooxidantes
de la mezcla de FeCl2 y vitamina C preparadas en el da, a una
concentracin de 3,5 mg/10 mL de agua destilada en cada caso.

Para el ensayo se toma 1 mL de la muestra base que se describe arriba


y se adiciona 50 l de FeCl2 y de vitamina C, incubndose a 37 C y
se les aade 200 l de las muestras a evaluar como inhibidores de
la POL a concentracin de 100 ppm; adems se emplea 200 L de
etanol-agua (6:4) como blanco (control negativo) y 200L de hidroxi
tolueno butilado (BHT) como control positivo en sustitucin de la
cantidad de muestra para determinar la mxima y mnima oxidacin
respectivamente.

La reaccin de oxidacin se lleva a cabo por una hora, a 37 C se toma


1 mL de cada ensayo y se adicionan 2 mL de cido tiobarbitrico
(TBA) 20 mM (2,88g/L) en cido tricloroactico (TCA) al 15%. Las
reaccin transcurre en agua hirviendo por 15 min, donde se produce
el desarrollo de color, entonces se centrifuga por 15 min a 4.000 rpm y
los sobrenadantes obtenidos se le mide la absorbancia a 532 nm en un
espectrofotmetro UV / VIS. Los valores de TBARS se calculan a partir
del estndar 1,1,3,3-tetraetoxipropano (TEP) (1 mM) y se expresan en
concentracin de malondialdehido o en mg de malondialdehdo/kg.7

3.10.4. Dienos conjugados (DC)

La determinacin de DC es un mtodo relativamente nuevo de


medicin del dao oxidativo a los AGPI. Los hidroperxidos (LOOH)
Portada

64 Polifenoles en Alimentos
poseen DC caractersticos en sus estructuras que absorben la luz UV
alrededor de los 234 nm. La medicin de DC es muy til en sistemas de
lpidos puros o preparados de tejidos de animales de experimentacin.

En materiales biolgicos en general, sustancias como las hemoprotenas


absorben la luz en esta regin, interfiriendo con la determinacin.
Por tanto, se recurre a extracciones con cloroformo en las que aun
interfieren diferentes compuestos carbonlicos que absorben a 210 nm,
por lo que se prefiere el anlisis mediante el mtodo de la segunda
derivada del espectro UV, mtodo que permite distinguir incluso entre
diferentes tipos de DC presentes.

Ms del 90% de los DC presentes en el plasma humano corresponden


a ismeros del cido linoleico (no presente en animales). Este producto
puede provenir de la dieta o ser producido por el metabolismo de
bacterias intestinales.

3.10.5. Poder reductor de los grupos sulfidrilos (SH).


Protenas con grupos SH

La determinacin de protenas con grupos SH pueden determinarse


segn modificaciones de Romay y col.8 sobre el mtodo de base que
reside en la reduccin del cido 5,5-detiobis-2nitrobenzoico (DTNB),
por los compuestos sulfidrilos, formndose un anin coloreado cuya
absorbancia se registrada a 412 nm. El coeficiente de extincin molar
es de 13,60 mM.

3.11. Uso de los antioxidantes (AO) en alimentos

El proceso de oxidacin es la causa de mayor deterioro que sufren los


alimentos, despus de la contaminacin microbiana, por lo que se hace
necesaria la adicin de sustancias AO que prevengan la inhibicin de
uno de los pasos de la oxidacin: iniciacin, propagacin o terminacin.

La industria ha venido utilizando preferentemente los AO sintticos por


su potencialidad y la no incorporacin de olores y sabores al producto
como el hydroxi anisol butilado (BHT), el hidroxi tolueno butiado (BHA)
y el tetrabutil hidroquinona (TBHQ).

El BHA al 0,01% es eficaz para inhibir la oxidacin de lpidos en la


carne molida vacuna.9 Sin embargo, las concentraciones de adicin de
estos AO sintticos es restringida por la mayora de las legislaciones
Portada

65 Polifenoles en Alimentos
regulativas internacionales, como por ejemplo hasta el 0,02% por
las agencias canadiense y norteamericana respectivamente, a causa
de sospechas de algunos efectos txicos y posibles carcinognicos
asociados a su ingestin prolongada.10-13

Las limitantes de los niveles de inclusin para estos aditivos, por


sus posibles consecuencias y la necesidad de adicionar AO a los
alimentos, ha incrementado la bsqueda de fuentes de AO naturales,
cuya actividad proviene mayormente de los compuestos polifenlicos:
los flavonoides, isoflavonas, flavonas, antocianinas, catequinas y
otros molculas fenlicas.14, 15 Esta posibilidad de sustitucin del AO
sintticos por naturales aparece como una alternativa importante
en la industria de los alimentos, por la inocuidad de los mismos y
la preferencia de los consumidores a productos o suplementos de
fuentes naturales.16

Diversos extractos de plantas, frutas y aceites esenciales se han


ensayado como AO naturales. Algunos como la cscara de ctricos,
romero (Rosmarinus officinalis), organo (Origanum vulgare L),
granada (Punica granatum), yerba mate (llexpara guariensis) han
dado buenos resultados en su utilizacin para productos crnicos y
pescados.17-20

La adicin de extracto etanlico de yerba mate en albndigas de


carne de pollo disminuy sensiblemente su POL, medidas mediante
determinacin de TBARS y de la deplecin de vitamina E.21

En pescado con altos contenidos en AGPL, como el salmn, los ensayos


de adicin de pastas de ajo (Allium sativum L), baslica (Ocimun
santum L), (Capsicum frutescens L) y de ajo y pimienta negra (Piper
nigrum L) para mejorar su conservacin, evidenciaron acciones AO
y antibacterianas muy favorables, para esta segunda combinacin,
con menores ndices de ranciedad por TBARS e inhibicin del
crecimiento de bacterias mesfilas.22 Con independencia del efecto
AO buscado, el factor complementario necesario para la viabilidad
del producto radica en que no produzca modificaciones sensibles en
las caractersticas organolpticas y tenga buena aceptabilidad.

3.11.1. Caracterizacin de antioxidantes AO

Debido al empleo a gran escala de compuestos naturales o sintticos


como AO profilcticos, se hace necesario un estudio ms profundo
Portada

66 Polifenoles en Alimentos
de las propiedades anti o pro-oxidantes de la molcula que se
propone. Con estos fines se han diseado diferentes metodologas
experimentales. El desarrollo de estas metodologas es un factor
crtico de gran importancia en las estrategias de formulacin de un
suplemento AO y tambin en la elaboracin de alimentos fortificados.

Atendiendo a la diversidad de las variantes experimentales y de los


sistemas de ensayo, diseados para el estudio de un AO, resulta de
inters examinar las premisas bsicas que permitan considerar a un
agente cualquiera como AO, as como la metodologa para su estudio.

Un AO es aquella sustancia que presente, en muy bajas


concentraciones comparadas con la sustancia oxidable, retarda o
previene la oxidacin de esta ltima. 23

Desde el punto de vista fisiolgico est bien establecido la


participacin, en los mecanismos de defensa AO, de la enzimas
superoxidodismutasa (SOD), Glutatin peroxidasa (GPx), Catalasa
(CAT) y de otras protenas como la ceruloplasmina. Adems existen
muchas referencias acerca de la actividad AO de la vitamina E;
tambin se han propuesto como AO diferentes compuestos como
los b-carotenos, albmina, metalotionena, carnosina, cido ftico,
taurina, bilirrubina, cido rico, creatinina, ergotionena, cido
dihidrolipoico, ovotiol, coenzima Q, poliamidas, retinol, flavonoides
y otros fenoles, cido ascrbico (tambin referido como pro-
oxidante bajo ciertas condiciones de reaccin) y frmacos como los
antiinflamatorios no esteroidales, desferroxamina y n-acetilcistena.

El uso de AO en la terapia constituye un rea de gran inters.


No obstante, la terapia adecuada deber tener en cuenta si la
patologa se origina por una disrupcin aguda o crnica del balance
antioxidante/pro-oxidante.24 Los antioxidantes de origen natural son
los ms indicados para el tratamiento de disrupciones crnicas.24 El
empleo de este tipo de suplementos, que generalmente contienen
PF, encuentra su mayor obstculo en el desconocimiento de su
biodisponibilidad y toxicidad.25

Para conocer si las acciones del agente que se ensaya estn directamente
asociadas con su capacidad de captura de ERO o mecanismos que
impidan su formacin, por ejemplo unin a metales de transicin, es
necesario estudiar su comportamiento en sistemas sencillos donde se
ponen a reaccionar la ERO con el agente que se evala.
Portada

67 Polifenoles en Alimentos
Con este fin existe un conjunto de mtodos experimentales cuyo
basamento permite, a travs de reacciones qumicas, detectar si el agente
que se estudia capta o impide de algn modo la generacin de ERO.

Reacciones Qumicas
Captura de especies especficas:
O2, HOCI, H2O2 , *OH, ROO*

Molculas Biolgicas
Prdida de la funcionabilidad, alteraciones
de la estructura.
Organelos o Fracciones Subcelulares
Fosfolpodos Peroxidacin, alteracin de las funciones.
Carbohidratos
ADN Miticondrias Clulas
Enzimas Microsomas Lisis, peroxidaxin, alteracin de
Peroxisomas las funciones.

Hepatocitos
Macrfagos
Linfocitos
Organismos
DAO A PROTENAS:
Abundancia de grupos carbonilo (UV)
Prdida de grupo tioles (DTNB)
Modificaciones en grupos amino
DAO A LPIDOS:
Peroxidacin lipdica: (HPLC, CG, PRATB) malonildialdehdo, dienos conjugados,
isoprostanos, hidroperxidos:
DAO AL ADN:
Deteccin de productos de degradacin oxidativa: Tinilglicol, 8-hidroxi-2-desoxiguanosina;
5-hidroxi metil 2-desoxi urina; 5,6-dihidroxi 5,6-dihidroxi timidina (en orina por HPLC)
Fragmentacin del ADN. COMETA.
OTROS:
Actividad antioxidante total y reactividad de los antioxidantes
(Quimioluminiscencia, Fluorescencia, Consumo de O2 Espectrofotometra UV/Vis)

Grfico 3.3. Niveles para estudio de interaccin agente AO vs ERO. PRATBA = Pro-
ductos reactivos con el acido tiobarbitrico. DTNB = cido 5, 5-ditiobis 2 nitrobenzoico.
UV/Vis =Ultravioleta/ visible HPLC. Cromatografa lquida de alta resolucin. Cg =
Cromatografa gaseosa.
Portada

68 Polifenoles en Alimentos
Su basamento general consiste en un sistema generador de ERO de
inters y un sistema de deteccin de los efectos de este sistema sobre
la molcula blanco. En el medio de reaccin se interpone la sustancia
en ensayo.

En el Grfico 3.3 aparecen diferentes niveles a cumplimentar para el


estudio de la interaccin de un agente AO con las ERO. La flecha que
marca la direccin Reacciones Qumicas Organismos es la estrategia
ms acertada cuando se parte de una sustancia nueva, sinttica
o natural. Mientras que la direccin contraria se ha seguido en la
investigacin de los mecanismos de accin de sustancias, que se utilizan
con fines teraputicos diversos, y que se sospecha que sus efectos estn
relacionados con sus propiedades AO.

3.12. Procesamientos de muestras para la determinacin


de propiedades Antioxidantes

3.12.1. Alimentos: frutas, vegetales, y bebidas naturales y


espirituosas

3.12.1.1 Extraccin de compuestos de origen fenlico en


las frutas frescas

Las frutas deben ser compradas frescas, en estacin y en mercados o


productores autorizados para ello; se lavan y cortan en pedazos del
tamao de un cm2 aproximadamente y se elimina la piel.

Porciones de las frutas entre 200-300 mg en 25 mL de agua o del


solvente seleccionado segn los intereses del trabajo se homogeniza
en un homogenizador durante 30 s a velocidad de 16.000 r.p.m., en
dos oportunidades, manteniendo la muestra en hielo. Los solventes
ms utilizados son: metanol, etanol, acetona y agua acidulada a pH
4,5, tambin se reportan otros solventes como alcohol isobutlico y
porcentajes diferentes como el 50% o el 80% del solvente para lograr la
obtencin de los polifenoles de inters segn se reporta.26

La suspensin obtenida es centrifugada a 3.000 r.p.m. durante 10 min


y el sobrenadante es utilizado para el anlisis. El precipitado entonces
puede resuspenderse en otro tipo de solvente segn la solubilidad
deseada para la extraccin, todas las muestras se almacenan a -20 C,
hasta su anlisis preferentemente antes de 15 das.

Portada

69 Polifenoles en Alimentos
3.12.1.2. Preparacin de las muestras de alimentos

Los alimentos que se consumen generalmente cocidos pueden ser


hervidos justo al punto adecuado de coccin. Para las leguminosas
se procede por cocido a presin hasta que los granos estn blandos a
un tiempo mnimo.

Se pesan porciones entre 300-500 mg. Las leguminosas se lican en


cantidades mayores en licuadora domstica aadiendo los granos y
su agua de coccin a partes iguales. En todos los casos se preparan
las fracciones comestibles del alimento, aquellos de apariencia no
uniforme se homogenizan en cantidades mayores en proporcin
alimento/solvente y luego se homogenizan, como se describi
anteriormente.

3.12.1.3. Determinacin de peso seco de los alimentos


frescos

Todos los alimentos frescos son preparados a una concentracin de


0,5-1 g/mL de agua y llevados a secado a 60 oC durante 3 das hasta
peso constante. De forma general existe una relacin aproximada de
10:1 peso hmedo/peso seco.

Los polifenoles son los antioxidantes ms abundantes en la dieta,


ya que la ingesta media est estimada en alrededor de 1g, lo cual
supone 10 veces ms que la ingesta de vitamina C, 100 veces ms
que de vitamina E y 500 la de carotenoides.27 Los compuestos PF
presentes en la dieta mejoran la estabilidad frente a la oxidacin de
las LDL, proceso que ha sido asociado de forma significativa con la
gnesis de aterosclerosis y enfermedades del corazn.28

Los polifenoles presentes en las frutas incluyen a un amplio


rango de componentes con actividad antioxidante, tales como los
cidos hidroxicinmicos, hidroxibenzicos, flavonoles, flavanoles,
antocianinas, etc. La abundancia relativa de cada uno de estos
compuestos depende en gran medida de la especie, tipo de cultivo,
piel y parte comestible o pulpa, suelo, estado de madurez, horas luz,
incluso de la fertilizacin.29, 30

Portada

70 Polifenoles en Alimentos
3.13. Tcnicas Analticas para la determinacin de
Actividad Antioxidante Total. Determinacin del
Estado Antioxidante Total (TAS)

El mtodo de TEAC es la Capacidad Antioxidante en Equivalentes


de Trolox, que se encuentra disponible en forma de juego de reactivos
listos para su uso por los laboratorios Randox (Irlanda). Se basa en el
empleo del ABTS (2,2-azino-di-(3-etilbenzotiazolin sulfonato) el cual
se incuba con una peroxidasa (metamioglobina) y H2O2 para rendir el
radical ABTS+. Este radical presenta una coloracin verde azulada
relativamente estable, que se mide a 600 nm. La presencia de AO
en la muestra produce una supresin de esta coloracin siendo esta
proporcional a la concentracin de los AO. Los valores de referencia
para este indicador son de 1,30 a 1,77 mmolL-1.31 El mtodo utiliza el
Trolox, anlogo sinttico de la vitamina E, como patrn.

Este es de utilidad en la evaluacin y comparacin de la capacidad AO


de frutas, vegetales, vinos y otras bebidas, pues se puede tener una idea
ms real de su poder AO ya que tiene en cuenta la accin de interrelacin
y sinergismo de los diferentes compuestos AO que componen la muestra,
sin necesidad de conocer la identidad de los compuestos en cuestin.

3.13.1. Procedimiento de la tcnica TEAC

Se emplea 10 L de agua destilada para el blanco, 10 mL patrn (Trolox 1


mM) o 10 L de muestra en cada caso, a cada tubo de ensayo se le agrega
0,5 mL de cromgeno (metamioglobina / ABTS) y las soluciones resultantes
se incuban a 37 oC. Se determina la absorbancia (A1) de cada solucin a 600
nm en un espectrofotmetro. Seguidamente, se aade 100 L del sustrato
perxido de hidrgeno y se incuban las soluciones a 37 oC, durante tres
minutos. Se realizan nuevamente las lecturas de Absorbancia (A2).

El TEAC, expresado como mM de Trolox / L, se calcula utilizando la


siguiente expresin:

TEAC = F x (AB Am)

Donde:

F: factor F = Cp / (AB Ap)

Ab: A2 A1 Diferencia de absorbancia para el blanco.


Portada

71 Polifenoles en Alimentos
Am: A2 A1 p Diferencia de absorbancia para la muestra.

Ap: A2 A1 Diferencia de absorbancia para el patrn.

Cp: concentracin del patrn.

38

37 TAS No identificado
Estado de Antioxidantes Totales (mmoI/I)

10 Quercitina
Glicsido de Quercitina
8 cido Cafeico
Epicatequina
6 Catequina
cido Glico
4

0
Muestra de Vino A Muestra de Vino B

Grfico 3.4. Contribuciones de varios compuestos fenlicos al TEAC en dos muestras


de vino tinto (tomado de la firma Randox, Irlanda)

Composicin de antioxidantes
Fresa Grosella Frambuesa

Catequinas Catequinas Catequinas


Antocianinas Antocianinas Antocianinas
cido Ascrbico cido Ascrbico cido Ascrbico
Flavonas Flavonas Flavonas
Flavonol Flavonol Flavonol
Desconocido

Contribucin Relativa de Componentes del Total


de Antioxidantes Potenciales de Tres Tipos de Bayas

Grfico 3.5. Contribucin de compuestos fenlicos al TEAC en 3 tipos de bayas


Portada

72 Polifenoles en Alimentos
ANTIOXIDANTES DEL PLASMA HUMANO

Catequinas
Uratos
Ascorbato
Tocoferol
Otros

CONTRIBUCIN A LA REACTIVIDAD ANTIOXIDANTE TOTAL

Albumina
Uratos
Antioxidantes
de la dieta

Grfico 3.6. Determinacin de TEAC en plasma sanguneo

Tcnicamente es casi imposible la determinacin de las concentraciones


de todos los AO de bajo peso molecular. Adems, debemos tener en
cuenta que su potencia como AO depende tanto de su concentracin
como de su reactividad (Grfico 3.4-3.5-3.6); es por ello que ms que
determinar las concentraciones especficas de cada uno de ellos se ha
trabajado en los mtodos que miden actividad AO total.

Antioxidantes del plasma humano (concentracin molar relativa)

Antioxidantes secuestradores de radicales libres: Albmina, Uratos,


Ascorbato, -tocoferol, bilirrubina, -caroteno, Ubiquinona.

Antioxidantes que se unen a metales: Transferrina, Ceruloplasmina.

Portada

73 Polifenoles en Alimentos
3.13.2. Mtodos para la determinacin de la
reactividad y potencial antioxidante total

Para medir de forma integral la actividad antioxidante de una


muestra que contiene mezclas de compuestos con dichas propiedades,
existen dos grandes grupos de mtodos: los llamados medidores de
la Reactividad Total de los Antioxidantes (TAR) y los que miden el
Potencial Reactivo Antioxidante Total (TRAP).

Los mtodos de TRAP se basan en la medicin de la cantidad de


AO presentes en la muestra que son capaces de secuestrar radicales
(no ofrecen informacin sobre la reactividad de los compuestos por
separados) o sea que TRAP = ni [Xi] donde n es el nmero de RL
atrapados por la molculas Xi.

Mientras, en los mtodos TAR, este indicador depender tanto de


las concentraciones como de la reactividad de los AO que componen
la muestra. Siendo TAR un indicador que recoge la sumatoria de la
reactividad de los AO presentes, por lo que TAR = ki [X] donde ki es
la medida de la reactividad de las molculas Xi.

Aunque la metodologa es similar, varan en la concentracin de los


reactivos y el tiempo de medicin, siendo inferiores en las mediciones
de TAR.

Mtodos empleados:

TRAP Electrodo de Oxgeno.

TRAP/TAR Ensayo del luminol (mtodo quimioluminiscente).

TRAP Dicrolofluereceina acetato (fluorescencia o espectrofotometra).

TRAP Oxidacin de ficocianina.

TRAP TOSC Capacidad secuestradora total de oxiradicales.

TRAP/TAR ORAC Capacidad de Absorber Radicales de Oxgeno


(emplea ficocianina como blanco de la oxidacin y como sistema
generador Cu2+/H2O2 o AAPH (2,2-azobis (2-amidinopropano)
dicloruro.

Portada

74 Polifenoles en Alimentos
TRAP/TAR Ensayo del luminol (mtodo quimioluminiscente)

La quimioluminiscencia (QL) es el fenmeno de emisin de luz que


acompaa una reaccin qumica. La molcula durante su oxidacin
absorbe energa, colocndose en un estado elctricamente excitado;
al retornar de este estado, cede adiabticamente la energa en forma
de fotones.

Para el estudio de la Q, se utilizan contadores de centelleo,


luminmetros o contadores de fotones. Este mtodo emplea AAPH
como generador de RL y la luminiscencia del luminol, como indicador
de la concentracin de RL en estado estacionario. Los RL se producen
por termlisis del AAPH, el producto oxida el luminol.

En esta reaccin se emite QL, cuya intensidad va a ser directamente


proporcional a la concentracin de RL en el estado estacionario.
Los efectos de una muestra sobre la QL pueden emplearse para
monitorear la actividad antioxidante. Los antioxidantes inhiben
esta reaccin, captan los radicales peroxilos del azo-compuesto o los
radicales intermediarios de la oxidacin del luminol.

La medicin de TRAP: Se basa en la medicin de los tiempos de


induccin que tienen lugar en el sistema generador. Se mide el tiempo
en el cual se produce la recuperacin del 40% de la luminiscencia
inicial (Grfico 3.7).

Intensidad relativa

Luminol + AAPH Adiccin Antioxidante o plasma


100%

40%
T. ind. 40% vs.

0 2 3 4 5 6 7
Tiempo en min.

Grfico 3.7. Medicin del Potencial Reactivo Antioxidante Total


Portada

75 Polifenoles en Alimentos
El mtodo TAR mide modificaciones momentneas en la emisin de
luz producidas por la generacin de ERO en condiciones de equilibrio,
el poco tiempo de reaccin solo deja actuar a los ms reactivos.
En este caso se emplean las muestras diluidas y se realizan otras
modificaciones en las condiciones experimentales (Grfico 3.8).

Intensidad
relativa
Luminol + Adicin de Antioxidante
AAPH o plasma (valor lo)
10
0%

lo/l v.s.
Concentracin

Valor l

0 2 3 4
min

Grfico 3.8. Medicin de la Reactividad Total de los Antioxidantes

La medicin de este indicador por s sola no debe ser seguida como


indicador de la reactividad AO, siendo necesario un grupo de ensayos
adicionales para la cabal comprensin de los fenmenos asociados
al EO que tienen lugar en los sistemas biolgicos en general. Este
mtodo tambin puede ser empleado para caracterizar el poder AO
de un alimento dentro de otros parmetros a medir, siendo til para
conocer tanto el poder AO como la reactividad del conjunto de AO
presentes en la muestra.

Portada

76 Polifenoles en Alimentos
3.13.3. Determinacin de la capacidad reductora del
hierro como medida del poder antioxidante (FRAP)

Dentro de los mtodos en los que se valora la capacidad reductora


del AO, uno de los ms utilizados es el mtodo de FRAP (poder
antioxidante de la reduccin frrica, por sus siglas en ingls). Esta
metodologa consiste en medir el incremento en la absorbancia a 593
nm (azul) que se desarrolla cuando el complejo TPTZ-Fe+3 se reduce
a TPTZ-Fe+2.32 De esta forma, la capacidad AO que presentan los
extractos de diferentes frutas y vegetales se mide como la capacidad
reductora del extracto, dando un complejo coloreado,32 modificada
por lvarez-Parrilla y col.33

El reactivo FRAP es preparado diariamente, y mantenido a 37


o
C, mediante la mezcla de tampn acetato (0,3 M pH 3,6) con una
solucin 10 mM de TPTZ (2, 4, 6 tripiridil-s triazina) en HCL40
mM, y una solucin 20 mM de FeCl3 6 H 2O, en una proporcin de
10:1:1. Las soluciones del ensayo se prepararon mezclando 180 L
del reactivo de FRAP con 24 L de una mezcla de agua/muestra
en proporcin 3:1.

Para la obtencin de las curvas de calibracin se utiliza una solucin


metanlica (80%) de Fe2+ en el rango de 100 a 3.000 M a partir
de una solucin madre 3.000 M de FeSO4 7H2O. La absorbancia
se mide a 595 nm, cada 1min, durante 30 min., mediante un lector
de microplaca BioRad Benchmark. Los resultados se expresan como
mmol de Fe2+/100 g de peso fresco del alimento.

3.13.4. Capacidad de absorcin de radicales de oxgeno.


ORAC

Este mtodo consiste en medir la prdida de fluorescencia de la


fluorescena, debido a su oxidacin por accin de un radical perxido,
e integrar el rea bajo la curva de intensidad de fluorescencia frente al
tiempo. La capacidad AO del extracto se determina a partir del valor
del rea bajo la curva, ya que la presencia de AO retrasa el descenso
de la fluorescencia, con lo cual es posible calcular esa capacidad AO.34
Para la determinacin se utiliza 1,7 mL de un tampn de fosfato 7
mM pH 7, 100 L de R-ficoeritrina, 3,4 mg/L, 100 L de 2,2azobis-2-
aminopropano (AAPH) 320 mM y 100 L de muestra. El patrn que se
utiliza es Trolox1M (anlogo soluble de la vitamina E). La reaccin se
realiza a 37 C durante 15 min.
Portada

77 Polifenoles en Alimentos
La reaccin comienza con la adicin de AAPH. La fluorescencia se
mide y registra cada dos minutos a 570 mM y 540 mM de excitacin en
fluormetro hasta que la fluorescencia disminuye al 5% de la primera
lectura (~ 70 min). Los resultados se expresan como capacidad AO,
empleando las diferencias de las reas normalizadas bajo las curvas de
cada de la fluorescencia de R- ficoeritrina entre el blanco y la muestra.
Se utiliza el Trolox como referencia.

3.13.4.1. Mtodo del ORAC con microplacas

Metodologa descrita por Eberhardtet y col.,35 con ligeras


modificaciones. Curvas de calibracin con cido 6-Hidroxi-2,5,7,8-
tetrametilcroman-2-carboxlico (Trolox), 20-100 M en solucin
salina. Los resultados de capacidad AO se expresan en milimoles
de equivalentes de Trolox/100 g de peso fresco (mmol TE/100 g).
Las determinaciones se realizan en microplacas de 96 pocillos. Se
colocaron en cada pocillo 20 L de estndar de calibrado o muestra
(dilucin 1:100), se agrega 120 L de fluorescena 70 M y se incuba en
oscuridad a 37 C durante 20 min. Una vez transcurrido este tiempo,
se agrega 60 L de 2,2-Azobis-2-metilpropionamidina (AAPH) 4.8
mM, se agita y se mide la fluorescencia en un lector de microplacas
Biotek (FLx800), con filtro de excitacin 485/20 nm y de emisin
528/25 nm. Las reas bajo la curva de las grficas de intensidad de
fluorescencia vs tiempo se calculan mediante el software Sigma Plot
9.1 (Systat Software Inc., San Jos, CA, EEUU).

3.13.5. Ensayo de la determinacin del poder de


atrapamiento de radicales por DPPH

El DPPH (difenil-p-picrilhidrazil) es una especie radicalaria estable


en solucin, con una concentracin final en etanol de 200 mM y una
coloracin violeta intensa la cual se mide de 512-517 nm.

El ensayo consiste en determinar la disminucin de la absorbancia


que tiene lugar en presencia del compuesto que se desea evaluar
en una reaccin de 30 min de duracin. La prdida de radicales
hace cambiar el color de la reaccin hacia el amarillo, al cederle la
muestra electrones al radical DPPH. El estudio cintico permite
conocer el poder antioxidante de la muestra evaluada. Durante el
estudio de mezclas pueden determinarse diferentes pendientes. El
ensayo resulta positivo si la sustancia que ensayamos es capaz de
capturar el DPPH..
Portada

78 Polifenoles en Alimentos
3.14. Cuantificacin de polifenoles en alimentos

Ha habido un considerable inters en el contenido de flavonoides de


los alimentos desde la dcada de 1980, los estudios de Steinmetz y
Potter en 1996,36 demostraron una relacin entre una dieta rica en
frutas y verduras y un menor riesgo de enfermedades crnicas.

Los flavonoides son compuestos polifenlicos que pueden subdividirse


en cinco categoras estructurales: flavonas, flavonoles, flavanonas,
catequinas, y antocianidinas. Estos compuestos (agliconas) estn
glicosilados comnmente y tambin pueden estar alcoxilados o
esterificados. Como resultado, ms de 5.000 flavonoides diferentes
se han identificado en los materiales vegetales.37

La investigacin sobre el impacto en la salud de los flavonoides


requiere una base de datos que proporciona informacin cuantitativa
sobre compuestos especficos en alimentos. Una base de datos de
flavonoides (FDB) se constituy en Estados Unidos en 2003. Sin
embargo, es difcil lograr una base de datos completa debido a la gran
cantidad de alimentos que contienen flavonoides, la gran cantidad
de flavonoides glicosilados, y la falta de normas de anlisis para la
mayora de estos compuestos.

Un estudio exhaustivo de los flavonoides en los alimentos requiere


un plan de muestreo nacional vlido y mtodos de anlisis donde se
puedan identificar y cuantificar flavonoides (agliconas y glicosiladas)
en las cinco categoras estructurales, para lo que es necesario
el concurso y la colaboracin de varias instituciones nacionales
relacionadas con los alimentos.

Un gran nmero de mtodos han sido reportados para la


determinacin de flavonoides, ya sea para determinar estos en una
sola categora, para una variedad de alimentos o para determinar
todos los flavonoides en una sola comida.

Solo dos documentos han descrito mtodos diseados para cubrir


las cinco categoras de flavonoides.38 En cada caso, la cuantificacin
se logr mediante la hidrlisis de los flavonoides glicosilados para
permitir la comparacin con los estndares de aglicona disponibles.
Merken y Beecher en el ao 2000,38 describieron un mtodo para
la separacin de 17 agliconas que representan las cinco categoras
de flavonoides. Sakakibara y col. 39 describieron un mtodo para la
Portada

79 Polifenoles en Alimentos
determinacin de todos los flavonoides en las verduras, frutas y
ts. Tambin identificaron isoflavonas, antraquinonas, chalconas
y teaflavinas. Su mtodo era similar a la de Merken y Beecher,38
utilizando una extraccin con metanol 90% e identificaciones por
HPLC e intercambio de diodos.

3.14.1. Determinacin de Fenoles Totales

Los fenoles totales se determinan utilizando generalmente reactivo


de Folin-Ciocalteu, de acuerdo a diferentes metodologas como
las descritas por Georg y col.,39 utilizando como patrones cido
glico, catequina o cido cafico en solucin metanlica al 80%
principalmente.33

Procedimiento

Se utilizan 20 L de cada solucin de ensayo, 1 mL de Folin-


Ciocalteu, y 0,5 mL de agua destilada y se deja reposar durante 5
min.; finalmente se agregan 0,7 mL de la solucin de carbonato sodio
al 7,5%. Se deja reposar a temperatura ambiente durante 30 min. en
oscuridad y se lee la absorbancia a 760 nm en un espectrofotmetro.

La concentracin de Fenoles Totales, en mg/mL se calcula utilizando


la siguiente expresin:

F.T. = 100 x (Cp x Am)/ Ap

Donde:

Cp: concentracin del patrn.


Am: absorbancia de la muestra.
Ap: absorbancia del patrn.

3.14.2. Tcnicas de evaluacin de flavonoides totales

El contenido de flavonoides totales de la muestra puede ser diluido en


etanol / agua (6:4), se determina segn se ha descrito previamente40, 41
con ligeras modificaciones. Tanto la muestra (250 L) como el patrn
(+-) quercetina de concentracin de (11 mg/100 mL), se mezclan
respectivamente con 75 L de NaNO2 al 5%, se agitan ligeramente y
se dejan reposar durante 6 min. Despus se adiciona 150 L de AlCl3
al 10% y se deja reposar durante 5 min. Se aade 0,5 mL de NaOH
Portada

80 Polifenoles en Alimentos
1 M y se lleva a un volumen final de 2,5 mL con agua destilada. la
reaccin se deja transcurrir durante 90 min. La absorbancia de las
muestras se lee a 510 nm frente a un blanco de solucin de etanol-
agua (6:4) usando un espectrofotmetro.

Portada

81 Polifenoles en Alimentos
BIBLIOGRAFA

Portada

82 Polifenoles en Alimentos
Bibliografa

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