Aparatura folosit n cromatografia HPLC

Cromatografele de lichide de nalt performan snt formate dint-un sistem de vase cu

solveni (1) , o pomp de nalt presiune (3), o coloan cromatografic (6), unul sau
mai muli detectori (8), i un sistem de prelucrare a datelor (9), ele mai snt completate
cu elemente de reglare automat a debitului , a presiunii i a temperaturii. In figura 1
este reprezentat schema de principiu a unui cromatograf de lichide.

Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3-
manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem
distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient, 11-sistem
de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13,14-injector, 15-precoloana
cromatografic, 16,17-regulator debit de curgere, 18-coloan cromatografic,
19- incinta de termostatare a coloanei, 20-regulator debit de curgere detector, 20- detector, 21-
preamplificator electronic, 22-sistem de achiziie i prelucrare date, 23-calculator electronic

Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau soluii
tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul lor de la
recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest
traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare. O alt recomandare
este aceea ca volumul mort , denumit i volum extracolumnar, ntre introducerea probei
i traversarea detectorului s fie meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o
lire de band (vezi i cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin
msuri constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele componente
ale unui cromatograf de tip HPLC

Cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC) acopera azi, n proportie

aproximativ 80%, analiza substantelor moleculare: organice, organo-metalice si
anorganice inclusiv compusii foarte polari sau labili termic precum si compusii cu masa
moleculara ridicata (naturali sau sintetici). De aceea, mpreuna cu cromatografia de
 Fig. II.16. Prezentarea schematica a unui cromatograf de lichide (HPLC) modern

gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Desi eficacitatea
coloanelor nu o egaleaza nca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lnga faza
stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si analize uneori
imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masa a transformat, n ultimul
timp, aceasta metoda n principalul mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau
sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a
dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.
Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica,
care servea n primul rnd la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin introducerea
pompelor si n consecinta, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor
faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze
stationare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd
cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se poate observa ca din recipientele continnd
unul sau mai multi solventi pompa (sau pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un
amestec de doi sau mai multi solventi). n imediata vecinatate a coloanei se introduce proba,
automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana aflata ntr-o etuva termostat, are loc
separarea propriu-zisa. Efluentul coloanei intra ntr-un detector de unde componentul, daca este
separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esenta, un cromatograf
analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de fractiuni,
interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC singura
deosebire majora constituind-o sursa de eluent pompa.

Solvent Pompa Injector Coloana Detector nregistrator

 Fig. II.17. Schema bloc a unui cromatograf HPLC

II. 2.1. Detectori utilizati in cromatografia de lichide de nalta performanta (HPLC)

Tehnica HPLC s-a dezvoltat o data cu perfectionarea detectorilor. Detectorii n

cromatografie sunt instrumente analitice specializate, situate la iesirea eluentului dintr-o coloana
si care pot nregistra continuu substantele separate de catre aceasta. Deci detectorii constituie
acea parte a instrumentatiei care permite sa se observe modul cum decurge separarea prin
coloana fara a se vedea componentii propriu zisi ci doar semnalul lor.
ntruct coloanele de separare performante au capacitati de ncarcare mici, sistemul de
detectie trebuie sa fie unul foarte sensibil. Totodata, pentru ca n LC volumul de proba este de
ordinul microlitrilor (8-10l), volumul detectorilor trebuie sa fie de volum apropiat pentru a se
putea sesiza n mod continuu picul cromatografic.
n calitate de instrumente se poate utiliza, n principiu, oricare dispozitiv de analiza
chimica cunoscut, pentru probe lichide, precum si orice combinatii de instrumente fizice. De
exemplu, n ultimul timp, combinatia dintre un detector refractometric si unul bazat pe difuzia
luminii este extrem de eficace n analiza polimerilor n amestec cu monomeri sau oligomeri
dintr-un material. Exista chiar posibilitatea cresterii sensibilitatii detectiei printr-o reactie chimica
n urma adaugarii, cu un debit controlat, a unui reactiv potrivit. Tehnica se numeste derivatizare
si se poate practica chiar nainte de introducerea probei n coloana, dar si dupa iesirea din
coloana a componentelor separate. Metoda a fost utilizata pna n prezent n special legata de
metodele spectrofotometrice (colorimetrice) sau fluorimetrice si mai ales pentru analiza unor
amestecuri de compusi numerosi avnd aceleasi functiuni reactive (de exemplu aminoacizi).
Caracteristicile detectorilor sunt asemanatoare cu ale celorlalte instrumente analitice si
oarecum similare cu cele descrise la metoda GC.

II. 2.1.1. Detectori spectrofotometrici n UV-VIS

Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC, ct si n
HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica
sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul
trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-Beer
(A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie
sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS (prescurtare de la
Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la ntreaga scala, l. engl.). Astfel
n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante
organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au grefate functiuni
organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate
hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor hidrocarburilor cu diferite functiuni
organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2). ntre acestea se includ si numeroasele combinatii
de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul
ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct
proporionala cu coeficientul de extincie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea
detectorului ar trebui mrita lungimea celulei dar aceasta este restricionata. Sensibilitatea este
de ordinul 5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
 Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o
lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu
sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un domeniu ngust (de ex. linia 254nm
a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata n figura
II.18.

Sursa Monocromator Celula nregistrator

Fig. II.18. Schema bloc a unui detector HPLC spectrofotometric

2. Detectorii policromatici mai frecvent utilizai n cromatografele HPLC moderne permit si

selectarea lungimii de unda la care se lucreaz, dar chiar pot nregistra electronic absorbanta
celulei la mai multe lungimi de unda simultan. Acest mod de lucru da o mai mare sigurana
analizei, n sensul ca permite stabilirea puritii, adic daca picul constituie un semnal dat de o
singura substana sau de un amestec (ceea ce se cunoate sub numele de stabilirea puritii
picului).
Principiul de functionare al detectotrului Uv este prezentat n figura II.19. Detectorul este
format dintr-o celula cilindrica (5) cu capacitate de 1l-10l care este intersectata de coloana cu
eluent. Razele UV (1) sunt aranjate astfel incit sa treac prin celula cu proba de analizat (5) si
apoi sa cada pe fotoelement (6). Semnalul de la fotoelement ajunge la amplificator (7) (acesta
mrete intensitatea semnalului) si apoi la sistemul de achiziie, prelucrare si afiare a datelor
obinute (8); rezultatul este o cromatograma (9) ale crui picuri va oferi informaii calitativa si
cantitative despre substanele din soluia analizata.

10
2 3
6

7
1

4
I
5
8

9 t

Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de la
coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin care
circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8- sistem de
achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva detectorului

II. 2.1.2. Detectori refractometrici

Detectorii refractometrici, au la baza legile refractiei luminii.

 Principiul de functionare al acestor detectori are la baza legea lui Fresnel - de transmitere
a luminii prin medii transparente avnd un indicele de refractie dat. Astfel, un fascicul luminos
(mono sau policomponent) trece printr-o celula cu doua compartimente unul continnd doar
eluentul pur iar celalalt faza mobila care paraseste coloana , figura II.20

3 8

1 M
5 6

9 7
6
C
I

2 10
t

Fig.II.20. Principiul de functionare al unui detector refractometric. 1- radiatia luminoasa, 2- amestec de

substante, 3- solvent pur,4- perete sticla, 5-oglind semitransparent, 6,6*- fotoelement, 7-
amplificator, 8- surub reglator, 9- sistem nregistrator, 10- cromatograma, C- cuva
refractometrica, M- sistem ce regleaza detectorul in funcie de unghiul sub care cad razele

Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele
2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se
reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul 6. Semnalul este amplificat.
Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul primete un semnal
de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are loc compensarea modificrii indicilor de
refracie. In urma deplasarii urubului 8 , sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma
unei cromatograme.Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua
compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita
n momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din
coloana. n momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent
din detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara
aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea relativ coborta
(10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n
cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia eluentului la intrarea n coloana
difera de cea de la iesire si se modifica continuu, neexistnd o linie de baza. De asemenea
fenomenul este foarte sensibil la temperatura (0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a
detectorului ct si a coloanei.

II. 2.1.3. Detectorii electrochimici

Detectori electrochimici sunt folositi cu precadere pentru identificare calitativa si

cantitativa la amestecuri de electroliti precum si la substante care se pot oxida respectiv reduce.
Intru-cat marea majoritate a substantelor se pot oxida sau reduce si intru-cat detctorii si logistica
electronica de interpretare a datelor au devenit foarte performante momentan HPLC cu
detectori electrochimici a devenit cea mai importanta metoda analiza si identificare a
substantelor.
Exista trei tipuri de detectori electrochimici:
- Conductometrici- sunt folositi pentru analiza cantitaiva la electoliti
- Poteniometrici sunt folositi pentru detecia caritativa i analiza cantitaiva la electoliti i
substane organice ionizabile
- Coulometrici, amperometrici- sunt folositi pentru detectii in regim de oxido-reducere la
substantele organice;

II. 2.1.3.1. Detectorii conductometrici

Detectorii poteniometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde substantele
disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n cromatografia pe
schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt
asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-1ng). Detectorii conductometrici
msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din doi electrozi situai in coloana cu eluent
si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta este msurata cu ajutorul circuitului electric la
care este legata.
Principiul de functionare al unui detector poteniometrici este prezentat n figura II.21.
Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica.
Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula conductometrica(2).
Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica conductivitatea celor doi
electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub forma unui pic in cromatograma
(8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A doua substanta va modifica conductivitatea
electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce la masurarea timpului de retentie (analiza
calitativa) si la aparitia unui nou pic in cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de ioni
intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu 5kH.

6
7
1 2

4
5 H 8
3

Fig.II.21. Principiul de functionare al detectorului conductometric. 1- generator de inalta frecventa, 2-

celula conductometrica, 3- electrozi de platina, 4- sustanta de analizat ce vine de la coloana
cromatografica, 5- substanta iese din celula conductometrica, 6- amplificator, 7- sistem de
achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 8- cromatograma in coordonate conductivitate si timp
II. 2.1.3.2. Detectorii poteniometrici

Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din trei
electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar alimentat cu
solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de referinta se aplica o
tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba cinetica a curbelor de reducere,
care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt negative , figura II.23. ale elementelor
care se gasesc in solutia electrolitica complexa. Din E1 substantele incep sa se reduca,
intensitatea de reducere creste cu potentialul. Daca se aplica potential negativ in partea stanga
a lui E0, se observa ca E3 reprezinta inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii
acelui element.

i 10

3 4
7

1 t
6

2 5

Fig.II.22. Principiul de functionare al detectorului electrochimic poteniometric . 1- substantele ce vin de

la coloana cromatografica, 2- electrodul de lucru, 3- electrodul auxiliar 4- celula
electrochimica,5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6- electrodul de
referinta, 7- substanta iese din tubul capilar, 8- amplificator, 9- sistem de achiziie, prelucrare
si afiare a datelor,10- cromatograma in coordonate intensitatea cinetica si timp
 I

t
+i

E6 E5 E4 E3
0
E0 E1 E2 E(mv)

-i

Fig.II.23. Diagrama curbei cinetice si cromatograma obtinuta

Pentru a se putea efectua masurarile trebuie sa se cunoasca diagrama potentialelor.

Picurile pe cromatograma apar sub forma unui potential de semiunda (se duc tangente la
curbele de reducere si oxidare iar la mijlocul distantei dintre liniile ce se duc din capatul
tangentei pe ordonata cromatogramei se afla varful picului).

II. 2.1.3.3. Detectorii amperometrici sau coulometrici

II. 2.1.4. Detectorii de fluorescenta

Detectorii de fluorescenta se bazeaz pe msurarea intensitii fluorescentei pentru

substanele ce prezint acest fenomen. Fluorescenta este un fenomen care apare la unele
substane cnd sunt iradiate cu ultraviolete. Acele substane emit radiaii pe o lungime de unda
mai mare dect a radiatei incidente. Daca emisia de radiaii are loc in acelai timp cu emisia de
radiaie ultravioleta incidenta fenomenul se numete fluorescenta. Putini compui prezint
fluorescenta iar cei ce nu prezint pot fi transformai in derivai ai lor ce au aceasta proprietate.
Fluorescenta s-a artat a fi foarte folositoare ca proces de detecie iar cu detectorii bazai
pe fluorescenta s-au obinut unele dintre cele mai nalte sensibilitati din cromatografie de lichide.
Tehnicile de detecie bazate pe fluorescenta confer o buna sensibilitate probelor concentrate si
o sensibilitate mult mai mica atunci cnd se folosesc instrumente de genul senzorilor de
temperata, presiune etc..Din aceasta cauza lumina de fluorescenta este msurata pe un fundal
ntunecat( sau la zgomot de fond redus).
Pentru ca intensitatea fluorescentei sa poat fi msurata instrumental, raportul dintre
cantitatea de radiaie remisa si cantitatea de radiaie UV incidenta trebuie sa aib valori
cuprinse intre 0.1-1. Sistemul optic al celor mai multi detectori de fluorescenta este aranjat astfel
incat lumina fluorescenta sa cada sub un anumit unghi( de 90), figura II.24., pe raza
incidenta.Acest lucru micsoreaza cantitatea de lumina incidenta care ar interactiona cu
semnalul. In aceste circumstante semnalul este masurat pe un fundal aproape negru (pentru a
mai reduce din luminozitatea fundalului se foloseste un filtru).
 Cel mai simplu detector este format dintr-o sursa de excitare si un senzor ce
monitorizeaza semnalul pentru toate lungimile de unda (pentru anumite probe poate fi foarte
sensibil si relativ ieftin).

1
2 I 16
15
3

t
13
8
5

14
6
7 9 10 11 12

Fig.II.24. Principiul de funcionare al detectorului de fluorescenta.1- sursa de radiaie, 2- fanta, 3- filtru,

4- lentila, 5- substana ce vine de la coloana. 6- substana de analizat, 7-cuva cu perei de
cuar, 8- unghi de 90 grade,9- substana ce iese din cuva, 10- lentila, 11- filtru, 12- fanta, 13-
detector de fluorescenta, 14- amplificator, 15- sistem de preluare, prelucrare si afiare a
datelor, 16- cromatograma.

Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la detectorul de
fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si preluat de sistemul
de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate sub forma unei cromatograme
(16).

II. 2.1.5. Detectorul Diode Array

Detectorul sir de fotodiode poate fi folosit in numeroase situatii, de exemplu determinarea

puritatii unei solutii, separarea hidrocarburilor aromatice.
Principiul de utilizare. Detectorul este utilizat cu lampa de deuteriu si xenon care emit
ultraviolete (1). Lumina de la lampa trece prin proba aflata in tubul capilar (5) iar lumina
dispersata trece printr-o retea de difractie (6) apoi cade pe dioda Array (7). Rezolutia
detectorului depinde de numarul diodelor si de numarul lungimilor de unda acoperite. Doda
Array poate contin sute de diode iar semnalul de la fiecare dioda este preluat si amplificat de
catre amplicator (8) ca la sfarsit sa ajunga la sistem de preluare, prelucrare si afiare a datelor
(9) care de obicei este un calculator care stocheaza datele pe hard disc. La sfarsitul analizei
informatile oferite de fotodiode sunt afisate pe o cromatograma. Sunt oferite intensitatile
substantelor din amestec (analiza cantitativa) si timpii lor de retentie (analiza calitativa).
Sensitivitatea detectorului sir de fotodiode este de 1x10-7 g/ml iar domeniu dinamic liniar
de 5x103.
Schema principiului de functionare este prezentat in figura II.25
 2 3

1 6

4 5 I

10

7
t

8
9

Fig.II.25. Principiul de funcionare al detectorului sir de fotodiode. 1- radiaii ultraviolete, 2- substana ce

vine de la coloana cromatografica,3- substana ce pleac la tratament chimic, 4- fereastr
cuart, 5- tub capilar prin care circula substana de analizat, 6- reea de difracie, 7- dioda
Array, 8- amplificator, 9- sistem de preluare,achiziie si afiare a datelor, 10- cromatograma
(in care se preiau concomitent toate lungimile de unda)

II. 2.1.6. Alti detectori

In practica analitica se mai ntlnesc si alti detectori prezentati schematic n tabelul 2.

Dintre acestia o mentiune speciala trebuie facuta pentru cei bazati pe spectrometria de masa si
FT-IR, care au permis determinari calitative uneori imposibil de realizat prin alte variante de
detectie n lipsa etaloanelor cunoscute.
Acesti detectori permit ca, pe baza unei baze de date formata din spectre cunoscute, sa
se obtina compusii cei mai apropiati (3 dintre acestia), din toate substantele chimice cunoscute,
care ar putea fi prezenti n proba.

Tab. II.2. Limita de detectie pentru civa detentori uzuali

Detectori LC Limita de Caracteristici

detectie
Fluorimetrici 1-10pg Este necesara uneori derivatizarea
Sensibilitate 10-10M
Electrochimici 10pg = 1ng Sensibilitate 10-10M
(Amperometrici) Compusi oxidabili sau reductibili
Bazati pe 100pg - Necesare coloane capilare
Spectrometria 1ng Necesara pulverizarea
de Masa (MS) Pret de cost ridicat
FT-IR 1g Pret de cost ridicat
Difuzia luminii 10g Adecvati pentru macromolecule
Activitate optica 1ng Pentru substante optic active
Electrozi ion 10ng Doar pentru ioni sau compusi
selectivi ionizabili
Fotoionizare 1pg- 1ng -