Fig. 1 Schema de principiu a unui cromatograf de lichide. 1- butelie, 2-ventil nalt presiune, 3-
manometru nalt presiune, 4-reductor de presiune, 5- manometru de joas presiune, 6- sistem
distribuitor i dozare heliu, 7,8- recipiente cu solvent, 9- filtru, 10-pomp cu sistem de gradient, 11-sistem
de msurare a presiunii i a debitului, 12-sistem de introducere prob, 13,14-injector, 15-precoloana
cromatografic, 16,17-regulator debit de curgere, 18-coloan cromatografic,
19- incinta de termostatare a coloanei, 20-regulator debit de curgere detector, 20- detector, 21-
preamplificator electronic, 22-sistem de achiziie i prelucrare date, 23-calculator electronic
Trebuie avut n vedere c n HPLC se folosesc solveni organici puternici sau soluii
tampon care pot ataca chimic orice component ce se gsete n traseul lor de la
recipientele de stocare pin la detector , ca atare toate materialele folosite pe acest
traseu trebuie s prezinte o rezisten chimic corespunztoare. O alt recomandare
este aceea ca volumul mort , denumit i volum extracolumnar, ntre introducerea probei
i traversarea detectorului s fie meninut ct mai mic posibil prin aceasta evitndu-se o
lire de band (vezi i cap). Reducerea volumului mort se realizeaz n primul rnd prin
msuri constructive ale furnizorului de cromatograf i prin de alegerea corespunztoare
a coloanei cromatografice. In continuare vor fi descrise pe rnd elementele componente
ale unui cromatograf de tip HPLC
gaze constituie un punct de sprijin important n analizele chimice moderne. Desi eficacitatea
coloanelor nu o egaleaza nca pe cea din GC, prin faptul ca se poate modifica, pe lnga faza
stationara, si faza mobila, cromatografia de lichide (LC) face posibile separari si analize uneori
imposibil de realizat prin alte tehnici. Cuplajul cu spectrometria de masa a transformat, n ultimul
timp, aceasta metoda n principalul mijloc de analiza a compusilor moleculari naturali sau
sintetici, constituind unul din pilonii pe care se sprijina chimia sintetica actuala si pe care s-a
dezvoltat biochimia si biotehnologia moderna.
Metoda constituie o evolutie a unei metode mai vechi, cromatografia pe coloana clasica,
care servea n primul rnd la izolarea preparativa a compusilor naturali. Prin introducerea
pompelor si n consecinta, lucrndu-se la presiuni tot mai ridicate (200atm), dezvoltarea unor
faze stationare performante, de dimensiuni tot mai mici (recent constituite din granule de faze
stationare sferice, cu diametre 2-5m), n coloane tot mai scurte (3-10cm) s-a ajuns, ncepnd
cu anul 1969, la configuratia actuala figura II.16. Se poate observa ca din recipientele continnd
unul sau mai multi solventi pompa (sau pompele), alimenteaza coloana cu eluent (de regula un
amestec de doi sau mai multi solventi). n imediata vecinatate a coloanei se introduce proba,
automat, prin intermediul unui ventil cu by pass. n coloana aflata ntr-o etuva termostat, are loc
separarea propriu-zisa. Efluentul coloanei intra ntr-un detector de unde componentul, daca este
separat complet, poate fi colectat si izolat, cu ajutorul unui colector de fractiuni. Semnalul este
nregistrat fie cu un nregistrator, fie direct n memoria unui calculator. n esenta, un cromatograf
analitic HPLC are schema bloc din figura II.17. unde nu s-a mai prezentat colectorul de fractiuni,
interesant doar din punct de vedere preparativ. Se poate observa asemanarea cu GC singura
deosebire majora constituind-o sursa de eluent pompa.
Acest grup de detectori sunt cei mai folositi detectori pna n prezent, att n LC, ct si n
HPLC. Pentru a putea fi utilizati, compusii separati cromatografic trebuie sa fie colorati - adica
sa absoarba lumina pe domeniul de lungimi de unda al detectorului. Pe de alta parte, eluentul
trebuie sa fie practic transparent pentru acelasi domeniu spectral.
Legea fizica pe baza careia functioneaza acesti detectori este legea Lambert-Beer
(A=elC). Deci unitatile vor fi unitati de absorbanta, adimensionale. De aceea limita de detectie
sau zgomotul de fond se prezinta n cazul acestor detectori n AUFS (prescurtare de la
Absorbance Units Full Scale = unitati de absorbanta raportate la ntreaga scala, l. engl.). Astfel
n cadrul instrumentelor actuale sensibilitatea este de 0,001 AUFS cu zgomotul de fond de 1%.
Motivul principal al popularitatii acestor detectori este acela ca numeroasele substante
organice, anume cele care contin legaturi duble (electroni p), respectiv au grefate functiuni
organice cu electroni neparticipanti, absorb lumina n UV-VIS. Este vorba de toate
hidrocarburile olefinice si aromatice precum si derivatii tuturor hidrocarburilor cu diferite functiuni
organice (=C=O, =C=S, -N-O, -N=N-, -NH2). ntre acestea se includ si numeroasele combinatii
de interes biologic ca enzime, acizi nucleici etc.Un mare avantaj al acestor detectori este faptul
ca sunt insensibili la micile variatii de debit si temperatura. Sensibilitatea detectorului este direct
proporionala cu coeficientul de extincie si cu lungimea celulei. Pentru a mari sensibilitatea
detectorului ar trebui mrita lungimea celulei dar aceasta este restricionata. Sensibilitatea este
de ordinul 5x10-8g/ml. Cele mai moderne celule au diametre de 0,5-2mm si lungimi de 1-10mm.
Se pot distinge si n cazul acestei clase de detectori mai multe tipuri de detectori.
1. Detectorii monocromatici au fost primii utilizati, fiind mai ieftini deoarece lucreaza doar la o
lungime de unda. Modelul cel mai raspndit se compune dintr-o sursa luminoasa cu deuteriu
sau cu vapori de mercur, un monocromator care separa un domeniu ngust (de ex. linia 254nm
a mercurului) si un detector. Schema bloc a unui astfel de detector este prezentata n figura
II.18.
10
2 3
6
7
1
4
I
5
8
9 t
Fig. II.19. Principiul de funcionare al detectorului de UV. 1- raze UV, 2- substana ce vine de la
coloana cromatografica,3- substana ce pleac, 4- geam de cuar, 5- tub capilar prin care
circula substana de analizat, 6- detector (fotomultiplicator), 7- amplificator,8- sistem de
achiziie, prelucrare si afiare a datelor, 9- cromatograma,10- cuva detectorului
3 8
1 M
5 6
9 7
6
C
I
2 10
t
Radiatia luminoasa (1) trece prin solventul pur, apoi prin peretele de sticla ce separa cele
2 incinte, prin amestecul de substante. Ajunge sub un anumit unghi pe detector, o parte se
reflecta pe fotoelementul 6 iar o parte se refracta pe fotoelementul 6. Semnalul este amplificat.
Daca cele doua tensiuni primite de la cei 2 detectori sunt diferite, motorul primete un semnal
de corecie, in scopul egalizrii tensiunilor, astfel are loc compensarea modificrii indicilor de
refracie. In urma deplasarii urubului 8 , sistemul nregistrator 9 va nregistra datele sub forma
unei cromatograme.Diferenta dintre indicii de refractie pentru solutiile aflate n cele doua
compartimente vor fi practic nule, atta timp ct din coloana iese doar eluentul pur, dar diferita
n momentul n care n eluent mai apare un component separat - antrenat de catre eluent din
coloana. n momentul iesirii unui component are loc o deplasare a pozitiei fascicolului emergent
din detector - deplasare care este proportionala cu concentratia si sesizata de catre detector.
n cazul acestui tip de detector sunt posibile si picuri negative, ceea ce face necesara
aducerea liniei de baza la jumatatea scalei lucru care, pe lnga sensibilitatea relativ coborta
(10-5molL-1), constituie un dezavantaj. Acest detector este universal, dar nu poate fi utilizat n
cromatografia cu gradienti deoarece, n acest caz, compozitia eluentului la intrarea n coloana
difera de cea de la iesire si se modifica continuu, neexistnd o linie de baza. De asemenea
fenomenul este foarte sensibil la temperatura (0.0001C) fiind necesara termostatarea, att a
detectorului ct si a coloanei.
Detectorii poteniometrici sunt folositi in special pentru solutiile ionice unde substantele
disociaza complet. Acest tip de detectori se utilizeaza cu precadere n cromatografia pe
schimbatori de ioni si sunt sensibili la ioni anorganici sau organici inclusiv acizi organici. Sunt
asadar detectori specifici. Sunt suficient de sensibili (500pg-1ng). Detectorii conductometrici
msoar conductivitatea fazei mobile. Este constituit din doi electrozi situai in coloana cu eluent
si o rezistenta situata intre cei doi. Rezistenta este msurata cu ajutorul circuitului electric la
care este legata.
Principiul de functionare al unui detector poteniometrici este prezentat n figura II.21.
Celula conductometrica este etansa, iar cei doi electrozi sunt fixati si dimensionati din fabrica.
Substanta de analizat(4) vine de la coloana cromatografica si intra in celula conductometrica(2).
Cand se modifica concentratia primei substante (H=kC) se modifica conductivitatea celor doi
electrozi (3). Aceasta schimbare este amplificata si prinsa sub forma unui pic in cromatograma
(8). Astfel se realizeaza analiza cantitativa probei. A doua substanta va modifica conductivitatea
electrolilor dupa un anumit timp cea ce duce la masurarea timpului de retentie (analiza
calitativa) si la aparitia unui nou pic in cromaograma.
Este necesar un generator de inalta frecventa pentru a nu se instala un transfer de ioni
intre cei doi electrozi ceea ce ar duce la denaturarea analizei. Se alimenteaza cu 5kH.
6
7
1 2
4
5 H 8
3
Principiul de functionare: celula electrochimica, figura II.22. , este formata din trei
electrozi, unul de referinta, unul de lucru si unul auxiliar, aflati int-un tub capilar alimentat cu
solutie de la coloana cromatografica. Intre electrodul de lucru si cel de referinta se aplica o
tensiune functie de potential ceea ce duce la aparitia pe curba cinetica a curbelor de reducere,
care sunt pozitive, si a curbelor de oxidare, care sunt negative , figura II.23. ale elementelor
care se gasesc in solutia electrolitica complexa. Din E1 substantele incep sa se reduca,
intensitatea de reducere creste cu potentialul. Daca se aplica potential negativ in partea stanga
a lui E0, se observa ca E3 reprezinta inceputul oxidarii unui element iar E4 sfarsitul oxidarii
acelui element.
i 10
3 4
7
1 t
6
2 5
t
+i
E6 E5 E4 E3
0
E0 E1 E2 E(mv)
-i
1
2 I 16
15
3
t
13
8
5
14
6
7 9 10 11 12
Principiul de funcionare: Radiaia emisa de sursa (1) dup trecerea prin filtru este
focalizata de lentila (4) apoi cade sub un unghi de 90 pe radiaia incidenta. Lumina
fluorescenta emisa este focalizata de lentila (10), trece prin filtrul (11) si ajunge la detectorul de
fluorescenta care ii msoar intensitatea. Semnalul este apoi amplificat si preluat de sistemul
de prelucrare si afiare a datelor(15). Datele obinute sunt afiate sub forma unei cromatograme
(16).
1 6
4 5 I
10
7
t
8
9