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par
Samuel Fournier St-Laurent
Janvier, 2009
Ce mmoire intitul :
prsent par :
Samuel Fournier St-Laurent
Rsum
Le ttrachlorothne (PCE) et les thnes chlors qui lui sont apparents ont t abondamment
utiliss pour plusieurs applications en industrie ds le dbut du 20e sicle. Ils sont cependant
compts parmi les polluants les plus communs des sols et de leau et beaucoup defforts sont
dploys afin de les liminer. Nous croyons que la conversion des thnes chlors en thnes par
des microorganismes est une solution prometteuse. Le premier aspect du projet visait donc
tablir les conditions pour lesquelles un consortium enrichi en Dehalococcoides ethenogenes
permettrait la conversion complte de PCE en thne. Les expriences ralises nous ont permis
de souligner le rle de lacide lactique ajout aux cultures comme source de carbone et source
indirecte dlectrons pour la dhalorespiration. Nous avons galement pu tablir leffet de la
concentration initiale de biomasse dans les cultures sur le profil de dhalognation du PCE. Le
deuxime aspect du projet visait dvelopper un protocole dencapsulation du consortium dans
une matrice polymrique afin de profiter des nombreux avantages potentiels de lencapsulation.
Nous avons test trois montages dencapsulation diffrents : atomisation avec jet dair,
atomisation avec vibrations ultrasoniques et drop-wise . Le dernier montage prvoyait
lencapsulation des cultures dans des billes dalginate enrobes de chitosane glifi par du
lignosulfonate. Cest le seul montage qui nous a permis dencapsuler le consortium de faon
efficace sans effet significatifs ngatifs sur son activit de dchlorination. Aussi, la comparaison
des profils de dhalognation du PCE de cellules encapsules et cellules libres a montr une plus
faible accumulation de TCE, 1,2-DCE et VC dans les chantillons de cellules encapsule et, par
consquent, une conversion plus rapide et plus complte du PCE en thne. Finalement, nous
avons observ une tendance favorable lide que les microorganismes encapsuls bnficient
dun effet de protection contre de faibles concentrations doxygne.
Astract
Tetrachloroethylene (PCE) and other chlorinated ethenes have been used for industrial purposes
since the beginnning of 20th century. However, they are now considered common pollutants of
soil and water. A lot of efforts are directed toward elimination of these compounds and we
believe degradation of these chlorinated ethenes by microorganisms is the best solution. The first
step of this project was to establish a complete conversion of PCE to its non-toxic product
ethylene using an enriched consortium of Dehalococcoides ethenogenes. Our results show the
importance of lactic acid as a carbon source and indirect source of electrons in a reaction known
as dehalorespiration. We have been able to establish the effect of initial biomass on the
biodegradation profile of PCE. The second step of the project was to obtain a working protocol
for encapsulation of the consortium in a polymeric matrix. Such immobilization procedure would
then allows numerous possible advantages as shown in the literature. We tested three
encapsulation setups: air atomization, ultrasonic atomization and drop-wise technique. In the last
setup, we successfully encapsulated the bacterial consortium into particles made of an alginate
core surrounded by a chitosan layer. Thus the drop-wise technique allowed encapsulation of the
consortium without negative effects on its dechlorination activity. In addition, the dechlorination
profiles of encapsulated cells showed a lower accumulation of chlorinated intermediates TCE,
1,2-DCE and VC which yield a more rapid and complete conversion of PCE to ethylene. Finally,
our results support the idea that encapsulated microorganisms may benefit from a protective
effect when oxygen is present in the medium.
Rsum........................................................................................................................................... iii
Astract ............................................................................................................................................ iv
Introduction ..................................................................................................................................... 1
3. Matriel et Mthodes................................................................................................................. 35
3.1. Polymres............................................................................................................................... 35
3.2. Cultures cellulaires................................................................................................................. 36
3.3. Premier montage : microencapsulation par atomisation avec jet dair ................................. 38
3.4. Second montage : microencapsulation par atomisation ultrasonique .................................... 40
vi
4. Rsultats ................................................................................................................................... 49
4.1. Culture KB1 ........................................................................................................................... 49
4.1.1. Premires cultures ...................................................................................................... 49
4.1.2. Contamination par loxygne..................................................................................... 50
4.1.3. Stimulation par lacide lactique ................................................................................. 51
4.1.4. Effet de laccroissement de la quantit de microorganismes ..................................... 56
4.1.5. Rsum des rsultats et conclusion sur la culture KB1.............................................. 61
Bibliographie............................................................................................................................... 103
vii
Tableau 1. chantillons dalginate et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier les
conditions ncessaires la formation de billes glifies............................................. 65
Tableau 2. chantillons de chitosane et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier
les conditions ncessaires la formation de billes glifies ....................................... 66
Tableau 3. chantillons dalginate, agents glifiants et agents denrobage utiliss lors des tests
visant identifier les conditions ncessaires la formation de billes glifies .......... 67
Tableau 4. Efficacit dencapsulation dtermine par le poids sec des chantillons finaux et de la
solution dalginate de dpart pour trois conditions dencapsulation utilises avec le
premier montage.......................................................................................................... 72
Tableau 6. chantillons dalginate et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier les
conditions ncessaires la formation de billes glifies avec le deuxime montage . 76
Tableau 7. chantillons de chitosane et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier
les conditions ncessaires la formation de billes glifies avec le deuxime montage
..................................................................................................................................... 77
Tableau 8. chantillons dalginate, agent glifiant et agent denrobage utiliss lors des tests
visant identifier les conditions ncessaires la formation de billes glifies laide
du deuxime montage ................................................................................................. 79
viii
Fig. 1. Structure des trois isomres dthnes chlors portant deux atomes de chlore ................... 8
Fig. 5. Profil de dhalognation du PCE dans un systme reconstitu in-vitro par lquipe de
Magnuson et al. (42).. ....................................................................................................... 18
Fig. 12. Profil de dhalognation du PCE par lune des premires cultures de KB1 et profil de
dhalognation du PCE dans les bouteilles contrle avec milieu de culture strile. ...... 49
ix
Fig. 13. Profil de dhalognation du PCE par lune des premires cultures de KB1 contamine
par de loxygne lors de linoculation............................................................................. 51
Fig. 14. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue une dose dacide
lactique correspondant 5 mM au jour 18 aprs linoculation....................................... 52
Fig. 15. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue une solution saline au
jour 18 aprs linoculation.. ............................................................................................ 53
Fig. 16. Comparaison du pourcentage des concentrations finales de 1,2-DCE, VC et thne par
rapport la concentration totale du PCE et de ses produits de dhalognation dans les
chantillons pour des cultures stimules et non-stimules par lajout dacide lactique (5
mM)................................................................................................................................. 54
Fig. 17. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue des doses additionnelles
de 5 mM dacide lactique et de 50 M de PCE au jour 15 aprs linoculation.. ............ 55
Fig. 18. Augmentation de la quantit de protines dans des cultures ayant reues des doses
supplmentaires de 5mM dacide lactique...................................................................... 56
Fig. 19. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au
dpart est de 11,3 mg/L................................................................................................... 57
Fig. 20. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au
dpart est de 55,0 mg/L................................................................................................... 58
Fig. 21. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au
dpart est de 63,6 mg/L................................................................................................... 58
Fig. 22. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au
dpart est de 85,0 mg/L................................................................................................... 59
x
Fig. 23. Variation du pourcentage de PCE, 1,2-DCE, VC et thne prsents 2,8 jours en
fonction de la concentration initiale de protines dans les chantillons de la culture KB1.
......................................................................................................................................... 60
Fig. 24. Concentration de PCE en micromoles par litre dans les chantillons contenant 1,0 g de
billes dalginate. .............................................................................................................. 69
Fig. 25. Concentration de PCE en micromoles par litre dans les chantillons contenant 1,0 g de
billes de chitosane.. ......................................................................................................... 69
Fig. 27. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules
prpares selon le protocole du deuxime montage........................................................ 80
Fig. 28. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre (deuxime
montage).......................................................................................................................... 80
Fig. 29. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules
prpares selon le protocole du deuxime montage et contamines par une quantit
inconnue doxygne.. ...................................................................................................... 81
Fig. 30. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules
prpares selon le protocole du troisime montage (drop-wise). La concentration de
protines au dpart est de 55,0 mg/L.. ............................................................................ 85
Fig. 31. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre (troisime
montage). La concentration de protines au dpart est de 55,0 mg/L............................. 86
xi
Fig. 32. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules
prpares selon le protocole du troisime montage (drop-wise). La concentration de
protines au dpart est de 85,0 mg/L. ............................................................................. 86
Fig. 33. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre. La
concentration de protines au dpart est de 85,0 mg/L. .................................................. 87
Fig. 34. Profil de dhalognation du PCE par des cultures KB (contamination volontaire par
loxygne). ...................................................................................................................... 90
Fig. 35. Pourcentage des molcules de PCE qui ont perdu aucun, au moins deux, au moins trois
ou les quatre atomes de chlore au temps 5,6 jours dans les chantillons de cellules
encapsules avec le protocole du troisime montage (drop-wise). ................................. 91
Fig. 36. Pourcentage des molcules de PCE qui ont perdu aucun, au moins deux, au moins trois
ou les quatre atomes de chlore au temps 5,6 jours dans les chantillons de cellules
libres................................................................................................................................ 91
xii
Parmi les polluants les plus communs et les plus difficiles liminer se retrouvent le
tetrachlorothne (PCE) et trichlorothne (TCE), deux composs utiliss en grande quantit
comme solvents industriels ds le dbut du 20e sicle (1, 44, 85). Plusieurs auteurs attribuent la
prsence du PCE et TCE dans lenvironnement leur grande utilisation et aux faibles normes
dentreposage (3, 25, 27, 50, 51, 73, 75). Ces polluants se retrouvent principalement dans le sol
et leau et sont considrs comme toxiques pour les humains (2). Beaucoup defforts sont donc
dploys afin de dvelopper un moyen efficace et peu coteux pour les liminer.
Une solution ce problme fut rendue possible grce lisolement, par lquipe de
Maymo-Gatell, Chien, Gossett et Zinder (51), dune bactrie capable de convertir compltement
le PCE en thne: Dehalococcoides ethenogenes 195. Cette bactrie anarobie est aussi capable
dutiliser une gamme varie de composs chlors comme accepteur dlectrons pour sa
croissance. En raison de la capacit unique qua D. ethenogenes 195 de transformer le PCE, il est
raisonnable de penser quelle pourrait savrer utile pour une stratgie de bioaugmentation dans
un site contamin. Malheureusement, elle ne peut tre cultive seule sans ncessiter un ou
plusieurs composs encore inconnus pour survivre (50, 51). Ce(s) compos(s) ne semble pas se
retrouver chez toutes les bactries et pour linstant la seule faon de cultiver D. ethenogenes en
culture pure est dajouter un culot de bactries anarobes soniques provenant de cultures
capables de dhalogner le PCE (42, 50, 51). Un premier aspect de ce projet vise donc tablir
un systme stable dlimination complte du PCE laide de cellules de D.ethenogenes.
Lautre aspect du projet vise encapsuler les bactries responsables de cette conversion.
Lencapsulation est une technique visant immobiliser des cellules, protines ou autres
molcules dans une matrice polymrique ayant le plus souvent la forme dune sphre. La
structure des capsules et le choix du polymre varient selon les besoins : bioracteurs
microscopiques pour la production industrielle, entreposage, culture cellulaire, distribution de
mdicaments ou probiotiqes (40, 57, 65). Le plus souvent, la taille des pores de la matrice
polymrique permet lchange de nutriments et dchets cellulaires avec le milieu extrieur et les
cellules peuvent ainsi survivre et se reproduire lintrieur des capsules. Les avantages de
lencapsulation qui sont le plus souvent rapports sont une plus grande efficacit de production
dans le cas des bioracteurs ainsi que la protection du matriel encapsul contre les conditions de
lenvironnement extrieur comme des carts de pH et temprature, substances toxiques,
anticorps dun hte etc. (40, 57, 74) Il est galement possible dencapsuler des cellules et inclure
3
dans la matrice polymrique des nutriments, enzymes et autres co-substrats (74). Nous pensons
donc pouvoir profiter des nombreux avantages de lencapsulation afin damliorer lefficacit de
conversion du PCE par D. ethenogenes tant dans un environnement difficile quen conditions
optimales. Lobtention dun systme de transformation complte du PCE laide de bactries
encapsules reprsentera donc une tape majeure de ce projet.
Nous poursuivrons ensuite par la prsentation des mthodes et matriel utiliss pour dvelopper
un modle dencapsulation de D. ethenogenes. Puis, nous prsenterons les rsultats des
diffrentes tapes menant la ralisation de notre objectif et nous terminerons par une analyse
des travaux en mettant laccent sur limpact de ceux-ci sur des recherches futures.
1. Revue de la littrature
Nous prsentons ici le PCE ainsi que ses produits de dgradation jusqu lthne. Pour
chacun, nous rapportons les principales mthodes de fabrication, caractristiques physico-
chimiques, sources de pollution par lactivit humaine ainsi quune courte analyse des donnes
sur leur toxicit.
PCE
Le ttrachlorothne (PCE) est un solvant industriel synthtique dont la production
remonte 1821 lorsque le scientifique Michael Faraday procda la dcomposition thermale de
lhexachlorothane (33). Dautres mthodes de fabrication ont ensuite t dveloppes comme
loxychloration du 1,2-dichlorothane et la chloration de rsidus chlors comme loxyde de
propylne. Le PCE a connu un essor rapide au 20e sicle surtout en raison du fait quil
reprsentait peu de risque dinflammation compar dautres solvants industriels (25, 75).
5
Depuis, ce solvant est un produit commun retrouv au niveau domestique, industriel et militaire
pour des applications comme le nettoyage sec de tissus, le dgraissage de pices mcanique et
la finition de la coloration des tissus (8, 49, 75). Au dbut du 20e sicle, il tait aussi utilis pour
le traitement des infestations par certains nmatodes (8). Enfin, le PCE est aussi utilis comme
intermdiaire dans la production dacide trichloroactique et certains rfrigrants fluors (25).
Dans des conditions normales, le PCE se retrouve sous la forme dun liquide incolore
avec une lgre odeur sucre (3). Il est trs peu soluble dans leau (15 mg/100ml 20oC) mais
miscible dans lthanol et autres solvants organiques hydrophiles (8). Le PCE en solution pure
sans stabilisants se dgrade lentement en prsence dair, dhumidit et de lumire (13). Mme en
prsence de stabilisants, il reste sensible la lumire. Ses synonymes sont : ttrachlorure
d'thne, perc, perchlore, perchlorothne, ttrachlorotne et perk (8).
Le PCE est toxique pour les humains et animaux de laboratoires principalement en cas
dinhalation ou ingestion. En grande quantit dans lair (>1000 ppm), il affecte en quelques
minutes le systme nerveux central et peut causer tourdissements, somnolence, vomissement,
perte de conscience, troubles respiratoires et arythmie cardiaque (13). des concentrations plus
faibles (100 ppm 100 0ppm) des nauses et irritations des yeux et des voies ariennes
6
suprieures sont rapports (13). En cas dingestion, le PCE cause des troubles digestifs et une
dpression du systme nerveux central (13). Le PCE a aussi des effets sur le foie et les reins
causant des dommages parfois irrversibles. Une exposition chronique au PCE long terme peut
causer des troubles psychiques comme des troubles de mmoire et altration de lhumeur.
Certaines tudes chez des femmes travaillant dans des industries de nettoyage sec rapportent
aussi une augmentation des problmes de menstruation et davortements spontans (3).
Concernant les effets mutagnes ou cancrignes du PCE, les nombreuses tudes narrivent pas
un consensus. Une quipe de recherche amricaine a dailleurs regroup plus de 44 articles sur le
sujet et dtermin si le PCE avait des effets cancrignes sur les animaux incluant les humains.
Ils sont arrivs la conclusion quil nexiste pas de lien ou quil manque de preuves pour relier
lexposition au PCE au cancer (59). Enfin, le PCE est considr comme un cancrogne
suspect.
TCE
Le trichlorothne est, tout comme le PCE, un solvant industriel utilis comme agent de
dgraissage pour nettoyer les mtaux (12). Il est fabriqu en utilisant du dichlorothne et des
ions de chlore. Le procd doxychlorination donne du PCE et du TCE qui sont ensuite spars
(4). Le TCE est aussi utilis comme solvant pour les graisses, huiles, cires et autres substances
grasses dans lindustrie du textile. Il sagit galement dun intermdiaire dans la synthse de
produits pharmaceutiques comme les aliphatiques polychlors ou la production dinsecticides.
Au niveau domestique, le TCE entre dans la composition de substances adhsives, lubrifiants,
peinture, vernis et pesticides (31). Il peut aussi tre utilis comme rfrigrant et comme solvant
dans lindustrie arospatiale pour chasser loxygne liquide (31).
Dans des conditions normales le TCE se retrouve sous la forme dun liquide incolore
avec une lgre odeur sucre, rappellent lodeur du chloroforme (12). Il est, tout comme le PCE,
trs peu soluble dans leau (0,1 g/100 ml 20oC) et miscible dans la plupart des solvants
organiques comme lthanol, ltherdithylique, actone, etc. (12). Le TCE pur ragit
violemment avec les bases fortes, librant du dichloroacthne (explosif), ainsi que les poudres
mtalliques. Il se dgrade lentement lorsquil est expos lair et lhumidit (12). Il est donc
ncessaire de le stabiliser (2% poxydes ou amines) (4). Ses synonymes sont trichlorothne,
7
La principale source du TCE qui se retrouve dans lenvironnement est sans contredits le
rejet des usines qui utilisent le TCE comme solvant (4). Des problmes dentreposage peuvent
aussi librer les stocks directement dans leau et les sols. Cependant, puisque le TCE est sensible
la lumire et lair, sa demi-vie dans latmosphre est denviron une semaine. Sa dgradation
entrane alors la formation dun irritant pulmonaire : le phosgne (4). Dans leau de surface, sa
demi-vie est denviron deux semaines. Les milieux pollus par le TCE sont donc le plus souvent
les sols et les nappes deau souterraines. Les listes prioritaires de lEPA aux tats-Unis ont
identifis le TCE sur au moins 861 des 1 428 sites dangereux sur lensemble du territoire (4). En
somme, le TCE est surtout retrouv dans les sols et dans lair proximit des usines qui en font
lusage. Des travailleurs dans ces usines peuvent tre exposs des niveaux de TCE qui varient
entre 1 et 100 ppm.
Le PCE et TCE sont similaires quand aux effets toxiques observ chez les animaux de
laboratoires et chez les humains. Le principal effet toxique aigu du TCE est une dpression du
systme nerveux central causant des tourdissements, somnolence, vomissement, troubles
respiratoires, perte de conscience, faible coordination et arythmie cardiaque (12, 13). Le TCE a
galement des effets sur le foie et les reins. Des effets toxiques ont t observs sur les cellules
de Clara dans les poumons de souris (12). des concentrations plus faibles ( 1000 ppm), les
effets irritants (yeux, peau, poumons) du TCE sont mis en vidence. Chez les souris et les rats, le
TCE est souvent reconnu comme cancrigne sans toutefois confirmer hors de tout doute les
effets mutagnes (12). Finalement, en raison de biais ou manque de rsultats significatifs, le
caractre mutagne ou cancrigne du TCE chez les humains na pu tre confirm. Il en est de
mme pour les effets sur la reproduction humaine (12).
DCE
Nous regroupons les produits de la dchlorination du TCE sous lunique nom de
dichlorothne (DCE). Cependant la dchlorination du TCE libre en fait trois types de
molcules diffrentes portant toutes deux atomes de chlore mais des positions diffrentes. Ces
8
Fig. 1. Structure des trois isomres dthnes chlors portant deux atomes de chlore
Ces trois molcules se retrouvent toutes sous forme liquide temprature et pression
normales. Elles ont aussi une odeur caractristique de chloroforme et une plus grande solubilit
dans les solvants organiques (80). La solubilit dans leau du 1,2-DCE est de 0.35 g / 100 ml
pour lisomre cis et 0.64 g / 100 ml pour lisomre trans (14). Tout comme le PCE et TCE, les
thnes chlors deux carbones sont susceptibles la lumire, lair et lhumidit. En se
dcomposant, ils deviennent des produits corrosifs comme par exemple de lacide chlorhydrique
(14). Ils ragissent galement avec les bases fortes en formant un produit explosif:
chloroactylne (14).
Les industries sont les principales sources de pollution par le DCE. Les procds de
fabrication de copolymres de chlore (emballages plastiques flexibles et transparents) librent du
DCE dans lair (80). Il est galement possible de penser que des accidents lors du stockage,
transport et manipulation de DCE sont responsables dune partie de la pollution par ces
composs. Aux tats-Unis, le DCE se retrouve surtout dans leau, incluant de faibles
concentrations dans leau potable.
Une forte exposition au DCE (>1000 ppm) a des effets semblables aux autres thnes
chlors : dpression du systme nerveux central, symptmes dtat dbrit, convulsions, perte
9
de conscience (80). Lors de lexposition plus long terme chez des rats, des effets toxiques sur le
systme nerveux, foie, reins et poumons ont t observs (80). Les isomres de 1,2-DCE se
fixent sur lhme et inhibent plusieurs enzymes comme les enzymes cytochromes P450 (14).
Leur action influence donc la toxicit dautres polluants et mdicaments. Ses effets cancrignes
ne sont pas reconnus chez les humains en raison du manque de lien vident entre lexposition
chronique au DCE et le nombre de cancer dans les populations tudies. Cependant, il a t
rapport une occasion la prsence de tumeurs dans les glandes mammaires et les reins de rats
exposs de faibles concentrations de DCE dans leau (5).
VC
Le chlorure de vinyle (VC) est un thne chlor qui se distingue des autres produits de
dgradation puisquil nest pas utilis comme solvant industriel. En effet, le VC est plutt un
composant de dpart pour la formation du polyvinyle (7), un polymre utilis dans la fabrication
dune grande varit de plastiques entrant dans la composition de tuyaux, cbles, membranes
demballages (7). Le VC entre aussi dans la fabrication de meubles, pices automobiles et divers
articles domestiques (7). Aux tats-Unis, il a aussi t utilis dans des arosols, mdicaments et
cosmtiques jusquen 1974. Le VC est un gaz inodore et incolore avec une lgre odeur sucre.
Il est galement trs inflammable et est soluble dans leau (7).
Les sources potentielles du VC sont les missions des usines qui lutilisent dans leur
procd de fabrication ou les entrepts qui contiennent de grands volumes de VC (6, 7). Les
nouvelles voitures dgagent aussi une faible dose de VC qui svapore des pices de plastique (6,
7). Leau peut aussi tre contamine par ce compos si elle est en contact avec des tuyaux de
polyvinyle (6, 7). Bien entendu, les dpotoirs o se retrouvent tous les produits fabriqus base
de polyvinyle dchargent du VC dans leau de ruissellement et dans lair. Finalement, il est aussi
possible de retrouver du VC dans les zones contamines avec du PCE, TCE ou DCE comme
produit de la biodgradation par la flore microbienne (6).
Une exposition aige au VC (10 000 ppm 20 000 ppm) cause des problmes au niveau
du systme nerveux central comme des nauses et des tourdissements (6). des niveaux plus
levs encore, le VC cause des irritations des voies respiratoires des yeux et des reins (87). Une
10
inhibition de la coagulation sanguine et des cas darythmies cardiaque ont aussi t observs
chez des animaux de laboratoires (6). Parmi les effets chroniques non-cancrignes associs
des doses plus faibles de VC se retrouvent des cas de dommages au foie et aux reins, des
symptmes de dommages au systme nerveux central ainsi quau systme nerveux priphrique
(6). Une exposition chronique au VC pendant un an a cause des dommages aux testicules et une
baisse de fertilit chez des rats (6). Pour finir, le VC est associ des cas de cancer du foie
(angiosarcoma) et a t class comme carcinogne du groupe A par la Environmental
Protection Agency amricaine (79).
thne
Lthne ou thylne est le produit final souhait de la transformation des thnes
chlors. Contrairement ces derniers, lthne ne contient pas datome de chlore et se retrouve
sous forme de gaz pression et temprature normales (10). Il a une lgre odeur sucr et il est
considr comme inoffensif pour ltre humain (surtout lorsque compar au aux thnes chlors
mentionns prcdemment). Les risques associs son utilisation sont surtout lis ses
proprits inflammables.
Contrairement aux molcules prsentes prcdemment qui sont surtout produites par les
industries, lthne est une molcule trs prsente dans la nature puisquelle est aussi produite
par des systmes vivants, principalement les vgtaux. En effet, lthne est une hormone
vgtale responsable de plusieurs phnomnes biologiques comme le mrissement des fruits,
linduction de la production de fleurs ou encore la mort des feuilles et des fleurs (48). Ses
effets varient selon sa concentration et les espces exposes. Dans lindustrie alimentaire,
lthne est un problme important et sa concentration dans les zones dentreposages est rduite
au minimum pour viter que les fruits ne mrissent trop vite. Dans dautres cas, les fruits
pourront tre exposs des concentrations faibles mais constantes de 1 50 ppm pour initier
leur maturation lorsque viendra le temps de les livrer aux consommateurs (48). La production
dthne se fait aussi en industrie par pyrolyse partir dthane, propane et butane (70). En
raison de la simplicit de la molcule dthne ainsi que de son double lien covalent, il est aussi
utilis comme ractif dans des ractions chimiques pour la production de composs chimiques
comme les plastiques et les rsines (70).
11
Le traitement des sols et eaux contamins par des thnes chlors peut se faire laide de
plusieurs mthodes diffrentes. Notre but ici nest pas den faire une liste exhaustive mais bien
dtudier une approche en particulier savoir la conversion des thnes chlors par lajout et/ou
le support des populations microbiennes mtaboliquement actives dans le site dcontaminer.
Cette dernire est une approche alternative aux mthodes traditionnelles qui visaient pomper
(ou creuser) et traiter leau (ou les sols) qui taient bien souvent lentes et coteuses (32). En
fait, depuis la dcouverte de bactries capables dutiliser les thnes chlors comme accepteurs
dlectrons, la biormdiation est devenue une approche attrayante et potentiellement efficace.
Comme le PCE et les thnes chlors dintrt se retrouvent aussi naturellement dans la
nature (30), on peut penser quil existe des organismes capables de dgrader ces polluants. En
fait, les bactries ont dvelopp travers le temps divers mcanismes dlimination de ces
composs et il est aujourdhui possible denlever les atomes de chlore du PCE avec des cultures
mixtes provenant de milieux aussi communs quune station de traitement des eaux uses (27). Il
y a cependant une distinction apporter entre la simple facult de dchlorination et celle plus
complexe quest la dchlororespiration. Plusieurs bactries ont des systmes leur permettant
denlever des atomes de chlore des thnes chlors et on dira alors quelles sont capables de
dhalognation ou dchlorination. Dautres bactries ont des systmes enzymatiques leur
permettant de coupler llimination de latome de chlore la production dATP. Au niveau de
lnergie, ce phnomne de dchlororespiration est possible puisque le potentiel rdox du couple
R-Cl / R-H est valu entre +250 mV et +600 mV (34). Nous prsentons ici les mcanismes par
lesquels les bactries peuvent transformer les composs halogns comme le PCE.
Dhalognation oxydative
La dhalognation oxydative est catalyse par des enzymes utilisant loxygne comme les
monooxygnases et dioxygnases (24). Ces enzymes, comme par exemple la mthane
monooxygnase de certaines bactries mtanotrophes ou les cytochromes P-450, ont des
fonctions biologiques importantes mais peuvent galement ragir avec divers composs
12
halogns incluant le TCE (41). Les microorganismes capable de dhalogner les thnes chlors
grce ce systme ne retirent pas de bnficies direct de cette conversion (i.e. pas dnergie ou
source de nutriments). Cela peut mme nuire leur comptitivit comme dans le cas de cultures
capable de dhalogner le tolune (47). Le mcanisme de dhalognation oxydative dpend du
type de monooxygnase. Dans le cas de la conversion du TCE par la mthane monooxygnase,
lenzyme catalyse lpoxydation du compos et le produit rsultant est transform spontanment
par hydrolysation ou isomrisation (24). Chez dautres microorganismes comme Pseudomonas
aeruginosa 142, la dhalognation du 2-halobenzoate se fait par lenzyme 2-halobenzoate 1,2-
dioxygnase en utilisant du NADH comme donneur dlectrons. La conversion se fait aussi en
prsence doxygne molculaire et les produits sont du HCl, CO2 et du benzne-1,2-diol.
Certaines tudes suggrent aussi des mcanismes utilisant de la glutathionne (55). Bien que
plusieurs bactries arrivent transformer le PCE et TCE, la dhalognation sarrte souvent aux
intermdiaires DCE et VC (53). Concernant la dhalognation du TCE en pratique, une solution
envisage est lutilisation de bactries mthanognes capables de transformer le TCE en
conditions arobies, couples des bactries mthanotrophes capable de transformer le PCE en
TCE en conditions anarobie (54).
Dhydrohalognation
La dhydrohalognation est une raction qui limine les halognes laide denzymes
dhydrohalognases. Latome enlever, par exemple le chlore, est libr sous forme de HCl
laissant un lien double sur la molcule (25). Sphingomonas paucimobilis UT26 est une bactrie
qui utilise ce mcanisme pour transformer linsecticide lindane (60). Pour dautres bactries,
cette raction simple est une des nombreuses tapes conduisant la minralisation de composs
aromatiques portant un ou plusieurs atomes de chlore (25).
Transfer de mthyle
Chez certaines bactries anarobies strictes comme Acetobacterium dehalogenans, la
dhalognation des composs chlors se fait par transfert de groupe mthyle. Ce microorganisme
transforme le chloromthane grce son enzyme chloromthane dhalognase qui catalyse le
transfert du groupe mthyle de son substrat sur une molcule de ttrahydrofolate. La raction
produit un ion chlore et une molcule de ttrahydrofolate portant un mthyle supplmentaire :
methylttrahydrofolate (78).
Dhalognation substitutive
La majorit des dhalognases qui ont t caractrises sont des enzymes du type
dhalognase hydrolytiques (25). Ces enzymes ont la particularit dliminer les halognes en
utilisant de leau. Latome de chlore se trouve ainsi remplac par un groupe alcool. Un exemple
denzyme appartenant cette famille est la 4-chlorobenzoyle-CoA dhalogenase de
Pseudomonas sp. CBS3 qui enlve latome de chlore sur le 4-chlorobenzoyle (25). La
dhalognation substitutive peut galement se faire en utilisant la glutathionne dans une raction
de dhalognation thiolytique (25). Lenzyme glutathionne S-transfrase peut ragir avec le
compos chlor dichloromthane pour librer un ion chlore de la molcule. Le complexe form
avec lenzyme est alors suffisamment instable pour tre hydrolys par de la glutathionne ou du
formaldhyde qui sont tous deux des mtabolites importants chez les bactries
mthylotrophiques.
14
Dhalognation rductrice
Cette raction est celle que D. ethenogenes utilise pour dhalogner les thnes chlors.
Elle est associe aux bactries anarobes comme par exemple des mthanognes et des
homoactognes (34). La dhalognation rductrice se fait au moyen denzymes appels
dhalognases rductrices qui contiennent des facteurs corrinodes (exception : un hme chez
Desulfomonile tiedjei) et sont localises dans la membrane cellulaire (exception : cytoplasme
chez Dehalospirillum multivorans) (34). Deux mcanismes de la raction sont suggrs par
Holliger et al. : (1) le co-facteur de lenzyme ragit avec un carbone du PCE pour provoquer
llimination dun atome de chlore; (2) un lectron est transfr du co-facteur vers le PCE suivi
de la formation dun anion de chlore et dun radical de TCE qui ragira avec un proton pour
former du TCE (34). Des tudes sur ces enzymes ont aussi rvles la prsence dautres co-
facteurs contenant des noyaux Fe-S. Finalement, il est important de souligner que la TCE-
dhalognase rductrice chez D. ethenogenes est lun des rares enzymes capables de transformer
le DCE et le VC.
Bien que ces diffrentes bactries et les systmes prsents fonctionnent pour la
dhalognation des composs chlors, la transformation du PCE nest souhaitable que si elle
seffectue compltement jusqu un ou plusieurs composs inoffensifs. Il apparait que la
dhalognation complte soit inefficace en condition arobie (73). Dailleurs, lide quune
culture en condition arobie elle seule ne pouvait dhalogner tous les thnes chlors a t
gnralement accept jusquen 2001 alors que des chercheurs ont rapports une conversion
partielle de PCE, TCE, DCE et VC par une bactrie Escherichia coli recombinante portant un
gne codant pour lenzyme tolune-o-xylne monooxygnase (73). Une dhalognation plus
efficace est obtenue avec des systmes complmentaires arobes/anarobes. Il semble que le
produit final le plus souvent obtenu lors de la dhalognation des thnes chlors soit lthne
(27). Certains auteurs ont cependant rapports une conversion complte vers du CO2 (82, 83).
15
Dcouverte
Plusieurs tudes sur la dgradation des thnes chlors sur des sites contamins ont
rvles que sur certaines dentre eux, la dhalognation se faisait compltement pour donner de
lthne alors que sur dautres, la raction sarrtait des tapes intermdiaires (DCE ou VC)
(53). Il fut par la suite dmontr que linoculation de ces sites avec des consortiums (i.e.
bioaugmentation) capables de produire de lthne permettait une conversion complte (22, 46).
Cest en tentant disoler la ou les bactries responsables de cette conversion complte que
lquipe de Maymo-Gatell, Chien, Gossett et Zinder mirent en vidence le rle unique de
Dehalococcoides ethenogenes 195. lpoque, elle tait la seule bactrie connue capable de
dhalogner compltement le PCE jusqu lthne. Depuis, dautres bactries de la mme
famille ont t isoles et possdent toutes la capacit dutiliser des thnes chlors comme
accepteurs dlectrons. La premire Dehalococcoides isole est un coque denviron 0,5
micromtre. Comme beaucoup danarobies strictes, elle est trs susceptible loxygne. Une
faible exposition loxygne dun consortium contenant cette bactrie peut dailleurs causer une
perte irrversible de lactivit de dhalognation. D. ethenogenes est capable de
dhalorespiration (systme coupl la production dATP) et peut utiliser une grande varit de
composs de 2 5 carbones contenant des atomes de chlore ou brome (52). Lors de lisolement,
il fut remarqu quelle rsistait aux antibiotiques vancomycine et ampicilline et quelle tait
susceptible la ttracycline. La susceptibilit la ttracycline confirmait quil sagissait bien
dune eubactrie et sa rsistance aux autres antibiotiques fut explique par la structure unique de
la paroi cellulaire qui ressemblait aux S-layers observes sur les archaea (50).
Profil de dhalognation
La dhalognation du PCE par les bactries D. ethenogenes est complexe en raison de la
diversit des produits intermdiaires et le systme enzymatique utilis. Lorsquon observe les
changements de concentration du PCE et de ses produits de transformation sur une priode de
plusieurs jours, on remarque un profil gnral qui peut tre divis en phases. Durant la premire
phase de la dhalognation, le PCE est converti rapidement ce qui se traduit par une
accumulation presque simultane des autres intermdiaires chlors. La deuxime phase de la
dhalognation est caractrise par la disparition finale du PCE et la conversion des
intermdiaires TCE et 1,1-DCE en 1,2-DCE et VC. De faibles concentrations de PCE semblent
tre requises pour la conversion des intermdiaires (51). La dernire phase de la dhalognation
a lieu lorsque le PCE, TCE et DCE ont compltement disparus. La concentration de VC
commence alors baisser et une concentration significative dthne apparat. Nous prsentons
dans la figure suivante (figure 4) un exemple de profil de dhalognation ralis par lquipe de
Maym-Gatell, Anguish et Zinder avec des bactries D. ethenogenes en culture pure.
17
Fig. 4. Exemple de profil de dhalognation du PCE par Dehalococcoides ethenogenes 195 ralis par lquipe de
Maym-Gatell, Anguish et Zinder (51). a) Une dose de 0.7 mmol de PCE a t donne des bactries cultives dans
un milieu contenant du PCE. b) Agrandissement du premier graphique montrant les intermdiaires de la raction.
Fig. 5. Profil de dhalognation du PCE dans un systme reconstitu in-vitro par lquipe de Magnuson et al. (42).
La concentration initiale de PCE est de 600 nmol avec du Titanium (III) citrate comme donneur dlectrons. Les
enzymes responsables de la raction sont la PCE-RDase et la TCE-RDase isoles partir dune culture pure de
Dehalococcoides ethenogenes 195.
ou les facteurs mystre nont pas encore t identifis. Comme solution temporaire
lutilisation de cette bactrie en souche pure, les cultures sont amendes avec des extraits de
microorganismes cultivs sur un mlange butyrate-PCE ou, anciennement, dextraits de cultures
anarobies cultives sur H2-PCE (50, 51). Mais dans la pratique, la faible croissance de la souche
en culture pure et les besoins nutritionnels complexes compromettent srieusement sa survie lors
de la dhalognation du PCE sur des sites contamins. Cest pour cette raison que des cultures
enrichies sont utiliss non seulement sur des sites contamins mais aussi en laboratoire lors de la
purification denzymes (42, 46). Malgr certaines amliorations, nous verrons dans le cadre de ce
projet les limites de lutilisation de cette bactrie imposes notamment par sa faible croissance et
sa susceptibilit loxygne.
Dfinition
Lencapsulation de cellules trouve ses origines dans les technologies dimmobilisation
utilises dans certains procds industriels (37). Elle peut tre dcrite comme la squestration des
cellules dans une matrice polymrique ayant le plus souvent une forme sphrique. La matrice
contient des pores travers lesquels les nutriments, dchets mtaboliques et autres molcules
diffusent. En dautres mots, les bactries se retrouvent coinces lintrieur dun filet de forme
sphrique dont la taille des mailles dtermine les molcules qui les traversent. En condition
optimales, les cellules ne sont cependant pas distribues uniformment dans les billes : elles
auront tendance crotre en plus grand nombre prs de la surface plutt quau milieu (89).
Lencapsulation a permis daugmenter laction de bactries dj utilises (57, 74) et a permis le
dveloppement de nouvelles applications (19, 40, 88). Quelques exemples de polymres utiliss
sont lalginate, agar, chitosane, gomme gellan, glatine, poly(thne glycol), etc. Dans sa forme
simplifie, une encapsulation se fait partir dune solution liquide contenant le polymre ainsi
que des cellules. partir de cette solution que nous dsignerons dans ce projet sous le nom de
solution-mre, des gouttelettes sont formes puis ensuite glifies ( cross-link ) grce une
raction avec un agent chimique ou un procd physique comme un changement de
temprature. Lencapsulation ne se limite pas quaux cellules : une grande varit de
20
mdicaments, enzymes ou mme des brins dADN ont dj t encapsuls (19, 39, 63, 65). Dans
la littrature, le terme microencapsulation est aussi retrouv. Il sagit en fait dencapsulation o
les particules glifies (i.e. les capsules) ont une taille lchelle du micromtre.
Mdecine
Dans le domaine de la mdecine, nous avons identifi les travaux de lquipe mene par
Thomas Ming Swi Chang comme tant les plus reprsentatifs. Dans ce domaine, lencapsulation
sert souvent isoler les cellules des dfenses immunitaires de lhte en gardant les anticorps
lextrieur de la capsule. La matrice sert aussi protger le matriel encapsul de lacidit de
lestomac lors de ladministration orale. Dans une exprience (19), le chercheur nous dcrit
21
lencapsulation de cellules E. coli DH5 modifies gntiquement pour exprimer le gne codant
pour lenzyme urase : le noyau des billes contient des bactries immobilises dans une matrice
dalginate elle-mme enveloppe dune couche intermdiaire de polylysine, puis dune couche
finale dalginate. cette tape, il est intressant de noter que 8,6 g de cellules encapsules
taient aussi efficaces que 1,212 kg de microcapsules contenant de lurase-zirconium-phosphate
pour liminer lure contenue dans un bassin. Les bactries encapsules ont t administres
oralement des rats sur une base quotidienne pendant 21 jours. Les rats utiliss prsentaient
lorigine des dysfonctions rnales et leur niveau dure dans le plasma atteignait en moyenne
52,08%. Pendant ce traitement, les niveaux dure sont revenus la normale 9,10% et sont
remonts aprs la fin les traitements.
Industrie
Pour les applications en industrie, nous avons retenu deux exemples, lun pour le
domaine alimentaire et lautre pour lindustrie pharmaceutique. Pour le premier exemple, les
cellules encapsules sont des bactries anarobies de la famille Bifidobacterium, des bactries
connues pour leurs proprits probiotiques (40). Les auteurs croyaient quen incorporant ces
microorganismes la nourriture, les clients bnficieraient de plusieurs effets positifs comme
une plus grande digestion des protines, protection contre la colonisation de microorganismes
pathognes et une stimulation du systme immunitaire. Lutilit de lencapsulation tait donc de
dvelopper un moyen de protection contre le milieu hautement acide de lestomac afin que les
22
bactries puissent atteindre les intestins. Les cellules de Bifidobacterium ont t encapsules
laide de plusieurs types de polymres par la technique de spray drying . Ces polymres sont
la glatine animale, gomme arabique et un polymre damidon soluble. Les billes ont ensuite t
plonges dans des bassins de solution acide pH 2 et pH 3 pendant quatre heures afin de simuler
les conditions de lestomac. Nous pouvons observer dans les rsultats les plus intressants que
seulement 2% des cellules libres exposes au pH de 2 ont survcues alors que ce chiffre slve
76% dans le cas de cellules encapsules dans de la glatine. Une explication possible est
linteraction de la matrice avec les protons libres dans la solution acide.
Ces exemples dmontrent une nouvelle fois leffet protecteur dune matrice polymrique
face un milieu ayant un pH trs bas. Aussi, il est raisonnable de penser que des co-substrats
comme des enzymes peuvent tre ajouts la matrice. Aussi, il est suggr que lencapsulation
des bactries dans des racteurs opration continue minimise la perte des bactries croissance
lente qui pourraient savrer utiles pour le bon fonctionnement du racteur (76).
23
Biormdiation
Un autre exemple dapplication possible de lencapsulation de cellules que nous voulons
prsenter se trouve dans lamlioration de la biodgradation dhydrocarbures aliphatiques de
quatre onze carbones (57). La problmatique de la pollution des sols et de leau par les
hydrocarbures est similaire celle des thnes chlors puisque leur prsence dans les sols et
leau est souvent d leur grande utilisation et des dversements accidentels (57). La
problmatique est aussi similaire dans le fait que les composs transformer sont aussi toxiques
pour les bactries responsables de la transformation. Les auteurs ont dabord isols un
consortium de bactries partir de sols contamins par la gazoline. Ce consortium fut utilis par
la suite lors dexpriences de dgradation de la gazoline dans des chantillons de sols et deau
contamins. Le mme consortium a aussi t encapsul dans des microbilles de gomme gellan
par la technique de glification externe. En comparant lactivit de dgradation de cellules libres
et cellules encapsules, les auteurs ont nots plusieurs diffrences intressantes lorsque la
concentration de gazoline tait grande (200 mg/L 600 mg/L). Premirement, les cellules libres
ajoutes ces chantillons contamins ncessitent une priode dacclimatation de quelques jours
avant de dgrader de faon significative les polluants. Ce dlai na pas t ncessaire pour les
cellules encapsules. Ensuite, les cellules libres ont russi dgrader seulement 7% des
hydrocarbures prsent dans les chantillons de 600 mg/L alors que les cellules encapsules ont
dgrades 67% des polluants.
barrire entre les bactries et les particules de sols ce qui permettrait une meilleure diffusion de
linoculum dans la zone contamine.
Le dernier outil offert par lencapsulation est la conservation des cellules. En effet, des
cellules du bacille Calmette-Guerin ont t encapsules dans des billes dagarose puis congeles
en utilisant du trhalose comme cryoprotecteur (40). Les microcapsules sont restes stables aprs
un entreposage de 12 mois et les cellules taient viables.
1.5. Polymres
Il existe une grande varit de polymres qui ont t utiliss ou qui pourraient tre
thoriquement utiliss pour lencapsulation de cellules. Ils sont le plus souvent regroups en
deux catgories savoir les polymres naturels (retrouvs dans la nature) et les polymres
artificiels (obtenus la suite dun traitement chimique par lhumain). Parmi les plus populaires
se retrouvent lalginate, la gomme gellan, lacide poly-lactique, lagarose, la chitosane et mme
le silicone (16, 65). Nous prsenterons ici avec plus de dtails ceux qui ont t utiliss dans le
cadre du projet savoir lalginate et la chitosane.
Lalginate
Lalginate est un polysaccharide naturel isol partir de plusieurs espces dalgues
brunes. Il est compos de D-acide mannuronique (M) li en 1 4 -L-acide guluronique
(G). La composition des blocs M et G ainsi que la longueur des brins de polymre peut varier
selon le type dalgue et son stade de maturation (17, 69). travers notre revue de la littrature,
nous navons pu trouver de nomenclature dfinie pour lalginate : les auteurs donnent le plus
souvent le nom de leur fournisseur sans aucun dtail supplmentaire. Pourtant, il apparat que
dans la plupart des chantillons disponible, deux caractristiques importantes lies la formation
de la matrice, savoir le poids molculaire ainsi que la composition en blocs M et G, varient
beaucoup (69). Par exemple, dans lchantillon que nous avons slectionn pour notre tude,
Protanal LF10/60 (FMC biopolymers, Norvge), le poids molculaire des brins est si vari que le
fabriquant indique plutt la viscosit dune solution aqueuse forme avec lchantillon comme
indice de la longueur moyenne des brins de polymres. Bref, dans le domaine de lencapsulation,
les tudes sont bien souvent des cas uniques en raison de lchantillon dalginate (ou autre
polymre) choisi ce qui rend difficile toute tentative de gnralisation. Malgr cet inconvnient,
lalginate est souvent utilis pour lencapsulation de cellules vivantes en raison de sa grande
biocompatibilit. Il est aussi utilis dans plusieurs applications en mdecine malgr une certaine
controverse au sujet de la probabilit que lacide mannuronique puisse provoquer une raction
immunitaire chez lhte (19). Pour glifier lalginate, des cations divalents comme le calcium et
26
le barium sont utiliss. Les ions interagissent avec les blocs dacide guluronique (do
limportance de spcifier la composition dun chantillon) pour former des liaisons ioniques
entres les diffrents brins (69). La proprit que ce polymre a pour former des complexes forts
avec des cations a aussi t exploite dautres fins comme par exemple dans la purification
dchantillons contenant lenzyme glucoamylase (77). Des capsules dalginate ont cependant un
dsavantage important : la glification est rversible. La prsence dagents chlateurs comme
lacide citrique, lacide lactique, ou un tampon phosphate dans le milieu o se trouvent les
capsules acclrent la dgradation de la matrice de gel en enlevant les ions divalents (20). Une
solution vise enrober des billes rcemment formes avec de la polylysine afin de stabiliser la
matrice (19). Une autre alternative la polylysine est lenrobement des billes dalginate avec de
la chitosane. Pour ce faire, des billes dalginate sont dabord formes puis sont ensuite plonges
dans une solution contenant de la chitosane. Lalginate et les groupes chimiques amine sur la
chitosane forment un complexe non-covalent qui augmente la durabilit des billes compar
lalginate seule (20).
La chitosane
La chitosane est un driv de la chitine quon retrouve dans la carapace des crustacs et
insectes (38). Elle est donc, tout comme lalginate, un polymre abondant et facilement
renouvelable. Dans certaines zones ctires, la chitine est mme considre comme un polluant
(45). Par diffrents traitements, ce polymre naturel est transform pour donner de la cellulose ou
de la chitosane. Dans le cas de cette dernire, un groupe actyle situ sur latome dazote est
enlev par un traitement chimique avec NaOH. La figure suivante (figure 6) montre la structure
de la chitine et de la chitosane.
27
Fig. 6. Structure dun brin de polymre de chitine et de chitosane. Lors du traitement de la chitine avec NaOH, le
groupe actyle reli latome dazote est enlev.
La mthode dencapsulation choisie pour une application varie selon la taille des
capsules, la nature du polymre, la nature du produit encapsul. La plupart de ces mthodes
produisent des billes avec une forme gnralement sphrique ou une forme ressemblant une
goutte deau en chute. La prcision concernant la taille peut aussi varier grandement ce qui peut
29
reprsenter un obstacle pour la constance entre les chantillons dune mme exprience. Bien
que limage abstraite dune capsule soit une bille sphrique avec un diamtre dfini, dans la
pratique, les mthodes dencapsulation permettent plutt la formation dchantillons de
particules gnralement sphriques avec une distribution de taille plus ou moins grande. Nous
vous prsentons ici les mthodes les plus connues pour lencapsulation de cellules.
Drop-wise
Cette mthode commune est souvent utilise avec de lalginate. Une solution liquide
contenant un polymre et des cellules est dabord forme puis dpose goutte--goutte laide
dune seringue et dune aiguille dans un bain o se fera la glification. Dans le cas de lalginate
par exemple, le bain contient des ions calcium ou barium (2% m/v).
Coacervation
Lencapsulation par coacervation dbute par un mlange liquide dans lequel se trouvent
les cellules et le polymre. La composition, la temprature ou le pH de la solution sont ensuite
modifis afin dinitier la formation dune fine membrane non-glifie (aussi appele pr-
membrane) autour dun noyau liquide appel coacervat. Finalement, la pr-membrane est
solidifie par glification ou vaporation de solvant. Il est important de noter que pour cette
mthode, le coacervat et la pr-membrane ne doivent pas tre tous deux hydrophobes ou
hydrophiles. Lun doit tre hydrophobe et lautre hydrophile. Cest pourquoi des glatines
hydrophiles sont utilises lors de limmobilisation de coacervats hydrophobes comme de lhuile
vgtale ou certaines vitamines (19).
mulsion
Cette mthode sapparente la coacervation puisquelle utilise aussi la nature immiscible
de ractifs hydrophiles et hydrophobes. Le mlange de dpart peut contenir des cellules et des
polymres le plus souvent de nature hydrophile (ex. polyamine, polyphnol, L-lidine, agar,
gomme gellan, alginate) dans un solvant hydrophobe comme par exemple de lhuile de canola
(58). Le mlange est agit de faon circulaire afin de former une mulsion o se retrouveront des
billes dhuile entoures de blocs de polymres encore sous forme liquide. La membrane des
capsules est ensuite forme par lajout de monomres hydrophobes (19), en changeant un
30
paramtre comme la temprature du mlange (23, 58, 88) ou par lajout dautres composs
initiant une raction de glification des ions de calcium pour lalginate (17).
Atomisation
Nous avons regroup sous le thme atomisation les mthodes o un bec atomiseur est
utilis. Le protocole gnral dencapsulation avec un atomiseur est semblable la mthode du
drop-wise puisquun mlange de cellules et de polymre est envoy vers un outil qui a pour
tche de sparer le mlange en particules sphriques suivi dune tape de glification. Chaque
systme datomisation diffre donc dans la faon datomiser le mlange. Pour lencapsulation de
cellules, un atomiseur air peut tre utilis. Une mince pellicule de solution liquide circule alors
sur la paroi intrieure dun tube travers lequel passe un jet dair pressuris. la sortie de
latomiseur, la pellicule liquide est spare en une multitude de particules sous la force de lair.
Un autre type datomisation est latomisation par vibrations incluant les vibrations ultrasoniques.
Une fine pellicule du mlange est alors tale sur une surface la sortie de latomiseur (le bec)
qui vibre. Les forces de vibrations causent la formation de crtes et de creux sur la surface de la
pellicule liquide qui se spare ensuite en gouttelettes (71, 72). Finalement, certains atomiseurs
sparent le mlange liquide grce des hlices ou des disques en rotation (9). Il est intressant de
noter ici quil existe un type dappareil atomisation par vibrations commercialis par la
compagnie Inotech Encapsulation (Dottikon, Suisse) o les particules qui quittent le bec de
latomiseur passent travers un champ lectrique de 200-1800 volts. Lorsque de lalginate est
utilis dans le mlange de dpart, les billes se retrouvent charges ngativement et gardent une
forme sphrique durant la chute dans le bain de calcium et au moment de limpact avec la
surface liquide du bain. Grce cette modification, lappareil permet la production de billes
parfaitement sphriques et la moyenne de taille la plus prcise que nous ayons observ parmi les
diffrents systmes dencapsulation valus.
Spray-drying
Bien que la mthode de spray-drying comprenne lutilisation dun atomiseur, nous ne
lavons pas inclus dans la description de la mthode datomisation. En effet, contrairement
latomisation o la forme des capsules est donne suivi dune glification, la mthode du spray
drying atomise et solidifie les capsules en une seule tape. La procdure commence avec la
31
formation dune solution de cellules et de polymre dans un solvant. Le mlange est ensuite
amen vers un atomiseur qui disperse le mlange en fine particules dans un jet dair compress
haute temprature (75 oC 160oC) (15, 26, 40). Le solvant contenu dans les particules svapore
alors rapidement et des billes solides sont obtenues. En raison de plusieurs facteurs techniques
comme par exemple lvaporation rapide du solvant, les capsules obtenues sont de forme
irrgulire et la formation dagrgats est frquente (17).
2. Hypothses et objectifs
avons vu prcdemment avec des capsules dalginate enrobes de polylysine (19). Ce sont donc
les tests avec la chitosane qui seront favoriss en premier puisquil sagit dun driv dun
biopolymre naturel, disponible faible cot et que sa glification est durable. Il est intressant
de noter quen utilisant ce polymre grande chelle nous pourrions contribuer la valorisation
dun produit souvent considr comme un rejet de la transformation de produits de pche.
Lalginate stabilis par un enrobage la chitosane sera envisag comme alternative. Le choix de
la mthode dencapsulation a t arrt sur les systmes datomisation. Nous pensons que
latomisation pourra nous permettre de fabriquer des capsules de la taille voulue tout en tant
facile reproduire sur une grande chelle : il suffit daugmenter le nombre datomiseurs pour
augmenter la production. Dans le cas o nous ne pourrions dvelopper un systme
dencapsulation par atomisation viable pour la culture, nous envisageons comme alternative la
mthode du drop-wise qui est plus simple et plus souvent rapporte dans la littrature.
Enfin, lensemble des ces hypothses sinscrivent dans une dmarche visant produire un
protocole dencapsulation de cellules bactriennes mtaboliquement actives capables de
convertir le PCE en thne. Nous utiliserons donc une culture enrichie en D. ethenogenes afin de
contourner le problme du ou des facteur(s) manquant(s). Le polymre qui sera favoris en
premier est la chitosane. Lutilisation de lalginate seule et lalginate enrobe est galement
envisag. Aussi, nous tenterons de dvelopper un protocole dencapsulation qui nous permettrait
de fabriquer des capsules dun diamtre entre 10 m et 100 m en considrant la technique de
drop-wise comme la dernire alternative. Finalement les dveloppements des deux volets, qui
sont dune part les cellules bactriennes et dautre part la mthode dencapsulation, seront faits
en parallle pour assurer une compatibilit entre lactivit mtabolique des cellules et les
conditions dencapsulation lors des expriences ralises avec les diffrents montages
dencapsulation.
3. Matriel et Mthodes
3.1. Polymres
Alginate
Lalginate a t obtenu de la compagnie FMC biopolymers (Norvge) sous le nom de
Protanal LF10/60, un polymre dalginate de sodium forte proportion en acide guluronique
(65% 75%) et une faible viscosit de 20 cps 70 cps (1% m/v en solution). La formation de
particules solides sest fait au contact dune solution glifiante contenant 2% (m/v) de CaCl2.
Lalginate obtenu tait sous la forme dune poudre et une solution liquide frache a t prpare
pour chaque encapsulation dans une solution saline (0,9% NaCl). Pour la prparation dun
mlange sans oxygne, la solution a t bouillie pendant 10 min puis barbote avec de lazote
pur. Lalginate en solution a ensuite t strilis 121oC et 15 psi pendant 20 minutes.
Chitosane
La chitosane a t obtenue chez Marinard Biotech (Canada) sous le nom de KITOMER.
Elle a t isole partir de Pandalus Borealis et avait un degr de dacthtylation de 88% et une
viscosit de 33 cps (1% m/v en solution). Pour chaque encapsulation, les flocons ont t dissous
dans une solution saline (0,9% NaCl) contenant 1% (v/v) dacide actique. Pour la prparation
dun mlange sans oxygne, la solution a t bouillie pendant 10 min puis barbote avec de
lazote pur. La chitosane en solution a ensuite t strilise 121oC et 15 psi pendant 20 minutes.
Lignosulfonate
Le polymre complexe nous a t fourni par la compagnie LignoTech USA Inc (tats-
Unis) sous le nom de BORRESPERSE NA POWDER. Le lignosulfonate en poudre a t dissous
dans une solution saline (0,9% NaCl) avant chaque exprience dencapsulation. Le pH a t
ajust 8,0 avec du NaOH 1M. Pour la prparation dun mlange sans oxygne, la solution a t
bouillie pendant 10 min puis barbote avec de lazote pur. Le lignosulfonate en solution a ensuite
t strilis 121oC et 15 psi pendant 20 minutes.
36
Escherichia coli
Les cultures de ces bactries taient utilises dans certains tests visant estimer la survie
des cellules bactriennes au procd dencapsulation. Les souches furent gardes au conglateur
-70oC. Les bactries taient ensuite places en croissance dans des flasques de 500 ml
contenant un milieu de culture dont la composition par litre tait de 12,8 g Na2HPO4, 3,0 g
KH2PO4, 0,5 g NaCl, 2,5 g NH4Cl, 0,49 g MgSO4 7 H2O, 0,015 g CaCl2 2 H2O, 0,01 g
Thiamine, 0.01 g FeSO4 7 H2O et 7,5 g dextrose. Le pH tait ajust 7,4 avec une solution de
NaOH 1M, puis le volume final de la solution tait ajust 1 litre avec de leau distille. La
strilisation du milieu de culture se faisait 121oC et 15 psi pendant 20 minutes avant
linoculation. Les cultures ont t laisses en croissance dans un incubateur 30oC et une
agitation de 150 rpm pendant environ 20 heures avant utilisation.
mlange gazeux dazote et de CO2 (80/20, N2/CO2) jusqu lobtention dun pH entre 7,2 et 7,3
la temprature ambiante (~23oC). La solution tait verse dans des bouteilles en verre de 500 ml
fermes hermtiquement avec des bouchons de butyle (Geo-Microbial Technologies, tats-
Unis). Finalement, une solution rductrice (2 mM L-cystine, 2 mM Na2S x 9H2O) tait ajoute
dans une proportion de 1 ml par litre de milieu et le milieu de culture complet tait strilis
121oC et 15 psi pendant 20 minutes. Lajout du PCE sest fait en injectant une solution-mre
contenant 8% (v/v) de PCE dilu dans lthanol pour obtenir une concentration initiale de 100
M de PCE. Les bouteilles ont t places dans un agitateur une vitesse de 100 rpm. Une
culture de bactries avec une densit optique initiale 600 nm denviron 0,10 recevait une
nouvelle dose de 100 M de PCE et 5 mM dacide lactique toutes les semaines. Aprs 3 4
semaines (entre 21 et 27 jours), la culture atteignait la densit optique 600 nm de 0,35 ce qui
tait une valeur suffisante pour commencer une exprience dencapsulation ou pour inoculer un
nouveau milieu afin de propager le consortium.
Description
Le premier montage propos produisait des capsules par atomisation avec jet dair. La
figure 8 montre le montage o la pice principale est un atomiseur jet dair (SESNZ-035HA00,
TurboSonic Technologies Inc, USA) travers lequel un mince film de liquide tait atomis par le
passage dair pressuris. La bouteille dair comprim contenait de lair strile et elle tait relie
par un tube de Norprene un tube dacier fixe de 3 mm qui servait aussi de support
latomiseur. La solution-mre se trouvait dans une bouteille de 500 ml ferme do partaient
deux tubes de Norprene : lun tait quip dun filtre strile de 0.22 m (Millipore, Irlande) et
lautre tait le tube dalimentation principal travers lequel a t inject le master mix . Une
pompe pristaltique (Gilson Manipuls 3 de Gilson, Villiers-le-Bel, France) a t utilise afin
damener la solution-mre vers latomiseur. Ce dernier tait suspendu dans un flasque de 6 litres
au-dessus de la solution glifiante. Un tube de Norprene quip dun filtre strile de 0,22 m
servait vacuer lair hors du flasque. Finalement, la solution-mre et la solution glifiante
taient agits grce des barreaux magntiques et des plaques agitatrices.
39
Fig. 8. Schma du montage dencapsulation avec jet dair : 1) Cylindre de gaz comprim, 2) Manomtre, 3) Tubes
daration pour la sortie ou lentre dair quipes de filtres, 4) Master mix dans une bouteille de 500 ml, 5) Pompe
pristaltique, 6) Atomiseur, 7) Solution glifiante agite grce un barreau magntique.
Protocole dencapsulation
La plupart des sections du montage (tubes, bouteille, flasque, barreaux magntiques,
atomiseur) taient assembles et autoclaves 121oC et 15 psi pendant 20 minutes. Ensuite, les
filtres et le tube de Norprene joints au cylindre dair comprims taient relis au montage en
conditions striles. Lajout de 600 ml de solution glifiante et de solution-mre dans leur
contenant respectifs fut aussi fait en conditions striles. Une fois le processus dencapsulation
dmarr, lair tait amen dans le flasque de 6 litres avec une faible pression et le
fonctionnement des tubes daration tait confirm. La pression dair tait ensuite ajuste la
valeur voulue entre 50 et 70 psi. La vitesse dagitation du barreau magntique de la solution
glifiante tait ajuste afin dviter la formation dun vortex qui pourrait dformer les particules
liquides arrivant dans la solution. Le dmarrage du montage tait termin par la mise en action
de la pompe pristaltique. Durant les premires secondes, il tait normal que les particules
40
jectes soient plus grandes et difformes que prvues : latomiseur jectait le mlange de faon
sporadique. Un flot continu de particules jectes tait ensuite observ et avait laspect dune
fine brume. Il est prfrable de ne pas interrompre une atomisation en cours puisque latomiseur
produirait une nouvelle fois des particules difformes lors de larrt et au redmarrage. Une fois
latomisation termine, les particules taient filtres travers un filtre de mailles dacier dont les
pores sont de 0,8 mm puis filtres une deuxime fois travers un filtre de nylon (120 m,
Millipore). La premire filtration liminait les agrgats de gels incluant les particules difformes
jectes au dbut de latomisation. La deuxime filtration liminait les billes avec un diamtre
suprieur 120 m. Finalement, le lavage des billes sest fait dans une bouteille de 500 ml
contenant 200 ml dune solution de 0,1% CaCl2. Le mlange tait laiss 30 minutes dcanter
puis le surfactant tait limin. Lopration de lavage tait ensuite rpte.
Description
Le deuxime montage tait enferm dans une bote en plastique (1 m x 0,6 m x 0,8 m)
dans laquelle lair tait remplac par une atmosphre compose uniquement dazote. Deux gants
en caoutchouc situs lavant de la bote permettaient lutilisateur situ lextrieur de
manipuler les objets lintrieur. Le deuxime montage se distingue par le fait quun atomiseur
ultrasons a t utilis. Lappareil comporte deux pices principales : latomisateur et le
gnrateur. La premire pice est un atomiseur bec conique capable dun dbit maximal de 1,2
ml par seconde et produisant des vibrations 48 kHz (8700-48 Ultrasonic Atomizing Nozzle,
Sono-Tek, -U). Latomiseur tait reli au gnrateur qui convertissait lnergie lectrique la
frquence voulue (Broad band Ultrasonic Generator, Sono-Tek, -U). Le gnrateur permettait
de modifier la puissance de lappareil afin dobtenir une atomisation plus rgulire selon la
viscosit et le dbit de la solution atomiser. Cette dernire se trouvait dans une seringue en
plastique jetable de 60 ml et une pompe seringue (Harvard Apparatus, -U) a t utilise afin
dacheminer le mlange vers le bec de latomiseur via un tube de Norprene. Ce bec tait
suspendu dans louverture dune bouteille de plastique de 5 litres de faon ce que les particules
41
de gel soient jectes le plus loin possible de la surface intrieure de la bouteille. La solution
glifiante tait agite grce un barreau agitateur.
Fig. 9. Schma du montage dencapsulation avec vibrations ultrasoniques : 1) Gnrateur , 2) Support en acier, 3)
Atomiseur, 4) Solution glifiante agite grce un barreau magntique, 5) Seringue de 60 ml dans laquelle se trouve
le master mix, 6) Pompe seringue
42
Fig. 10. Photographies montrant latomiseur et le gnrateur. En haut, latomiseur est reli au tube dalimentation
qui sort droite de la photographie et par lequel est achemin le master mix. Le gnrateur est la bote noire. En
bas, photographie de latomiseur : le bec de latomiseur est la structure conique inverse situe en bas de la pice.
43
Protocole dencapsulation
Avant lassemblage final des composantes du montage, les tubes, bouteille, support,
barreau magntique taient autoclavs 121oC et 15 psi pendant 20 minutes. Tout le matriel et
les solutions utiliss pendant lencapsulation ont t enferms dans la bote. Les murs intrieurs
taient lavs avec un mlange dthanol 70% et lair remplac par de lazote pur. Avant le
dbut de lexprience, lair lintrieur de la bote tait pomp travers un tube de 50 ml
contenant de la laine de cuivre chauffe afin dliminer les traces doxygne. Latomisation
dbutait par la mise en fonction de latomiseur suivie de la pompe pristaltique. Comme pour le
premier montage, lagitation de la solution glifiante tait ajuste afin de ne pas crer un vortex
qui aurait eu pour effet de dformer les particules avant leur glification. La puissance de
lappareil a aussi t ajuste afin dobtenir une atomisation rgulire du liquide : si cette
puissance tait trop faible, le liquide ne serait pas atomis et saccumulerait sur le bec et si la
puissance tait trop forte, les particules ne seraient pas jectes de manire rgulire.
Latomisation pouvait tre arrte tout moment sans quil y ait djection irrgulire. La
plupart des expriences ont t ralises avec un dbit de liquide dans le bec entre 1 ml/min et 3
ml/min et une intensit des ondes de 3,5 watts 5,0 watts. Une fois latomisation termine, les
particules taient filtres travers un filtre de mailles dacier dont les pores sont de 0,8 mm puis
filtres une deuxime fois travers un filtre de nylon (120 m, Millipore). La premire filtration
liminait quelques rares agrgats de gels qui auraient pu se former pendant latomisation. La
deuxime filtration liminait les billes avec un diamtre suprieur 120 m. Finalement, les
capsules ont t laves deux reprises par lajout de 200 ml dune solution de 0,1% (m/v) CaCl2
suivie dune dcantation dans une bouteille de 500 ml.
Description
Le troisime montage se distingue des deux premiers par le fait que les capsules formes
avaient un diamtre dans lchelle des millimtres contrairement quelques dizaines de
micromtres. La taille du matriel utilis nous permettait aussi de raliser lexprience dans une
tente anarobie flexible de type C (Coy laboratory products Inc., tats-Unis). Loutil utilis en
44
guise datomiseur tait une seringue strile de 60 ml jetable quipe dune aiguille 26 G, elle
aussi strile et usage unique. La solution glifiante tait garde dans un bcher de 200 ml et
agite grce un barreau agitateur.
Fig. 11. Schma du montage dencapsulation par drop-wise : 1) Seringue dans laquelle se trouve le master mix,
2) Solution glifiante agite grce un barreau magntique
Protocole dencapsulation
Le matriel et les solutions taient striliss 121oC et 15 psi pendant 20 minutes et
placs dans la tente 16 heures avant leur utilisation pour minimiser la contamination par des
traces doxygne. La fabrication des capsules commenait par lajustement de la vitesse
dagitation de la solution glifiante. La solution-mre tait ensuite place dans la seringue.
Loprateur plaait la seringue en position verticale au-dessus de la solution glifiante de faon
ce que laiguille se trouve environ 5 cm de la surface du liquide. Dune lgre pression du
doigt, la solution-mre tait dpose goutte goutte (dbit approximatif de deux gouttes par
seconde) dans le bain glifiant. Une fois cette opration termine, les billes taient laisses dans
le bain pour une priode de 10 minutes. Les billes ont t filtres avec un filtre de mailles dacier
dont les pores sont de 0,8 mm. Finalement, les billes ont t laves en versant 200 ml dune
solution de 0.1% CaCl2 directement sur les billes la surface du filtre.
45
Lors de plusieurs expriences, les billes dalginate, dont la glification est rversible, ont
t stabilises suite un enrobage avec le polymre chitosane. Les billes dalginate laves
obtenues partir denviron 50 ml de solution-mre taient places dans 100 ml dune solution
saline (0,9% NaCl). ces billes en solution taient ajouts 100 ml dune solution de 2% (m/v)
de chitosane prpare dans une solution saline et 1% (v/v) dacide actique. Le mlange ainsi
form tait agit doucement (50 rpm) sur une plaque agitatrice pendant 30 minutes pour laisser la
chitosane interagir avec lalginate la surface des capsules. Lenrobage tait stabilis en
polymrisant la chitosane avec du lignosulfonate. Pour se faire, les capsules enrobes et laves
avec une solution saline taient resuspendues dans un volume de 100 ml de solution saline. Un
volume de 100 ml de 20% (m/v) lignosulfonate prpare dans une solution saline tait ensuite
ajout et le mlange tait agit doucement (50 rpm) sur une plaque agitatrice pendant 30 minutes.
Finalement, les capsules taient laves trois fois avec une solution saline ou jusqu ce que
coloration brune d au lignosulfonate disparaisse.
Les chantillons de cellules libres et cellules encapsules ont t prpars comme lors de
la dtermination du profil de dhalognation du PCE (voir mthodes danalyse). laide dune
seringue analytique en verre tanche, un volume doxygne pur a t inject dans les chantillons
immdiatement aprs lajout du PCE. Les chantillons contrles taient des cellules bactriennes
non-exposes loxygne et des chantillons qui contenaient uniquement le milieu dfini strile.
Absorption
Les tests dabsorption du PCE sur diffrents polymres, nanotubes de carbone et poudre
de charbon ont t faits dans des bouteilles en verre de 60 ml contenant 20 ml de solution saline
46
Protines
Pour dterminer la concentration de protines dans les chantillons, lensemble DC
Protein Assay Reagents Package (# 500-0116, BioRad, tats-Unis) a t utilis. Cet ensemble
47
Poids sec
Le poids sec des chantillons dalginate polymris a t dtermin en plaant les
chantillons en entier au four 105 oC pendant environ 16 heures. Les chantillons de contrle
ont aussi t soumis au mme traitement de schage. Une fois sec, les chantillons ont t pess
sur une balance analytique (AL204, Mettler Toledo, Chine).
chauffement de 60 oC par minute jusqu 220 oC maintenu pendant 6 minutes. Les courbes
talons ont t faites avec des mlanges gazeux obtenus de Liquid carbonic, Praxair et Scott gas.
La quantit de chaque thne dintrt (incluant PCE, TCE, DCE, VC, thne et lalkane thane)
dans lchantillon gazeux tait rapporte et leur concentration finale dans la bouteille tait
calcule en tenant compte du volume de lespace de tte, le volume de la phase liquide et la
constante de Henry.
49
4. Rsultats
100 A
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
Somm e des thnes PCE
temps (jours) TCE
DCE VC thne
110
100
B
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
temps (jours)
Fig. 12. (A) Profil de dhalognation du PCE par lune des premires cultures de KB1 et (B) profil de
dhalognation du PCE dans les bouteilles contrle avec milieu de culture strile.
50
Les rsultats obtenus suggrent que la culture a dhalogn le PCE et son premier
produit, le TCE, compltement pendant les 7 premiers jours. Cependant, les thnes portant deux
et un atome de chlore se sont accumuls dans la bouteille. Environ 18 jours aprs linoculation,
99% des molcules de dpart ne portaient plus quun seul atome de chlore et 1% seulement du
PCE de dpart a t compltement converti en thne. La baisse de la somme des thnes (PCE
et ses produits de transformation) a t attribue une perte travers le bouchon puisque quune
baisse similaire a t observe dans les chantillons abiotiques.
100
90
80
70
concentration ( M)
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
temps (jours)
Fig. 13. Profil de dhalognation du PCE par lune des premires cultures de KB1 contamine par de loxygne lors
de linoculation.
Contrairement une culture saine, les chantillons contamins ont montrs une
diminution plus lente de la concentration de PCE. De faibles concentrations de TCE persistaient
durant toute la dure de lexprience et les autres intermdiaires taient aussi prsents. Lthne
tait pratiquement inexistant. cette tape du projet, nous avons attribu aux cultures cultures
contamines par loxygne les observations suivantes : une activit de dhalognation plus lente
du PCE, une absence ou des traces dthne et une accumulation persistante de VC et DCE.
Dans la culture enrichie, lacide lactique prsent dans le milieu a t utilis par certaines
bactries pour produire de lhydrogne qui tait son tour utilis par les cellules de D.
ethenogenes pour la dhalognation des thnes chlors (dhalorespiration). Nous avons tent de
stimuler la dhalognation des thnes chlors en ajoutant aprs quelques jours une nouvelle
52
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
temps (jours)
Fig. 14. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue une dose dacide lactique correspondant
5 mM au jour 18 aprs linoculation. La concentration de protines au dpart est de 18,1 mg/L et les valeurs sont les
moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 10%.
53
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
temps (jours)
Fig. 15. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue une solution saline au jour 18 aprs
linoculation. La concentration de protines au dpart est de 18,1 mg/L et les valeurs sont les moyennes de
duplicatas ; lcart est au maximum de 10% pendant les 15 premiers jours et au maximum de 15% jusqu 27 jours.
Nous avons pu constater que les chantillons ayant reus une dose supplmentaire dacide
lactique pouvaient raliser la conversion complte du PCE vers lthne. Dans les chantillons
contrle, la conversion du produit majoritaire, le DCE, a continu au-del de 18 jours mais est
reste lente avec une vitesse moyenne de 1,7 M par jour entre le 20e et le 26e jour. Durant le
mme intervalle de temps, la production dthne a atteint la vitesse moyenne de 1,0 M par jour
pour les chantillons non stimuls (figure 15) alors quelle tait dix fois plus grande (10,0 M
par jour) dans les chantillons stimuls (figure 14).
le rsultat des produits majoritaires de la dhalognation du PCE mesurs 27 jours aprs le dbut
de lexprience (donc 9 jours aprs lajout de la dose additionnelle dacide lactique) dans les
chantillons stimuls et les chantillons contrle. La stimulation a eu pour rsultat de permettre
aux cultures de convertir compltement les intermdiaires DCE (de 24% 0%) et VC (de 42%
1%). Enfin, cette dhalognation des intermdiaires chlors a fait en sorte que lthne dans les
chantillons stimuls reprsentait environ 99% des thnes dintrts alors quil tait de moins de
30% dans les chantillons contrles.
100%
90%
80%
70%
pourcentage (%)
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
DCE VC thne
produits de dhalognation majoritaires
Fig. 16. Comparaison du pourcentage des concentrations finales de 1,2-DCE, VC et thne par rapport la
concentration totale du PCE et de ses produits de dhalognation dans les chantillons pour des cultures stimules et
non-stimules par lajout dacide lactique (5 mM).
Cette forte stimulation par lacide lactique nous a permis de raliser une autre exprience
o des doses additionnelles de 50 M de PCE et de 5 mM dacide lactique ont t ajoutes au 15e
jour de lexprience. Comme le montre la figure 17, la dose additionnelle de PCE a t
totalement convertie en thne. La concentration initiale de protines que nous avons utilis
55
comme indicateur de la quantit de cellules prsentes dans la culture est de 17 mg /L. Cependant,
au moment o lacide lactique et le PCE sont ajouts, la culture contenait 65 mg/L de protines.
160
140
120
concentration ( M)
100
80
60
40
20
0
0 5 10 15 20 25 30
temps (jours)
Fig. 17. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 ayant reue des doses additionnelles de 5 mM dacide
lactique et de 50 M de PCE au jour 15 aprs linoculation. La concentration de protines au dpart est de 17 mg/L
et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 15%.
Comme lune des raisons pouvant expliquer une partie de la stimulation par lacide
lactique tait laugmentation de la biomasse (ou quantit de microorganismes) dans les
chantillons, nous avons ralis des expriences visant dterminer laugmentation de la
concentration de protines en fonction du temps dans des cultures qui reoivent des doses
ponctuelles d'acide lactique. La figure 18 montre que ds linoculation dun milieu de culture
frais contenant 5 mM dacide lactique, la quantit de protines a augment rapidement durant les
5 premiers jours puis est reste relativement stable jusqu laddition dune dose supplmentaire
dacide lactique. partir de 12,7 jours, nous avons observ un phnomne similaire puisque la
quantit de protines a augment une nouvelle fois et est reste stable jusqu laddition de la
troisime dose dacide lactique.
80
70
concentration de protines (mg / L)
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20 25 30
temps (jours)
Fig. 18. Augmentation de la quantit de protines dans des cultures ayant reues des doses supplmentaires de 5mM
dacide lactique. Les cultures dbutent avec une dose initiale et les ajouts sont faits aux jours 12,7 et 20,7.
57
Par la suite, nous avons ralis plusieurs expriences indpendantes en utilisant des
quantits initiales de microorganismes diffrentes afin de pouvoir dterminer leffet de la
biomasse initiale sur le profil de dhalognation du PCE. Comme dans les expriences
prcdentes, la concentration de protines dans chaque chantillon a t utilise comme
indicateur de la biomasse prsente. Les concentrations initiales de protines testes taient de
11,3 mg/l (figure 19), 55,0 mg/L (figure 20), 63,6 mg/L (figure 21) et 85,0 mg/L (figure 22).
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6
temps (jours)
Fig. 19. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au dpart est de 11,3
mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 15%.
58
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6
temps (jours)
Fig. 20. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au dpart est de 55,0
mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 15%.
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6
temps (jours)
Fig. 21. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au dpart est de 63,6
mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 15%.
59
110
100
90
80
concentration ( M)
70
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6
temps (jours)
Fig. 22. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1. La concentration de protines au dpart est de 85,0
mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 15%.
Afin de pouvoir comparer les diffrents profils de dhalognation, nous avons utilis les
valeurs de concentration du PCE et des autres thnes majoritaires mesurs 2,8 jours. Ce temps
a t choisi puisquil correspondait aux dernires mesures faites sur les chantillons contenant
une biomasse initiale de 85,0 mg/L en protines avant que la conversion du PCE en thne dans
ces chantillons ne soit termine. Nous avons calcul pour chaque type d'thne d'intrt le
pourcentage quil occupait sur la concentration totale des thnes dintrts (PCE, TCE, DCE,
VC, Eth).
60
100%
90%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
0 10 20 30 40 50 60 70 80 90
concentration initiale de protines (mg / L)
Fig. 23. Variation du pourcentage de PCE, 1,2-DCE, VC et thne prsents 2,8 jours en fonction de la
concentration initiale de protines dans les chantillons de la culture KB1.
Nous avons pu observer la figure 23 que tant que la concentration de PCE se situait au-
del de 5% 10%, laugmentation de la concentration des produits majoritaires de la
dhalognation (1,2-DCE, VC, thne) variait de faon directement proportionnelle avec
laugmentation de la biomasse initiale. La diminution de la concentration de PCE a aussi t
linaire jusqu ce quelle reprsente environ 5% des thnes. Lorsque la biomasse initiale
permettait datteindre ce seuil, les concentrations de 1,2-DCE et VC diminuaient rapidement. Le
plus haut pourcentage dthne observ fut 93% avec une biomasse initiale de 85 mg/L.
61
Le profil gnr par les premiers rsultats montre que les cultures taient capables de
dhalogner le PCE mais que la conversion finale vers lthne a t faible. En effet, la figure
12, nous avons pu observer une disparition rapide du PCE pendant les 7 premiers jours et le
rsultat de cette conversion fut une accumulation de TCE, 1,2-DCE et VC. Cependant, lorsque le
PCE, TCE et DCE ont disparu, la conversion finale du VC en thne fut beaucoup plus lente
comparativement aux travaux raliss par une autre quipe (51). Les expriences sur les
premires cultures ont aussi produit des chantillons contamins par loxygne et la plupart de
ces chantillons contamins nous ont fournis des occasions dobserver leffet de la contamination
de loxygne sur le profil de dhalognation du PCE. Comme le consortium KB1 tait enrichi en
D. ethenogenes et que cette bactrie tait responsable de la majorit de la dhalognation
complte du PCE, nous nous attendions observer une baisse globale de lactivit. Les profils
(figure 13) ont montr une faible transformation de PCE si bien quil faisait parti des thnes
chlors majoritaires aprs plus de 18 jours alors quil tait limin en 7 jours dans les
chantillons non contamins. Malheureusement, il ne nous tait pas possible cette tape de
dterminer la quantit doxygne entr dans les chantillons et des expriences plus dtailles
devaient tre ralises une autre tape du projet.
En prenant compte des rsultats sur les profils de dhalognation (figure 12) des
premires cultures, nous avons envisags deux hypothses pouvant expliquer le fait que la
62
transformation se soit arrte au VC. Premirement, il tait possible que les premires cultures
aient t contamines par de loxygne suite une erreur lors de linoculation initiale.
Cependant, nous avons aussi observ le profil de dhalognation de cultures contamines et dans
ces cas, la transformation sarrtait bien avant que le VC soit le seul produit majoritaire. Cette
hypothse semblait donc peu valide. Deuximement, nous savions que les bactries D.
ethenogenes enlvent les atomes de chlore des thnes chlors par dhalorespiration, une
raction qui, pour les cellules de D. ethenogenes ncessite de lhydrogne molculaire comme
donneur dlectron et les thnes chlors comme accepteurs dlectrons. Si la conversion
sarrtait au VC, ctait peut-tre parce que la culture avait consomme la dose initiale dacide
lactique et quelle ne disposait plus dune source capable de lui procurer de lhydrogne
molculaire. Afin de vrifier cette hypothse et en ayant comme objectif dobserver une
conversion complte du PCE et thne, nous avons ralis une exprience o une dose
supplmentaire dacide lactique tait ajoute plusieurs jours aprs linoculation. Les figures 14 et
15 montrent les profils de dhalognation du PCE obtenus suite cette exprience. La
comparaison des deux profils gnrs a dmontr que lajout dacide lactique stimulait la
dhalognation des thnes chlors et permettait une conversion complte vers lthne. Les
chantillons qui ont reus de leau saline ont vu leur vitesse apparente de disparition du 1,2-DCE
diminuer partir du 16e jour jusqu la fin de lexprience. Les trois produits majoritaires que
nous avons pu retrouver dans ces chantillons la fin de lexprience sont le 1,2-DCE (25%) le
VC (47%) et lthne (28%) alors que dans les chantillons stimuls, lthne reprsentait plus
de 99% des produits. Nous pensons donc que c'est l'ajout d'acide lactique qui a permis aux
cellules de complter la dhalognation des thnes chlors. Le deuxime effet observ suite
lajout dacide lactique a t fait suite la ralisation dune exprience similaire la premire
sauf quune dose supplmentaire de PCE (50 M) a t ajoute en mme temps que lacide
lactique (figure 17). Environ 24 heures aprs linjection de cette dose supplmentaire de PCE,
non seulement nous navons dtect aucune trace de PCE dans les chantillons mais les cultures
avaient aussi converti la majorit de cette dose supplmentaire en VC. En effet, la concentration
totale des thnes dintrt (somme des produits) durant cet intervalle de 24 heures tait passe
de 102 158 M et la concentration du VC de 25 88 M. Cest lors des expriences suivantes
que nous avons trouv une explication cette surprenante efficacit dans la vitesse de
dhalognation du PCE au VC. Ces expriences avaient comme objectif de dterminer leffet de
63
lajout supplmentaire dacide lactique sur la biomasse contenue dans les bouteilles. La mesure
de la biomasse a t faite en mesurant la concentration de protines dans les chantillons.
Comme le montre la figure 18, la concentration des protines a augment partir du premier jour
puis sest stabilise quelques jours suivants. Cette augmentation suivie dune stabilisation sest
rpte de nouveau lors des ajouts subsquents dacide lactique mais laugmentation tait
toujours plus faible chaque fois. Ces variations de concentration de protines suggrent que
lacide lactique a aussi stimul laugmentation de la biomasse. Ainsi, lors de linjection de la
dose supplmentaire de PCE, la biomasse contenue dans la culture de dpart avait augmente et
les rsultats obtenus seraient attribuables la fois cette augmentation de la biomasse et
lacide lactique. Lajout dacide lactique reprsenterait donc une faon de stimuler la conversion
complte du PCE en thne en introduisant dans les chantillons une nouvelle source de donneur
dlectrons. Cette stimulation entranerait galement (en quelques jours) une augmentation de la
quantit de biomasse, mesure par la concentration de protines dans les chantillons.
Un autre facteur influenant les profils de dhalognation du PCE serait donc la biomasse
initiale prsente dans les chantillons. En effet, la concentration de protines utilise comme
indice de la biomasse a influenc non seulement la vitesse mais aussi le pourcentage de
molcules de PCE qui ont t compltement converties en thne avant que la dose initiale
dacide lactique soit consomme. En comparant les profils de dhalognation aux figures 19, 20,
21 et 22, nous avons pu dterminer que la vitesse apparente de disparition du PCE et dapparition
de lthne augmentait en fonction de la biomasse initiale. Nous avons galement observ un
effet sur la concentration des intermdiaires. Par exemple le VC a atteint des concentrations
suprieures au PCE lorsque la concentration de ce dernier tait denviron 20 M et sauf lorsque
la biomasse initiale dans les chantillons tait de 85 mg/L de protines. Aussi, lactivit de
dhalognation des thnes chlors lorsque la biomasse tait de 11,3 mg/L de protines a t
comparable aux rsultats obtenus avec les premires cultures cest--dire que la vitesse de la
dhalognation sestompait rapidement et sarrtait avant la conversion totale des thnes chlors
en thne. Nous avons propos dans la section prcdente que cet arrt serait principalement d
un manque de donneurs dlectrons. Par contre, le fait davoir une biomasse leve dans un
milieu contenant la mme dose initiale dacide lactique permettrait une dhalognation complte
du PCE en thne.
64
Aprs une revue de la littrature afin de trouver les polymres dj utiliss pour
lencapsulation de cellules vivantes, nous en avons retenus deux qui seraient tests lors du
dveloppement de la mthode dencapsulation. Le choix des polymres sest fait en tenant
compte de quatre critres diffrents : biodgradabilit, disponibilit, cot de lencapsulation,
conditions de lencapsulation sans impact ngatif sur lactivit des cellules. Les polymres
naturels alginate et chitosane ont t retenus principalement parce quils sont biodgradables, ils
sont disponibles en grande quantit et leur cot ainsi que le cot de leurs agents glifiants sont
faibles. Par la suite, nous avons identifi les conditions ncessaires la formation de billes
glifies faites partir de ces polymres. La technique de drop-wise a t retenue pour cette
tape. Il sagit dune technique dutilisation relativement rapide compare aux autres utilises
pour ce projet et son utilisation nous permet de tester des chantillons ayant des proprits trs
varies. En comparaison, lquipement utilis pour la microencapsulation avec ultrasons
ncessitait des mlanges de polymres ayant une faible viscosit (<100 cps dans une solution de
1% m/v) ainsi quun nettoyage et conditionnement complet de lquipement entre chaque
chantillon. Les rsultats des diffrents tests prsents aux tableaux 1, 2 et 3 montrent la
dmarche progressive didentification dune combinaison polymre-agent glifiant pour les
polymres alginate et chitosane. Les diffrents polymres et agents glifiants ont t dissous dans
de leau saline (0,9% NaCl) et les solutions rsultantes ont t utilises pour former des billes de
gel. Une combinaison satisfaisante permettait la formation de billes assez rsistantes pour tre
manipules avec les doigts dans un dlai de quelques secondes.
65
Tableau 1. chantillons dalginate et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier les
conditions ncessaires la formation de billes glifies
Agents glifiants
chantillon dalginate Observations
(m/v)
Protanal LFRS/60
2 % ions Ca2+ sous forme de Billes aplaties et de forme
Haute teneur en acide
CaCl2 2H2O irrgulire.
mannuronique
Les diffrentes combinaisons testes nous ont permis de constater que lalginate ayant
une grande proportion dacide mannuronique (~70%) donnait des billes aplaties et de forme
irrgulires. Ce rsultat tait envisag puisque la glification de lalginate se fait grce lacide
guluronique dans la chane de polymre (69). Les particules dalginate aplaties seraient donc le
rsultat de liens trop peu nombreux pour garder la forme liquide initiale intacte. La diffrence
entre les chantillons Protanal LF10/60 et Protanal LF10/60LS a t a priori impossible faire.
Cependant, lorsque manipules, les billes de Protanal LF10/60LS se sont dformes lgrement
et ne sont pas revenues leur forme sphrique dorigine. Le Protanal LF10/60 a donc t retenu
comme candidat pour les expriences avec les diffrents montages.
66
Tableau 2. chantillons de chitosane et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier
les conditions ncessaires la formation de billes glifies
Tableau 3. chantillons dalginate, agents glifiants et agents denrobage utiliss lors des tests
visant identifier les conditions ncessaires la formation de billes glifies
chlateurs. Nous avons alors tent un compromis : tirer avantage de la formation rapide des
capsules dalginate et du caractre plus durable de la chitosane en enrobant les capsules
dalginate dune couche de chitosane. La chitosane serait son tour glifie en prsence de
lignosulfonate. Les capsules obtenues taient dune rsistance comparable aux billes dalginate et
nous avons dcid de retenir cette formule lors des tests avec les montages dencapsulation et
lors des tests o des capsules contenant des cellules bactriennes seraient utilises.
Les tableaux prcdents montrent la facilit avec laquelle il a t possible de former des
billes dalginate puisque la solution glifiante ne ncessite que la prsence dions calcium. Le
tableau 2 montre les diverses tentatives faites pour former des billes de chitosane. Lors de ces
essais, nous avons privilgi lutilisation de lagent glifiant lignosulfonate la glutaraldhyde
qui est considr comme toxique pour les humains. Les rsultats des nombreuses tentatives nous
permettent de croire que nous pouvons glifier la chitosane en surface et donc, quil serait
intressant de lutiliser pour enrober des particules dalginate. Cest pourquoi nous avons
envisag la formation de capsules dalginate enrobes avec de la chitosane.
Lalginate et la chitosane ont t les deux polymres utiliss pour la fabrication des
capsules et nous avons test les polymres pour leur capacit absorber le PCE dans leur
matrice. Dans le cas o ces matrices absorberaient le PCE, il faudrait alors compenser une baisse
apparente de PCE dans les chantillons de bactries encapsules par la capacit dabsorption des
polymres prsents. Les tests dabsorption avec lalginate ont t faits avec lalginate choisi au
dpart pour les expriences dencapsulation : Protanal LF10/60. La chitosane utilise fut la
Kitomer 22 cps. Des capsules ont t prpares grce la technique du drop-wise en
utilisant une solution dalginate 2% (m/v) dans une solution saline strile et en utilisant une
solution glifiante de calcium ou une solution de 1.5% chitosane dans 1% dacide actique et une
solution glifiante de 25% (m/v) de lignosulfonate pH 10 prpare dans une solution saline.
69
60
50
40
PCE ( M)
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10
temps (jours)
capsules + 25 M PCE contrle + 25 M PCE
capsules + 50 M PCE contrle + 50 M PCE
Fig. 24. Concentration de PCE en micromoles par litre dans les chantillons contenant 1,0 g de billes dalginate. Le
temps zro correspond au moment o le PCE est ajout aux bouteilles. Les bouteilles contrles sont prpares de la
mme faon que les chantillons hormis lajout des billes.
110
100
90
80
70
PCE ( M)
60
50
40
30
20
10
0
0 2 4 6 8 10
temps (jours)
Fig. 25. Concentration de PCE en micromoles par litre dans les chantillons contenant 1,0 g de billes de chitosane.
Le temps zro correspond au moment o le PCE est ajout aux bouteilles. Les bouteilles contrles sont prpares de
la mme faon que les chantillons hormis lajout des billes.
70
Ainsi, pour les quantits de polymre et de PCE testes, nous navons pas mesur de
baisse de PCE dans les chantillons qui aurait t attribuable un phnomne dabsorption par
les billes dalginate (figure 24) et de chitosane (figure 25). En effet, la concentration de PCE au
dbut et la fin des expriences est la mme dans les chantillons avec capsules et sans capsules.
Une baisse de la concentration du PCE pendant lexprience est observe pour quelques
chantillons mais serait attribuable des pertes travers les bouchons puisque les contrles
abiotiques ont galement montr une faible perte de PCE. En effet, la baisse progressive des
thnes prsents dans les chantillons est un phnomne qui a aussi t observ dans toutes les
expriences de ce projet. Enfin, un bilan de la somme du PCE et de ses produits de
dhalognation a t fait pour chaque chantillon test dans ce projet et nous navons aucun
moment observ dabsorption dun ou de plusieurs thnes dintrt lorsque des capsules taient
prsentes.
Lencapsulation avec jet dair est le premier montage qui a t test. La premire tape de
son utilisation a t de tester les paramtres de pression dair dans le bec de latomiseur et de
dbit de la pompe amenant la solution-mre vers latomiseur. Ces tests prliminaires ont t fait
avec des solutions dalginate striles dont la concentration variait entre 1 g/100 ml et 3 g/100 ml.
Ds les premiers essais, nous avons ralis que le dbit ne pouvait dpasser 5 ml/min avec la plus
faible concentration dalginate et malgr le fait que lalginate choisi tait de trs faible viscosit
(20 cps - 70 cps 1% m/v). Au del de cette valeur, latomiseur en surcharge se remplissait de
liquide et jectait le surplus dalginate par secousses successives plutt quen un jet continu. Un
rsultat semblable a t observ pour des valeurs de pression plus faibles que 50 psi. Au-del de
60 psi, les particules taient jectes du bec de latomiseur une grande vitesse. Dans ce cas, un
film de polymre se formait la surface du bain glifiant. Pour viter la formation de ce film, il
nous tait possible daugmenter la vitesse dagitation du liquide dans le bain de solution
71
glifiante pour viter que les particules arrivant la surface de liquide entrent en collision avec
des capsules encore liquides. Malheureusement, nous navons pas augment la vitesse de
lagitation dans ce cas puisquelle atteint alors un seuil o il se cr un vortex dans le liquide qui
a pour effet de dissoudre les particules avant quelles soient glifies. Le choix des paramtres
reposait donc sur un quilibre entre la pression dair, le dbit et la vitesse dagitation dans le bain
glifiant. Les tests prliminaires ont montrs que le dbit de liquide ne pouvait tre ajust au-
del de 5 ml/min et que la pression dair devait se situer entre 50 psi et 60 psi.
Fig. 26. Microcapsules dalginate obtenues avec le premier montage. La solution-mre contient 2 % (m/v)
dalginate et 3 g /L de cellules E.coli atomis 60 psi et un dbit de 4,5 ml/min. Observations au microscope
optique avec un grossissement de 250x.
72
Les capsules obtenues grce ce montage ont t filtres une premire fois travers un
filtre de mailles dacier avec des pores de 0,8 mm pour liminer certains agrgats de gels. En
examinant les particules avec un microscope optique, nous avons constat quelles taient le plus
souvent de forme sphrique mais que beaucoup avaient une forme elliptique (figure 26). Aussi,
les capsules avaient un diamtre variant entre 5 m et 400 m. Dans le but de rduire cette
variation de taille, nous avons filtr les capsules une deuxime fois en utilisant un filtre de nylon
de 120 m. Ainsi, nous avons obtenu des chantillons contenant des capsules de la taille
recherche au dpart soit un diamtre entre 10 et 100 m.
Bien que la taille des capsules nous paraissait satisfaisante, seulement une fraction de la
solution-mre utilise au dpart se retrouvait dans les chantillons aprs les tapes de filtration.
Nous avons donc dtermin le poids sec de la solution-mre utilise au dpart et compar la
valeur au poids sec des capsules obtenues aprs les deux tapes de filtration. Lefficacit de
lencapsulation reprsente le pourcentage de la masse dalginate obtenue sous forme de capsules
de la taille voulue par rapport la masse totale dalginate utilise au dpart dans le master mix.
Le tableau suivant (tableau 4) regroupe trois expriences dencapsulation ralises chacune en
triplicata o lefficacit de lencapsulation a t la plus grande.
Tableau 4. Efficacit dencapsulation dtermine par le poids sec des chantillons finaux et de la
solution dalginate de dpart pour trois conditions dencapsulation utilises avec le premier
montage
Paramtres dencapsulation
Efficacit
Concentration
Dbit de la pompe dencapsulation (%)
dalginate Pression dair
(ml / min)
(g/100mL)
2 50 4,5 22,8 7,7
2 60 4,5 23,1 5,1
3 60 4,5 24,4 9,0
73
Ainsi, bien que ce premier systme dencapsulation nous permetait dobtenir des billes de
la taille recherche, seulement 23% des constituants de la solution-mre se retrouvaient dans le
produit final pour les paramtres tests. Un autre montage dencapsulation a donc t favoris.
Durant la premire phase des tests avec ce montage, nous avons dtermin les valeurs de
pression, dbit de liquide et concentration dalginate dans la solution-mre pour lesquelles une
atomisation tait possible. Il nous est apparu vident en constatant les valeurs de dbit maximal,
de concentration dalginate maximale et de pression minimale que le montage utilis exigeait des
solutions de polymre dont la viscosit ne dpassait pas 210 cps. Lapparition dun film
dalginate la surface du bain glifiant pendant latomisation du mlange de polymre peut tre
explique par larrive dun trop grand nombre de particules la surface de la solution glifiante.
Les particules ne pourraient alors pntrer dans le liquide avant que de nouvelles gouttelettes
atomises arrivent leur tour. Lorsque lagitation du bain glifiant fut augmente pour crer une
surface de contact plus grande, nous avons observ la formation de courts filaments dalginate.
Nous pensons que ces filaments taient le rsultat de particules dalginate entres en collision
puis glifies alors quelles stiraient d aux forces prsentes dans le liquide. Lquilibre entre
les diffrents paramtres dencapsulation a t atteint avec une valeur de pression de 50 psi ou 60
psi pour des mlanges dalginate 2% m/v ou moins et un dbit de liquide dans latomiseur de
4,5 ml/min.
Le diamtre des capsules obtenues avec le montage par atomisation avec jet dair se
trouvait entre 5 m et 400 m. Puisque notre objectif de dpart tait dobtenir des microcapsules
avec un diamtre entre 10 m et 100 m, nous avons filtr les chantillons et rejet les capsules
plus grandes que 120 m. Cependant, nous avons observ que seule une faible proportion du
volume de la solution dalginate de dpart se retrouvait dans les chantillons de billes de la
dimension voulue. Afin destimer la perte totale de polymre lors de lutilisation de ce systme
dencapsulation, nous avons compar le poids sec dun chantillon de billes obtenu la fin du
74
procd au poids sec de la solution dalginate utilise pour fabriquer cet chantillon. Nous avons
rapport au tableau 4 trois conditions dencapsulation avec le premier montage pour lesquelles
les valeurs defficacit dencapsulation ont t les plus leves. En utilisant cet indice
defficacit dencapsulation, nous avons t en mesure de juger que malgr la faible viscosit du
mlange de polymre et loptimisation des paramtres dencapsulation, nous ne pouvions utiliser
ce systme dencapsulation sans accepter de perdre environ 67% des constituants du master mix
ou de travailler avec des capsules ayant une distribution de taille variant entre 5 m et 400 m.
Cest donc la faible efficacit du montage qui nous a pouss envisager un autre systme
dencapsulation.
Tableau 6. chantillons dalginate et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier les
conditions ncessaires la formation de billes glifies avec le deuxime montage
Agent glifiant
Polymre Observations
(m/v)
Les capsules obtenues sont
rgulires et les dchets dans le
premier filtre sont quasi-
Protanal LF10 / 60 2 % Ca++ sous forme de CaCl2
inexistants. Sous le microscope,
2H2O
les capsules ont un diamtre
variant entre 30 m et 160 m
avant la deuxime filtration
2 % Ca++ sous forme de CaCl2
Protanal LF10 / 60 2H2O + 0.4% chitosane
Formation abondante de fibres.
2 % Ca++ sous forme de CaCl2
2H2O + 0.8% chitosane
77
Le tableau 6 montre quil est possible avec ce montage de former des capsules partir
dune solution dalginate en utilisant une solution contenant des ions calcium comme agent
glifiant. Nous avons galement voulu observer leffet de la chitosane dans le bain glifiant sur
la raction de glification de lalginate: notre but tait de former des capsules dalginate enrobes
de chitosane en une seule tape. Cependant, la prsence de chitosane semblait interfrer avec la
glification des particules dalginate et le polymre se rpandait dans le bain (prsence de fibres)
plutt que de garder la forme dune bille.
Tableau 7. chantillons de chitosane et agents glifiants utiliss lors des tests visant identifier
les conditions ncessaires la formation de billes glifies avec le deuxime montage
Agent glifiant
Polymre Observations
(m/v)
Polymre trop visqueux pour
lappareil. Une plus grande
10% lignosulfonate pH 5 puissance est ncessaire pour
10% lignosulfonate pH 8 atomiser le liquide. Les particules
10% lignosulfonate pH 10 ont tendance saccumuler la
25% lignosulfonate pH 5 surface de la solution glifiante. Si
Kitomer 22cps
25% lignosulfonate pH 8 lagitation du bain est augmente, de
25% lignosulfonate pH 10 fines fibres de chitosane denviron 5
mm apparaissent dans le liquide. Les
fibres sont trs abondantes et la
plupart du polymre reste dans les
filtres.
5% lignosulfonate pH 8 Les particules ont tendance
Kitomer 14cps 5% lignosulfonate pH 10 saccumuler la surface de la
(faible viscosit) 10% lignosulfonate pH 8 solution glifiante. Si lagitation du
10% lignosulfonate pH 10 bain est augmente, de fines fibres
78
apparence, seule une fraction (moins de 50%) de la quantit de polymre utilise au dpart
passait travers le filtre dont les mailles mesuraient environ 0,8 mm.
Tableau 8. chantillons dalginate, agent glifiant et agent denrobage utiliss lors des tests
visant identifier les conditions ncessaires la formation de billes glifies laide du
deuxime montage
100
90
80
concentration ( M) 70
60
50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
temps (jours)
Fig. 27. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules prpares selon le
protocole du deuxime montage. La concentration de protines au dpart est de 82,4 mg/Let les valeurs sont les
moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 20%.
100
90
80
70
concentration (M)
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 28. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre. La concentration de protines au
dpart est de 85,0 mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 15%.
81
90
80
70
60
concentration ( M) 50
40
30
20
10
0
0 5 10 15 20
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 29. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules prpares selon le
protocole du deuxime montage et contamines par une quantit inconnue doxygne. La concentration de protines
au dpart est de 82,4 mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 20%.
Ds les premiers essais, nous avons remarqu que la culture encapsule avait un profil
diffrent des cellules libres puisque le PCE tait quasi-instantanment converti en DCE la
premire journe des expriences (figure 27). Le DCE tait ensuite converti en VC pendant les
jours qui suivent et des traces dthne apparaissaient vers la quinzime journe. 20 jours, le
VC reprsentait environ 97% des thnes dintrts prsents. Dans le cas des cellules libres
(figure 28), les profils observs taient similaires aux profils obtenus lors des expriences de
dtermination de leffet de la biomasse sur les profils de dhalognation et prsent la figure
22 : plus de 80% du PCE initial tait converit dans la premire journe et il y avait une
accumulation des intermdiaires chlors. Lthne tait alors le produit majoritaire de la raction
ds le premier jour avec une concentration de 34 M. La figure 29 prsente un profil de
dhalognation de cellules encapsules contamines par loxygne. Nous avons observ une
diminution plus lente de la dhalognation du PCE par rapport aux chantillons de cellules
libres. Tout comme les cellules encapsules non-contamines, le profil de la figure 29 montre
une apparition marque du DCE par rapport au VC (15% vs. 2%) avant la fin de la premire
journe et le VC reprsentait plus de 95% des thnes prsents la 20e journe de lexprience.
82
Deux indices de survie ont t utiliss pour dterminer la survie des bactries au
processus dencapsulation : protines et cellules viables. Les expriences ont t faites avec des
cellules de E. coli comme modle principalement en raison de la rapidit avec laquelle nous
pouvions obtenir un nombre de cellules suffisantes compar la culture KB1. Les rsultats
obtenus avec le premier indice, la quantit de protines, nous ont permis de croire que le
processus a un impact ngatif significatif sur le nombre de cellules intactes. En effet, aprs le
processus, nous avons recueillis par centrifugation et lavage les cellules intactes en dlaissant les
protines en suspension libre. Le tableau 5 montre que la concentration de protines dans les
chantillons de cellules soumises aux vibrations ultrasoniques tait plus petite que dans les
chantillons non-soumis ces vibrations. Ainsi, environ 29,6% des cellules auraient t dtruites
par le processus et limines lors des tapes de centrifugation et lavage qui ont suivies
latomisation. En tenant compte du premier indice, nous avons estim la survie des cellules au
processus 70,4%. Le deuxime indice utilis, le dcompte des units formatrices de colonies
par volume, na pas montr un impact significatif des vibrations ultrasoniques sur les bactries.
En effet, en tenant compte de la variation sur les rsultats obtenus, la valeur de cellules viables
par ml de solution pour les chantillons soniqus (2,83 0,62) 109 CFU / ml est similaire la
valeur pour les chantillons contrles (3,04 0,34) 109 CFU / ml. Le processus aurait donc eu
un impact ngatif sur la survie des cellules pour lun des indices utilis (protines). Pour cette
raison, nous avons considr lencapsulation par atomisation avec ultrasons comme une mthode
dencapsulation considrer pour des tests plus pousss.
Avec le systme dencapsulation avec ultrasons, nous avons test les polymres alginate
et chitosane pour fabriquer des capsules ayant un diamtre prs de 100 m. Nous avons
galement test la fabrication de microcapsules dalginate enrobes avec de la chitosane et
glifies en prsence de lignosulfonate. Le premier polymre utilis, lalginate Protanal LF10 /
60, a donn des rsultats satisfaisant cest--dire que nous avons pu obtenir des capsules ayant un
83
diamtre entre 30 m et 160 m avant les tapes de filtration lorsque lalginate est glifie en
prsence dions calcium. Ces rsultats reprsentaient une progression par rapport au premier
montage puisque la distribution de taille tait plus petite : 30 m 160 m pour latomisation
ultrasonique vs. 5 m - 400 m pour latomisation avec jet dair. Avec lalginate, nous avons
aussi utilis une combinaison dions calcium et chitosane dans le but de glifier la matrice
dalginate et lenrober de chitosane en une seule tape. Malheureusement, la prsence de fibres a
t observe lors de ces essais. Nous pensons que la prsence de fibres dalginate dans la
solution glifiante indique que les particules liquides nont pu garder leur forme lors de la
glification et se sont tires sous les forces mcaniques prsentes dans la solution glifiante. Ce
phnomne pourrait tre d la trop grande vitesse dagitation du liquide ou une raction de
glification trop lente. La deuxime hypothse nous semble la plus plausible dans ce cas puisque
la vitesse dagitation de la solution glifiante tait la mme lors des expriences prcdentes avec
une solution glifiante uniquement compose de CaCl2 en solution. Enfin il nous a t possible
avec le deuxime montage dencapsulation dobtenir des billes dalginate avec un diamtre prs
de 100 m en utilisant de lalginate faible viscosit et une solution glifiante contenant des ions
de calcium. Comme lors des tests prliminaires, la chitosane sest avre difficile glifier dans
les conditions testes. Pour toutes les conditions prsentes au tableau 7, la prsence de courtes
fibres de chitosane glifies ont t observes, indiquant que les particules liquides nont pas
gard leur forme sphrique une fois plonges dans la solution glifiante. Lors des tapes de
filtration, ces fibres se sont accumules dans les filtres et nous avons constat tout comme lors de
lutilisation du premier montage, la faible efficacit du systme. Ces rsultats nous laissent croire
que la chitosane ne pourrait tre utilise de manire efficace avec ce systme parce que la
composition et le pH des solutions glifiantes ne permettrait pas une glification des particules
assez rapide pour quelles rsistent aux forces prsentes dans le liquide en mouvement dans la
solution glifiante. Une autre approche qui a donne des rsultats satisfaisants est la formation de
microbilles dalginate enrobe de chitosane. En effet, le protocole dvelopp avec le second
montage a permis la cration de microbilles dune taille variant entre 40 m et 120 m. Bien que
la prparation des billes exigeait un plus grand nombre dtapes o une contamination biologique
ou chimique (traces doxygne) tait possible, nous pensons que la couche additionnelle de
chitosane glifie reprsenterait une construction plus stable que des billes dont la matrice est
uniquement compose dalginate. Pour le projet actuel cependant, cette construction reprsentait
84
une option supplmentaire que nous pourrions utiliser lors de llaboration du protocole
dencapsulation des cellules bactriennes.
La mthode utilise pour le troisime montage tait la mme que celle utilise pour
valuer les polymres au dbut du projet. Nous avons choisi lalginate enrobe de chitosane
comme formule pour fabriquer les capsules afin dallier la rapidit de la glification de lalginate
la nature covalente des liens entre la chitosane et le lignosulfonate.
100
90
80
70
concentration (M)
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 30. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules prpares selon le
protocole du troisime montage (drop-wise). La concentration de protines au dpart est de 55,0 mg/L et les valeurs
sont les moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 10%.
86
100
90
80
70
concentration (M)
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 31. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre. La concentration de protines au
dpart est de 55,0 mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 10%.
100
90
80
70
concentration (M)
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 32. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 immobilise dans des capsules prpares selon le
protocole du troisime montage (drop-wise). La concentration de protines au dpart est de 85,0 mg/L et les valeurs
sont les moyennes de duplicatas; lcart est au maximum de 10%.
87
100
90
80
70
concentration (M)
60
50
40
30
20
10
0
0 1 2 3 4 5
temps (jours)
Somme des thnes PCE TCE
DCE VC thne
Fig. 33. Profil de dhalognation du PCE par la culture KB1 en suspension libre. La concentration de protines au
dpart est de 85,0 mg/L et les valeurs sont les moyennes de duplicatas ; lcart est au maximum de 20%.
Nous avons pu faire des comparaisons similaires pour les deux valeurs de biomasses (55
mg/L et 85 mg/L de protines) entre les profils des cellules encapsules et des cellules libres.
Premirement, la vitesse apparente de dhalognation du PCE pendant les deux premiers jours de
lexprience est plus faible avec les cellules encapsules que les cellules libres. Cette diffrence
semble indiquer que les cellules encapsules transformeraient moins rapidement le PCE que les
cellules libres dans la premire phase de la dhalognation du PCE. Deuximement,
laccumulation des intermdiaires DCE et VC a t plus faible avec les cellules encapsules. Par
exemple, nous avons pu observer dans les chantillons de cellules encapsules avec une
concentration de protines initiale de 55,0 mg/L (figure 30) que la concentration maximale de
VC pendant toute la dure de lexprience a atteint 22 M avec des traces de DCE. Pour la mme
biomasse avec des cellules libres (figure 31), la concentration maximale de VC a atteint 31 M et
le DCE, 18 M. Troisimement, ces diffrences dans laccumulation des intermdiaires ont fait
en sorte que, pour les chantillons ayant une concentration initiale de protines de 55, 0 mg/L, la
vitesse apparente dapparition dthne pendant les deux premiers jours a t plus grande pour
les cellules encapsules que les cellules libres. Enfin, en comparant les profils des figures 30 et
31, nous avons remarqu pour les chantillons contenant 55,0 mg/L de protines que les cellules
88
encapsules russissaient convertir la quasi-totalit du PCE initial en thne alors que pour les
cellules libres, lthne ne reprsentait que 73 % des thnes prsents au 8e jour de lexprience.
La figure suivante (figure 34) montre les profils de dhalognation du PCE par des
cellules encapsules et des cellules libres lors dune exprience o des chantillons ont t
volontairement contamins par des concentrations connues doxygne. Diffrents volumes
doxygne pur ont donc t injects dans des chantillons prpars en duplicata. Les deux
premiers profils montrent le profil moyen dchantillons contrle (sans oxygne) puis, les profils
suivants montrent des chantillons contamins par une quantit croissante doxygne
correspondant 0,5%, 0,7% et enfin 0,9% du volume total des chantillons.
89
110 110
A B
100 100
90 90
80 80
concentration ( M)
concentration ( M)
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
temps (jours) temps (jours)
110 110
100
C D
100
90 90
80 80
concentration ( M)
concentration ( M)
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
temps (jours) temps (jours)
110 110
100 E 100 F
90 90
80 80
concentration ( M)
concentration ( M)
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
temps (jours) temps (jours)
110 110
100 G 100 H
90 90
80 80
concentration ( M)
concentration ( M)
70 70
60 60
50 50
40 40
30 30
20 20
10 10
0 0
0 1 2 3 4 5 6 0 1 2 3 4 5 6
temps (jours) temps (jours)
Fig. 34. Profil de dhalognation du PCE par des cultures KB. Dans la colonne de gauche, les chantillons de
cellules encapsules et dans la colonne de droite, les chantillons de cellules libres. A et B : chantillons contrles
non-exposs loxygne, C et D : chantillons exposs 0,5 % (v/v) doxygne, E et F : chantillons exposs 0,7
% (v/v) doxygne, G et H : chantillons exposs 0,9 % (v/v) doxygne. La concentration initiale de protines
dans les chantillons est de 54,5 mg L-1 et les valeurs pour chaque graphique sont les moyennes de duplicatas ;
lcart est au maximum de 20%.
Afin de pouvoir comparer les profils des diffrents chantillons, nous avons, pour chaque
chantillons, pris la concentration du PCE et de ses produits de dhalognation au temps 5,6
jours. Ensuite, nous avons utilis ces valeurs de concentration pour calculer le pourcentage des
molcules initiales de PCE dans chaque chantillon auxquelles il a t enlev aucun, deux ou
plus, trois ou plus ou les quatre atomes de chlores. Par exemple, le pourcentage de molcules qui
ont perdues au moins trois atomes de chlore est le rsultat de la contribution des concentrations
dthne et de VC mesures dans les chantillons ce moment.
91
100%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
aucun deux et plus trois et plus quatres
atome(s) de chlore enlev(s)
Fig. 35. Pourcentage des molcules de PCE qui ont perdu aucun, au moins deux, au moins trois ou les quatre atomes
de chlore au temps 5,6 jours dans les chantillons de cellules encapsules avec le protocole du troisime montage
(drop-wise). Les diffrentes conditions indiques correspondent la concentration initiale doxygne (O2) dans les
bouteilles.
100%
pourcentage des molcules de PCE au dpart (%)
90%
80%
70%
60%
50%
40%
30%
20%
10%
0%
aucun deux et plus trois et plus quatres
atome(s) de chlore enlev(s)
Fig. 36. Pourcentage des molcules de PCE qui ont perdu aucun, au moins deux, au moins trois ou les quatre atomes
de chlore au temps 5,6 jours dans les chantillons de cellules libres. Les diffrentes conditions indiques
correspondent la concentration doxygne dans les bouteilles.
92
La figure 35 montre les rsultats de ces calculs de concentrations pour les cellules
encapsules. Pour les deux premiers groupes de colonnes correspondant la conversion du PCE
vers le DCE, nous avons observ un faible changement dans les pourcentages pour les quatre
conditions de contamination par loxygne. Pour les concentrations doxygne testes, la
dhalognation du PCE vers le DCE tait donc peu affecte. La troisime colonne nous a permis
dobserver une baisse de la conversion du DCE vers le VC puisque le pourcentage des thnes
dintrts qui ont perdu trois atomes de chlore ou plus a chut de 96% 79% lorsquune
contamination de 0,5% doxygne tait prsente. Cependant, les pourcentages se sont maintenus
prs de 80% quand le niveau doxygne a t augment ce qui indique que les cultures
encapsules taient peu affectes par cette hausse du pourcentage doxygne. Une observation
similaire a pu tre faite pour les thnes qui ont perdu tous leurs atomes de chlore : le premier
niveau de contamination par loxygne a fait chuter le pourcentage de molcules dans cette
catgorie de 92% 57% et les niveaux plus levs de contamination affectaient peu ce dernier
pourcentage.
Pour les cellules libres contamines par loxygne (figure 36), la dhalognation du PCE fut
touche ds le dbut : le pourcentage de PCE dans les chantillons contrle tait de 16% et les
valeurs augmentaient progressivement jusqu 64% pour les chantillons contenant 0,9%
doxygne. Pour les autres tapes de la conversion du PCE vers DCE, DCE vers VC et VC vers
lthne, nous avons observ une baisse de lactivit de dhalognation entre chaque
augmentation des niveaux de contamination doxygne. Ces rsultats suggrent que les
diffrentes tapes de la dhalognation du PCE ont t directement affectes par loxygne et
que la baisse dactivit variait en fonction de laugmentation des niveaux de contamination.
93
Ce projet nous a amen combiner les avantages possibles offerts par lencapsulation avec
lactivit de dchlorination particulire dun consortium enrichi en D. ethenogenes, le
consortium KB1. Lobjectif principal de ce projet tait de proposer un modle dencapsulation de
microorganismes dans le but de convertir compltement le polluant PCE en thne. Lors des
expriences ralises pour atteindre cette cible, nous avons obtenus plusieurs rsultats montrant
limpact de lencapsulation sur le consortium enrichi. Nous discuterons ici de ces effets de
lencapsulation en abordant dans un premier temps lactivit de dhalognation du PCE par la
culture KB1 en suspension libre (non-encapsule). Par la suite, nous exposerons limpact de
lencapsulation sur lactivit de la culture selon le type de montage utilis : encapsulation
ultrasonique ou encapsulation avec la technique de drop-wise . Finalement, nous discuterons
des avantages de lencapsulation lorsque les cellules sont exposes loxygne.
fournis des lments supplmentaires pour supporter nos rsultats. En effet, dans la culture pure
de D. ethenogenes utilise par cette quipe, la conversion finale du VC vers lthne ne se fait
pas avant que la concentration du PCE soit faible. Nos profils de dhalognation du PCE
montrent aussi cette tendance une plus grande accumulation dthne ds que le PCE
reprsente de 5% 10% des thnes. Lors de la reconstitution du systme de dhalognation du
PCE in vitro laide des deux enzymes responsables de cette raction chez D. ethenogenes (42),
la mme relation entre lapparition dthne et la faible prsence du PCE a t observe. Il est
important de rappeler ici que la conversion du PCE en TCE pour ces bactries serait due
lenzyme PCE-RDase alors que la conversion successive du TCE en DCE, VC, puis thne serait
attribuable lenzyme TCE-RDase. En plus de cette relation particulire entre la concentration
de PCE et la vitesse de conversion des intermdiaires, il faut noter le fait que la dhalorespiration
avec les thnes chlors est la principale source dnergie pour ces cultures et que lacide
lactique peut aussi tre utilis comme source de carbone. Nous pensons donc que la variation du
pourcentage dthne observ en fonction de la biomasse initiale (figure 23) peut tre explique
par un accroissement de la vitesse de dhalognation du PCE chez les cultures ayant une
biomasse par unit de volume plus importante, ce qui se traduit par un accroissement de
laccumulation dthne lorsque la concentration de PCE atteint le seuil de 5% 10%. Enfin, nos
rsultats montrent que le consortium utilis peut dhalogner le PCE en suivant un profil gnral
similaire ceux observs dans la littrature avec la culture pure ou avec un systme reconstitu
in-vitro.
premire journe, seulement quelques traces de PCE ont t dtectes et la proportion dthnes
chlors sous forme de DCE slevait 95% des thnes prsents. De plus, les profils ont montr
une production dthne aussi faible que lors des premiers tests ralises avec des cultures
contamines par de loxygne. La contamination par loxygne elle seule narrivait pas
expliquer le profil de dhalognation du PCE : comme nous avons pu observer plus tt avec
plusieurs cultures, la contamination par loxygne cause normalement un ralentissement de la
dhalognation du PCE. Nous avons dailleurs pu observer ce phnomne dans les chantillons
de cellules encapsules et contamins par loxygne (figure 29). Nous pensons que les profils
obtenus avec des cellules encapsules avec le deuxime montage seraient le rsultat de plusieurs
facteurs. Premirement, les bactries seraient soumises aux vibrations ultrasoniques lors de leur
passage dans le bec de latomiseur et nous avons montrs que ces vibrations pouvaient dtruire
au moins une partie des cellules lors des tests de survie en utilisant E. coli comme modle. Il est
raisonnable de penser que tous les types de microorganismes qui composent la culture KB1 ne
ragissaient pas de la mme faon aux effets nfastes de ces vibrations (pression, chaleur) et que
par consquent, la composition de la communaut bactrienne prsente dans les cultures fut
change. Pour vrifier cette dernire explication, nous pourrions envisager un test danalyse
phylogntique des squences 16S dADN ribosomale prsentes dans le consortium avant et
aprs traitement. Deuximement, les diffrentes tapes additionnelles pour la prparation des
chantillons de cellules encapsules comme lenrobage la chitosane, les lavages et la
stabilisation la lignosulfonate taient susceptibles de contaminer les chantillons avec des
traces doxygne. Ainsi, bien que la contamination par loxygne ne soit pas le seul facteur, elle
aurait nanmoins pu jouer un rle dans le profil de dhalognation observ la figure 27.
Finalement, les bactries encapsules taient dans un environnement diffrent des cellules en
suspension libre et nous ne sommes pas en mesure de dterminer prcisment les effets que ce
nouvel environnement a eu sur lactivit des cellules (ex. diffrents niveaux dARN messager,
reproduction et survie de diffrentes bactries).
les profils de cellules encapsules de cellules en suspension libre (figure 30 33). En raison du
nombre dchantillons, il ne nous a pas t possible de procder des tudes statistiques
pousses des rsultats mais nous avons nanmoins pu dgager des tendances qui se rptaient
dans plus dune exprience.
La premire observation ralise fut la disparition moins rapide du PCE dans les
chantillons de cellules encapsules. En comparant les profils de dhalognation aux figures 30,
31 et 34, nous avons pu noter une tendance un retard denviron un jour entre les chantillons de
cellules encapsules et les cellules libres pour des concentrations de PCE entre 80 M et 10 M.
En dautres mots les cellules libres atteignaient une concentration de PCE donne environ un
jour avant les cellules encapsules. Nous expliquons mal ce phnomne parce que nous avons
montr lors des tests dabsorption que le PCE ntait pas absorb dans la matrice des capsules.
Aussi, il est peu probable que la matrice polymrique agisse comme une barrire importante
puisque les pores des capsules dalginate laissent gnralement diffuser les molcules dites
petites comme le glucose ou linsuline mais pas les molcules qui ont un plus grand poids
molculaire comme lalbumine ou les immunoglobulines (65). Bien que ce premier impact de
lencapsulation sur lactivit du consortium ne soit pas en faveur de lencapsulation, il a t
largement compens par le deuxime impact.
La deuxime observation ralise est que les concentrations des intermdiaires DCE et
VC dans les chantillons de cellules encapsules restaient plus faibles que dans les chantillons
de cellules en suspension libre. Lencapsulation permettrait donc la formation dun
environnement o la concentration des thnes chlors plus toxiques (DCE et VC) serait plus
faible. Ces diffrences nous ont apparues plus videntes des concentrations de protines
bactriennes dans les chantillons de 55 mg/L (fig. 30 et 31). Il ne nous a pas t possible de
mesurer la concentration des thnes chlors lintrieur des capsules mais nous proposons
lhypothse que la faible accumulation dintermdiaires est due au fait que les produits de
dhalognation du PCE se retrouvent dans un espace restreint o un plus grand nombre de
cellules actives sont prsentes. Par consquent, les intermdiaires TCE, DCE et VC seraient plus
rapidement rutiliss par les cellules comme accepteur dlectrons dans leur chane de
respiration. Cette hypothse sinscrit dans une logique dj avance par lquipe Moslemy,
97
Neufeld et Guiot (57) qui proposaient que la capsule cre un environnement o les constituants
cellulaires des bactries mortes taient plus facilement repris par les autres cellules prsentes
dans la capsule.
Finalement, les profils obtenus avec des cellules encapsules avec le troisime montage
nous ont montr une dhalognation complte du PCE en thne avec une faible accumulation
dintermdiaires (figures 30 33). En comparant le profil de dhalognation du PCE des cultures
encapsules et des cultures en suspension libre, nous sommes en mesure daffirmer que notre
premier objectif a t atteint : le systme dvelopp avec le troisime montage est fonctionnel et
permet lencapsulation dune culture de cellules bactriennes qui ont une activit de
dhalognation du PCE en thne. Dans ce cas, la conversion complte du PCE a t observe
dans les chantillons de cellules encapsules et la tendance rpte (figures 30, 31, 34) est que la
vitesse apparente de cette dhalognation tait plus grande que dans les chantillons de cellules
libres.
observ un phnomne semblable au plus faible niveau de contamination doxygne mais les
effets semblent moins importants.
tait peu affecte par une augmentation du niveau de contamination (la respiration des
microorganismes en priphrie limiterait la pntration doxygne vers lintrieur de la capsule).
Les tendances observes supportent donc lide que les cellules encapsules bnficient
dun effet protecteur contre loxygne prsent dans le milieu tant au plus faible niveau de
contamination (0,5% oxygne) quaux niveaux plus levs. Nos observations constitueraient
alors un exemple supplmentaire des effets bnfiques de lencapsulation sur des cellules
soumises des conditions difficiles comme la prsence de substances toxiques, carts de
temprature et pH extrmes.
Trois montages diffrents ont aussi t tests pendant ce projet. Le premier montage nous
permettait de faire des microcapsules par atomisation avec jet d'air mais il s'est avr peu
efficace en raison de la perte d'environ 67% des constituants de la solution-mre pendant le
processus. Le deuxime montage nous a permis de progresser davantage puisque nous avons pu
obtenir des capsules d'une taille de 30 m 160 m et procder des expriences
d'encapsulation avec le consortium enrichi KB1. En utilisant E. coli comme modle, nous avons
obtenus des rsultats nous permettant de croire que l'atomisation avec ultrasons avait des effets
ngatifs sur la survie des cellules. Grce deux indices, concentration de protines et units de
formation de colonies, nous avons estim la survie des cellules entre 70% et 100%. Cependant, la
comparaison des profils de dhalognation du PCE a rvl que ce processus d'encapsulation
avait des effets sur l'activit de dchlorination complte du PCE. L'effet principal fut l'arrt
quasi-total de la conversion VC thne. Le troisime montage, l'encapsulation drop-wise
est celui qui nous a permis d'atteindre notre objectif puisque nous avons pu encapsuler le
consortium KB1 et obtenir une dhalognation complte du PCE. Les profils ont rvls des
tendances intressantes comme une activit de dchlorination accrue avec les cellules
encapsules puisque la vitesse apparente d'accumulation d'thne dans les chantillons tait plus
grande et la concentration maximale des intermdiaires DCE et VC tait plus faible. Puisque la
principale difficult rencontre dans les expriences avec les cellules fut la contamination par
l'oxygne, nous avons test l'effet de l'encapsulation sur des cellules exposes diffrentes
concentrations du contaminant. Les cellules immobilises dans les capsules semblent avoir
bnfici d'un effet protecteur et elles ont ainsi pu continuer convertir compltement le PCE en
thne mme aux plus hauts niveaux de contamination.
Finalement, ce projet a t ralis dans le but d'obtenir un modle qui pourrait tre utilis dans
des applications en biormdiation et nous croyons que l'encapsulation de la culture KB1 avec le
troisime montage offre plusieurs avantages. Premirement, les polymres utiliss (alginate,
chitosane, lignosulfonate) proviennent de sources facilement renouvelables et le montage peut
102
tre reproduit plusieurs fois pour obtenir une capacit de production des billes grande chelle.
Deuximement, les cellules encapsules semblent conserver une activit de dchlorination
comparable voire mme suprieure aux cellules libres. La faible accumulation des intermdiaires
chlors DCE et VC tait un lment important de l'activit de dchlorination des cellules
encapsules: l'environnement o se faisait la dhalognation serait moins exposs des
intermdiaires qui sont connus comme tant plus toxiques pour les animaux et les humains que le
PCE prsent au dpart. Troisimement, les cellules contenues dans les capsules conservaient une
activit de dhalognation complte du PCE en prsence de faibles concentrations d'oxygne et
nous pensons que cet effet protecteur combin aux nombreux effets protecteurs rapports par
d'autres quipes favoriserait la survie des cellules dans les conditions difficiles des sites
contamins par le PCE. Le modle d'encapsulation dvelopp dans le cadre de ce projet
reprsenterait donc une progression vers une application en biormdiation des sols contamins
par les thnes chlors.
103
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