AO DEL BUEN SERVICIO CIUDADANO

Universidad Nacional Mayor de San Marcos

Universidad del Per (DECANA DE AMERICA)
Facultad De Farmacia y Bioqumica
Escuela Acadmico Profesional de Farmacia Y Bioqumica
Departamento Acadmico de Farmacologa, Bromatologa y
Toxicologa

Prctica N: 2
Profesor: Q.F Teresa C. Gallardo Jugo
Grupo: 3C

Integrantes:
Ataucusi Esquivel Kevin
Gonzales Bravo Katterine
Novoa Ordoez Luz
Yucra Chaqquere Winy
INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS - Equipo: C3 / Turno: Tarde/ PRCTICA N2

INTRODUCCIN
Los organismos coliformes se definen como bacilos Gram negativos, aerobios
o anaerobios facultativos, no esporulados, que fermentan la lactosa con
produccin de gas dentro de 48 h de incubacin a 35C. Este definicin
pretende involucrar bacterias de hbitat tpicamente intestinal (Escherichia coli),
si bien existen microorganismos que satisfacen la definicin y que
frecuentemente se localizan en ambientes extraintestinales (Enterobacter
aerogenes). De hecho, el grupo no se configura a base de gneros
microbianos, sino de cepas que en el desarrollo de la prueba cumplen con la
definicin. Ms an, algunas cepas de Salmonella, por ejemplo, se comportan
como coniformes por el hecho de fermentar la lactosa, en tanto que cepas de
E. coli lentas fermentadoras de la lactosa (patgenas), quedan fuera de la
definicin. Las bacterias ms prominentes del grupo pertenecen a gneros de
las familias Enterobacteriaceae que fermentan la lactosa: Escherichia,
Enterobacter, Citrobacter y Klebsiella.
La E. coli es el tpico coliforme en el sentido de que se trata de una bacteria
cuyo hbitat natural es el contenido intestinal de los animales de sangre
caliente. Por tal razn, su hallazgo en un alimento o en el agua es ms
significativo desde un punto de vista sanitario, que el de cualquier otro
coliforme. La presencia de coliformes en los alimentos resulta de su exposicin
al medio ambiente y a las posibilidades de desarrollo que encuentren en tales
substratos. Es evidente que su hallazgo en un alimento no involucra
necesariamente a la materia fecal.
En los alimentos los coliformes adquieren un significado distinto al que reciben
en el agua. Los factores ms determinantes de esta diferencia radican en su
capacidad para multiplicarse en los alimentos, en la operacin de fuentes no
fecales de contaminacin y a la presencia de coliformes residuales en el equipo
y utensilios en plantas y servicios de alimentos.
El recuento de los coliformes puede efectuarse por la tcnica del nmero ms
probable o por la tcnica de vaciado en placa. Los coliformes fecales se
refieren a aquellos coliformes que tienen capacidad para fermentar la lactosa
con produccin de gas a temperaturas de 44-45C. Excepto esto, los coliformes
fecales se identifican del resto de los coliformes en lo que se refiere a su
resistencia al medio ambiente, agentes qumicos y factores que favorecen o
impiden su desarrollo. La tcnica para su recuento es el nmero ms probable
(NMP), con caldo lauril triptosa como medio presuntivo incubado a 35C por 48
h y caldo EC que contiene sales biliares que le dan selectividad como
confirmativo, incubado a 44.5 +/- 0.2 C. El NMP se computa en las tablas
correspondientes en la forma indicada para los coliformes totales.
INOCUIDAD DE LOS ALIMENTOS - Equipo: C3 / Turno: Tarde/ PRCTICA N2

METODOLOGA
MTODO: Tcnica de los tubos mltiples de fermentacin Mtodo del nmero ms
probable (NMP)
Materiales y equipos:
1. Incubadora a 35-37C
2. Pipetas bacteriolgicas de 1 mL
3. Aguja de inoculacin con alambre de nicrn o de platino- iridio.
4. Caldo Lauril Sulfato Triptosa (LST), volmenes de 10 mL. En tubos de 150 x 15
mm conteniendo tubos de fermentacin invertidos 75x10mm).
5. Caldo Lactosado Verde Brillante Bilis al 2 % (CLVBB), volmenes de 10 mL. en
tubos de 150 x 15 mm. conteniendo tubos de fermentacin invertidos
(75x10mm).
6. Agar Eosina Azul de Metileno (EMB) segn LEVINE o Agar Endo.

Figura 1. Esquema del mtodo de los tubos mltiples de fermentacin Nmero

ms probable (NMP).
MTODO: Numeracin de Coliformes termotrficos
Materiales y equipos:
1. Asa de inoculacin
2. Bao de agua regulado a 44.5 C 0.2 C
3. Caldo E.C, volmenes de 10 mL en tubos de 150 x 15 mm. conteniendo tubo
de fermentacin invertido (75 x 10 mm).
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Figura 2. Esquema del mtodo de los tubos mltiples de fermentacin, tcnica confirmativa para coliformes
termotrficos.

MTODO: Pruebas bioqumicas para la identificacin de coliformes.

Se realizarn las siguientes pruebas: IMVic
1. Prueba de Indol
Se inocula en caldo triptosa y se incuba a 35 37C durante 24 horas.
Luego se aaden 5 gotas del reactivo de Kovacs.

2. Prueba de Rojo de metilo

Se inocula el medio (caldo MRVP) con cultivo y se incuba a 35 37C
durante 48 horas.
Aadir 5 gotas del reactivo de rojo de metilo.

3. Prueba de Voges Proskauer

Se inocula el medio (caldo MRVP) con cultivo y se incuba entre 35
37C durante 24 horas.
Agregar 0.6 mL de -naftol al 5% y 0.2 mL de KOH al 40%.

4. Prueba de Citratos
Inocular en el agar citrato el cultivo e incubarlo entre 35 37C durante
24 horas.

Figura 3. Serie positiva para Escherichia coli

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PROCEDIMIENTO
1.- TECNICA DE LOS TUBOS MULTIPLES DE FERMENTACION O METODO DEL
NUMERO MAS PROBABLE (NMP)
1.- Preparar la muestra
de queso de acuerdo al
procedimiento de
preparacin y dilucin
de las muestras de
alimentos.
2.- Pipetear 1 ml de cada
dilucin (-1, -2 y -3) en tubos
de Caldo Lauril Sulfato
Triptosa (LST) utilizando 3
tubos por dilucin.
3.- Incubar los tubos a 35C 37C
por 24 48 h. Despus de 24 h anotar
los tubos que muestren produccin
de gas. Reincubar por 24 h los tubos
que no muestren gas.
8.- Referirse a la tabla del
NMP y anotar el NMP
basndose en los niveles de
dilucin de las muestras y el
nmero de tubos positivo
confirmado de cada dilucin
seleccionada.
7.- Anotar el nmero de tubos
confirmados en cada dilucin
como bacterias coliformes
positivos.
6.- Confirmar la presencia de
bacterias coliformes por:
Formacin de gas en el CLVBB
5.- Seleccionar la dilucin ms
elevada en la que los tres
tubos son positivos para
dilucin de gas. Transferir una
asada a tubos conteniendo
CLVBB. Incubar a 35 37C
por 24 a 48 horas.
4.- Despus de 48 h anotar
los tubos que muestren
produccin de gas.
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NUMERACION DE COLIFORMES TERMOTROFICOS

1.- Seleccionar los tubos de

caldo LST que muestren
formacin de gas en la
prueba presuntiva.

2.- Inocular una asada de 5.- Anotar el nmero de

cada tubo gas positivo en tubos gas positivo y referirse
tubos con caldo E.C. a la tabla del NMP para
expresar el resultado.

3.- Incubar los tubos de 4.- Los tubos de caldo E.C que
caldo E.C a 44.5C 0.2C por muestren formacin de gas
24 a 48 horas. son positivos para coliformes
termotrficos
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PRUEBAS DE IDENTIFICACIN PARA BACTERIAS COLIFORMES IMVIC

I. TECNICA PARA LA PRUEBA DE INDOL

1.- Inocular tubos con

caldo triptonado a
partir del cultivo puro
e incubar a 35 37C
por 24 horas

2.- Aadir a cada tubo 0.2 0.3 ml de reactivo para indol.

3.- Esperar 10 minutos y observar la

aparicin de un color rojo oscuro en
la superficie de la capa de alcohol
amlico si la prueba es positiva
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II.- TECNICA PARA LA PRUEBA DE ROJO DE METILO Y VOGES PROSKAUER

1.- Inocular tubos de caldo RM VP. A

partir del cultivo puro e incubar a 35
37C por 48 para VP y 5 das para RM.

2.- Aadir :
Prueba VP: 0.6 ml de solucin de hidrxido de
potasio y mg de creatinina. Agitar los tubosy dejar
en reposo durante 2 a 4 horas. La aparicin de un
color roja a carms es positiva
Prueba RM: 5 gotas de la solucin de rojo de
metilo. Agitar
Observar la aparicin de un color rojo si la
reaccin es positiva.
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III.- PRUEBA DE CITRATO DE SODIO

1.-Inoclar tubos de agar

citrato de Simmons e incubar
a 35 37C por 48 horas.
Sembrar por picadura y estra
en la superficie inclinada.

2.- Observar si hay desarrollo. El crecimiento

se manifiesta si hay cambio del color verde
claro del medio a azul.
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PROTOCOLO

NMP DE COLIFORMES, COLIFORMES TERMOTROFICOS Y Ecoli

COLIFORMES

Prueba Presuntiva:

Medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubacin: LST/35-37C por 24 a 48h.

Positividad de la prueba: 3- 3- 2

Fundamento de las reacciones: Fermentacin de lactosa, generando cido y gas; inhibicin de

flora acompaante por lauril sulfato de sodio.

Prueba Confirmativa

Medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubacin: CLVBB/35-37C por 24 a 48h.

Positividad de la prueba: 3- 3- 2

Fundamento de las reacciones: Fermentacin de lactosa, generando cido y gas, en un medio

con sales biliares que junto al verde brillante inhibe desarrollo de Gram positivas y Gram
negativas.

COLIFORMES TERMOTROFICOS

Medio de cultivo, temperatura y tiempo de incubacin: EC/44,5C por 24 a 48h.

Positividad de la prueba: 3-2-0

Fundamento de las reacciones: Fermentacin de lactosa, generando cido y gas a una

temperatura elevada, con inhibicin de flora acompaante por sales biliares.

Escherichia coli

Fundamento de las reacciones: INDOL positivo (la bacteria posee enzima triptofanasa que
permite hidrolizar el triptfano y formar indol), ROJO DE METILO positivo (produccin de
cidos fuertes a partir de glucosa que genera un pH menor a 4.4 generando el viraje del color),
VOGES P. negativo (ausencia de oxidacin del acetilmetil carbinol a diacetilo por ello no see
evidencia el color rojo) y CITRATO negativo (indica que la bacteria no usa como fuente de
carbono al citrato)

Diluciones Coliformes EC I RM VP C Observaciones

P. P. P.C. CT
A + + + Presencia de Col. Termotrficos
B + + + Presencia de Col. Termotrficos
C + + + Presencia de Col. Termotrficos
a + + + Presencia de Col. Termotrficos
b + + + Presencia de Col. Termotrficos
c + + - Presencia de Coliformes
a + + - Presencia de Coliformes
b + + - Presencia de Coliformes
c - - - Ausencia de coliformes

CDIGO NMP/Coliformes: 3 -3 -2 NMP/g o mL Coliformes: 11x 102/g

CDIGO NMP/Col. Termotrficos: 3 -2 -0 NMP/g o mL Col. Termotrficos: 93/g

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CUESTIONARIO
1. Cules son las caractersticas similares y diferentes entre
coliformes y coliformes termotrofos?

SIMILITUDES DIFERENCIAS

Se usan como indicadores para la Para la prueba confirmativa se usa

deteccin de prcticas sanitarias CLVBB (Caldo lactosado Verde Brillante
deficientes en el manejo y en la Bilis), esta prueba diferenciar los
fabricacin de los alimentos. coliformes de los coliformes termofrofos
ya que fermentarn la lactosa
produciendo cido y gas.

Se usan como indicadores en la En medio de cultivo E.C se evidencia

evaluacin de la calidad microbiolgica formacin de gas para coliformes
de un producto (aunque no termotrofos.
necesariamente implica un riesgo
sanitario, cuando los coliformes son de
origen no fecal)

La posibilidad de cuantificar las colonias Los procedimientos para la determinacin

se fundamenta en su dispersin y de coliformes termotrofos incluyen
separacin. filtracin del agua con una membrana
que despus se incuba en medios
selectivos a 44 45C por 24 horas y se
realiza recuento de colonias.

En medio LST (Caldo Lauril sulfato Para determinar las colonias de

Triptosa), que inhibe crecimiento de flora
acompaante, se presenta crecimiento en
ambos tipos de bacterias, ya que
fermentan la lactosa, incluso de los
fermentadores lentos. Esto a 35-37C en
un tiempo de incubacin de 24 a 48
horas.
coliformes termotrofas se procede a
realizar ensayos bioqumicos como la
prueba de indol (reaccin pisitiva por
presencia de color rojo oscuro en la
superficie de la capa de alcohol amlico)

Existen reacciones positivas para Otra prueba bioqumica que confirmara

formacin de gas. (Prueba presuntiva). la presencia de coliformes termotrofos es
la prueba de rojo de metilo (positivo si
hay aparicin de color rojo y amarillo si es
negativo).
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2. Por qu se emplea el grupo coniformes (grupo coliaergenes)

como un indicador de un buen tratamiento tecnolgico en leche
pasteurizada?

Las investigaciones ecolgicas han puesto de manifiesto que E. coli, procede

del intestino de hombre y de los intestinos de los animales de sangre caliente,
si bien puede sobrevivir y an multiplicarse en determinados substratos. El
origen fecal de E. coli, concluye que si esta bacteria se encuentra en algn
alimento ello indica que han tenido lugar una contaminacin de origen fecal y
que, consiguientemente, existe el riesgo de que hayan llegado al alimento en
cuestin microorganismos patgenos de procedencia entrica.

En los alimentos que han sido sometidos a un tratamiento de higienizacin

eficaz, que asegura su inocuidad para el consumidor, por lo general la
determinacin de coliformes o microorganismos del grupo coliaergenes
(microorganismos que incubados a 37 C, fermentan la lactosa con produccin
de gas en un medio, con verde brillante y 2 % de bilis) no tiene necesariamente
relacin con una contaminacin de origen fecal y consiguientemente, con la
posible presencia en los alimentos de microorganismos patgenos de
procedencia entrica, sino que es slo una indicacin de deficiencias o fallos
en el tratamiento industrial de los alimentos.

La determinacin de la presencia de coliaergenes luego de la pasteurizacin

indica la calidad higinica de la leche. Por ejemplo, el Enterobacter aerogenes
provocan compuestos gomosos perjudicando al producto final. En medio
Levine, las colonias de coliformes como E. coli se presentan planas o
ligeramente cncavas, de color oscuro con el centro negro, brillo metlico
verdoso con tendencias a unirse y con un tamao de 2-3 mm. En cambio, las
colonias de Enterobacter aerogenes se observan ms levantadas,
marcadamente convexas, de color menos oscuro que la especie coli, sin el
brillo metlico y con un mayor tamao de 4-6 mm.2
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REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS
1. Camacho A., Giles M., Ortegn A., Palao M., Serrano B., Velzquez O.
Tcnicas para el Anlisis Microbiolgico de Alimentos. 2 ed. Facultad
de Qumica, UNAM. Mxico. 2009. Pg. 2-5.

2. Celis M., Juarez D. Microbiologa de la leche. Editorial de la Universidad

Tecnolgica Nacional. Buenos Aires. 2009. Pg. 18-23.