BIOLOGIA CELULAR Y MOLECULAR

LABORATORIO No 4: EXTRACCIN DE ARN

1. INTRODUCCIN

En los organismos celulares el ARN es la molcula encargada de dirigir la sntesis

de protenas, pues aunque el ADN es el que contiene la informacin que
determina la estructura de estas, no puede actuar solo y se vale del ARN para
traducir esta informacin y producir las protenas necesarias para el desarrollo y
actividades de la clula.

La mayor dificultad en la extraccin del ARN es evitar la contaminacin con

RNAsas, enzimas muy estables que no requieren cofactores para su funcin. Por
lo tanto, se deben tratar las soluciones y los materiales con Dietil-piro carbonato
(DEPC), el cual inactiva las ribonucleasas por modificacin covalente

2. OBJETIVOS

Identificar las etapas y fundamentos indispensables para la extraccin de

ARN
Adquirir conocimiento bsico para el manejo y cuidado de ARN extrado
Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencin de ARN

3. MARCO TEORICO

La mayora de protocolos para extraccin de ARN estn basados en el mtodo

descrito por Chomezynski y Sacchi (1), el cual se basa en el aislamiento de este
cido nucleico empleando fenol-cloroformo e isotiocianato de guanidina. Durante
el procedimiento debe realizarse una etapa de homogenizacin de la muestra con
el (los) reactivo (s) que contengan la solucin fenol-isotiocianato, donde este
ltimo se encarga de conservar la integridad del ARN, mientras rompe las clulas
y disuelve sus componentes, la adicin posterior de cloroformo separa la solucin
en fase acuosa y orgnica, donde la primera de estas contiene el ARN, esta fase
acuosa es posteriormente tratada con isopropanol para recuperar por precipitacin
el ARN.
La metodologa que se va a utilizar en esta prctica, permite recuperar el ARN de
la fase acuosa como ya se mencion, igualmente el ADN y las protenas pueden
ser recuperados de la fase orgnica por precipitacin secuencia, as con etanol se
logra precipitar el ADN de la interfase y con una precipitacin adicional pueden
recuperarse las protenas de la fase orgnica.

Esta tcnica permite obtener ARN a partir de pequeas cantidades de tejido y

clulas en cultivo o suspensin de origen humano, vegetal, animal o bacteriano.
As mismo el ARN obtenido si se realiza el procedimiento con precaucin est libre
de contaminacin con ADN y protenas y finalmente puede ser utilizado en
diferentes procedimientos como Northern blot, Dot blot, Transcripcin reversa,
ensayos de proteccin de RNAsas PCR y clonaje molecular

4. PRE-LABORATORIO

1. Durante la extraccin de ARN se emplea sales de guanidinium. Cul es su

funcin y que tipo de sales son las ms utilizadas?
2. Cul es la funcin del dietilpirocarbonato (DEPC) durante la extraccin del
ARN?
3. Mediante el mtodo de TRIzol se puede aislar simultneamente ADN, ARN y
protenas?
4. Se obtiene la misma cantidad de ARN que de ADN en la extraccin con
TRIzol?
5. Qu tipo de ARN se obtiene en este tipo de extraccin?
6. Porque se requiere agua milliQ, ultrapura o tipo I en este procedimiento?

5. PRECAUCIONES

Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente
durante el procedimiento de manipulacin del ARN para obtener la segunda
cadena o cadena complementaria, por lo cual deben tenerse en cuenta los
siguientes aspectos cuando se trabaja con ARN:

- Siempre deben utilizarse guantes de ltex, ya que la piel contiene algunas

bacterias que poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer.
- Utilizar pipetas y micro pipetas estriles, reservadas para trabajo de ARN,
evitando as contaminaciones cruzadas.
- Utilizar material tratado con inhibidores de RNAsas (libre de RNAsas)
-El reactivo bromuro de etidio es altamente peligroso por lo que siempre deben
utilizarse elementos de proteccin como guantes y gafas, evitando completamente
el contacto con piel y ropa, as como evitando inhalar el reactivo o los vapores de
este.

Otras precauciones son:

- Utilizar siempre tubos de polipropileno
 - Utilizar material resistente al cloroformo y altas velocidades de
centrifugacin
- Equilibrar los tubos previos a la centrifugacin
- Tapar o sellar correctamente los tubos durante la centrifugacin y durante la
incubacin para evitar la evaporacin.

6. MATERIALES Y REACTIVOS

Tubos Vacutainer con EDTA, heparina o citrato

Reactivo TRIzol (Gibco)
Eppendorf estriles de 1.5 mL
Micro pipetas
Puntas estriles
Centrfuga y micro centrfuga
Guantes
Agua desionizada estril
Cloroformo
Agua libre de ARNasas
Isopropanol
Etanol al 75% en agua libre se RNAsas

7. PREPARACIN DE REACTIVOS

NaCl al 0.9%

-Agua libre de RNAsas

1mL de Dietil-pirocarbonato (DEPC)
1L de agua destilada estril

Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizar completamente el DEPC

con el agua (durante 12 horas aproximadamente). Esto debe hacerse en cabina
de extraccin y con todas las medidas de bioseguridad conocidas.
Autoclavar 2 veces y almacenar a temperatura ambiente

- Etanol al 75%
100mL de agua libre de RNAsas
Etanol grado biologa molecular

Mezclar cuidadosamente 75mL de etanol con 15mL de agua libre de RNAsas en

un frasco estril hasta homogenizar completamente
No autoclavar y almacenar a temperatura ambiente.
8. PROCEDIMIENTO

Esta prctica se realizar en dos clases. En la primera se recolectara la muestra a

partir de sangre total se obtendrn Clulas Mononucleares de Sangre Perifrica
(CMSP), mediante gradientes de centrifugacin Ficoll Hypaque y se dejara hasta
el paso de homogenizacin.

TECNICA DE TRIzol PARA EXTRACCIN DE ARN

I. HOMOGENIZACIN
1. En un tubo Eppendorf de 1.5 mL, homogenizar el pellet de CMSP (obtenidas
previo sometimiento de sangre total a gradiente de Ficoll-Hypaque) con 1 mL de
reactivo TRIzol. Se deja incubando a -70 0C, hasta la prxima prctica.
2. Mezclar suavemente con micro pipeta.

II. FASE DE SEPARACIN Homogenizar pellet de clulas blancas

3. Incubar la muestra homogenizada con TRIzol
durante 15 minutos a temperatura
Mezclar e incubar
ambiente, permitiendo as la completa
disociacin de los complejos de
nucleoprotenas.
4. Adicional 200ul de cloroformo, tapar Adicionar cloroformo
perfectamente el tubo
Agitar e incubar
5. Agitar fuertemente durante 15
segundos
6. Incubar por 2 a 3 minutos a
temperatura ambiente y en posicin Separacin de fases
vertical
7. Centrifugar las muestras a 14000rpm Tomar la fase acuosa y

por 10 minutos preferiblemente a Adicionar isopropanol

temperatura de 4 a 8C
8. Luego de centrifugar, la mezcla se
separa en una fase inferior roja, fase de Descartar el sobrenadante
fenol cloroformo, en una interfase y en
Adicionar etanol al 75% al pellet.
una fase incolora superior, la cual
Mezclar
contiene exclusivamente el ARN

III. FASE DE PRECIPITACIN Eliminar el

sobrenadante
9. Transferir la fase acuosa
cuidadosamente a un tubo Eppendorf
nuevo (aqu puede separarse Dejar secar a T ambiente
igualmente la fase orgnica para
posterior purificacin de ADN o Adicionar agua libre de RNAsas y
homogenizar
protenas)
10. Adicional 0.5 mL de isopropanol
para precipitar el ARN de la fase acuosa
11. Incubar el tubo por 10 minutos a temperatura ambiente y en posicin vertical
12. Centrifugar a 10000rpm (o 12000g) por 10 minutos, preferiblemente a
temperatura de 2 a 8C
13. El ARN debe verse precipitado antes de la centrifugacin como un pellet
parecido a un gel.

IV. FASE DE LAVADO

14. Remover el sobrenadante cuidadosamente y eliminarlo
15. Adicionar 1 mL de etanol al 75% al pellet para lavarlo
16. Mezclar por agitacin
17. Centrifugar a 6000rpm por 5 minutos preferiblemente a 2- 8 C
18. Eliminar cuidadosamente el sobrenadante

V. FASE DE DISOLUCIN

19. Secar a temperatura ambiente, colocando el Eppendorf con el ARN sobre una
toalla de papel estril
20. Adicionar 30ul de agua libre de ARNasas
21. Disolver el ARN por pipeteo suave, opcionalmente puede incubarse 10
minutos a 55-60C para lograr una completa disolucin

9. POST-LABORATORIO

1. A qu factores puede deberse la obtencin de baja cantidad o prdida total del

ARN extrado con esta metodologa?
2. Qu otras tcnicas comerciales existen para extraer ARN?
3. El ARN obtenido aqu puede utilizarse directamente para realizar una
determinacin especfica a travs de PCR? Por qu?
4. A partir de que otras muestras puede realizarse la extraccin de ARN y con qu
objetivo se realiza en estas muestras la extraccin?
5. Qu inhibidores de nucleasas existen y en que procedimientos deben
utilizarse?

10. BIBLIOGRAFIA
Revista Nature Protocolos Aos 2009-2013
- Almonacid, C Pinilla G. Introduccin al anlisis Bioqumico y a sus
mtodos de separacin. Universidad Colegio Mayor de
Cundinamarca . 2008
- Chomczynski P. and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162:156
- Chomczynski P. and Sacchi. 1993. Biotechniques. 15:532
- Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: a Laboratory Manual. 2
nd edition, Cold Spring. Laboratory, Cold Spring Harbor, New York
- David, L.G. dibner, M.D.& Battery, J.F. Bassin methods in molecular
biology. Elsiever Science Publishing Co. Ind. NY. 1986
 - Catlogos de TRIzol casa comercial GIBCO.

11. AUTOEVALUACION.
NUMERO DE LOGRO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS
LA PRACTICA (Objetivos A CADA
cumplidos) DEBILIDAD
SI NO
 ANEXO COMPLEMENTARIO AL LABORATORIO No. 4

OBTENCION DE ADNc

1. INTRODUCCIN

Cuando el ARN mensajero es obtenido, se puede llevar a cabo una amplia

variedad de aplicaciones: elusin del ARNm, cuantificacin del ARNm y sntesis
de ADNc (ADN complementario) el cual puede ser utilizado para: amplificacin,
deteccin de la expresin de genes especficos o almacenaje de ADNc.

Para obtener el ADNc se utiliza una tcnica denominada RT-PCR (Reverse

Transcription - Polymerase Chain Reaction; Transcripcin Reversa - Reaccin en
Cadena de la Polimerasa), que nos permite la amplificacin de una cantidad
pequea de molculas de ARN (tanto ARNm como RNA total) con gran
especificidad, mediante la Transcripcin reversa del RNA a ADNc, que es
posteriormente amplificado.

2. OBJETIVOS

Identificar los reactivos, funcionamiento y orden de adicin de los reactivos

necesarios en la obtencin de ADNc in Vitro.
Adquirir conocimiento bsico para el manejo y funcionamiento de la
obtencin de cadenas complementarias de ADN
Realizar un procedimiento comercial y accesible para la obtencin de ADNc

3. MARCO TEORICO

Esta tcnica permite obtener ADNc a partir de pequeas cantidades de ARN de

origen humano, vegetal, animal o bacteriano. As mismo el ADNc obtenido por
este mtodo, si se realiza el procedimiento con precaucin, est libre de
contaminacin con DNAsas y protenas. Adems el ADN contaminante, tanto en
las muestras, como en los reactivos, debe ser evitado con el fin de impedir la
aparicin de productos inespecficos

Hay dos partes bien diferenciadas en cualquier RT-PCR: la transcripcin reversa y

la amplificacin. La transcripcin reversa, utilizando RNA total como ARNm, es la
etapa clave en una RT-PCR. Existen varios factores que influencian la eficiencia
del proceso, tales como: la enzima que va a llevar a cabo esta reaccin, la
presencia de estructuras secundarias en el ARN, etc.
Las reverso transcriptasas virales, tales como M-MLV y AMV, han sido las
enzimas de eleccin durante muchos aos. Estas enzimas, sin embargo, son
termolbiles, y no pueden llevar a cabo la transcripcin reversa cuando existen
estructuras secundarias en el ARN. En este caso, se suelen utilizar transcriptasas
reversas termoestables, que pueden llevar a cabo la reaccin a 55-70C,
permitiendo la desnaturalizacin de las estructuras secundarias, y aumentando la
eficiencia global de la reaccin.

4. PRECAUCIONES

Las RNAsas (enzimas que rompen ARN) pueden ser introducidas accidentalmente
durante el procedimiento de manipulacin del ARN para obtener la segunda
cadena o cadena complementaria, por lo cual debe utilizarse durante todo el
procedimiento guantes de ltex, ya que la piel contiene algunas bacterias que
poseen estas enzimas y contaminan el ARN a extraer; utilizar todo el material
necesario para el trabajo de ARN (pipetas, micro pipetas, entre otros) estril y con
inhibidores de RNAsas evitando as contaminaciones cruzadas. Se deben tener en
cuenta otras precauciones enunciadas en la prctica de extraccin de ARN

5. PRE- LABORATORIO

Dependiendo las condiciones experimentales puede darse la necesidad de usar

ADNc, para lo cual se realiza primero la extraccin de ARN que ms tarde ser
sintetizado a ADNc. Para ello, la ciencia se ha valido de un truco viral: los virus
que no poseen ADN propio tienen que transformar su ARN a ADN dentro la clula
husped y para ello estn equipados con una ADN polimerasa especial, al igual
que otras polimerasas es dependiente de ARN, est se denomina transcriptasa
reversa. La ms conocida comercialmente es la MMLV (Molones Murine Leucemia
Virus) que aade nucletidos al poli nucletido naciente en direccin 5' 3'.
MMLV utiliza ARNm como molde, pero requiere de un cebador.

Teniendo en cuenta el enunciado anterior. Responda las siguientes preguntas:

1. Cul es la diferencia entre ADNc y ADN genmico?

2. Actualmente en el mercado se cuenta con otro tipo de retrotranscriptasas,

mencione alguna de ellas? Cules son las diferencias entre cada una de ellas?

3. La retrotranscriptasas utilizan ARNm como molde, pero requiere de un cebador.

Los cebadores ms comunes son un oligo dT (TTTTTTTT), primers degenerados
(generalmente hexmeros) especficos anti sentido o sentido. En qu
condiciones se deben emplear cada uno de ellos?

6. MATERIALES REACTIVOS Y EQUIPOS

ARN obtenido con anterioridad

Micro pipetas
Puntas estriles
Vortex
Centrfuga con rotor para tubos de 15ml y Micro centrifuga para viales de 1.5 ml
Guantes
Agua des ionizada estril
Tris
Acetato
EDTA
SDS
Bromuro de etidio
Agarosa
Reactivos comerciales para transcripcin reversa
Cmara de electroforesis

7. PREPARACION DE REACTIVOS

Agua libre de RNAsas

1mL de Dietil pirocarbonato (DEPC)
1L de agua destilada estril
Mezclar en una botella con magneto hasta homogenizacin completa del
DEPC con el agua (durante 12 horas aproximadamente), adicionando el DEPC
en cabina de extraccin y con todas las medidas de bioseguridad conocidas.
Autoclavar 2 veces y Almacenar a temperatura ambiente

8. PROCEDIMIENTO

TECNICA DE ADNc DE PROMEGA

Luego de la extraccin de ARN, cada muestra se procesa para la obtencin de

cadena complementaria o ADNc por medio de una reaccin la cual contiene la
enzima Transcriptasa Reversa MMLV-RT, buffer para la enzima, dNTPs, RNAsin y
Random Primers u Oligo DT (Promega).

El procedimiento utilizado es:

1. En un tubo Eppendorf, colocar 10 l de RNA (200ng aproximadamente)

2. Adicionar 5ul de agua libre de RNAsas 6ul de buffer para RT, 1ul de RNAsin,
1.5ul de dNTP (mezcla de 10mM), 3 l de Oligo DT o Random Primers y 1.5ul
de enzima MMLV-RT.
3. Incubar a 37C durante 1 hora.
4. El ADNc obtenido se puede guardar a -20C hasta su futuro uso.
5. Puede observarse la calidad del ADNc visualizndolo en gel de agarosa al 1%
preparado en buffer de corrido TAE (tris-acetato-EDTA) y teido con bromuro
de etidio.
6. El corrido se hace a 100V durante 30 minutos aproximadamente

9. POST-LABORATORIO

1. Cmo acta o funciona la MMLV-RT en la transcripcin reversa?

2. Qu otras transcriptasas reversas existen, de que origen y que caractersticas
tienen?
3. La enzima para la transcripcin reversa en que paso del procedimiento
debera adicionarse y porque?
4. El ADNc obtenido en que procedimiento o para que finalidades puede
utilizarse?
5. Qu inhibidores de RNAsas existen y cmo actan?

10. BIBLIOGRAFIA

-Revista Nature Protocols aos 2009- 2012

1..Catlogos y fichas tcnicas 2012 de las casas comerciales: Invitrogene, Promega, Biorad,
Biologend, Bioline, Roche, etc.

2.Chomczynski P and Sacchi. 1987. Anal Biochem. 162: 156.

1. David, L.G. Dibner, M.D. & Battery, J.F. Basic methods in molecular biology. Elsiever Science
publishing Co. Ind. NY. 1986.
2. Sambrook, J. et al. 1989 Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd edition, Cold Spring.
Laboratory, Cold Spring Harbor, New York,
3. Catlogos de PROMEGA para obtencion de caderna complementaria de DNA.
4. Fundamentos moleculares en medicina. Fernando Lizcano Losada.Manual Moderno. Universidad de la
Sabana. 2005.
5. Biologa molecular e ingenieria genetica. Texto ilustrado de biologa molecular e ingenieria genetica.
Luque jose et l. Primera edicion. 2001.

11. AUTOEVALUACION.

NUMERO DE LOGRO FORTALEZAS DEBILIDADES SUGERENCIAS

LA PRACTICA (Objetivos A CADA
cumplidos) DEBILIDAD
SI NO