LA TERAPIA GENTICA MANIPULACIN DE GENES BIOLOGA CELULAR

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LA TERAPIA GENTICA Y LA BIOLOGA CELULAR

LA MANIPULACIN DE GENES

La terapia gentica es la tcnica que permite la localizacin exacta los posibles genes defectuosos
de los cromosomas y su sustitucin por otros correctos, con el fin de curar las llamadas
enfermedades genticas, entre las que se encuentran muchos tipos de cncer.

El desarrollo de la terapia gentica se ha apoyado en los avances cientficos experimentados por

determinadas ramas de la biologa, como la gentica, la biologa molecular, la virologa o la
bioqumica. El resultado es una tcnica que permite la curacin de casi cualquier patologa de
carcter gentico.

En el desarrollo de dicha terapia hay que tener en cuenta diversos factores. Por un lado, es
necesario saber cul es tejido diana, es decir, el que va a recibir la terapia.

En segundo lugar, conocer si es posible tratar in situ el tejido afectado. Igualmente importante
resulta determinar el que facilita el traspaso de un gen exgeno a la clula, es decir, qu vector se
ha elegir para el desarrollo del nuevo material gentico que posteriormente se introduce el tejido.
Finalmente, es preciso estudiar al mximo la eficacia del gen nuevo y saber que respuesta tendr
el rgano o tejido hospedador, con la entrada del gen modificado.

La finalidad principal de los estudios sobre terapia gnica en el mbito de la medicina es conseguir
los mejores resultados tanto en prevencin como en investigacin, diagnstico y terapia de las
enfermedades hereditarias; sin embargo, esta manipulacin del material gentico puede ser
utilizada en ingeniera gentica, con el fin de mejorar determinadas caractersticas de los seres
vivos.
Los inicios de la terapia gnica

Los primeros trabajos en terapia gnica se realizaron con ratones, mediante tecnica del ADN
recombinante, que consiste en introducir el ADN extrao en los embriones, de forma que dicho
ADN se expresa luego completamente, a medida que desarrolla el organismo. El material gentico
introducido se denomina transgn; los individuos a los que se les aplica esta tcnica reciben el
nombre de transgnicos. Con la introduccin de estos transgenes se puede lograr la identificacin
de zonas concretas del material gentico para llevar a cabo su cloonacin, con el fin de que solo se
vean afectadas un tipo especfico de clulas.

Vectores

Los vectores virales agrupan cuatro tipos de virus: retrovrus, adenovirus, virus adnoasociados y
herpesvirus; existen tambin vectores no virales, como el bombardeo con partculas, la inyeccin
directa de ADN, los liposomas catinicos y la transferencia de genes mediante receptores.

Vectores virales

Los retrovirus comprenden una clase de virus cuyo material gentico es una cadena sencilla de
ARN; durante su ciclo vital, el virus se transcribe en una molcula bicatenaria de ADN, gracias a la
accin de la enzima reverso transcriptasa, que se integra en el genoma de la clula husped sin
aparente dao para ella. La mayor parte de los retrovrus a excepcin del HIV, slo se pueden
integrar en clulas con capacidad para replicarse, lo cual restringe su uso. Sin embargo, se pueden
desarrollar en grandes cantidades y su expresin en la clula hospedadora se realiza durante
largos periodos de tiempo. Los adenovirus son un conjunto de virus con ADN lineal de cadena
doble.

Los vectores de adenovirus son ms grandes y complejos que los retrovirus, pues en su
construccin solamente se elimina una pequea regin del material gentico vrico. Su ciclo de
infeccin, que comprende de 32 a 36 horas en un cultivo celular conlleva en primer lugar la
sntesis de ADN de la clula y, posteriormente la sintesis y ensamblaje del ADN y las protenas
vricas. Las infecciones de estos virus en seres humanos estn asociadas a enfermedades benignas,
como la conjuntivitis.
La principal ventaja de su utilizacin en la terapia gnica es que se pueden producir en grandes
cantidades y transfieren de forma muy eficaz el material gentico a un nmero elevado de clulas
y tejidos, aunque el hospedador parece limitar la duracin de la expresin del nuevo material
gentico.

Los virus adeno-asociados son muy pequeo no autnomos y con ADN lineal de cadena sencilla.
Para la replicacin de estos virus es necesaria la confeccin con adenovirus.

La insercin del material genetico de los adenovrus asociados se suele producir en regiones del
cromosoma 19. Los vectores que se forman con este tipo de virus son muy simples, no pueden
exceder en mucho la longitud del ADN viral, aproximadamente 4.680 nucletidos, y son capaces
de expresarse a largo plazo en las clulas que no se dividen; sin embargo, la respuesta que
producen en la clula hospedadora es menor que la que se ocasiona con el tratamiento con
adenovirus y es difcil la produccin de este vector en grandes cantidades.

Los herpesvirus poseen un material gentico compuesto por ADN de doble cadena lineal, con un
tamao aproximado de 100 a 250 Kb.

Presentan variaciones en cuanto al tamao y organizacin del genoma, contenido gentico o

clulas sobre las que actan. Pero por regla general, este tipo de de virus son muy tiles, pues es
posible insertar en su genoma grandes cantidades de ADN extrao y llevar a cabo durante largos
periodos de tiempo infecciones latentes en la clula hospedadora, sin ningn efecto aparente
sobre sta.

En la clase de los gamma-herpesvirus como el virus de Epstein-Barr, se pueden producir

infecciones latentes en clulas en divisin, de modo que el material gentico que lleva insertado
el virus se replica conjuntamente a la divisin celular y se hereda en toda la nueva progenie de
clulas. El inconveniente que presentan estos virus es que estn asociados a daos
linfoproliferativos, con lo cual, para su uso como vectores es necesario identificar estos genes y
eliminarlos, manteniendo nicamente aquellos que permitan la replicacin del virus y el
mantenimiento del plsmido viral. Hasta la fecha, el uso fundamental de los herpesvirus en la
terapia gnica se limita al empleo in vivo del herpes simples (HSV).

Vectores no virales

El bombardeo de partculas constituye una tcnica efectiva de transferir genes tanto in vitro como
in vivo. En este mtodo fsico el plsmido o porcin de ADN es recubierto en su superficie por
gotas de oro o tungsteno, de 1 a 3 micras de dimetro. Estas partculas, aceleradas por una
descarga elctrica de un aparato o por un pulso de gas son disparadas hacia el tejido.

El xito de esta tcnica puede estar asegurado en los procesos de vacunacin. Otra alternativa es
la inyeccin directa del ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente, dentro del tejido
deseado. Este mtodo econmico, y un procedimiento no txico, si se compara con la entrega
mediante virus. Como desventaja fundamental hay que sealar que los niveles y persistencia de la
expresin de genes dura un corto periodo de tiempo.

Esta tecnologia puede tener potencial como un procedimiento de vacunacin y como e genes a un
nivel bajo. Los liposomas catinicos consisten en la mezcla de un lipido catinico de carga positiva
y varias molculas de ADN con carga negativa debido a los fosfatos de la doble hlice.

Este tipo de vectores se han usado en el tratamiento de la fibrosis sistica y en las enfermedades
vasculares. Se pueden realizar transferencias de estos va catter, aunque su uso es limitado,
dedido a la baja eficacia de transfeccin del material gentico contenido en este complejo a la
clula hospedadora ya su relativa toxicidad.

Un problema que se plantea con las tcnicas anteriores es que el vector alcance realmente su
objetivo y no quede diseminado por el organismo. Por ello existe un procedimiento que consiste
en introducir, junto al material gentico que queremos transferir, molculas que puedan ser
reconocidas por los receptores de la clula diana. Estas molculas pueden ser azucares, pptidos,
hormonas, etc. y su ventaja respecto a otros modelos es que se establece una interaccin muy
especfica, como la interaccin transportador/clula, y no muy inespecfica como la que se verifica
entre las cargas inicas.
Experimentos en animales

Los experimentos con animales conforman una parte fundamental en el estudio de cualquiera de
las aplicaciones de terapia gnica; sus dos objetivos principales son el anlisis de la seguridad del
sistema de vectores y el estudio de la eficacia de la transferencia de genes.

El efecto de la dosis y su duracin es comprobado en varias especies, incluyendo primates y otros

animales que sean hospedadores para el virus salvaje (por ejemplo, las ratas del algodn se usan
para el estudio de adenovirus). Se analiza la difusin de secuencias vitales, especialmente a las
gnadas, y cualquier efecto adverso, como la inflamacin tras la administracin del vector.

El propsito de estos ensayos no es mostrar que el vector no produce efectos adversos

cualquier clase de droga tiene esa capacidad en determinada dosis, sino precisar el tipo de
suceso adverso que podra esperarse si los humanos estuvieran expuestos al vector, y fijar las
posibles dosis que pueden acarrear estos sucesos. Para una enfermedad gentica, un ratn con un
gen eliminado o un animal con el fenotipo apropiado sera vlido en este tipo de estudio.

Terapia gnica en seres humanos

Esta terapia est destinada al tratamiento de enfermedades infecciosas y auto inmunes, Las
estrategias se basan en la eliminacin de poblaciones de clulas infectadas con virus, como el HIV,
mediante administracin directa de molculas de cidos nucleicos o a travs del desarrollo de
vacunas. En la terapia contra el cncer, se puede actuar con diferentes objetivos. Si se opera sobre
las clulas del sistema inmunitario, se manipulan ex vivo las clulas efectoras antitumorales del
sistema inmune. Estas clulas son modificadas genticamente y reimplantadas con el fin de liberar
dentro del tumor el producto de los genes exgenos, como las ctoquinas.

Sobre las clulas hematopeyticas o formadoras de sangre se acta incorporando los llamados
genes MDR, que confieren mayor resistencia a las altas aplicaciones de quimioterapia en el
paciente. Si se acta directamente sobre las clulas tumorales, se introducen factores genticos
que provoquen la muerte o apoptosis de las clulas tumorales o aumenten la respuesta del
sistema inmunitario antitumoral del paciente.
Otro de los campos ms promisorios de las terapias gnicas es el de las inmunoterapias y la
fabricacin de vacunas biotecnolgicas.

Recordemos que nuestro organismo est sometido a mltiples agresiones de parsitos, bacterias y
virus. El sistema inmunitario debe clasificar a esos agresores y armar una respuesta efectora capaz
de eliminarlos.

En el caso de las bacterias extracelulares y de sus productos txicos, la respuesta eficaz consiste
en la produccin de anticuerpos opsonizantes o neutralizantes.

Si se trata de bacterias intracelulares (como los micoplasmas) que se replican en el interior de

los fagosomas, la respuesta ms contundente corre a cargo de las clulas T que activan los
fagocitos en los procesos de hipersensibilidad retardada.

Por ltimo, ante una infeccin vrica, si bien los anticuerpos especficos podran limitar la
difusin del virus a otras clulas, slo una respuesta citotxica (por los linfocitos T citotxicos)
acabar con las clulas infectadas y erradicar el virus.

Con la vacuna quedamos expuestos a un material biolgico que imita al agente infeccioso. Por
eso, el sistema inmunitario desencadena la resistencia ante el patgeno y lo memoriza, sin
experimentar la infeccin ni la enfermedad. El proceso se asemejara a introducir en el organismo
un chip de memoria con determinadas instrucciones. Para vacunar contra un patgeno, se
inocula en el organismo un microorganismo muerto (vacuna muerta), un microorganismo vivo
pero incapacitado para desencadenar la enfermedad (vacuna viva atenuada) o una porcin
purificada del patgeno (vacuna subunitaria).

A partir de la Ingeniera gentica y la Biotecnologa, se perciben tres reas prometedoras en el

campo de la vacunacin: la administracin de vacunas a travs de las mucosas, las vacunas de ADN
y las vacunas teraputicas.

stas nuevas tcnicas permitirn curar enfermedades como la hepatitis B, el papilomavirus, el

herpes genital e incluso el sida. La Biotecnologa est proporcionando, entonces, un potencial
ilimitado para el desarrollo de nuevas vacunas y, con ello, se est ampliando el campo de accin
de la vacunacin, adems de presentar vehculos efectivos para el tratamiento de determinados
tumores y enfermedades virales, lo que puede cambiar la relacin del ser humano con las
enfermedades del prximo siglo.

https://historiaybiografias.com/terapia/

Daniel Soutullo

1. Introduccin

2. Definicin y tipos de terapia gnica

3. Condiciones de aplicabilidad de la terapia gnica

4. Pasado y presente de la terapia gnica

5. Problemas de la terapia gnica y de sus aplicaciones

6. Conclusin

1. Introduccin
En el captulo anterior hemos comentado algunas implicaciones de la
concurrencia de intereses econmicos en el desarrollo del Proyecto
Genoma Humano y en algunas de sus aplicaciones en el terreno
biosanitario, con especial atencin a los tests de diagnstico de
enfermedades genticas en general y de las multifactoriales en
particular.

El presente captulo estar dedicado a la terapia gnica, otro de los

campos que mayores expectativas ha levantado en los ltimos aos ya
que, a diferencia de los tests de diagnstico comentados, la terapia
gnica est orientada no al diagnstico sino a la curacin de las
enfermedades, curacin que, mediante su aplicacin, se pretende que
pueda llegar a ser definitiva. Aunque la investigacin en terapia gnica
se ha desarrollado paralelamente al Proyecto Genoma Humano y no
puede ser considerada una consecuencia directa del mismo, no cabe
duda de que el conocimiento de la secuencia completa del genoma
humano, en la medida en que permita el conocimiento de todos los
genes, puede suponer un impulso muy importante para las posibilidades
de la terapia gnica[1].

En este captulo describiremos en qu consiste la terapia gnica, los

principales pasos que ha dado hasta ahora desde su puesta en marcha y
algunas de sus aplicaciones presentes y futuras. Tambin discutiremos
las dificultades ms importantes con las que se encuentra y por qu a
pesar de stas constituye uno de los focos de mayores esperanzas
sanitarias que ha abierto la revolucin biotecnolgica de los ltimos 25
aos.

2. Definicin y tipos de terapia gnica

No existe una nica definicin satisfactoria de terapia gnica.
Lacadena presenta dos, una ms estricta y otra ms amplia:

En un sentido estricto, por terapia gnica humana (TG) se entiende la

administracin deliberada de material gentico en un paciente humano con la
intencin de corregir un defecto gentico especfico. Otra definicin ms amplia
considera la terapia gnica como una tcnica teraputica mediante la cual se inserta
un gen funcional en las clulas de un paciente humano para corregir un defecto
gentico o para dotar a las clulas de una nueva funcin.[2]

La primera de las definiciones, la ms estricta, se corresponde con lo

que fueron los primeros protocolos de terapia gnica a comienzos de los
aos 90, es decir, ensayos dirigidos a corregir los efectos de algunas
enfermedades monognicas recesivas. Sin embargo, esta definicin no
engloba una buena parte de los procedimientos que, a nivel
experimental, estn empezando a ser ensayados en modelos animales e
incluso en humanos. Adoptar la segunda de las definiciones puede
ayudar a resolver este problema pero presenta la contrapartida de que
al extender excesivamente los lmites del concepto aparecen nuevos
problemas, quizs de mayor trascendencia social. Algunos autores han
prevenido contra una utilizacin demasiado laxa del concepto de
terapia gnica ya que puede abrir la puerta a tratamientos que no son
propiamente teraputicos pero que se presentan disfrazados de tales.
Apuntan, adems, que esa utilizacin amplia del concepto no suele ser
inocente y puede ser considerada una forma de hacer ms aceptables
procedimientos de ingeniera gentica humana que de otro modo
podran contar con una mayor oposicin social. En este sentido, Miguel
Moreno opina que:

No deberamos considerar terapias gnicas las destinadas a prevenir el desarrollo

de enfermedades hereditarias, conforme a los datos derivados de un anlisis gentico
revelador de propensiones a las mismas; ni las de carcter preventivo, contra
infecciones generalizadas de origen viral; o las transferencias gnicas destinadas a
identificar los fenmenos (genticos, fisiolgicos, cromosmicos, etc.) implicados en la
etiologa de una enfermedad especfica (su fin primero es el diagnstico, que en
muchas ocasiones de poco sirve para la terapia).[3] (vase artculo original)

Teniendo presentes estos problemas, aunque no resulte totalmente

satisfactoria para los propsitos de nuestra discusin, emplearemos a lo
largo de este captulo la definicin genrica de que la terapia gnica
consiste en la modificacin gentica de clulas de un paciente a fin de
combatir alguna enfermedad[4]. Aunque no elimina totalmente los
problemas antes apuntados, circunscribe los usos de la terapia gnica a
unos fines teraputicos y deja fuera de la misma otras utilidades
diagnsticas, preventivas o eugensicas no propiamente curativas.
Adems, una definicin tan general como sta presenta la ventaja de
que permite englobar estrategias muy distintas encaminadas a la
curacin, mediante tcnicas genticas, de enfermedades no solamente
genticas sino tambin infecciosas.

Otro problema que conviene tener presente cuando nos referimos a la

terapia gnica es su carcter fundamentalmente experimental. En este
sentido, definirla como una terapia no deja de ser una proyeccin de
sus potencialidades futuras cuando stas lleguen a convertirse en una
realidad, cosa que de momento solamente se ha producido en un nico
caso[5]. Exceptuando este caso, los ensayos ms exitosos realizados
hasta ahora deben ser considerados ms un tratamiento, que ha
conducido a una mejora temporal, que una curacin propiamente
dicha[6].

Dependiendo del tipo de clulas a las que se aplique podemos

distinguir entre terapia gnica somtica y germinal[7]. La primera dirige
la modificacin gentica a cualquiera de los tejidos corporales del
paciente y, aunque llegase a tener efectos duraderos a largo plazo,
stos se circunscriben al individuo tratado. En ningn caso pasan a la
descendencia pues los genes que se transmiten de padres a hijos son
aqullos presentes en los vulos y espermatozoides. Una intervencin
gentica sobre clulas pulmonares, nerviosas, musculares, sanguneas o
hepticas, por poner solamente unos pocos ejemplos, podra corregir
defectos genticos en estos tejidos u rganos, pero estas clulas no se
transmiten a la progenie por lo que, por importante que pueda llegar a
resultar para el paciente en cuestin, carece de consecuencias
hereditarias.

La terapia germinal, por el contrario, ira encaminada a la

modificacin gentica de las clulas reproductoras, de sus clulas
precursoras de la lnea germinal o de las clulas embrionarias en las
primeras etapas del desarrollo. En el caso de las clulas germinales los
efectos teraputicos se manifestaran sobre los descendientes, aqullos
que se originan a partir de las clulas germinales tratadas, pero no
sobre los individuos productores de dichas clulas. Por afectar a la lnea
germinal, todas las clulas de los individuos de la generacin emergente
sometida a terapia incorporaran la modificacin que, de este modo,
podra propagarse hereditariamente a las generaciones siguientes
descendientes de ese linaje. De momento la terapia germinal no est
autorizada en ningn pas y todos los protocolos en marcha hasta el
momento en seres humanos son de terapia somtica[8]. Sin embargo,
como las consecuencias ticas y sociales de la aplicacin de estos dos
tipos de terapias son muy distintas el debate sobre la utilizacin futura
de la terapia germinal tiene una relevancia notable por lo que nos
ocuparemos de l, aunque brevemente, en la parte final del captulo.
 En cuanto a los mtodos de aplicacin hay que distinguir la terapia ex
vivo, cuando los genes se transfieren a clulas en cultivo extradas del
paciente que posteriormente son reincorporadas al organismo, y la
terapia in vivo, cuando los genes se transfieren directamente al
paciente[9], por ejemplo, a travs del torrente circulatorio. Una variante
de esta ltima es la modalidad de terapia in situ, si el tratamiento es
realizado directamente en el rgano afectado[10].

Desde un punto de vista terico se pueden concebir distintas

estrategias de terapia gnica dependiendo de los objetivos que se
persigan[11]. La ms comn y simple consiste en la insercin gnica, la
introduccin en las clulas tratadas de una copia de un gen normal. Esta
tcnica, conocida tambin como terapia de aumento gnico (GAT)por el
efecto que produce[12], se aplica a enfermedades recesivas en las cuales
no se produce el producto gnico normal. La introduccin de una copia
de la variante no mutada del gen persigue la produccin de la protena
funcional en una cantidad suficiente para restablecer el fenotipo
normal. En este procedimiento los genes recesivos mutantes no
interfieren con el producto gnico normal por lo que no es necesario
proceder a su eliminacin. La insercin gnica es especialmente apta
para enfermedades recesivas que no requieren una regulacin estricta
de la cantidad de producto gnico producido para que el fenotipo
normal pueda ser recuperado. Es por esto que es la tcnica de terapia
gnica ms empleada y prcticamente la nica ensayada en los
protocolos con clulas humanas afectadas por dolencias hereditarias.
Sin embargo, es inservible para la casi totalidad de enfermedades
producidas por genes de efecto dominante.

Una segunda modalidad, ms difcil desde el punto de vista tcnico,

es la correccin dirigida de mutaciones (gene targeting) mediante algn
procedimiento de modificacin o ciruga gnica que sustituya o bien el
gen defectuoso por una copia normal del mismo o tan slo sustituya la
secuencia mutada del gen por la secuencia normal, recomponindose de
este modo la funcin original del gen. El mecanismo concreto para
realizar esta sustitucin sera la recombinacin homloga[13], que ya ha
sido ensayada en ratones pero que debido a su dificultad y escasa
fiabilidad actual an no ha sido nunca ensayada en humanos. Tambin
sera posible realizar la correccin a nivel del ARN mediante el empleo
de ribozimas. De llegar a ser aplicada esta modalidad podran ser
tratadas enfermedades dominantes.

Existen otras estrategias de terapia gnica como la supresin dirigida

de clulas especficas insertando genes suicidas o genes estimuladores
de la respuesta inmune o la inhibicin dirigida de la expresin
gnica bloqueando el ADN, el ARN o la protena producida por el gen.
Existen diversos procedimientos posibles para conseguir este objetivo,
como puede ser el uso de ADN antisentido o la formacin de hlices
triples mediante el uso de oligonucletidos de ADN. Los mtodos
basados en la supresin de clulas ya se han ensayado para la
eliminacin de tumores cancerosos, mientras que los basados en la
inhibicin de la expresin gnica podran ser tiles para el tratamiento
de ciertos cnceres, algunas enfermedades infecciosas y para
enfermedades hereditarias de efecto dominante.

Con un catlogo tan grande de tcnicas de terapia gnica el espectro

de enfermedades que podran ser tratadas es tericamente bastante
amplio. Entre ellas se encuentran enfermedades infecciosas, cnceres,
enfermedades hereditarias recesivas y dominantes y trastornos del
sistema inmune, como alergias y enfermedades autoinmunes[14]. Sin
embargo, en la prctica, las dificultades para aplicar con xito la mayor
parte de las estrategias de terapia gnica son numerosas y los
resultados obtenidos hasta ahora han sido mucho ms modestos de lo
que en un principio se esperaba. Los problemas pueden surgir por la
naturaleza de enfermedad a tratar, por el tipo de tejido en el que se
localice la dolencia, por el mtodo empleado para transferir los genes a
las clulas o, tambin, por el nivel de control de la expresin gnica
necesario para que las clulas tratadas funcionen con normalidad.
Incluso, se han dado algunos casos de reacciones inmunitarias contra el
producto gnico normal producido por el gen introducido mediante
terapia que el organismo ha tratado como extrao.
3. Condiciones de aplicabilidad de la
terapia gnica
Aunque, como acabamos de ver, la terapia gnica tericamente
podra ser aplicable a enfermedades muy distintas, existen varios
factores que condicionan su aplicabilidad y que han reducido
enormemente las posibilidades concretas de actuacin.

El primero de estos factores hace referencia al tipo de herencia. En

general, las enfermedades mendelianas, determinadas por la accin de
un nico gen, son mejores candidatas que las enfermedades
multifactoriales que, adems de depender de la accin conjunta de
varios genes, estn influidas por factores ambientales. Una excepcin a
este criterio general lo constituye el cncer que, pese a que puede ser
catalogado como una enfermedad tpicamente multifactorial, ha sido
objeto en los ltimos aos del mayor nmero de protocolos de terapia
gnica.

El segundo factor a considerar es el patrn de herencia. Las

enfermedades recesivas son mejores candidatas a ser tratadas mediante
terapia gnica que las dominantes. En las primeras, debido a su carcter
recesivo, podra ser suficiente aadir una copia del gen sano para
recuperar el fenotipo normal, mientras que en las segundas esto no es
suficiente en la mayora de los casos y sera necesario recurrir a algn
tipo de modificacin dirigida del gen daado, lo que complica
enormemente las posibilidades de intervencin.

El tercer factor se refiere ms especficamente a la naturaleza de la

mutacin causante de la enfermedad. Por ejemplo, cuando la mutacin
es de prdida de funcin, es decir, el gen afectado deja de producir la
protena codificada por l o sta no es funcional, como es el caso de la
mayora de enfermedades recesivas, el defecto podra ser corregido por
terapia de aumento gnico, la ms sencilla de todas pues, en principio,
bastara con la introduccin de una copia normal del gen que produjese
la protena funcional para que la correccin se llevase a efecto. Por el
contrario, las mutaciones de ganancia de funcin, como la aparicin de
una nueva protena mutante o de un producto txico, que son
caractersticas de algunas dolencias dominantes, no pueden ser tratadas
aadiendo genes normales y necesitaran de otras estrategias ms
difciles de llevar a cabo, como el bloqueo especfico del gen mutado o
la correccin dirigida de la mutacin.

El cuarto factor a tener en cuenta es el control de la expresin

gnica. Aquellos genes que no necesitan un excesivo control de su
expresin, manteniendo un fenotipo funcional con niveles variables de
producto gnico, son los ms fciles de tratar. Por el contrario, cuando
la expresin gnica requiere un control estricto los problemas que se
presentan son mucho mayores. Este ha sido el caso, por ejemplo, del
tratamiento mediante terapia gnica de la enfermedad de los glbulos
rojos -talasemia. La expresin del gen de la -globina insertado
requiere, para curar la enfermedad, un control exacto de su
produccin, que debe ser igual al de la -globina. Esto es necesario para
que las molculas de hemoglobina resultantes, formadas por dos
cadenas proteicas de -globina y otras dos de -globina, desempeen su
funcin con normalidad. Esta necesidad de control de la expresin
gnica ha impedido hasta el momento la consecucin de progresos
significativos en la aplicacin de la terapia gnica a esta enfermedad
sangunea.

El quinto factor de importancia en la aplicabilidad de la terapia

gnica es el tamao del ADN codificante del gen a insertar. Los genes
con secuencias de pequeo tamao son siempre mejores candidatos,
mientras que los genes con un ADN codificante de gran tamao pueden
ser difciles de transferir al interior de las clulas debido a la dificultad
de encontrar vectores adecuados.

Por ltimo, la enfermedad ser ms fcilmente tratable si se

manifiesta en un tejido cuyas clulas puedan ser extradas, cultivadas
con facilidad in vitro, resistentes a la manipulacin y reintroducidas sin
dificultad en el organismo. Adems, sera deseable que fuesen clulas
de larga vida, a ser posible que permaneciesen durante toda la vida del
paciente. Las clulas que ms se aproximan a estas condiciones tisulares
son, sobre todo, las de la mdula sea, la piel y el hgado por lo que, en
principio seran las mejores candidatas.

El procedimiento estndar ms utilizado de terapia gnica sigue, de

modo muy esquemtico, los siguientes pasos[15]: 1) Identificacin,
aislamiento y amplificacin del gen que va a ser utilizado para el
tratamiento; 2) Extraccin y cultivo in vitro de las clulas del tejido del
paciente a tratar; 3) Transferencia del gen teraputico al interior de las
clulas mediante un vector. El gen transferido debe llevar alguna
secuencia promotora que permita su expresin y debe ir acompaado
tambin de algn marcador que permita identificar las clulas a las que
se ha incorporado el gen, por ejemplo, un gen de resistencia a algn
frmaco. De esta manera al ser expuesto el cultivo al frmaco en
cuestin, nicamente sobrevivirn aquellas clulas resistentes, es decir,
las que hayan incorporado el gen de resistencia y el gen teraputico
asociado al mismo. A continuacin se transfieren las clulas
seleccionadas con el gen incorporado al paciente a la espera de que
ejerzan su funcin fisiolgica normal lo que conllevara la eliminacin
de la patologa.

Uno de los pasos cruciales y que mayores problemas ha planteado

hasta ahora ha sido el de seleccionar el vector adecuado para la
transferencia gnica. Los principales tipos de vectores son virus
(retrovirus, adenovirus, virus adeno-asociados, herpes virus y lentivirus,
un familia particular de retrovirus), aunque tambin se han realizado
ensayos con liposomas, conjugados moleculares y con ADN desnudo[16].
El uso de virus como vectores en terapia gnica para introducir genes en
clulas se realiza destruyendo la actividad patognica del virus y su
capacidad de multiplicacin dentro de las clulas. Para ello, se eliminan
de su ADN los genes responsables de estas funciones, que son sustituidos
por los fragmentos de ADN teraputico que se desean transferir. Cada
tipo de vector presenta ventajas e inconvenientes distintos y hasta el
momento no se ha encontrado ninguno que resulte idneo[17]. Los
retrovirus y los adenovirus son los vectores que ms se han utilizado
hasta ahora y, debido al carcter no tcnico de esta exposicin, sern
los nicos sobre los que realizaremos un breve comentario.
 Los retrovirus presentan una eficacia alta de trasferencia gnica y
tienen la ventaja de que integran el ADN transferido en los cromosomas
de la clula tratada por lo que ofrecen estabilidad a largo plazo. Sin
embargo, presentan algunos inconvenientes de importancia. Los ms
destacados son que la integracin del ADN trasferido en los cromosomas
de la clula se realiza al azar por lo que podra interferir el
funcionamiento de un gen sano. Incluso podra llegar a transformar una
clula en cancerosa si la insercin se realiza en un protooncogen o en
un gen supresor de tumores. En segundo lugar, solamente pueden
transferir ADN a clulas que se dividan activamente por lo que no son
aptos para aquellos tejidos en los cuales las clulas habitualmente no se
dividen, como el tejido nervioso o el muscular. En tercer lugar, no
pueden ser utilizados para terapia in vivo ya que, normalmente, son
eliminados por el sistema inmune del complemento. Y, finalmente, el
ADN transferido no puede superar el tamao de 8 kb (8.000 nucletidos)
por lo que no sirven para transferir genes demasiado grandes.

Por su parte los adenovirus, virus que en estado natural provocan

resfriados comunes, tienen como principales ventajas que tambin
presentan una eficacia alta de transferencia gnica, pueden transportar
genes grandes, de hasta 35 kb, y pueden infectar clulas que no se
dividan. Adems, son aptos para realizar terapia in vivo, ya que pueden
transferirse directamente a los tejidos del paciente. Los principales
inconvenientes radican en que no integran el ADN en los cromosomas
por lo que su efecto no es duradero, ya que los genes se pierden cuando
las clulas se dividen. En algunos casos este problema podra
convertirse en una ventaja si el efecto que se pretende conseguir es
transitorio, como en el caso de algunos protocolos de terapia gnica
contra ciertos tipos de cnceres. Otro problema que presentan es que
suelen provocar una importante respuesta inflamatoria e inmunolgica,
que puede provocar complicaciones en el paciente. Adems, esta
respuesta inmunitaria reduce la eficacia de la terapia, al eliminar una
buena parte de los virus que se usan para la transfeccin.

Actualmente la cuestin de los vectores de transferencia de genes es

uno de los problemas tcnicos ms importantes que presenta la terapia
gnica y que hasta ahora ms ha limitado la obtencin de resultados
satisfactorios, hasta el punto de que hay investigadores que creen que
las estrategias futuras tendrn que cambiar sustancialmente: Casi con
toda seguridad, las herramientas del futuro no van a ser los prototipos
que se estn ensayando hoy en los laboratorios. Y no habr una tcnica
ideal para cada enfermedad, sino que existirn muchas opciones[18]

4. Pasado y presente de la terapia

gnica
El primer ensayo de terapia gnica realizado en humanos se remonta
a 1980, cuando Martin Cline realiz un intento de curacin mediante
este tcnica, sin autorizacin previa, de dos enfermos de talasemia[19].
El intento no tuvo xito y se sald con la prdida del puesto de trabajo
de Cline.

La aprobacin del primer protocolo clnico para un ensayo que

implicaba la insercin de un gen en un ser humano fue realizada en
enero de 1989. La solicitud fue presentada por los Dres. Anderson,
Blaese y Rosenberg y no era propiamente una terapia gnica[20]. En
septiembre de 1990, los mismos Blaese, Anderson y sus colaboradores
realizaron el primer ensayo clnico de terapia gnica con resultado
exitoso. La paciente era una nia de 4 aos con deficiencia en
adenosina desaminasa, una enfermedad recesiva muy rara que provoca
una inmunodeficiencia combinada grave[21]. El tratamiento consisti en
introducir el gen ADA en linfocitos T cultivados, extrados de la paciente
y reintegrarlos posteriormente a su organismo. Dado que los linfocitos
no son clulas madre y tienen una duracin temporal limitada se saba
que, an en el caso de que el ensayo tuviese xito, la curacin no sera
definitiva por lo que tendra que ser repetida a intervalos regulares.
Aunque los resultados fueron positivos y la nia pudo llevar desde
entonces una vida normal, el tratamiento hubo de ser repetido, primero
cada 1-2 meses y posteriormente cada 3-6 meses. Sin embargo, es difcil
hacer una evaluacin precisa del mismo ya que la paciente fue tratada
simultneamente con PEG-ADA, un frmaco que incluye la protena ADA
normal y que es utilizado en los tratamientos convencionales de esta
enfermedad[22]. Desde entonces ms de 3.000 pacientes han recibido
terapia gnica para diversas afecciones en todo el mundo.

En 1992, los ensayos aprobados incluan, adems de la transferencia

del gen ADA a linfocitos, las transferencias para seis genes distintos
ms, algunos de ellos relacionados con tumores[23]. En los ltimos aos
se han realizado ensayos para algunos trastornos hereditarios como la
fibrosis qustica, hipercolesterolemia familiar, enfermedad de Gaucher
y la distrofia muscular de Duchenne. Hasta agosto de 2000, haba
registrados en los Institutos Nacionales de la Salud de los Estados Unidos
431 ensayos de terapia gnica, de los cuales 393 (91 por ciento)
correspondan a los propios Estados Unidos y 38 (9 por ciento) al resto
del mundo[24]. De todos ellos, 271 (64 por ciento) estaban dedicados al
cncer, 33 (9 por ciento) al sida, 28 (7 por ciento) a enfermedades
cardiovasculares, 25 (6 por ciento) a fibrosis qustica y los 52 restantes a
otras enfermedades, ninguna de las cuales superaba por separado el 2
por ciento del total de ensayos[25].

Se observa en estos datos un predominio muy grande de los ensayos

dirigidos a tratar el cncer y, en bastante menor proporcin, al sida.
Diversos autores[26] coinciden en afirmar que las razones de esta
preponderancia de ensayos de terapia gnica sobre el cncer tienen
relacin con varios factores entre los que se cuentan, adems de la
gravedad del mismo, la mayor facilidad de tratamiento que otras
enfermedades mediante terapia gnica ya que siempre es ms fcil
programar una estrategia destructiva dirigida a la eliminacin de clulas
que otra constructiva encaminada a restaurar su correcto
funcionamiento, la gran experiencia existente en investigaciones sobre
tumores desde el punto de vista clnico, la elevada financiacin que
recibe la investigacin sobre el cncer y el inters de la industria
farmacutica sobre un problema que afecta a un gran nmero de
enfermos. Sin embargo, a pesar de todos estos esfuerzos, y como se
prevea debido a su complejidad, el cncer est revelndose como una
enfermedad difcil de corregir y los progresos han sido modestos[27].
 Hasta el da de hoy el nico caso registrado de curacin
(provisionalmente) definitiva mediante terapia gnica ha sido el
conseguido por Marina Cavazzana-Calvo y Alain Fischer en el hospital
Necker de Pars[28] al tratar a cinco nios aquejados de una
inmunodeficiencia combinada severa. A diferencia de otros casos
anteriores, en ste fueron cultivadas clulas madre extradas de su
mdula sea a las que se les insert, mediante un retrovirus, el gen
funcional. Las clulas fueron reinyectadas en el torrente sanguneo de
los pacientes cinco das despus. A los tres meses los nios tratados
haban recuperados sus defensas y cuatro de ellos pudieron volver a
vivir con sus familias sin ningn tratamiento adicional[29]. El hecho
novedoso de haber realizado el tratamiento sobre clulas madre
hematopoyticas y no sobre clulas ya diferenciadas ha permitido que
el efecto teraputico sea permanente, ya que la renovacin celular se
realiza a partir de las clulas madre corregidas mediante la terapia
gnica.

5. Problemas de la terapia gnica y de

sus aplicaciones
Pese a este logro, los avances en los ensayos de terapia gnica
realizados hasta ahora han sido limitados y los resultados bastante
modestos. Adems, en los ltimos tres aos se ha generado una cierta
sospecha sobre la seguridad de los ensayos realizados a raz de que en
1999 se hiciese pblica la noticia de la muerte de un paciente (Jesse
Gelsinger, de 18 aos), como consecuencia del tratamiento de terapia
gnica al que estaba sometido para intentar curar la deficiencia de la
ornitina transcarbamilasa que padeca[30]. Segn la investigacin oficial
realizada los investigadores ocultaron informacin crucial que hubiera
evitado el incidente [...]. Adems los cientficos haban ocultado a la
FDA que otros dos voluntarios sometidos previamente al mismo ensayo
haban sufrido unos efectos secundarios tan graves que, de haber sido
notificados, hubieran supuesto la inmediata suspensin del ensayo,
segn las normas acordadas con anterioridad por los cientficos de la
FDA[31].
 Con posterioridad a este caso, y como consecuencia de la alarma
desatada por el mismo, fueron hacindose pblicas otras noticias de
ocultamientos de problemas y de hasta nueve fallecimientos no
notificados[32]. La directora de la Oficina de Poltica Cientfica de
EE.UU. comunic que en 1999 se produjeron 1.070 sucesos adversos en
los ensayos, de los cuales slo se notificaron 39 a los NIH[33]. Parece ser
que en la mayora de estos casos de ocultamientos hay motivos
puramente econmicos. Los cientficos callan para no perder la
financiacin de las empresas farmacuticas, y stas a su vez exigen
silencio sobre sus productos[34]. De ser cierta esta relacin causal entre
el ocultamiento de resultados adversos (incluyendo riesgos graves para
las personas) e intereses empresariales estaramos en presencia de una
las consecuencias ms negativas que se pueden derivar de la presin de
los intereses econmicos privados sobre algunas investigaciones
biosanitarias potencialmente beneficiosas para la poblacin pero que,
en la prctica, se pueden convertir no solamente en perjudiciales por
sus consecuencias directas sobre los afectados, sino tambin por el
descrdito que ejercen sobre el conjunto de la investigacin en
gentica molecular humana. En este sentido la Sociedad Americana de
Terapia Gnica ha propuesto que los cientficos no deberan tener
responsabilidad en proyectos en los que tengan intereses econmicos[35].

Es por estos motivos que resulta necesario abordar los problemas de

la terapia gnica con transparencia y un estricto control sobre los
protocolos a ensayar, dejando a un lado el exceso de propaganda
triunfalista que, de forma interesada, ha caracterizado la informacin
pblica relacionada con la terapia gnica. Existe un amplio acuerdo
sobre que, si se toman las precauciones exigidas a todo nuevo
tratamiento teraputico en fase experimental, la terapia gnica
somtica no plantea problemas ticos distintos a otros tratamientos ms
convencionales[36], como pueden ser los trasplantes de rganos. Miguel
Moreno resume esta valoracin ampliamente compartida:

La terapia por transferencia gnica en tejidos somticos plantea cuestiones ticas

muy limitadas, puesto que el xito o el fracaso en el intento afectar slo al paciente
enfermo. El asunto entra dentro de las preocupaciones tpicas en torno a cualquier
tipo de experimentacin con humanos, exactamente dentro del clculo de beneficios y
 riesgos para el individuo. Existe unanimidad en exigir una evaluacin cuidadosa del
riesgo que implica el uso de vectores virales, incluyendo su capacidad para infectar las
lneas celulares del progenitor y el potencial dao colateral de la insercin.[37]

Los problemas denunciados hasta ahora, que han puesto en

entredicho la fiabilidad de la terapia gnica, estn relacionados
precisamente con la exigencia de evaluacin cuidadosa del riesgo
apuntada en la cita precedente, con la transparencia en la notificacin
de los resultados y con el necesario control por parte de las comisiones
cientficas y ticas de evaluacin. Siguiendo parcialmente a
Lacadena[38], podemos resumir las exigencias ticas actuales de la
terapia gnica somtica en los siguientes puntos: 1) La terapia gnica
slo debera ser aplicada para tratar pacientes con enfermedades
graves; 2) Debera intentarse solamente cuando no haya otras
alternativas teraputicas o cuando, habindolas, suponen un mayor
riesgo o una menor accin beneficiosa; 3) Su aplicacin a una
enfermedad humana debera requerir la evidencia de que es segura,
beneficiosa, tcnicamente posible y ticamente aceptable; 4) Con las
condiciones precedentes, la terapia gnica somtica para el tratamiento
de enfermedades graves puede considerarse aceptable ticamente
porque puede ser apoyada por los principios fundamentales de
autonoma, beneficencia y justicia.

En mi opinin es positivo que, pese a los problemas apuntados y con

las salvaguardas necesarias, la investigacin sobre la terapia gnica y
sus potencialidades teraputicas siga desarrollndose porque en el
futuro se pueden obtener resultados beneficiosos desde el punto de
vista sanitario para un cierto nmero de enfermedades, difcilmente
alcanzables por otras vas. Sin embargo, an aceptando plenamente esa
necesidad de desarrollo de la terapia gnica somtica, no est de ms
que nos preguntemos por qu se han exagerado sus posibilidades a corto
plazo y se han depositado en ella esperanzas excesivas o simplemente
infundadas. Este exceso de confianza no consiste solamente en una
creencia popular procedente de un desconocimiento de la verdadera
problemtica de la terapia gnica. La propia comunidad cientfica se ha
encargado de cultivar esa confianza en su capacidad teraputica
inminente. Ya hemos apuntado que uno de los motivos subyacentes
podra ser la necesidad de financiacin de los equipos de investigacin y
los intereses econmicos de las empresas que los sostienen. Pero
tambin existen razones de tipo ideolgico que refuerzan esta
tendencia a volcarse en la bsqueda de tratamientos genticos, en
algunos casos de dudosa utilidad, menospreciando o relegando al olvido
otras lneas de investigacin importantes.

En este sentido, hemos comentado en otro sitio cmo el peso de la

ideologa del determinismo biolgico predominante se pona de
manifiesto en las aplicaciones de los tests de diagnstico gentico y en
las estrategias de lucha contra el cncer, por ejemplo, en la poca
importancia relativa de los fondos dedicados a estudios epidemiolgicos
en comparacin con los destinados a estudios genticos[39]. Esta misma
tendencia a dar una importancia predominante a las investigaciones que
se orienten directamente a la accin sobre los genes se pone de
manifiesto en las expectativas depositadas en la terapia gnica, como si
siempre y en todo tipo de enfermedades esa accin teraputica fuese
ms eficaz que cualquier otra estrategia alternativa. De esta manera el
estudio de las causas no solamente genticas que propician la aparicin
de muchas enfermedades, y que podran contribuir a reducir su
incidencia es, en la prctica, menospreciada.

No debemos olvidar que cuando nos referimos a las causas de las

enfermedades, en la mayora de ellas los genes constituyen uno de los
elementos causales, pero rara vez son el nico. El caso de las
enfermedades multifactoriales, como el cncer, en el que interaccionan
de forma compleja genes y ambiente es el ms notorio. Pero incluso en
algunas enfermedades metablicas provocadas por la mutacin en un
nico gen los factores que influyen para que la enfermedad se
manifieste pueden ser variados. El caso de la fenilcetonuria es, sin
duda, el ms conocido. Esta dolencia es producida por un gen recesivo
que se expresa en los individuos homocigticos, que reciben ambos
genes de sus padres portadores sanos. Los individuos fenilcetonricos
son incapaces de metabolizar el aminocido fenilalanina y convertirlo
en tirosina. La fenilalanina se acumula en las clulas provocando
alteraciones, entre ellas retraso mental. Pero si desde el momento
mismo del nacimiento hasta el final del perodo de crecimiento se les
suministra una dieta casi carente en fenilalanina[40] y suplementada con
tirosina, el desarrollo puede ser normal.

Este caso ilustra cmo los factores internos (genes) y externos (la
dieta en esta ocasin) contribuyen a determinar el desarrollo o la
ausencia de la enfermedad. Existen otras dolencias genticas en las que
la accin de los genes resulta mucho ms influyente o, incluso,
completamente determinante. En la distrofia muscular de Duchenne o
en la enfermedad de Huntington, por citar dos casos bien conocidos, la
accin de los genes deletreos no puede ser contrarrestada mediante
otros tratamientos y la terapia gnica, en la medida en que llegue a ser
posible en el futuro, puede representar la nica esperanza de curacin
de las personas que las padezcan. Sin embargo, en otros casos la terapia
gnica, aunque llegase a ser posible, no tendra por qu ser siempre la
mejor estrategia a emplear, sobre todo si se trata de enfermedades
multifactoriales.

En primer lugar, porque la actuacin sobre los factores ambientales,

adems de eficaz, puede contribuir a una accin preventiva importante,
lo que reducira los casos en los que la enfermedad llegase a
desarrollarse. En segundo lugar, porque una vez manifestada la
enfermedad puede ser que otros tratamientos distintos de la terapia
gnica sean ms recomendables, aunque la enfermedad tenga una base
gentica bien establecida. Pero hoy en da, a pesar de su escaso
potencial teraputico actual, es habitual que los investigadores en
gentica humana se dirijan hacia la terapia gnica, incluso antes de
evaluar otras vas esperanzadoras ms convencionales. Este hecho fue
puesto de manifiesto en el informe encargado por Harold Varmus,
director de los NIH, a un comit ad hoc de catorce expertos en el que se
deca que los investigadores saltan inmediatamente, en algunos casos,
del descubrimiento del gen de una enfermedad a intentar una terapia
gnica, sin utilizar previamente el hallazgo como base de trabajo para
tratamientos ms convencionales[41].
 Este estado de cosas en relacin con las ilusiones despertadas por la
terapia gnica sera una manifestacin de lo que algunos autores han
llamado la genetizacin de la sociedad o la mistificacin de lo
gentico. Jacques Testart, uno de los ms crticos en este sentido,
considera que la terapia gnica aparece tal vez como
un bluff gigantesco, alimentado por el apetito econmico de los
industriales, por el orgullo de los investigadores, por la infelicidad de
las familias afectadas y, sobre todo, por el inmenso deseo de vencer al
destino por parte de todos los humanos[42]. La valoracin precedente,
pese a su dureza, contiene, a mi entender, elementos justos que
inciden en la orientacin de la que es deudora la investigacin en
gentica molecular humana en sus distintas reas de desarrollo, como
son el proyecto genoma humano que analizamos en el captulo anterior
y la terapia gnica que comentamos en ste. A pesar de esto, como ya
he apuntado, la terapia gnica somtica contiene potencialidades
teraputicas para combatir muchas causas de padecimiento humano en
forma de enfermedades de momento incurables, que sera absurdo
negar. Por ello, la investigacin en este campo y su aplicacin prudente
en ensayos clnicos bien controlados debe ser aceptada.

No ocurre lo mismo con la terapia gnica germinal. Aunque no es

posible en la extensin de este captulo que desarrollemos una discusin
sobre la misma, conviene que hagamos notar que presenta muchos ms
problemas que la terapia somtica y casi ninguna de sus ventajas
potenciales. Para las personas interesadas remito a mi ensayo O
pensamento euxensico na actualidade[43], en el que realizo un anlisis
crtico de la terapia gnica germinal y de la llamada ingeniera gentica
de mejoramiento. Me limitar pues a resumir muy brevemente mi punto
de vista sobre esta modalidad de terapia gnica.

Muchas de las crticas dirigidas a la terapia gnica germinal se

centran en que produce la modificacin permanente del patrimonio
gentico hereditario del linaje de las personas sometidas a la misma.
Aunque esto es cierto no me parece una razn suficiente para rechazar
la intervencin germinal desde un punto de vista moral, siempre y
cuando tenga una clara finalidad teraputica. Desde mi punto de vista,
la terapia germinal es rechazable porque los objetivos teraputicos que
pretende cubrir pueden ser logrados por otros medios, sin los peligros
que acompaaran al uso de esta tcnica. Entre estos otros medios
podra incluirse la terapia gnica somtica que ya hemos comentado.

Frente a esta ltima, los defensores de la terapia germinal suelen

argumentar que los efectos teraputicos de la terapia somtica no
pueden ser transmitidos a los descendientes de la persona tratada,
objetivo que s podra lograrse con la terapia germinal, si sta
funcionase correctamente. Pero, incluso en este ltimo supuesto, la
seleccin de embriones obtenidos mediante fecundacin in vitro, previo
diagnstico preimplantatorio de los mismos, cubre prcticamente todos
los supuestos (salvo algunas excepciones muy raras) en los que sera de
aplicacin la terapia germinal, sin las dificultades tcnicas y los riesgos
iatrognicos asociados al uso de la misma. Tngase en cuenta que la
aplicacin de la terapia germinal tambin hara necesario el diagnstico
preimplantatorio de los embriones (o en su caso de los vulos), para
detectar aqullos portadores del gen deletreo que debe ser corregido
mediante la terapia. Siempre ser ms sencillo seleccionar los
embriones sanos que intentar modificar los genes de los embriones
portadores de la enfermedad. No existen, pues, justificaciones
teraputicas para optar por la terapia germinal, aceptando los peligros
asociados a la misma, ya que no aporta ninguna ventaja suplementaria a
las posibilidades de las tcnicas que ya existen.

Si el objetivo fuese realizar ingeniera gentica de mejoramiento,

introduciendo alguna caracterstica gentica nueva antes no presente,
como la resistencia gentica a algn agente infeccioso (como el VIH), la
intervencin germinal s sera la nica forma de lograrlo. Pero en este
caso ya no estamos en presencia de una intervencin teraputica y,
aunque no forma parte de los objetivos de esta discusin, los problemas
ticos y sociales asociados a este tipo de intervencin, que podramos
etiquetar como propiamente eugensica, en mi opinin hacen
rechazable el recurso a la misma[44].

6. Conclusin
 La terapia gnica somtica comenz a principios de los aos 90 del
siglo que acaba de terminar con unas enormes expectativas, que en el
trascurso de los aos siguientes se vieron parcialmente defraudadas
debido a las dificultades y problemas que impidieron el logro de avances
significativos. Parte de estas expectativas fueron potenciadas por los
intereses de los propios grupos de investigacin, necesitados de
encontrar fuentes de financiacin para sus ensayos. Esas mismas
necesidades llevaron en algunas ocasiones a realizar protocolos de
investigacin con pocas garantas, en los que se ocultaron a los
organismos responsables de su control algunos de los resultados
adversos que se produjeron. Esta situacin lleg a provocar una crisis de
confianza en los ensayos de terapia gnica cuando se dio a conocer que
se haba ocultado la muerte de una persona como consecuencia del
tratamiento al que haba sido sometida.

Pese a estos problemas las tcnicas de terapia gnica somtica se han

ido desarrollando y siguen siendo una va muy prometedora, aunque no
tan inminente como en un principio se pensaba, para la lucha contra un
buen nmero de enfermedades genticas.

Existe un amplio acuerdo sobre la idea de que la terapia gnica

somtica no plantea problemas ticos distintos de los de cualquier otro
tratamiento teraputico nuevo en fase experimental. Pero se considera
muy necesario, sobre todo a la luz de las experiencias negativas
ocurridas, que los protocolos que se pongan en prctica se desarrollen
con mucha prudencia y con un control estricto por parte de las
comisiones cientficas y ticas destinadas a tal fin. Asimismo, es
necesario que los intereses econmicos de las empresas privadas con
inversiones en este campo no interfieran negativamente en lo que debe
ser una buena y segura prctica de experimentacin clnica.

Por lo que se refiere a la terapia germinal, resulta rechazable porque

sus supuestas ventajas no compensan los peligros asociados a la misma,
toda vez que existen alternativas teraputicas con el mismo potencial y
que no comportan los mismos riesgos. nicamente en la perspectiva de
una ingeniera gentica de mejoramiento humano, que nosotros
rechazamos, tendra sentido la modificacin gentica de las clulas
germinales.

[1]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, Arbor, CLXVIII, 662 (Febrero de 2001),
p. 255.

[2]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica,

1999, http://www.cnice.es/tematicas/genetica/1999_04_01.html, p. 1.

[3]. Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas y clonacin,
Septiembre de 1997. (en este sitio web)

[4]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, Ediciones Omega, S. A., Barcelona, 1999,
p. 591.

[5]. El Pas, 28 de Abril de 2000, p. 38.

[6]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 617.

[7]. Carlos Alonso BEDATE, Terapia gentica, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Gentica Humana.
Fundamentos para el estudio de los efectos sociales de las investigaciones sobre el genoma humano, Ctedra de
Derecho y Genoma Humano, Fundacin BBV-Diputacin Foral de Bizkaia, Universidad de Deusto, Bilbao, 1995, pp.
260-261.

[8]. Para una revisin sobre la regulacin jurdica de la terapia gnica, tanto somtica como germinal, en
Europa vase Herman NYS, Terapia gnica humana, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Biotecnologa y
Derecho. Perspectivas en Derecho Comparado, Ctedra de Derecho y Genoma Humano-Editorial Comares, S. L.,
Granada, 1998, pp. 89-98; la legislacin espaola es revisada por Amelia MARTN URANGA, El marco legal de la
terapia gnica en Espaa, en Carlos Mara ROMEO CASABONA (Ed.), Biotecnologa y Derecho. Perspectivas en
Derecho Comparado, op. cit., pp. 112-113.

[9]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 599.

[10]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 2.

[11]. David SUZUKI y Peter KNUDTSON, Gentica. Conflictos entre la ingeniera gentica y los valores humanos,
Editorial Tecnos, S. A., Madrid, 1991, pp. 163-164.

[12]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 597.

[13]. Ibid., pp. 577-578.

[14]. Ibid., p. 596.

 [15]. Lydia FEITO GRANDE, El sueo de lo posible. Biotica y terapia gnica, Universidad Pontificia Comillas,
Madrid, 1999, pp. 105-111.

[16]. Philip L. FELGNER, Terapia gnica sin virus, Investigacin y Ciencia, n 251, Agosto de 1997, pp. 52-57.

[17]. Theodore FRIEDMANN, Problemas de la terapia gnica, Investigacin y Ciencia, n 251, Agosto de 1997,
pp. 44-50.

[18]. Ibid., p. 49.

[19]. Bertrand JORDAN, Los impostores de la gentica, Ediciones Pennsula, S. A., Barcelona, 2001, p. 94.

[20]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 1.

[21]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 617.

[22]. Ibid., p. 619.

[23]. Carlos Alonso BEDATE, Terapia gentica, op. cit., p. 260.

[24]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, op. cit., pp. 266-267.

[25]. Ibid., p. 269.

[26]. Tom STRACHAN y Andrew P. READ, Gentica molecular humana, op. cit., p. 621; Robert MANARANCHE,
Terapia gnica, en Jean-Franois MATTEI (Coord.), El Genoma Humano, Editorial Complutense, S. A., Madrid, p.
96.

[27]. Fernando LARCHER et al, La terapia gnica ante el nuevo milenio, op. cit., p. 270.

[28]. M. CAVAZZANA-CALVO et al., Gene therapy of human severe combined immunodeficiency (SCID)X1
disease, Science, 2000, 288: 669-672.

[29]. Robert MANARANCHE, Terapia gnica, op. cit., pp. 105-108.

[30]. El Pas, 9 de Diciembre de 1999.

[31]. Ibid.

[32]. El Pas, 19 de Febrero de 2000.

[33]. El Pas, 4 de Marzo de 2000.

[34]. El Pas, 12 de febrero de 2000.

 [35]. Alain FISCHER, Lmites y esperanzas de la terapia gnica, Eidon, Febrero / Mayo 2001, n 6, p. 19.

[36]. Lydia FEITO GRANDE, El sueo de lo posible. Biotica y terapia gnica, op. cit., p. 344; Edward M. BERGER y
Bernard GERT, tica de la terapia gnica, Perspectivas bioticas 1999, vol. 4 (7-8), pp. 30.

[37]. Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas y
clonacin, op. cit., p. 11.

[38]. Juan Ramn LACADENA, Terapia gnica, op. cit., p. 1.

[39]. Vase la cita 35 del captulo anterior.

[40]. La fenilalanina es uno de los aminocidos esenciales y, por lo tanto, debe estar presente en la dieta,
incluida la de las personas fenilcetonricas. La dieta adecuada para ellas no carece por completo de este
aminocido sino que debe encontrarse en las cantidades mnimas, imprescindibles para la formacin de las
protenas, pero suficientemente bajas para evitar su acumulacin perjudicial.

[41]. Citado por Miguel MORENO, Modelos y presupuestos en la divulgacin de los avances en terapias gnicas
y clonacin, op. cit., p. 15.

[42]. Jacques TESTART, Homens provveis. Da procriaao aleatria reproduao normativa, Instituto Piaget,
Lisboa, 2000, p. 41.

[43]. Daniel SOUTULLO, Sobre clons e xenes. Ensaios sobre as implicacins sociais da Bioloxa, Edicins
Laiovento, Santiago de Compostela, 2001, pp. 179-202.

[44]. Ibid., pp. 196-202.

Juan Jos Oliva

Se acaba de graduar como licenciado en Biologa por la Universidad de Granada

NDICE

1. Introduccin

1.1 Concepto de terapia gnica

1.2 Objetivos globales de la terapia gnica

2. Desarrollo de la terapia gnica

2.1 Genes ajenos integrados en el cromosoma del animal receptor

2.2 Los transgenes pueden ser regulados por los pratones de tejido especfico

2.3 La expresin transgnica puede ser dirigida a tejidos especficos

2.4 Transgenes utilizados para matar tipos celulares especficos

2.5 Los retrovirus pueden ser utilizados para esbozar linajes celulares

3. Definicin de vector

4. Vectores virales

4.1 Retrovirus

4.2 Adenovirus

4.3 Virus adenoasociados

4.4 Herpesvirus

5. Vectores no virales

5.1 Bombardeo de partculas

5.2 Inyeccin directa de ADN

5.3 Liposomas catinicos

5.4 Transferencia de genes mediante receptores

6. Diseo de vectores

6.1 Retrovirus

6.2 Adenovirus

6.3 Virus adenoasociados

6.4 Herpesvirus

7. Produccin de vectores

7.1 Retrovirus

7.2 Adenovirus
7.3 Virus adenoasociados

8. Eficacia del vector

8.1 Estudios in vitro

8.2 Estudios en animales

1. INTRODUCCION
1.1 CONCEPTO DE TERAPIA GENICA.

El concepto de terapia gnica podemos abordarlo desde diferentes deficiones

como son:

" Es la introduccin de material exgeno (natural o recombinante) en sujetos

humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el nivel fenotpico."

Es una estrategia terapetica basada en la modificacin del repertorio gentico de

clulas somticas mediante la administracin de cidos nucleicos y destinada a curar
tanto enfermedades de origen hereditario como adquirido. "

" Es la transferencia de material gentico nuevo a clulas de un individuo dando lugar

a un beneficio terapetico para el mismo. "

Aunque estas deficiones rozan lo meramente descriptivo, la terapia gnica

engloba un amplio rango de posibilidades que no pueden ser incluidas en una
descripcin tan general.

Actualmente el trmino terapia gnica se ha visto "aumentado" con el tiempo

hasta incluir transferencias gnicas de naturaleza preventiva y aquellas que
contribuyen al avance de la investigacin mdica. Lo cual roza mucho con
confusiones al respecto del trmino que inicialmente se le dio . Cabra
preguntarnos si la terapia gnica dista mucho ms de la expresin de "
intervenciones estrictamente terapeticas en el ser humano ", ya que la
controversia del trmino nos lleva a pensar cosas totalmente distintas. En el
transcurso de este trabajo iremos perfilando ideas sobre la problemtica que
rodea a dicho concepto.
As se lleva a pensar desde diversos colectivos de expertos en biotica, medicos ,
etc , que el trmino de terapia gnica debera sufrir nuevas modificaciones:

1. Desde un punto de vista biolgico, deberiamos hablar de transferencia gnica

,puede ser tanto en lnea germinal como en lnea somtica.
2. Atendiendo a sus objetivos, tendriamos que hablar de transferencia gnica:
a. Con finalidad mdica tanto en prevencin, investigacin , diagnstico
clnico y terapia.
b. Con finalidad no mdica para su uso en ingeniera gentica orientada a la
mejora de caractersticas o a la eugenesia.

En cuanto a todas las ideas y puntos de vista que rpidamente surgen al conocer
estas nuevas definiciones, las trataremos ms profundamente en diversos
apartados.

1.2 OBJETIVOS GLOBALES DE LA TERAPIA GENICA.

La terapia gnica se presenta como una promesa terapetica de utilidad en todo

tipo de patologas, la cual probablemente revolucionar nuestra concepcin de la
medicina. El surgimiento de la terapia gnica ha sido posible gracias a la
confluencia de los avances del conocimiento en campos tales como: Biologa
Molecular, Gentica , Virologa, Bioqumica, y Biofsica entre otras.

El estudio conjunto de todas estas ciencias pretende dar respuesta a las

siguientes preguntas:

Cul es la naturaleza del producto gnico? Es un cido nucleico? Es una protena? Si

es as, Es secretada , donde se localiza, cunta cantidad se requiere, y durante
cunto tiempo?

Cul es el tejido diana? Es un tipo particular de clula? Es una clula fcilmente

accesible? El estado de la enfermedad la deja ms o menos accesible?

Est la clula en divisin o no ?

Es posible el tratamiento in vivo o ex vivo? Esto es, Pueden las clulas ser
separadas y tratadas ex vivo, como en todos los primeros protocolos o pueden , o
deben, ser tratadas in situ? Si las clulas son tratadas ex vivo, Sern readministradas
como un neorgano separado o sern colocadas en su localizacin normal? Si es un
neorgano, Comprender clulas de la misma o de distinta especie?

Es requerida la expresin del gen de forma temporal o permanente? Ser la clula

devuelta tratada? Eliminar la clula tratada una aplicacin acertada?

Es necesario el tratamiento de todas las clulas en un rgano o tejido? Habr un

efecto permanente? Tendrn las clulas tratadas una ventaja selectiva ?
Desde estas simples consideraciones, se sigue que los requerimientos para
cualquier aplicacin varian en gran manera e influirn profundamente en la
eleccin de un vector para ser desarrollado y testado. Los factores que
requerirn ser testados incluyen la eficacia de la transferencia del gen , la
duracin de la expresin del gen, la capacidad para repartir la dosificacin, y la
capacidad para dirigirse a las clulas apropiadas y evitar las inapropiadas. Los
factores desconcertantes que puedan aparecer, incluyen la incapacidad del
vector para entrar o integrarse en los cromosomas celulares, el cierre de los
promotores transcripcionales, la prdida del ADN introducido, la destruccin de
las clulas tratadas y la neutralizacin del vector insertado o del producto
gnico. Todos estos factores dependern fuertemente de la eleccin del vector y
de la capacidad del hospedador para responder a dicho vector.

2. DESARROLLO DE LA TERAPIA
GENICA.
Determinados descubrimientos en el campo de la Biologa Molecular han hecho
posible el desarrollo de la terapia gnica.

Los primeros experimentos surgieron en la introduccin de genes en levadura y

clulas de mamfero en cultivo tisular. El reto estaba en qu habra que hacer si
quisieramos estudiar el control gentico del desarrollo de un organismo superior,
donde las interacciones celulares juegan un papel crucial.

2.1 GENES AJENOS INTEGRADOS EN EL CROMOSOMA DEL ANIMAL

RECEPTOR.

Los primeros animales superiores en que se utilizaron estas tcnicas fueron

ratones. Estos experimentos se basaban en las tcnicas del ADN recombinante. El
ADN ajeno o extrao era inyectado en embriones tempranos y era incorporado a
los cromosomas de algunas clulas embrionarias y mantenidos en ellos , con su
consiguiente proliferacin y diferenciacin en clulas tisulares adultas . Tambin
se hicieron experimentos en los que el ADN ajeno poda integrarse en la lnea
germinal. Una vez que la clonacin de genes fue posible se poda microinyectar
en embriones tempranos de ratn el ADN deseado.

La mejor tcnica era aquella en la que se microinyectaban genes clonados en un

vulo fertilizado con dos proncleos, uno masculino y otro femenino que sern
los que darn lugar al ncleo del embrin unicelular. Cientos de copias del ADN
extrao disueltos eran inyectados directamente en uno de los dos proncleos y
despus el embrin inyectado sera transferido al tero de la madre adoptiva, y
se espera que finalice el desarrollo embrionario.
El porcentaje de zigotos que sobrevivieron a la manipulacin y el desarrollo
variaban entre el 10-30% . De los supervivientes el nmero de individuos que
presentaban ADN extrao en sus cromosomas era del 2-40% . El ADN extrao
apareca integrado al azar sin preferencia por un lugar concreto en los
cromosomas .

A estos ratones se les llam ratones transgnicos, y al ADN inoculado se le

llam transgn .

Se supo que el ADN inyectado poda ser estable tanto en clulas somticas como
germinales.

En ratones derivados de embriones inyectados con ADN de interfern humano

clonado o con ADN de la beta-globina del conejo, se vio que transmitan estos
transgenes a su descendencia como un rasgo mendeliano, junto a sus dems
genes.

Todos los ratones derivados de un nico progenitor forma una lnea de

ratones en la que cada miembro posea los mismos transgenes y en la misma
posicin del genoma. Lo que posteriormente se intent conocer o determinar es
que si esos transgenes adquiridos se expresaban, y en ese caso, si su expresin
est apropiadamente regulada . Estos experimentos se llevaron a cabo ms
adelante con clulas totipotenciales ( en clulas embrionarias del blastocito del
ratn ), las cuales se podan cultivar en un cultivo tisular pero manteniendo
intacta su capacidad de diferenciacin. A estas clulas se les introduca el ADN
deseado por transfeccin plasmdica o por infeccin retroviral. Estas clulas
transgnicas se inoculaban en el tejido diana, en el cual por sus condiciones
caractersticas podan diferenciarse a clulas del tipo de tejido en el que se
encontraba pero transportando en su interior los neogenes.

Como las clulas totipotenciales pueden ser manipuladas in vitro antes de

inyectarlas en el embrin, los genetistas de ratones podan utilizar la
recombinacin homloga para producir ratones transgnicos con mutaciones en
genes especficos o reemplazar genes mutados por su equivalente normal.

2.2 LOS TRANSGENES PUEDEN SER REGULADOS POR PATRONES DE

TEJIDO ESPECFICO

Aunque un transgn integrado en una localizacin cromosmica distinta a la de

su duplicado endgeno, normalmente se expresa,de manera que mimetiza la
expresin del gen endgeno.
2.3 LA EXPRESION TRANSGENICA PUEDE SER DIRIGIDA A TEJIDOS
ESPECIFICOS

El ARN codificado para la insulina humana puede ser diferenciado fcilmente del
ARN trranscrito por los genes de la insulina del ratn. Cuando ratones
transgnicos del gen de la insulina humana eran analizados, el ARN de la insulina
humana slo se encontraba en el pncreas y no en otros tejidos. Esto significa
que la transcripcin de los transgenes de la insulina humana era inducida por las
mismas seales que inducan a los genes endgenos de la insulina del ratn, es
decir, que responde a lasmismas seales reguladoras que los genes endgenos.

Los transgenes pueden interrumpir la funcin de los genes endgenos, pero en

muy raras ocasiones. Los transgenes interrumpen esas funciones de genes
endgenos cuyo producto es requerido para una embriognesis normal. Las
anormalidades resultantes nos pueden dar pistas sobre el proceso del desarrollo a
partir de los genes cuya funcin se ha interrumpido. Una lneas de ratones
transgnicos (S) fue creada usando una molcula de ARN recombinante
comprimida de un virus del tumor de mamas del ratn (MMTV) , LTR y con el gen
c-myc de ratn. Cuando el ratn heterozigtico se reproduca algunos de sus
descendientes tenan anormalidades en los miembros anteriores y posteriores.
Esto demostr que hubo cosegregacin de la zona MMTV-myc y confirm que la
integracin del transgn da al gen endgeno. El fenotipo de los ratones
homozigticos se asemejaba a una conocida mutacin de un locus
llamado ld para la deformacin de los miembros, luego encontraron alelos para
el locus ld a los que se les llam ld"Hd" (Harvard).

La localizacin cromosmica de la insercin de ld"Hd" fue determinada y

comparada con la ld. El ADN integrado con MMTV-myc era usado como etiqueta
para clonar ADN de la regin de insercin de la regin ld"Hd". Luego, se vio que
descendientes ld/ld"Hd" tenan deformidades idnticas a los de ld"Hd"/ld"Hd", lo
que demostraba que los dos loci eran allicos.

De este modo, la insercin transgnica puede ser utilizada no solo para la

identificacin sino para clonar genes importantes para el desarrollo.

2.4 TRANSGENES UTILIZADOS PARA MATAR TIPOS CELULARES

ESPECIFICOS

La introduccin de genes en tipos celulares especficos es una poderosa

herramienta para estudiar el desarrollo del ratn. En otro tipo de experimentos,
el opern para un gen expresado en una clula diferenciada especfica es usado
para restringir la expresin de un gen de una toxina exclusiva a esa clula. Solo
el tipo celular especfico es matado, y los efectos de la ausencia de estas clulas
en el desarrollo del ratn pueden ser analizados. Por ejemplo, el gen para la
elastasa 1 se expresa slo en el pncreas exocrino, y sus secuencias reguladoras
son usadas directamente en la expresin de la cadena de la toxina diftrica A, en
esas clulas. Veinticinco ratones transgnicos eran obtenidos, y siete de ellos
carecan de un pncreas normal. Por microscpio se descubri que algunos
ratones posean un pncreas rudimentario en el que la parte exocrina era
altamente anormal.

Experimentos similares de ablacin celular se han hecho usando otras secuencias

promotoras. Las del gen del cristalino ( lente proteca ) han sido utilizadas en la
expresin directa de la cadena de la toxina diftrica en clulas de la lente del
ojo en desarrollo.

Una dificultad en esta aproximacin, es que el gen de la toxina es activado tan

pronto como la clula activa al gen endgeno. Si esto ocurre tempranamente en
el desarrollo, la ablacin de algunas lneas celulares poda ser letal para el
desarrollo. En cambio, un sistema inducible para una muerte selecitva de clulas
se ha descubierto al unir el gen de la timidina quinasa del herpesvirus1 (tk), a
secuencias promotoras de iniciacin de clulas especficas. Las clulas que
contengan ese transgn no se mueren hasta que se les aaden los nuclesidos
sintticos. Los nuclesidos no son txicos, pero la tk del herpesvirus metaboliza
esos nuclesidos en productos que matan a clulas en divisin.

La siguiente tcnica ha sido utilizada para determinar la relacin de linaje en la

pituitaria anterior. Se cree que las clulas que sintetizan prolactina derivan de
una clula precursora que sintetiza hormona del crecimiento (HC). Las clulas
productoras de HC y las de prolactina de la pituitaria anterior eran utilizadas
como clulas diana en ratones transgnicos usando tk con ambas sustancias.

Seguido a la inyeccin de los nuclesidos sintticos, animales con promotores HC

unidos a transgenes tk, crecan formas enanas y carecan de clulas
sintetizadoras de HC y de las que sintetizan prolactina, pero a los que tenan
transgenes prolactina-tk eran normales. La primera conclusin de este estudio es
que las clulas formadoras de prolactina no se dividan, ya que si lo hiciesen
moriran por los nuclesidos metabolizados. La segunda es que las clulas
formadoras de HC deban ser las precursoras de ambos tipos de clulas, ya que el
ratn donde se mataron las clulas formadoras de HC, perdi sus clulas
formadoras de prolactina.

2.5 LOS RETROVIRUS PUEDEN SER UTILIZADOS PARA ESBOZAR LINAJES

CELULARES

Los estudios de linajes celulares han sido realizados por introduccin de

marcadores gnicos en ratones recin nacidos. Los retrovirus son vectores
eficientes en transportar genes a las clulas. Los virus Moloney Murine-Leukemia
recombinantes han sido fabricados sustituyendo sus genes gag, pol y env por el
gen lacZ de E. coli. Clulas que contengan este virus recombinante integrado en
su ADN pueden ser identificadas por microscopio por tincin. El objetivo de estos
experimentos es liberar al marcador vrico a una zona particular en un embrin o
animal joven, infectando as un nmero limitado de clulas. De cada clula
infectada se obtiene un clon de clulas que contenga el marcador vrico
integrado.

Las distribuciones y tipos de clulas teidas del clonado proporciona informacin

del linaje celular que tienen con las clulas de las cual se ha obtenido. Esto se ha
hecho particularmente en estudios del desarrollo de la retina. El marcador vrico
se inyecta entre la retina y el epitelio pigmentado en el da del nacimiento o en
los siete das desps del nacimiento. Seis semanas despus se hacan secciones
tisulares que se tean con X-gal (azul) , y se vio que una pequea cantidad de
virus formaba agrupaciones de clulas teidas de azul, y que eran las que
procedan de una sola clula infectada.

Podemos sealar que algunos clones tenan ms de un tipo celular, demostrando

as que un nico precursor puede dar distintos tipos celulares. Hay algunos
problemas con esta tcnica. Por ejemplo, algunas clulas que llevan marcadores
vricos puede que no expresen la beta-galactosidasa y el virus no puede ser
encauzado a una clula en particular.

Hay mtodos alternativos, que incluyen inyeccin directa de marcadores con

dextranos fluorescentes, lo que se ha hecho con Xenopus, y que es difcil hacerlo
en embriones de mamferos.

Todos estos experimentos en ratones estn encauzados para la futura aplicacin

de la terapia gnica en humanos. Por todo ello son una base indispensable para
el desarrollo de futuras iniciativas en terapia gnica y para contraste de
resultados y pruebas de inminentes proyectos.

3. DEFINICION DE VECTOR
Los vectores son sistemas que ayudan en el proceso de transferencia de un gen
exgeno a la clula, facilitando la entrada y biodisponibilidad intracelular del
mismo, de tal modo que este pueda funcionar correctamente. Se han utilizado
una gran variedad de vectores con fines experimentales, pero todos ellos pueden
ser clasificados en: vectores virales y vectores no virales.

4. VECTORES VIRALES
En este anlisis, consideramos los sistemas de vectores basados en cuatro grupos
de virus diferentes: retrovirus, adenovirus, virus adenoasociados y herpesvirus.
De manera clara, los virus pueden ser utilizados como vectores en la terapia
gnica, al menos bajo circunstancias ideales. La pregunta que debe ser
contestada es, qu barreras hacen posibles en el presente que limiten la
asplicacin de estos vectores vricos?

4.1 RETROVIRUS

Los retrovirus comprenden una gran clase de virus desarrollados que contienen
ARN de cadena sencilla como genoma viral. Durante el ciclo de vida vrico
normal, el ARN vrico se transcribe a la inversa para producir ADN de cadena
doble (gracias a la accin del enzima reversotranscriptasa) que se integra en el
genoma de la clula hospedadora y se expresa en perodos prolongados. Como
resultado, las clulas infectadas vierten virus de forma constante sin dao
aparente en la clula hospedadora. El genoma viral es pequeo
(aproximadamente 10 kilobases) , y su organizacin prototpica es muy sencilla,
comprendiendo tres genes que codifican:

gag, el grupo especfico de antgenos, protena de la cpsida y de la matriz sin

actividad enzimtica.

pol , la transcriptasa inversa, proteasa e integrasa.

env , protenas de la envuelta del virus (transmenbrana y superficial).

Los extremos del genoma cuando ya es ADN son llamados LTRs, ( long terminal
repeats) e incluye actividades promotoras incrementadoras y secuencias
involucradas en la integracin.

El genoma tambin incluye una secuencia necesaria para el empaquetamiento

del ARN vrico, otras secuencias para el corte y empalme entre donador y
aceptor y para la generacin de ARNs mensajeros envueltos de forma separada.

De forma importante, la mayora de los retrovirus se pueden integrar slo en

clulas que se replican, aunque el virus de la inmunodeficiencia humana (HIV)
parece ser una excepcin. Esta propiedad, poseida por la mayora de los
retrovirus, restringe claramente su uso como vector para la terapia gnica.

Los retrovirus han sido estudiados de forma intensa en los ltimos veinte aos, en
parte porque una categora de retrovirus causa tumores en animales. Esta
capacidad de causar tumores y trasnsformar las propiedades de desarrollo de las
clulas en un cultivo, se entiende bien ahora, y est basada al menos en dos
mecanismos bsicos:

El primero es que ciertos virus han incorporado protooncogenes activados que por una
mutacin han adquirido la capacidad de transformar el desarrollo celular. La habilidad
del retrovirus para transformar clulas por este mecanismo no es asunto de
 importancia en la terapia gnica, porque los oncogenes son siempre suprimidos de los
vector.

El segundo mecanismo de transformacin por retrovirus, resulta de una mutagnesis

insercional sobre la integracin de un genoma vrico. Debido a que el LTR vrico tiene
actividad promotora e incrementadora y est presente en ambos finales del genoma,
la insercin de una secuencia de LTR adyacente a un protooncogn celular puede
llevar a una expresin inapropiada de una protena involucrada en la regulacin
celular. Este mecanismo fue estudiado extensamente en la activacin del gen c-my
por el virus de la leucosis aviar (ALV).

Si los vectores retrovricos para la terapia gnica se integran en el genoma

humano de forma aleatoria , la mutagnesis insercional ocurrir con cierta
frecuencia. Esto podra llevar a la activacin del protooncogn o a la ruptura de
un gen supresor de tumores. En la prctica, de cualquier forma, los hechos
adversos atribuidos a la mutagnesis insercional son extremadamente bajos,
quizs reflejando la observacin de que la mayora del genoma humano no est
codificado y esa transformacin oncognica lleva consigo normalmente muchos
hechos mutagnicos.

Esencialmente. los vectores de retrovirus son relativamente simples, conteniendo

en los extremos 5' y 3' secuencias LTR, una secuencia de empaquetamiento y una
unidad de transcripcin compuesta por el gen o genes de inters. Para
desarrollar este vector, se deben suministrar las funciones perdidas del virus en
"trans" usando la as llamada lnea de clulas envase. Esta clula est creada
para contener copias integradas de los genes gag-pol-env, pero no la seal de
empaquetamiento, as las secuencias del virus ayudante no llegan a ser
empaquetadas. Rasgos adicionales aadidos o quitados del vector o la lnea de
clula envase reflejan intentos de hacer los vectores ms eficaces o reducir la
posibilidad de contaminacin del virus ayudante.

La principal ventaja de los vectores de retrovirus es que se integran y son

capaces, potencialmente, de una expresin a largo plazo. Pueden ser
desarrollados en cantidades relativamente grandes, pero hay que tener
precaucin para asegurar la ausencia del virus ayudante.

El rango de hospedadores del vector puede ser manipulado, pero su aplicacin a

clulas que se replican es limitada. Todava quedan dudas acerca de la
posibilidad de la mutagnesis insercional.

4.2 ADENOVIRUS

Los adenovirus comprenden una gran clase de virus no desarrollados que

contienen ADN lineal de cadena doble. El ciclo de vida normal del virus requiere
la divisin de clulas y lleva consigo una infeccin productiva en clulas
tolerantes durante la cual grandes cantidades de virus se acumulan en el ncleo.
El ciclo de infeccin productiva lleva cerca de 32 a 36 horas en el cultivo celular
y comprende dos fases, la primera, la ms importante para la sntesis del ADN, la
segunda, durante la cual las protenas estructurales y el ADN vrico son
sintetizados y ensamblados en viriones. En general, las infecciones de adenovirus
estn asociadas con enfermedades benignas en humanos.

El genoma del adenovirus es ms grande ( sobre 35 kilobases ), y su organizacin

es ms compleja que la de retrovirus. De las cuatro primeras unidades
transcripcionales, cada una tiene un promotor separado , y codifica ARN
mensajero empalmados de varias formas. La ltima unidad transcrita codifica
protenas requeridas para la formacin del virus. La transcripcin es secuencial
en la que los genes E1 se expresan pronto, y en parte activan la transcripcin de
otros genes tempranos . La funcin de las protenas tempranas tiene varias
categoras: por ejemplo, la protena E1 rescata clulas de la quiescencia,
dejndolas capaces de sintetizar ADN vrico rpido y protenas, usando
predominantemente las funciones del cdigo del hospedador. Los genes E3
codifican funciones para detener los mecanismos de defensa de la clula
hospedadora, por ejemplo, para anular los efectos del factor del tumor necrtico
(TNF) en clulas infectadas y bloquear el transporte de protenas nacientes de
clase I del MHC, as reducir la presentacin de nuevos pptidos vricos
sintetizados por el sistema inmune del hospedador. Los genes E2 codifican
protenas involucradas en gran manera en la replicacin del ADN.La regin E4 es
compleja en su transcripcin y codifica funciones que regulan la transcripcin
entre las fases primaria y secundaria del ciclo de vida vrico.

Los adenovirus han sido estudiados tambin de forma intensa en un pasado

reciente. Las razones son dobles:

la primera es que el genoma vrico comprende varias unidades de transcripcin que

interactan, y son los suficientemente complejos para ser interesantes, tambin lo
suficientemente simples para permitir un anlisis molecular detallado. Como
resultado, muchos conceptos importantes en la Biologa Molecular eucaritica se
establecieron primero en los estudios de adenovirus, como el corte y empalme de
ARNs mensajeros.

la segunda razn es que los adenovirus tambin pueden transformar las propiedades
de desarrollo de clulas cultivadas y formar tumores cuando son inyectados en
roedores recin nacidos. Este proceso resulta de la infeccin de adenovirus en clulas
no permisivas. Bajo estas circunstancias, algunas expresiones tempranas de un gen y
la sntesis de ADN ocurren, pero muy poco, despus resulta la expresin de la protena
y la no produccin de virus. En cambio en una pequea proporcin de las clulas
infectadas de forma frustrada, el ADN vrico se integra y resulta la expresin de los
genes tempranos. La expresin constitutiva de las protenas E1a y E1b, como en una
infeccin productiva, anula la actividad supresora del tumor de las protenas Rb y p53,
en este caso de forma fortuita lleva una transformacin del crecimiento celular.
 Tambin estn involucrados factores adicionales. Por ejemplo, algunos serotipos de
adenovirus, como el Ad12, son ms oncognicos que otros, como el Ad2 y el Ad5. Esta
capacidad del adenovirus de transformar clulas en cultivo no se contempla como un
gran problema en las aplicaciones de la terapia gnica, porque a pesar de
investigaciones extensas los adenovirus no han estado nunca asociados la aparicin de
tumores de forma natural, ya sea en humanos o en animales y porque los genes que
transforman el E1 estn exentos de la mayora de los vectores defectuosos de
adenovirus.

Los vectores de adenovirus son algo ms grandes y complejos que los retrovirus o
vectores de virus adenoasociados (AAV), en parte porque solamente una pequea
fraccin del genoma vrico es eliminado de los vectores ms corrientes. Si otros
genes fueran eliminados, necesitaran ser provistos en "trans" para producir el
vector, lo cual se ha comprobado que es difcil. En vez de eso, dos tipos
generales de vectores basados en adenovirus han sido estudiados, la supresin en
los vectores de E3 y E1. Algunos virus de tipo salvaje que estn en los almacenes
de los laboratorios carecen de la regin E3 y pueden creceran ausencia de un
virus ayudante. Esta capacidad no significa que la produccin del gen E3 no sea
necesario en el salvaje solo que la copia en clulas cultivadas no la requieren. La
supresin de la regin E3 permite la insercin de secuencias de ADN exgeno
para producir vectores capaces de una infeccin productiva y la sntesis
transitoria de cantidades relativamente grandes de protenas.

La supresin de la regin E1 discapacita al adenovirus, pero estos vectores

pueden ser todava desarrollados porque all existe una lnea celular humana
establecida ( llamada293 ) que contiene la regin E1 de Ad5 y que expresa de
forma consecutiva las protenas de E1. Aplicaciones ms recientes de la terapia
gnica que involucran a adenovirus han utilizado la reposicin de vectores E1
desarrollados en clulas 293.

Las principales ventajas de los vectores de adenovirus se resumen en que son

capaces de transferir el gen episomal de forma eficiente en una amplia cantidad
de clulas y tejidos y que son fciles de producir en grandes cantidades. La
principal desventaja es que la respuesta del hospedador al virus parece limitar la
duracin de la expresin y la capacidad de repetir la dosis, al menos con altas
dosis de vectores de primera generacin.

4.3 VIRUS ADENOASOCIADOS (AAV)

El AAV es un virus muy pequeo, muy simple, no autnomo, que contiene ADN
lineal de cadena sencilla. El virus requiere la coinfeccin con adenovirus u otros
para replicarse. El AAV est extendido en la poblacin humana, como evidencian
los anticuerpos al virus, pero no est asociado con ninguna enfermedad conocida.
La organizacin del genoma es extremadamente simple, comprendiendo slo dos
genes:

rep, que codifica una familia de protenas superpuestas involucradas en la replicacin

e integracin.

cap, que codifica una familia de tres protenas estructurales vricas.

Los extremos del genoma comprenden repeticiones terminales (TR) de

cerca de 145 nucletidos.

Los AAV de tipo salvaje pueden integrar su ADN en el cromosoma del

hospedador en ausencia del virus ayudante. Esta integracin puede
ocurrir con ms frecuencia en regiones del cromosoma 19 y est
involucrada la protena rep.

Los vectores de base AAV son extremadamente simples. Contienen slo

las secuencias vricas TR que bordean la unidad de transcripcin de
inters. El nico problema parece ser que la longitud del vector ADN no
puede exceder mucho de la longitud del genoma viral con 4680
nucletidos. Generalmente, el desarrollo de vectores AAV es voluminoso
y lleva consigo la introduccin en la clula hospedadora, no solo del
propio vector, sino tambin de un plsmido que codifica rep y cap para
proveer de las funciones de virus ayudante.

La ventaja potencial del vector AAV es que parece capaz de una

expresin a largo plazo en clulas que no se dividen, posiblemente
aunque no necesariamente porque el ADN vrico lo integra. Los vectores
son estructuralmente simples, y pueden de todas formas provocar
menos respuesta de la clula hospedadora que del adenovirus. Su
principal limitacin en el presente es que los vectores son difciles de
desarrollar en grandes cantidades.

4.4 HERPESVIRUS

El virus presenta un material gentico compuesto por ADN bicatenario

lineal de 100 a 250 Kb. En el virus del herpes simplex ronda las 50 Kb.
mientras que en citomegalovirus las 220 Kb.

En la mayora de los casos el virus presenta dos trozos de ADN

bicatenario lineal unidos dando una estructura nica llamadas molcula
L y molcula S. Poseen en sus extremos secuencias repetidas terminales
( TRL y TRS ) que son los sitios mediante los cuales permite unirse a las
dos molculas. As, al unirse pueden hacerlo en diferentes orientaciones
segn la combinacin de las diferentes secuencias creando as cuatro
posibilidades o tambin llamados ismeros.

El potencial de estos virus como vectores gnicos recae en la habilidad

de llevar grandes secuencias de ADN extrao insertadas y su habilidad
para establecer infecciones latentes de larga duracin en las cuales el
genoma del virus existe como un episoma con efectos no aparentes en
la clula hospedadora . Los herpesvirus son , de cualquier manera,
enormemente diversos, variando en su tamao de genoma, en la
organizacin del genoma, en el contenido gentico, en las clulas sobre
las que acta y la patognesis, y en consecuencia diferentes herpesvirus
tienen muy diferentes usos potenciales en reparto de genes. La
naturaleza de la latencia viral es de particular relevancia. El virus de
Epstein-Barr y otros miembros del gamma-herpesvirus pueden
establecer infecciones latentes en clulas en divisin; el episoma viral
se replica coordinadamente con la divisin celular y est heredado por
toda la progenie de clulas. Como retrovirus, este grupo de herpesvirus
tiene el potencial para repartir genes a clulas pluripotentes y su
progenie diferenciada. Un inconveniente mayor al uso de estos virus en
terapia gnica, de cualquier manera, es el hecho de que gamma-
herpesvirus estn asociados con daos linfoproliferativos y en algunos
momentos con malignidad .El uso de gamma-herpesvirus requerir la
identificacin y eliminacin de estos genes involucrados en la
transformacin celular y el mantenimiento de aquellas funciones
necesarias para la replicacin del virus y el mantenimiento del plsmido
viral.

En contraste a los gamma-herpesvirus, el virus del herpes simplex (HSV),

y otros miembros de alfa-herpesvirus, no pueden mantener una
infeccin latente en clulas en divisin. El genomas del virus no
contiene un origen de latencia de la replicacin del ADN y el virus
persiste en el hospedador por el establecimiento de infeccin latente en
clulas de larga duracin neuronas sensoriales en el caso del HSV. Los
genes repartidos usando un vector del virus del herpes simplex pueden
por lo tanto mantenerse indefinidamente como un componente del
episoma latente viral en clulas de larga duracin , pero la herencia de
los genes reaprtidos a las clulas hijas de la siguiente generacin podra
ocurrir slo como resultado de una fortuita integracin no especfica.
Un tercer grupo de herpesvirus, los beta-herpesvirus o citomegalovirus,
pueden tener potencial como vectores gnicos para la terapia gnica,
pero nuestro desconocimiento de la biologa de estos virus, y en
particular la naturaleza de la infeccin latente, es escasa y no hay
proyectos inmediatos de explorar este potencial.

An as algunos herpesvirus estn siendo probados en el reparto de

genes extraos y terapia gnica, aunque hasta ahora slo se han
utilizado los virus del herpes simplex (HSV) in vivo.

4.4.1 INFECCIN PRODUCTIVA Y ESTADO LATENTE

La secuencia nucleotdica del virus del herpes simplex ha sido

determinada,tambin todos los productos gnicos han sido
identificados, y la mayora de las funciones de los productos gnicos se
conocen por lo menos hasta el nivel superficial. La infeccin productiva
comprende la expresin de todos los genes conocidos en una cascada
temporal de tres fases. Los genes tempranos codifican protenas
reguladoras de las cuales algunas son esenciales para la infeccin del
ciclo; los genes tempranos codifican enzimas necesarios para la sntesis
del ADN viral y para modificar protenas de la clula hospedadora ; los
genes tardos codifican las protenas del virin. El ciclo productivo
termina con la muerte celular siguiendo despus de una infeccin in
vivo. Los eventos que llevan a una infeccin latente se conocen muy
poco, pero virus mutantes para el ciclo de infeccin productiva pueden
iniciar y establecer una latencia neuronal aunque la infeccin tambin
es posible en otras clulas. La infeccin latente en neuronas expresa
una familia de transcritos desde el promotor LAT pero las funciones de
estos transcritos se desconoce, y la interrupcin o deleccin del
promotor LAT no previene la infeccin latente. Las conclusiones
pertinentes para la construccin del vector es que las funciones de los
genes no virales parecen neceasarios para el establecimiento o
mantenimiento del estado latente.

4.4.2 REPLICACIN DE VECTORES COMPETENTES.

De los aproximadamente setenta genes de HSV ms de la mitad son

dispensables para el crecimiento en el cultivo celular. Los productos
gnicos dispensables incluyen activadores transcripcionales, enzimas
modificadoras de nuclesidos y nucletidos, una protena quinasa y
algunas protenas de membrana de funcin desconocida. Estos genes
representan mltiples convenientes para la insercin de secuencias
ajenas y su deleccin resulta muy variable dependiendo de los niveles
de atenuacin. Muchos otros genes que se han identificado cuya
deleccin resulta en una atenuacin dramtica , y es posible formar
vectores competentes y que son completamente apatognicos. Mientras
estos vectores son necesarios en la investigacin sobre los problemas del
reparto de genes y de la expresin gentica a largo plazo, es improbable
que los vectores competentes replicativos sean aceptados para uso
clnico. En concreto, la atenuacin a travs de la deleccin de mltiples
genes se encauzar para fabricar generaciones de virus que slo estn
parcialmente atenuados si la recombinacin debiera ocurrir con el HSV
residente en el hospedador.

4.4.3 REPLICACIN DE VECTORES DEFECTIVOS

La funcin de algunos genes de HSV son absolutamente necesarios para

la repliacin del virus y la deleccin de estos genes necesita de la
correspondiente funcin " in trans" de la clula ayudante. Mutantes de
HSV combinados con clulas ayudantes se basan en un nmero de
funciones gnicas que carecen del regulador transcripcional para genes
inmediatamente tempranos (IE3), del transactivador vrico Vmw65
(VP16) y de un nmero de glicoprotenas de superficie esenciales. La
atenuacin se ha enfocado hacia vectores carentes del gen IE3 porque la
funcin es requerida durante el ciclo productivo, pero otros genes IE son
expresados, de hecho hiperexpresados, ante la carencia de IE3 y se ha
visto que los productos gnicos de IE son citotxicos. Los vectores que
carecen del transactivador vrico (VP16) ofrece la ventaja de que esa
protena acta activando la transcripcin de todos los genes
inmediatamente tempranos y que adems es una esencial componente
de la estructura del virin.

4.4.4 VECTORES AMPLICN

El ADN del HSV se replica por el mecanismo del crculo rodante y los
plsmidos que contengan un origen de replicacin de HSV actuarn
como un modulador para la sntesis de ADN en clulas coinfectadas con
HSV . Si el plsmido tambin contiene una seal de empaquetamiento
de HSV, entoncs el concatmero lineal ser empaquetado en partculas
virsicas.

Los plsmidos de este tipo se les llam amplicn. La replicacin del

amplicn y empaquetamiento es dependiente de un virus auxiliar y la
progenie infectiva es una mezcla del amplicn empaquetado y del virus
auxiliar , que no pueden ser fsicamente distinguidos ni separados.
Siempre que el virus auxiliar sea defectivo para la replicacin, la
propagacin de la mezcla amplicn-virus auxiliar requiere una lnea
celular completamentaria, entonces el virus auxiliar componente de la
mezcla no representa riesgo y puede ser ignorado para el propsito de
la transferencia de genes. La ventaja de este sistema, es que el
amplicn pueda acomodar una secuencia extraa que se aproxima al
lmite de empaquetamiento del HSV ( aproximadamente 150 Kb ). Estos
amplicones empaquetados pueden repartir gran cantidad de genes o
algunas copias de pequeos genes por partculas. La desventaja comn
de todos los sistemas auxiliares dependientes, es que el radio del
auxiliar-amplicn vara considerablemente en su trnsito y por eso es
difcil preparar colonias de vectores reproducibles.

5. VECTORES NO VIRALES
5.1 BOMBARDEO DE PARTCULAS

Este se ha mostrado como un mtodo efectivo de transferir genes tanto

in vitro como in vivo . En este mtodo fsico el plsmido de ADN es
primero revestido sobre su superficie de gotas de 1 a 3 micras de
dimetro de oro o tungsteno. Estas partculas son aceleradas por una
descarga elctrica de un aparato o por un pulso de gas y son "
disparadas" hacia el tejido.

Un acercamiento menos invasivo es por el bombardeo directo de

partculas en la piel. La fuerza fsica del impacto supera la barrera de la
membrana celular. Sin embargo, caractersticas de rigidez de los
diferentes tejidos, la procedencia del ADN extrao, y la capacidad de
transcripcin intrnseca conducen a grandes variaciones en la eficiencia
de la expresin de los genes en conjunto. En experimentos sobre
epidermis de rata, tejidos musculares, hgado y pncreas se ha
observado que el ADN extrao de la clula no llega a integrarse en el
genoma de las clula hospedadora, y existe como un episoma
relativamente inestable. Esto podra sugerir aplicaciones limitadas de
esta tecnologa en la terapia gnica, pero sera til para investigaciones
en la expresin de construcciones de ADN en tejidos especficos.

El requisito para un procedimiento quirrgico en sujetos humanos de

igual modo est muy limitado a la hora de usar esta tecnologa. De
cualquier manera, las tcnicas quirrgicas de endoscopa podran hacer
menos incoveniente estas limitaciones descritas.
Finalmente un desarrollo factible de este mtodo puede ser aplicado en
su uso directo como parte de un protocolo de vacunacin. Como
demuestran las investigaciones de Ulmer y colaboradores en la
inyeccin directa en el msculo, del gen que codifica la protena de
matriz del virus influenza A. El individuo (en este caso ratn ) manifest
una respuesta de proteccin inmunitaria frente al virus en posteriores
infecciones.

5.2 INYECCIN DIRECTA DE ADN

Por este mtodo el ADN o ARN puro circular y cerrado covalentemente

es directamente inyectado dentro del tejido deseado.

En experimentos llevados a cabo por Wolff y colaboradores mostraron

niveles significativos de expresin en el uso sobre clulas del msculo
esqueltico para construcciones de genes chivato o genes trazadores. La
longevidad de la expresin se mostr persistente durante al menos 60
das en las inyeccin con ADN, aunque con ARN y protenas tuvo una
vida media menor que 24 horas. Mediante anlisis con Southern blot se
sugiri que el ADN se encontraba como un episoma circular cerrado no
replicativo.

El mecanismo preciso de captura del cido nucleico a travs de la

membrana celular muscular fue postulado como resultado de una serie
de caractersticas estructurales favorables de clulas multinucleadas,
retculo sarcoplasmtico y un extenso sistema tubular transverso.
Gracias a ste el contenido extracelular es penetrado profundamente en
la clula facilitando la transferencia del ADN.

As el mtodo de inyeccin de ADN directamente es simple, econmico,

y un procedimiento que no es txico comparado con la entrega
mediante virus. El potencial para llevar largas construcciones de ADN es
tambin ventajoso. De cualquier manera, los niveles y persistencia de la
expresin de genes es probablemente demasiado corta (das) . Esta
tecnologa puede tener potencial como un procedimiento de
vacunacin, y como expresin de genes a un nivel bajo. Si es suficiente
para alcanzar una respuesta inmunolgica.

Por otro lado, sera inaceptable considerar una correccin extendida de

daos miopticos tales como la Distrofia Muscular de Duchenne por
mltiples inyecciones en muchos grupos de msculos en repetidas
ocasiones.
5.3 LIPOSOMAS CATINICOS

La tcnica recae en las propiedades de carga elctrica del ADN

(negativo debido a la cadena de fostatos en la doble hlice), lpidos
catinicos (carga positiva) y la superficie celular (una red de cargas
negativas debido a los residuos del cido silico).

As, lo mismo que hacen las histonas (protenas ricas en aminocidos

cargados positivamente que compactan el ADN), los lpidos catinicos
interaccionan con las cargas negativas del ADN condensndolo. El
exceso de cargas positivas permiten a los transportadores catinicos
interaccionar, mediante enlaces electrostticos con las cargas negativas
que presenta la membrana celular.

Cualquiera que sea la naturaleza del vector, sus interacciones con el

ADN son imprescindibles. La mayor parte de los equipos mezclan de
manera emprica vector y cido nucleico, formando un complejo que
contiene , en general, varias molculas de ADN. Estos complejos vector
catinico/ ADN tienden a agregarse y observados al microscopio
electrnico tienen un dimetro de 50 a 150 nanmetros. nicamente
una condensacin controlada del ADN permitira la formacin de
partculas que encerrarn una sola molcula de ADN. Esto reducira su
dimetro a una veintena de nanmetros, lo que facilitara
considerablemente su paso a los compartimentos vasculares, as como la
penetracin en las clulas y su ncleo. Decir tambin que el hecho de
que el ADN est compactado lo protege de las enzimas ( nucleasas )
capaces de degradarlo.

As lpidos monocatinicos tales como DOTMA (N(1-(2,3-dioleyloxy)-

propyl)-NNN-trimethylammonium chloride) y los pptidos policatinicos
de segunda generacin como DOPSA (2,3-dioleyloxy-N-
(2(sperminecarboxamido) ethyl)-NN-dymethyl-1-propanaminium
trifluoroacetate) forman liposomas que se unen espontneamente a
polianiones de ADN o ARN. El resultado es la captura del 100% de los
complejos estables de ploinucletidos, y por atraccin de cargas y por
propiedades de fusin, los lpidos pueden absorberse a la membrana
celular y entregar el cido nucleico directamente dentro del
citoplasma, evitando la ruta de degradacin lisosomal.

Pero, cmo logran que los complejos transfectantes entren en las

clulas? Al igual que muchos virus en sus ciclos infectivos interaccionan
con protenas azucaradas de la membrana plasmtica, los complejos
transfectantes con carga neta positiva, parece que utilizan estas
molculas de superficie para fijarse en la clula. Luego, las
interacciones electrostticas les permiten la penetracin.

In vitro, la etapa de penetracin en la clula no plantea problemas. Las

molculas comerciales son extremadamente eficaces sobre cultivos
celulares se acercan muchas veces al 100%. In vivo, sin embargo, su
eficacia cae considerablemente para, a veces, llegar casi a cero. As,
despus de la inyeccin por va intravenosa de complejos cargados
positivamente, se constata que la transferencia de genes tiene lugar
principalmente hacia las clulas del pulmn y del hgado. Esta
biodistribucin sugiere que los complejos transfectantes se agregan en
partculas de gran tamao, ya que , sin duda, interaccionan con
protenas de la sangre. Por tanto,no pueden abandonar eficazmente el
sistema vascular: las partculas son retenidas mecnicamente por unos
filtros naturales, los pulmones yel hgado, y penetran en las primeras
clulas que encuentran.

En el tratamiento de la fibrosis cstica, Alton y colaboradores

desarrollaron una preparacin con un ADNc para el regulador de la
conductancia transmembrana de la fibrosis cstica (CFTR) y un liposoma
catinico DC-chol/DOPE (3beta-N-N' , N'-
dimethylamino ethanecarbamoyl) cholesterol/dioleoyl
phosphatidylethanolamine). Esta combinacin lipdica ha sido aprobada
en pruebas en humanos e in vitro ha mostrado al menos tanta eficacia
como DOTAP ( N-(1-( 2,3 -dioleoyloxy) propyl)-N,N,N,-
trimethylammonium methyl-sulphate) o DOTAP/DOPE. Se comprob que
su aplicacin no provocaba signos de inflamacin o necrosis en el tejido.
Adems el ADNc era expresado en ARNm por RTPCR y aunque algunos
ratones tratados corregan completamente la deficiencia, otros slo
tenan una correccin parcial, as que se obtienen limitadas
conclusiones a la hora de su alicacin en humanos. Tal vez, los tejidos
ms intensamente estudiados para el desarrollo de liposomas catinicos
sean las paredes de los vasos arteriales.

Las enfermedades cardiovasculares son las causas ms comunes de

morbilidad y mortalidad en las sociedades industrializadas . Sistemas en
la entrega de ADN-liposomas mediante catteres son factibles, pero son
limitados por una baja eficiencia de transfeccin y por la toxicidad,
pero a pesar de todo los sistemas de ADN-liposomas son usados.
Segn Nabel y colaboradores una posibilidad para aumentar la dosis de
liposomas catinicos sera pronosticar un aumento en la eficiencia de
transfeccin, aunque se ha demostrado que puede ser limitado por la
toxicidad celular a concentraciones crecientes. Para dirigir este
problema se ha informado recientemente de la creacin de un nuevo
liposoma catinico, el DMRIE (dimyristyloxy-propyl-3- dimethyl-
hidroxyetilammonium/ DOPE).

Aunque el aumento de la eficiencia de transfeccin de DMRIE/DOPE con

respecto a DC-chol/DOPE fue ms tarde de lo esperado.

El mecanismo de cmo la proliferacin de clulas aumenta con la

transferencia y expresin de liposomas mediados con ADN es simple
especulacin. Una propuesta para esta hiptesis es que la rotura de la
membrana nuclear de la clula diana que ocurre durante la mitosis
puede liberar en el citoplasma factores nucleares que estabilizan el
ADN. El ADN transfectado puede entonces ser protegido por estos
factores de la digestin por nucleasa de la clula hospedadora por una
combinacin de particin estructural y/o intracelular.

El futuro de la entrega de genes mediante liposomas catinicos en

sistemas cardiovasculares parece prometedor en la luz de estos
recientes desarrollos.

La proporcin de lpidos con respecto al ADN/ARN, tambin como la

concentracin total tiene que ser cuidadosamente optimizada para
evitar toxicidad observada con elevadas dosis. Este mtodo es usado en
general como un eficiente propsito para transfectar ADN dentro de una
amplia variedad de lneas celulares de crecimiento en cultivos de
tejidos.

Varios estudios han demostrado la eficiencia de liposomas policatinicos

en el reparto de ADN in vivo. Este mtodo es una alternativa atractiva a
los mtodos de transferencia viral debido a que no hay obligaciones en
el tamao del ADN, baja inmunogenicidad y fcil volumen de
preparacin.

5.4 TRANSFERENCIA DE GENES MEDIANTE RECEPTORES

En los mtodos anteriormente descritos el problema es que el ADN

termina por el conjunto del organismo y no a sus objetivos especficos
debido a que no posee la capacidad de introducirse en su tejido diana.
Para ello - lo mismo que en vectores vricos - se pueden transplantar al
transportador de los ligantes, unas molculas que sern reconocidas por
los receptores presentes en el tipo celular elegido. La naturaleza de los
ligantes es muy variada , desde azcares, pptidos, hormonas, etc. Su
inters es que son capaces de sustituir por una interaccin
transportador/clula muy especfica, la no especfica debida a las
cargas inicas.

Las clulas absorben los elementos del medio exterior por endocitosis:
su membrana se repliega hasta formar una vescula, el endosoma. Los
complejos de transfeccin aprovechan este mecanismo para penetrar en
sus objetivos celulares. El interior del endosoma se acidifica
progresivamente y luego se fusiona con otra clase de vescula
llamada lisosoma . ste contiene enzimas que degradan su contenido.
Por tanto, una vez en el endosoma, los complejos deben
necesariamente escapar de l antes de ser vertidos en los lisosomas y
sufrir su ataque enzimtico. Por esto, a los vectores sintticos se les
asocia unas molculas, llamadas fusigenas, que desestabilizan las
membranas del endosoma y les permite evadirse. A fin de que la
actividad fusigena se manifieste nicamente despus de la entrada en
el endosoma, se eligen unas molculas cuya actividad slo tiene lugar
cuando el medio se acidifica.

Una vez en el citoplasma, todava es necesario que el ADN llegue al

ncleo de la clula. Introducido en clulas en crecimiento
(especialmente clulas en cultivo), el ADN penetra en el ncleo durante
la divisin celular, cuando se rompe la envoltura nuclear. Pero en las
clulas en reposos- estado en el cual se encuentran la mayor parte de
las clulas del organismo- la envoltura nuclear constituye una barrera
que nicamente deja pasar, por difusin , las molculas cuyo tamao
sea inferior a 9 nm. Las molculas cuyo tamao est comprendido entre
9 y 25 nm. pueden penetrar en el ncleo valindosed de los poros de la
membrana nuclear.

En tal caso, se trata de un transporte activo que necesita el

reconocimiento de unas seales especiales llamadas seales de
localizacin nuclear (NLS). Pero la implantacin de este tipo de seal
en un vector sinttico no ha mejorado la eficacia de la transfeccin.
Adems, recordemos que la mayora de los complejos de transferencia
miden ms de 25 nm. Actualmente, esta etapa del transporte nuclear es
la ms difcil de resolver, a pesar de que es objeto de muchsimos
estudios.

Otro problema: si el vector ha de permanecer asociado al ADN hasta el

interior del ncleo, hay que asegurarse de que su presencia no
interfiera con la transcripcin del gen introducido. As, por ejemplo,
complejos a base de polmeros (polietilniminas) inhiben poco o nada la
transcripcin del transgn. En cambio, los transportadores catinicos a
base de lpidos inhiben esta transcripcin cuando presentan un exceso
de cargas positivas.

Adems de los problemas de vectorizacin del ADN a las clulas-

objetivo, hay otros elementos cruciales, como el mantenimiento
duradero del gen terapetico en las clulas -necesario si se desea tratar
una enfermedad gentica- y la regulacin de su expresin segn las
necesidades del organismo.

Para asegurarse el mantenimiento del gen, una primera solucin eficaz

es la integracin del transgn en el genoma del husped. Idealmente,
esta integracin debera tener su objetivo muy bien fijado, pero esto
todava no se consigue. En efecto, una integracin al azar en el
cromosoma puede hacerse mediante otro gen e inactivarlo. Otra va de
integracin es el mantenimiento de las construccin gentica, el
plsmido, en la forma llamada episomal, llegada al ncleo, pero no
integrada en el genoma del husped, se replicarn con las divisiones
celulares. Para conseguirlo, se emplean sistemas desarrollados por virus
tales como el de Epstein-Barr. Y una tercera posibilidad : introducir en
la clula-objetivo minicromosomas artificiales (MAC) estables y que se
replican de modo autnomo.

5.4.1 RECEPTOR DE ASIALOGLICOPROTENAS (ASGPr)

Este tipo de receptor es especfico para hepatocitos. El hgado es de

gran importancia en el metabolismo del cuerpo, por tanto es obvio que
sea diana para las terapia gnica, tambin muchas enfermedades son
debidas a deficiencias en enzimas hepticas.

Como describamos para los liposomas catinicos, el ADN es

empaquetado en un complejo electrosttico, se usa " asialoorosmucoid-
polylysine" (ASOR-PL) en lugar de lpidos.
As el receptor es cruzado y unido con el conjugado de policatin y
ligando e interacta con el policatin de ADN, y son eficientemente
unidos a los ASGPrs en la superficie del hepatocito. La purificacin
cuidadosa de los conjugados de ASOR-PL es esencial, y a su vez hay que
optimizar la proporcin del conjugado y el ADN. Una vez que se ha
alcanzado esto, es relativamente econmico y simple el procedimiento
para llevar a cabo una inyeccin perifrica intravenosa, evitando as la
necesidad de cateterizar un vaso de forma selectiva.

Dos ventajas significativas son la baja inmunogenicidad del complejo y

la habilidad para transferir fragmentos grandes de ADN (ms de 48 kb) .
La baja inmunogenicidad permitira mltiples inyecciones, que debera
ser casi seguro para las construcciones de ADN actuales, ya que la
eficiencia de la expresin del gen in vivo es relativamente baja, y cae
rpidamente con el tiempo.

Un ejemplo de la aplicacin de este sistema ha sido la bajada del

colesterol en suero seguido al reparto de los genes que codifican los
receptores de las lipoprotenas de baja densidad (LDLr).

Anteriormente comentabamos el mtodo de entrada, mediante

endocitosis mediada por receptor, y escape del endosoma antes de la
fusin con el lisosoma. En este caso las sustancias empleadas en esa
inhibicin de la unin con el lisosoma son una droga antimalaria
(cloroquinina) que aumentan la supervivencia del ADN por inhibicin de
la acidificacin del endosoma.

Tambin se han usado protenas de la cpsida de adenovirus que

facilitan la entrada por endocitosis, y ya en el interior se dan vesculas
recubiertas de clatrina.

El mecanismo de cmo la cubierta de la vescula compuesta por estas

partculas adenovricas inhiben la acidificacin es todava incierto. Lo
nico que se conoce es la capacidad de rotura del endosoma .

Actualmente la va de investigacin intenta descubrir protenas vricas y

pptidos sintticos que tengan propiedades de rotura del endosoma.

Tambin se estn llevando a cabo un sistema que combina las ventajas

de los liposomas de llevar ADN de gran tamao con las propiedades de
fusin del virus HVJ o tambin llamado virus Sendai que no es patgeno
en humanos. El ADN es condensado por mezcla con protenas no
histnicas de cromosomas de alta movilidad del grupo-1 (HMG-1).

Estas protenas parecen aumentar la eficiencia de la translocacin

nuclear y la expresin seguida a la fusin de la superficie celular. A este
complejo ADN-HMG-1 se le aaden lpidos neutros (colesterol, fosfatidil
colina, fosfatidil serina). La proporcin de lpidos usados es crtica para
la formacin de buenos liposomas. El virus Sendai se inactiva por una
breve exposicin a irradiacin ultravioleta, y se mezcla con el complejo
ADN-HMG-1 cubierto por liposomas.

Este mtodo ha sido desarrollado para el reparto en paredes vasculares,

hgado, rin. El mtodo es eficiente, fcil de llevar a cabo, requiere un
tiempo corto de incubacin y tiene un tamao del ADN ilimitado.
Aunque la transfeccin es eficiente en estos tejidos se necesita una
cateterizacin en vasos como pueden ser la vena porta del hgado,
arteria renal, coronarias, etc.

La principal desventaja tiene que ver con el uso de virus Sendai

intactos, a pesar de que tenemos como garanta que no es patgeno en
humanos, y da una duracin corta en la expresin y en el reparto de los
transgenes. Se debe a que el ADN como ya dijimos permanece como un
episoma inestable en la clula hospedadora.

Las investigaciones se centran as en el aumento de la estabilidad del

ADN y/o la integracin para mejora los proyectos de expresin a largo
plazo. As una posibilidad se centra en la ventaja del reparto conjunto
del ADN con protenas. As, la estabilidad del ADN procedera de un
recubrimiento con protenas de cromosomas y/o otras protenas
nucleares.

Se hicieron intentos con la protena recA , una recombinasa de bacterias

para intentar una integracin en el genoma de la clula hospedadora.
Pero los resultados resultaron ser un fracaso. Aunque recientemente se
ha visto que diferencias en la parte amino-terminal pueden ser la causa
de este fallo.

As en conjunto este tipo de vectores para la transferencia de genes in

vivo estn en una fase rpida de desarrollo. Su produccin es sencilla y
segura, son estables y pueden contener construcciones genticas de
gran tamao. Son eficientes en el reparto de los genes.
Por lo que podran ser incorporados a prcticas clnicas. Pero sin
embargo, su eficacia in vivo es actualmente decepcionante,
seguramente porque el conocimiento de los mecanismos que intervienen
es todava insuficiente. Pero sin duda el da en que podamos superar las
limitaciones de estos sistemas sern el campo dentro de la terapia
gnica con ms aplicaciones, beneficios terapeticos y costes de
manipulacin y construccin.

6. DISEO DE VECTORES
Los vectores vricos estn hechos al menos de dos componentes, el
genoma vrico modificado y la estructura del virin que lo rodea. La
mayora de los vectores de la generacin presente comprenden
partculas vricas basadas en gran manera en el tipo de estructura del
virus sin cultivar. Esta estructura envuelve y protege al cido nucleico
viral y provee los medios para unirse y entrar en las clulas dianas. De
todas formas, el cido nucleico del virus en un vector diseado para la
terapia gnica es cambiado de muchas formas. Los objetivos de estos
cambios son discapacitar el crecimiento del virus en las clulas diana
mientras se mantiene su capacidad para desarrollarse en forma de
vector en el envoltorio asequible o clulas auxiliares, dar espacio en el
genoma vrico para la insercin de secuencias de ADN exgeno e
incorporar nuevas secuencias que codifiquen y capaciten la expresin
apropiada del gen de inters. De esta forma, podemos considerar que
los cidos nucleicos del vector comprenden dos elementos: esas
secuencias vricas esenciales que permanecen y la unidad de
transcripcin para el gen exgeno.

Ya que cualquier secuencia que permanezca del virus que codifica,

podra ser expresada , incluso por un vector viral discapacitado, todas
las secuencias vricas no esenciales deberan ser eliminadas. As,
idealmente, un vector contendr slo aquellas secuencias de cido
nucleico de virus necesariamente requeridas en cis. De todas formas,
todas las dems funciones viralesson necesarias para permitir la replica
del genoma del vector para los propsitos de produccin y
provisionamiento de las protenas necesarias para ensamblar el virin.
Idealmente un envase especfico o clula auxiliar deberia ser construido
para que exprese aquellas funciones vricas capaces de funcionar en
trans. En la prctica, la expresin de las protenas estructurales del
virus y de las protenas implicadas en la replicacin a menudo resultan
txicas para una lnea celular, particularmente si el ciclo de vida del
virus incluye una ayuda, entonces la infeccin productiva producir la
muerte celular ms que una infeccin crnica. As, la lnea celular de
envoltura apropiada requiere desarrollar muchos vectores idealizados
que no existen. Los rasgos mnimos esenciales presentes en
generaciones de vectores vricos se discuten a continuacin.

6.1 RETROVIRUS
6.1.1 SECUENCIAS VRICAS ESENCIALES

Ya que las clulas toleran la presencia de protenas constitutivas de

retrovirus, la generacin de lneas celulares envolventes o clulas de
ensamblaje que expresen todas las protenas vricas es relativamente
clara. En consecuencia, los vectores de retrovirus slo necesitan
contener los elementos nucleicos en cis. Estos incluyen las secuencias
LTR 5' y 3' y la secuencia de ensamblaje (algunas veces referida como )
que se establece aguas abajo de LTR 5'.

La regin esencial de 5' contiene numerosas funciones vricas,

incluyendo muchas envueltas en la replicacin e integracin del cido
nucleico, secuencias promotoras e incrementadoras, un sitio de unin
del ARN de transferencia cebador (PBS) y un sitio donador de empalme.
Esta regin tambin abarca los codones de iniciacin para la protena
gag, el cual en el caso del virus MoMLV incluye una corriente
ascendente, que encuadra CUG que codifica una variante de la protena
gag glicolisada con una extensin N-terminal, as como la ms usual
AUG.

LTRs de varios retrovirus, que incluye aquellos con especificidad para

especies diferentes, han sido usados con xito para generar vectores de
retrovirus. Incluso los vectores basados en HIV se han producido. Ya que
los retrovirus de murine estn bien caracterizados y los experimentos
llevan consigo habitualmente modelos de ratn, los vectores utilizan el
LTR de MoMLV, y la secuencia de ensamblaje (por ejemplo el N2. LNL6,
y los vectores MFG). Aparte de las emisiones seguras que envuelven la
generacin de virus recombinates de tipo sin cultivar en la lnea celular
de ensamblaje analizada antes, para cualquier aplicacin dada, muchos
rasgos influencian la eficacia de un LTR. Algunos variantes de LTR han
sido designadas especialmente para la expresin de ciertos tipos de
clulas; por ejemplo, el vector basado en el virus de la clula de raz
embrinica de murine se expresa en clulas embrinicas. Los cambios
en la LTR influencian la expresin, incluyen eliminaciones en la regin
U3 y sealan mutaciones que cambian la unin del factor de
transcripcin o unin de otras protenas especficamente de la clula. El
PBS inmediatamente adyacente al 5' tambin influye en la expresin;
por ejemplo, un elemento silenciador de algunas clulas se une al
emplazamiento de ARN de transferencia para la prolina pero no al ARN
de transferencia para la glutamina.

La seal de ensamblaje generalmente usada es ms extensa que la

utilizada en los vectores de primera generacin e incluye ahora N-
terminal de gag que codifica secuencias. La expresin inicial del codn
de iniciacin para la sntesis de gag ms el gen de inters puede ser
prevenida por la mutacin de la secuencia AUG o la insercin aguas
abajo de un codn de terminacin. Adems , el codn de iniciacin CUG
de aguas arriba en MoMLV no est presente en MoMSV. Como
consecuencia para las aplicaciones tales como el vector LNL6, se
construye una secuencia de empaquetamiento hbrida que consiste en
secuencias de MoMSV sin las secuencias CUG y MoMLV aguas arriba que
contienen un AUG mutado.

Esta regin tambin contiene el donador del empalme producido de

forma natural aguas arriba del AUG del gag, el cual interactuaria con el
aceptor del empalme aguas abajo de las secuencias que codifican el
env. De todas formas, en ausencia del sitio aceptor de env, un sitio
aceptor de un empalme crptico 3' en las secuencias que codifican el gag
de la seal de empaquetamiento extendida es activada . El uso de la
combinacin del sitio aceptor-donador parece ser importante en algunos
vectores (como el N2) pero no en otros (LNL6). Las secuencias vricas
esenciales al final de 3' del vector viral incluyen las LTRs pero poco ms
.

6.1.2 UNIDAD DE TRANSCRIPCIN PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO

En el proceso de designacin de la unidad de transcripcin de un vector

de retrovirus, aparecen diversas preguntas. Primero, es una protena
requerida o codificar el vector el gen de inters ms un marcador
seleccionable? Si se necesitan dos protenas, se usarn dos promotores
o un ARN mensajero dicistrnico? Otra consideracin importante es la
cantidad de producto del gen requerida y la duracin deseada de la
expresin.
6.1.3 EL PROMOTOR Y EL INTENSIFICADOR

El LTR vrico se usa comnmente como promotor e intesificador del gen

de inters. Estos promotores son considerados como relativamente
fuertes, y pueden dar grandes cantidades del producto gnico . Si una
lnea celular especfica es el objetivo, un promotor especialmente
adaptado a esa lnea celular ser necesario, como se argument antes.
Cuando dos genes son insertados, un segundo promotor es a menudo
incluido aguas arriba de la segunda unidad de transcripcin. Un estudio
reciente sistemtico compar combinaciones y orientaciones distintas
de los promotores de SV40 y CMV con betagalactosidasa y neomicina
como los genes testados y se encontraron efectos marcados, lo cual
variaba con la construccin precisa, en ambos, la expresin del gen y la
estabilidad del vector. Un acercamiento alternativo es incorporar unos
sitios internos de entrada para el ribosoma aguas arriba de la segunda
regin que codifica y contar con una transcripcin sencilla para generar
ambos productos gnicos.

Una importante consideracin para las aplicaciones que requieren una

expresin a largo plazo es un promotor cerrado. Los experimentos
indican que en algunos casos, el ADN vrico integrado persiste pero la
transcripcin se ve reducida a niveles indetectables. Este
descubrimiento ha llevado a la bsqueda de promotores de
mantenimiento de larga duracin o promotores con gran especificidad
tisular. Tambin, cuando el producto es una protena segregada, la
investigacin se ha dirigido a encontrar un tejido alternativo en el cual
el gen pueda ser expresado pero el cierre pueda ser menos
problemtico.

6.1.4 EMPALME

Ya que muchos vectores estn construidos por insercin de un ADN

circular apropiado en un vector "cassette" preformado, la mayora
dependen de las seales de unin situadas en el extremodel vector. En
el vector N2, por ejemplo, un donador de empalme y un aceptor estn
presentes en la secuencia extendiad de empaquetamiento. En el vector
MFG, el aceptor de empalme es la secuencia que normalmente se utiliza
en la produccin de ARN mensajero de env. Localizando el AUG de la
secuencia introducida que codifica precisamente en el lugar del AUG de
env ha resultado una expresin altamente eficiente.
6.1.5 CONCLUSIONES DEL DISEO DE VECTORES DE RETROVIRUS

Aunque el diseo de vectores de retorvirus ha alcanzado un estado

avanzado,es algo an emprico. Este problema resulta en parte de la
naturaleza de los retrovirus. Como el cido nucleico del virus es ARN,
los sitios de empalme crpticos presentes en cualquier genoma
recombinado puede ser funcional y, en consecuencia, preludio del
empaquetamiento de transcritos de largo metraje. El xito slo se
puede asegurar testando el vector en clulas de embalaje apropiadas
para determinar si se obtiene un alto ttulo de virus, y si el vector es
estable. Adems, su capacidad para transducir clulas objetivo con alta
eficiencia necesita ser ensayada.

Considerando sto, de manera sorprendente pocos estudios sistemticos

se han hecho para comparar las propiedades de estos vectores . A
menudo, lo que se construye, usado en estudios comparativos, difiere
en ms de un rasgo, haciendo difcil una interpretacin. Una excepcin,
que puede ser interpretada , es el estudio sistemtico de la expresin
de beta-galactosidasa y de neomicn-resistencia en los vectores
estrechamente relacionados mencionados antes. Un estudio ms
reciente examin la expresin estable del ADA humano en clulas
hematopoyticas de ratn reconstituidas usando vectores MFG que
contienen rasgos que influenciaban la expresin en otros contextos. Los
resultados indican que los parmetros testados, el uso de una mutacin
PBS solamente o una LTR del virus del sarcoma mioproliferativo (MPSV),
ms que una LTR del MoML, produca expresin del gen
significativamente mejorada.

6.2 ADENOVIRUS

Vectores Ad4 basados en la eliminacin de E3 han sido diseados par el

uso como vacunas. En estos vectores, la unidad de transcripcin que
codificael inmunogn (por ejemplo el antgeno de superficie de la
hepatitis B o el pg160 del HIV) se inserta en la regin E3 del genoma de
una cepa salvaje. Las pruebas en animales han sido satisfactorias, pero
los resultados en test humanos han sido decepcionantes. Esto refleja
probablemente la importancia de la regin E3 en cuanto a que reduce la
respuesta de inmunidad de la clula hospedadora al adenovirus. En su
ausencia, la sntesis de antgenos dirigida al vector es de corta vida e
incapaz de producir inmunidad.
6.2.1 GENES VRICOS ESENCIALES

Virtualmente todos los vectores adenovricos para la terapia gnica son

vectores a los qwue se les ha sustituido E1, a los que les falta la mayora
de la regin que codifica el E1 y crecen en clulas 293. Los vectores
retienen inmediatamente es extremo terminal 5' inmediato del genoma
viral, incluyendo las repeticiones terminales, secuencias requeridas para
el empaquetamiento, y la superposicin de la regin incrementadora de
E1.

Todas las secuencias que codifican para E1a son borradas, pero a
menudo permanecen algunos de los extremos 3' del gen E1b y todas las
protenas de las secuencias que codifican las secuencias IX. Todos los
restos del genoma vrico pueden ser dejados intactos, pero
normalmente algunos o todas las secuencias que codifican la regin E3
son tambin eliminados. Un informe describe un vector en el que E3 es
retenido pero todas las secuencias en E4 eran eliminadas con la
excepcin de ORF-6, que era retenido porque pareca ser la nica
secuencia de la regin E4 que es esencial para el crecimiento en el
cultivo de tejido. El vector Ad2/ORF-6 se desarrolla bien, y es estable
en clulas 293.

Los intentos para crear vectores basados en adenovirus con

eliminaciones ms extensas son limitadas por la capacidad de producir
clulas de empaquetamiento apropiadas. En el presente, la eliminacin
de genes no esenciales,mutacin condicional de otros genes, o la
provisin de funciones del ayudante mediante la coinfeccin ms que la
expresin constitutiva son las opciones ms simples. Un informe del as
llamado vector pseudo-adenovirus (PDV) describa el desarrollo de un
vector de base Ad2 que contena solamente secuencias terminales
repetidas virales 5' y 3' bordeando el ADN exgeno que codifica beta-
galactosidasa. El desarrollo y empaquetamiento del vector en clulas
293 coinfectadas con un auxiliar de tipo salvaje es posible, pero la
dificultad de quitar todo el virus auxiliar de tipo salvaje presentes,
limita la aplicacin prctica de tal vector. Otros informes recientes
describen un vector E1- y E3- deleccionados en el cual el producto del
gen E2a incluye una mutacin sensible a la temperatura. Esta
construccin fue producida con la esperanza de que al decrecer la
actividad de la protena de unin al ADN producida a 37C dejara el
resto de genoma vrico ms quiescente.
6.2.2 UNIDAD TRANSCRIPCIONAL PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO. PROMOTOR
E INCREMENTADOR

Varios promotores se han usado par expresar genes exgenos en los

vectores de adenovirus, incluyendo adenovirus MLP, PGK e hbridos
CMV/beta-actina, as como el promotor endgeno E1a. La eleccin de
un promotor adecuado depende de la aplicacin y del tejido. El
promotor cerrado como resultado de los vectores de adenovirus an no
han sido descritos.

6.2.3 POLIADENILACIN

Se han usado una variedad de seales para la poliadenilacin,

incluyendo la secuencia endgena E1b/protena IX. Un problema que
parece causar la baja produccin de virus en algunos casos es la
oclusin po cierre del promotor en la unidad de transcripcin de la
protena IX, que es causada por la lectura a travs de un fuerte
promotor aguas arriba del gen introducido. La expresin de la protena
IX deja el empaquetamiento menos eficiente. Se puede resolver el
problema aparentemente utilizando una fuerte seal de poliadenilacin,
tal como en SV40, aguas abajo del ADNc exgeno o invirtiendo la unidad
de transcripcin.

6.3 VIRUS ADENOASOCIADOS

6.3.1 ELEMENTOS VRICOS ESENCIALES

Las nicas secuencias esenciales para un vector AAV son los 145
nucletidos TRs en el 5' y 3' al final del vector. Estos dan las secuencias
necesarias para la replicacin y el empaquetamiento del vector de ADN.

6.3.2 UNIDAD DE TRANSCRIPCIN PARA LA EXPRESIN DEL GEN EXGENO

Para algunas aplicaciones, el tamao del vector de ADN es

problemtico.El ADN es mayor de 4800 nucletidos es difcil de replicar
y empaquetar. Como consecuencia, la regin promotor-incrementador y
la seal de poliadenilacin utilizada son seleccionadas algunas veces
desde la base del tamao mnimo requerido. Sin duda, un vector que
codifica el regulador de conductancia transmembrana de la fibrosis
qustica (CFTR) utiliza un promotor sin el TR que no ha sido hasta ahora
descrito.
Cuando el tamao del ADN introducido no es problemtico, se pueden
utilizar unidades de transcripcin ms convencionales. Estas unidades
pueden incluir varios promotores exgenos y, en algunos casos,
marcadores seleccionables. Para introducir la especificidad de expresin
en tejidos, tambin han sido introducidos segmentos de regiones de
control del locus, pero con un xito limitado.

6.4 HERPESVIRUS

Adems del diseo y construccin de vectores HSV disminuidos la

seleccin de promotores que resultarn en una expresin a largo plazo
estable de un gen transducido en un tipo celular deseado es un rea de
investigacin activa.

Hasta hoy los estudios se han centrado profundamente en la expresin

del gen lac Z que ha sido situado bajo control de varios promotores
celulares o virales con el propsito de definir aquellos elementos activos
en cis suficientes para conferir una expresin gentica neuronal
duradera. Nuestro poco conocimiento de estos factores actuantes en cis
y trans en el control de las expresin gentica neuronal in vivo, junto
con la posible inactivacin de promotores heterlogos en el contexto
del genoma vrico latente asociado a histonas nos ha llevado a las
pruebas empricas en un nmero elevado de elementos reguladores
celulares y virales.

El sitio de insercin de promotores heterlogos del genoma de HSV y /o

la proximidad de secuencias reguladoras del promotor lac pueden
influenciar significativamente su actividad durante la latencia.

Desde que el virus codifica los LATs son transcritos indefinidamente

durante la latencia neuronal, se han hecho considerables esfuerzos para
definir aquellos elementos del promotor lac importantes en una
expresin gentica neuronal duradera, y para determinar si este
promotor tambin puede ser usado para dirigir una expresin gentica
ajena. Se ha demostrado que la replicacin competente de los vectores
HSV es capaz de la expresin estable de la beta-globina y de la beta-
galactosidasa en una proporcin de neuronas sensoriales de murine
cuando dichos genes son situados en diferentes localizaciones aguas
abajo de la caja TATAque contiene el promotor LAT al que se le
llama LAT1. Datos recientes han dilucidado la complejidad de la regin
reguladora del promotor LAT y han indicado que la expresin duradera
sea facilitada por elementos contenidos en una segunda regin
promotora, llamada LAP2 , que se encuentra aguas abajo de LAP1 y
tiene caractersticas comunes a los promotores de genes "housekeeper"
eucariotas. Se ha vistoque el promotor LAP2 dirigen la expresin del gen
lac Z en neuronas trigeminales durante 300 das despus de la infeccin,
independientemente de LAP1 cuando es insertado en una localizacin
genmica ectpica. De este modo el aumento de la complejidad de la
regin promotora LAT de HSV ofrece considerables promesas como
elemento suficiente para conferir una duradera expresin gentica en
neuronas in vivo y es importante determinar el nivel de expresin que
puede alcanzar esta regin promotora en diferentes tipos de neuronas
desde que los primeros estudios se sugiri que la actividad de estos
promotores en neuronas del sistema nervioso central es
considerablemente menor que el observado en el sistema nervioso
perifrico.

Est claro que aunque vectores repartidores de genes HSV en etapas

tempranas de su desarrollo, se han hecho progresos significantes
respecto al desarrollo de replicaciones apatognicas como en sistemas
basados en amplicones. El mayor obstculo que se ha de superar ahora y
que, deja problemas con todo lo relacionado con el sistema de vectores
es la expresin duradera. As, aunque la expresin transitoria pueda ser
alcanzada fcilmente por promotores bien caracterizados nuestro
conocimiento de los requerimientos precisos que facilitan la expresin
gnicas estable es pobre y la influencia de factores como la
organizacin de la cromatina, metilacin y la estabilidad del ARN han de
ser profundamente estudiados.

7. PRODUCCIN DE VECTORES
7.1 RETROVIRUS

La produccin de vectores basados en retrovirus en clulas

empaquetadoras tiene tres objetivos, la produccin de cido nucleico
del vector encapsidado en una partcula vrica con especificidad de
infeccin, la produccin eficiente de grandes cantidades de vectores, y
evitar la salida de retrovirus replicativamente competentes (RCR).
7.1.1 CLULAS EMPAQUETADORAS

Una lnea de clulas empaquetadoras, se produce por medio de una

transfeccin en el plsmido del virus auxiliar que codifique gag, pol, env
y por la seleccin de clulas que expresen las protenas y que soporte la
produccin de vector. Se puede evitar la replicacin de las secuencias
auxiliares haciendo al menos delecciones en las secuencias
empaquetadoras. De forma similar, para evitar la recombinacin con el
vector en replicacin se han de quitar secuencias adicionales. Por
ejemplo, otras secuencias adems de la secuencia que codifique la
envoltura, incluyendo la LTR 3' , son comnmente deleccionadas y
sustituidas por una secuencia poliadenlica, como la del SV40. Las
delecciones se pueden incorporar al LTR 5' para reducir su habilidad
para replicarse y en su lugar se puede utilizar un promotor exgeno.
Otras adaptaciones diseadas para asegurar que la lnea de clulas
empaquetadoras no pueda producir RCR incluye la insercin de
mutaciones puntuales o delecciones en posiciones claves del genoma del
auxiliar y romper el genoma viral en dos unidades transcripcionales, uno
que codifique gag y pol, y el otro que codifique env. La combinacin de
estos acercamientos y la transfeccin de clulas en diferentes tiempos
para incitar a la integracin del genoma dividido en diferentes sitios en
el cromosoma de la clula hospedadora reduce la posibilidad de
recombinacin. A pesar de esto, la mltiple recombinacin cruzada
genera un estallido del vector de replicacin-competente y queda la
posibilidad de que deba ser constantemente testado para la produccin
en masa.

Para asegurar la especificidad apropiada del objetivo, el gen env del

virus auxiliar/lnea de clula empaquetadora puede ser variado. Por
ejemplo,para generar un vector capaz de infectar clulas murina
(tambin llamado vector ecotrpico), se puede usar en una lnea de
clulas de empaquetamiento que expresa una secuencia env desde un
retrovirus murine como el MoMLV, pero para la produccin de un virus
capaz de infectar clulas humanas, en vez de este, se puede usar la
secuencia env de un virus anfotrfico como el 4070A.

Recientemente, se ha llevado a cabo acercamientos ms sofisticados del

objetivo. Inicialmente, estas llevaban consigo la modificacin covalente
de viriones. Una aproximacin ms precisa consiste en quitar secuencias
del gen env y reemplazarlas con secuencias que codifican protenas con
diferente especificidad. Por ejemplo, las secuencias erotropoyticas se
han utilizado para apuntar al receptor Epo. Otro acercamiento en
incorporar un anticuerpo de cadena simple dentro de la secuencia env.

Un acercamiento diferente utiliza la capacidad del retrovirus para

incorporar glicoprotenas de otros virus en su desarrollo para producir
as los llamadospseudotipos. Mtodos desarrollados de forma reciente
incorporan la protena HA del virus influenza y la protena G del virus de
la estomatitis vesicular (VSV) como la glicoprotena de superficie de
vectores retrovirus. La incorporacin del VSV tiene dos consecuencias:
primero, el vector tiene as un amplio campo de objetivo de la
glicoprotena VSV; segundo, las partculas del virin parecen ms
estables y pueden ser concentradas por centrifugacin sin prdida de
dosificacin (ttulo de una solucin).

Para producir vectores de retrovirus, un vector dado en forma de

plsmido es transferido en una lnea de clulas de empaquetamiento
seleccionada. Las secuencias del nuevo vector se integran y se replican
bajo la influencia de las funciones del vector auxiliar endgeno, por eso
generando viriones descendientes con la protena de envoltura
relevante provistas por la lnea de clas de empaquetamiento.
Tpicamente, la produccin de vectores en diversas lneas de clulas de
productoras es examinada para encontrar un productor de alta
estabilidad.

7.1.2 RETROVIRUS DE REPLICACIN COMPETENTE

Mucho esfuerzo ha ido en desarrollo de lneas celulares de

empaquetamiento debido a que la produccin de virus debe ser
reducida al mximo posible. Desde que este virus puede replicarse, su
presencia en una poblacin diferente incompleta o defectiva de
retrovirus presentara serios problemas de seguridad. Considerando las
consecuencias de inyeccin de un vector auxiliador libre y un vector que
contiene RCR en primates: los monos tratados con virus auxiliares libres
permanecan con la enfermedad libres durante los perodos de
observacin, mientras que aquellos tratados con un vector que contiene
RCR desarrolla linfomas despus de pocos meses. Presumiblemente, el
virus que replica es vertido o liberado constantemente e infecta clulas
adicionales. La viremia resultante lleva a mltiples rondas de
integracin, eventualmente resultan en una acumulacin de sucesos
mutagnicos. El FDA requiere ser testado de forma rigurosa en lotes
clnicos del vector si son de uso en humanos, y aunque raramente, estas
salidas de RCR en lotes clnicos han ocurrido. La caracterizacin
molecular del RCR muestra que regiones mnimas de secuencias de
homologa pueden dar lugar a recombinantes.

7.1.3 PURIFICACIN

La capacidad para transducir objetivos celulares con retrovirus depende

en parte de la multiplicidad de la infeccin, la cual depende del
volumen y la concentracin del virus aadido a las clulas. Idealmente,
los vectores para uso clnico podran ser purificados y concentrados,
pero esto es dficil en la prctica porque las partculas de retrovirus son
relativamente frgiles. Nuevos virus pseudotipo pueden ser una
excepcin, pero en el presente, lo mejor que pueden ser hecho es
proteger la produccin de clulas productoras de alta dosificacin de
virus. Adems, para el uso humano, la lnea de clulas para
empaquetamiento debe ser testada rigurosamente para excluir la
presencia de virus humanos y otros componentes.

7.2 ADENOVIRUS
7.2.1 CLULAS DE EMPAQUETAMIENTO

Una lnea celular (clulas 293), se usa generalmente casi de forma

exclusiva para adenovirus. Estas clulas se producen por la transfeccin
de ADN del Ad5 cortado en clulas del rin del feto humano. Despus
de la seleccin y aprobacin, la lnea celular que resulta contiene cerca
del 11% del genoma Ad5 desde el 5' y est inmortalizada,
presumiblemente bajo la influencia de las funciones E1a y E1b. La
duracin exacta de la insercin de Ad5 y el nmero exacto de
secuencias E1 de Ad5 es desconocido. Debido a que las clulas 293
contienen poco genoma de adenovirus (codifican, como mucho, una
protena estructural), su descripcin como una lnea de clulas de
empaquetamiento es debatible. Quizs la lnea de clulas auxiliares es
ms apropiada en este caso.

7.2.2 ADENOVIRUS DE REPLICACIN COMPETENTE (RCA)

Justo como los retrovirus, la recombinacin entre secuencias de E1 de

Ad5 presentes en clulas 293 y las secuencias superpuestas en los
vectores eliminados E1 en parte defectuosos, pueden generar
adenovirus de replicacin competente (RCA). Este problema se ha
detectado en vectores basados en Ad2 de ms longitud que el tipo sin
cultivar, porque una vez presente, la progenie de replicacin
competente cubre rpidamente el vector introducido y porque el
recombinante es un hbrido Ad5/Ad2 que puede ser distinguido de los
tipos sin cultivar. Aunque menos fcil de detectar y caracterizar, la
generacin de RCA con vectores basados en Ad5 y en Ad2 ms pequeos
tambin ocurre. La frecuencia de esta recombinacin es difcil de medir
de forma segura. En el futuro, los investigadores intentarn minimizar
secuencias que se superpongan con las secuencias de clulas 293. De
forma similar, un desarrollo valioso sera una clula 293 de segunda
generacin con una regin codificante E1 mejor definida, la cual podra
ser dividida entre E1a y E1b (como con las clulas de empaquetamiento
del retrovirus) para no fomentar la recombinacin.

Aunque el RCA puede ser generado en la produccin de vectores de

adenovirus si son potencialmente peligrosos. Adenovirus de tipo sin
cultivar pueden ser no fiables y la movilizacin y diseminacin del
vector por s mismo no parece posible. Sin embargo, el requerimiento
corriente de FDA para lotes clnicos de adenovirus es un RCA o menos
por dosis.

7.2.3 PURIFICACIN

Al contrario que retrovirus, los adenovirus permanecen estables cuando

son sujetos a una purificacin extensiva. Los procedimientos implican
mltiples ciclos de congelacin y descongelacin para romper las clulas
infectadas, y uno o ms pasos de centrifugacin seguido de dilisis o
cromatografa. Las preparaciones purificadas del vector que contiene
10e12 partculas/ml, puede ser obtenido con facilidad. As la magnitud
del rango es mayor de lo que es posible en retrovirus y AAV .

Las preparaciones son testadas extensivamente para RCA y otros virus

contaminantes. Adems, las preparaciones deben encontrar un
requerimiento de FDA de una partcula infectiva de unidad de radio
menor que 100.

7.3 ADENOASOCIADOS
7.3.1 CLULAS DE EMPAQUETAMIENTO

Los vectores AAV no tienen todas las secuencias que codifican virus,
pero la lnea de clulas de empaquetamiento no estable ya ha sido
analizada. En consecuencia, los genes cap y rep deben ser introducidos
en clulas como plsmidos al mismo tiempo que el plsmido del vector
que contiene el ADN circular flanqueado por TR. Los mtodos de
transfeccin usados para este propsito son ineficientes y difciles de
cubrir. Adems, las clulas transfectadas requieren una superinfeccin
con adenovirus para dar funciones auxiliares adicionales. Los esfuerzos
para mejorar la eficiencia de los mtodos de produccin son
obstaculizados porque la protena rep es txica para las clulas. Aunque
se han considerado muchos mtodos ingeniosos para solventar este
problema, como fabricar un adenovirus auxiliar para expresar rep y cap,
esto queda como un hecho significativo; ahora, los esfuerzos a gran
escala para producir material para experimentos de animales y las
pruebas clnicas implican la aplicacin de la fuerza bruta de los mtodos
de transfeccin tradicional.

7.3.2 PURIFICACIN

El auxiliar de adenovirus puede ser separado de los preparados de AAV

por tratamiento de calor y/o por la centrifugacin de CsCl para producir
viriones purificados.

8. EFICACIA DEL VECTOR

8.1 ESTUDIOS IN VITRO

Una vez que se ha diseado y producido un vector particular para una

aplicacin dada y se muestra que se puede producir en cantidades
apropiadas, la prxima pregunta que aparece es, funciona? cunto
producto gnico se sintetiza? cul es la duracin de la expresin? Se
pueden dirigir estas cuestiones usando clulas cultivadas.

El primer problema que necesita ser clasificado es si el virus transferir

el gen a las clulas deseadas. Para los vectores de retrovirus, este
problema ser determinado por una protena que lo envuelve. Para los
vectores basados en adenovirus, el conocimiento de la biologa del virus
no permite predecir si el vector entrer en una clula particular o
tejido, porque el tropismo conocido est definido en trminos de
capacidad del virus para replicarse en una clula. Un vector con xito
requiere slo que el virus entre en una clula y exprese un gen exgeno.
Adems, el receptor de adenovirus no est bien caracterizado, de nuevo
hacer una prediccin es difcil. En la prctica los vectores de adenovirus
pueden entrar en la clula de una amplia variedad de tejidos y
especies. El rango del hospedador de AAV es difcil de predecir a partir
de datos de infecciones vricas, porque el virus es defectuoso en cada
caso. En la prctica, como con los adenovirus, los experimentos de
transferencia de genes han demostrado que los vecotres son capaces de
entrar en gran variedad de clulas.

Los marcadores seleccionables son comnmente usados para ayudar en

la identificacin y enriquecimiento de clulas en las que un vector ha
transferido el gen , especialmente con vectores basados en retrovirus y
AAV. La seleccin para la resistencia a G418 en clulas tratadas con un
vector que contiene un gen de resistencia a la neomicina es un modo
poderoso de seleccionar clulas que posiblemente contengan el gen de
inters adyacente.Aunque es de ayuda para estudios iniciales in vitro,
este informacin no es necesaria para indicar el grado de transferencia
del gen que esposible de alcanzar en ausencia de seleccin, excepto
quizs en aquellas raras instancias donde la transferencia del gen
teraputico confiere por s mismo una ventaja selectiva. La
transferencia del ADNc de ADA a clulas T con pacientes deficientes en
ADA es un ejemplo. Algunas generaciones posteriores de vectores
retrovirus no tienen marcadores seleccionables aunque son muy
eficientes, por ejemplo, los vectores basados en MFG en algunso
vectores AAV, el gen teraputico es tan grande como para impedir la
inclusin de secuencias seleccionables.

Los mtodos usados para detectar la transferencia y expresin del gen

no deberan ser slo cuantitativos , sino tambin indicar el porcentaje
de clulas en las que el gen es transferido y expresado. Para detectar la
transferencia del gen, el cido nucleico puede ser examinado por
mtodos basados en Southern, Northern y PCR. El mtodo de la PCR
puedeser extremadamente sensible, pero la mayora de las
configuraciones no son cuantitativas. Ninguno de estos mtodos mide el
porcentaje de clulas para las cuales la transferencia ha ocurrido, pero
se puede calibrar este valor usando los mtodos in situ para detectar el
cido nucleico en la clula diana. El estado de integracin del cido
nucleico del vector transferido es examinado a menudo. Se debe
recordar que, ya que el comportamiento del virus tipo salvaje est bien
caracterizado, un vector relacionado no se comportar necesariamente
del mismo modo. Por ejemplo, en ausencia de rep los vectores AAV no
siempre se integran, y si lo hacen, la integracin puede no retener
siempre la especificidad del tipo salvaje.
La deteccin del producto de la accin proteca codificada por el vector
se puede hacer por muchos mtodos. La inmunocitoqumica es til para
las protenas estructurales y no segregadas, aunque tengan una limitada
sensibilidad para protenas expresadas en pequeas cantidades. Los
mtodos de inmunoprecipitacin se usan algunas veces, pero dan
pequeas indicaciones de la distribucin de la protena. Las protenas
segregadas se detectan a menudo mediante test de ELISA y otros
mtodos basados en anticuerpos con gran sensibilidad. Algunos
productos de la accin proteca son detectados mediante ensayo de
funcin, especialmente varios genes usados comnmente para
propsitos anlticos, por ejemplo, beta-galactosidasa, cloranfenicol
acetil transferasa (CAT) y luciferasa. El colorante de la beta-
galactosidasa es relativamente insensible y subgetiva a ser coloreada
artifialmente en algunas clulas y tejidos, aunque la seal de
localizacin nuclear para distinguir la actividad enzimtica exgena
evita este problema. Los ensayos con luciferasa y CAT son muy
sensibles, pero no dan indicacin de la distribucin de la expresin
gnica.

Los ensayos para determinar la funcin de un gen teraputico expresado

es muy til porque permite testar, por ejemplo, la complementacin
del efecto de un gen, o la inhibicin del desarrollo vrico. La deteccin
de la actividad de los canales para cloro del producto del gen CFTR ,
deriva de pacientes con fibrosis qustica, es un buen ejemplo de este
tipo de ensayo.

La interpretacin de los datos obtenidos usando clulas en cultivo

requiere precaucin. Estas clulas se inmortalizan o se transforman o
son de tejidos o especies inapropiadas. Ms an, sus propiedades de
desarrollo, marcadores de superficie y receptores, el espectro de
protooncogenes celulares expresados y supresores de tumor, e incluso
su contenido de virus endgeno puede diferir de lo normal. Cada uno de
estos factores podra influir en la unin, comprensin y expresin del
vector. Adems, los datos obtenidos en clulas cultivadas ignoran
necesariamente la influencia potencial de las respuestas fisiolgicas in
vivo as como la respuesta inmune. Para mejorar algunos de estos
problemas, se necesita tejido humano primario, pero estos cultivos son
difciles de obtener y desarrollar y tiene una duracin de vida limitada.

El uso de clulas humanas ha sido particularmente til en el estudio de

la transferencia de genes por fibrosis qustica. Por ejemplo, clulas
epiteliales respiratorias primarias pueden ser desarrolladas en
monocapa formando uniones estrechas, permitiendo as el ensayo de
propiedades electrofisiolgicas en cmaras Ussing. Un paso inmediato
entre el cultivo de clulas y animales es el uso de xenoinjertos. Por
ejemplo, la trquea descarnada de rata puede ser poblada con clulas
de los conductos areos humanos e reinjertada en ratones desnudos,
permitiendo el estudio de la clula en monocapa durante algunas
semanas.

8.2 ESTUDIOS EN ANIMALES

Sin duda, los experimentos animales forman parte esencial del estudio
de cualquier aplicaciones de terapia gnica y se deberan iniciar lo
antes posible. Estos experimentos tienen dos objetivos, el estudio de la
seguridad del sistema de vectores y el estudio de la eficacia de la
transferencia de genes.

Los estudios de seguridad se requieren por el FDA antes de que

cualquier protocolo humano se permita. El efecto de la dosis y su
duracin es estudiado en varios animales, incluyendo primates y otros
animales que sean hospedadores para el virus salvaje (por ejemplo, las
ratas del algodn se usan para el estudio de adenovirus). La difusin de
secuencias vitales, especialmente a las gnadas, es examinado y la
replicacin o expresin parcial de los supuestamente virus defectuosos
tambin es testada. Cualquier defecto adverso como la inflamacin tras
la administracin del vector es estudiada. El propsito de estos
experimentos no es mostrar que el vector no tiene efectos adversos, ya
que cualquier clase de droga tiene estas propiedades en algunas dosis.
El objetivo es determinar el tipo de suceso adverso que podra esperarse
si los humanos estuvieran expuestos al vector, y establecer las posibles
dosis con la posible que estos efectos podran ser predichos. Estos datos
permiten la valoracin de la posible proporcin riesgo-beneficio de
cualquier prueba potencial.

Los tests de eficacia requieren el desarrollo de modelos relevantes de

estudio. Por ejemplo, para una enfermedad gentica, un ratn con un
gen eliminado o un animal con el fenotipo apropiado sera vlido. Para
aplicaciones en clulas hematopoyticas se puede utilizar la repoblacin
de la mdula en animales irradiados letalmente o tratados con drogas.
El ratn eliminado no tiene algunas veces el fenotipo predicho; las
clulas hematopoyticas del ratn son ms fcilmente manipuladas,
seleccionadas, desarrolladas y transducidas con el vector que las clulas
de primates y especialmente humanos y los modelos de cncer en la
vida real son impredecibles, a causa de la metstasis de los tumores
humanos.

Las respuestas inmune e inflamatoria al vector viral o a la protena

exgena son importantes parmetros a estudiar. El uso de animales
recin nacidos o ratones desnudos es valioso en los efectos que evaluan
la administracin de vector en ausencia de un sistema inmune completo
funcionamiento. Adems, la tendencia de los ratones que soportan
mutaciones de eliminacin de genes importantes en el sistema de
inmunidad estn disponibles as para que cualquier efecto pueda ser
estudiado en detalle para probar el papel relativo de las diferentes
armas del sistema inmune. Los ensayos sensibles estn disponibles para
detectar un gran espectro de citoquinas de ratn, agentes inflamatorios
y marcadores celulares.

8.2.1 RETROVIRUS

En la mayora de los casos, los vectores retrovirus son aplicados ex vivo.

Las clulas hematopoyticas, epitiales o musculares son objetivos
comunes. La transduccin ha sido demostrada mediante el uso de
clulas de mridos en cultivo, y la repoblacin de animales se ha
alcanzado usando varias molculas de ADN circular. Por ejemplo, los
investigadores han informado de la transduccin de clulas
hematopoyticas con ADNc que codifica globina, glucocerebrsidasas y
ADA; de fibroblastos con el factor IX; y de clulas musculares con el
factor IX, hormona del desarrollo y ADA. Aunque inicialmente se
detectan altos niveles de expresin, en algunos casos las expresiones
disminuyen en un perodo de das a semanas. El anlisis de clulas
transferidas es entonces necesario. Demostrando la persistencia del ADN
integrado en algunos casos, se ha establecido que la expresin que
conduce el promotor del gen exgeno est cerrada . Estos resultados
han llevado a la investigacin de promotores ms apropiados. Aparte de
algunos xitos, la expresin de larga duracin , especialmente de
grandes niveles de protenas, como abundantes factores de coagulacin
de sangre, permanecen problemticos. Adems, las observaciones
hechas u otras especies, especialmente primates (incluyendo humanos),
pueden ser problemticos.
Los sujetos humanos han sido tratados con clulas T autlogas que
codifican ADA y con clulas de hgado transducidas ex vivo con el
receptor de baja densidad de lipoprotenas .

8.2.2 ADENOVIRUS

En los dos ltimos aos, vectores de adenovirus que codifican

marcadores beta-galactosidasa u otras protenas han sido administrados
a un nmero importante de tejidos en animales. De forma
sorprendente, la expresin ha sido detectada en numerosos tejidos,
incluidos pulmn, corazn, hgado, msculo, mdula, cerebro, sistema
nervioso central, clulas endoteliales, riones, clulas de la retina y
tumores slidos. Los individuos con fibrosis qustica han sido tratados
con vectores adenovirus en la nariz y pulmn.

Los niveles de expresin en animales dependen de la cantidad de virus

aadida y del vector usado, pero en general la expresin inicial es
intensa , la duracin de la expresin vara en gran manera. En ratones
desnudos recin nacidos. la expresin es de larga duracin, mientras
que en ratones adultos la expresin decrece mucho en dos o tres
semanas. La prdida de expresin se asocia, particularmente en el
hgado, con las infiltracin de clulas inmunes e inflamatorias. Estudios
anteriores con virus de tipo salvaje en ratones que no eran permisivos a
la replicacin vrica, mostraban dos fases de respuesta caracterizada
por una infiltracin inicial mediada por citoquinas de neutrfilos y
monocitos, seguidos por una respuesta mediada por clulas T . El
esfuerzo ms corriente es focalizar en el intento de comprender los
papeles relativos de los diferentes tipos de clulas en los procesos
inflamatorios, resultantes de la administracin de vectores adenovirus y
la destruccin aparente de clulas tratadas con el vector. Una
proposicin es que los vectores defectuosos expresan an cantidades
significativas de protenas vricas, las cuales son el objetivo de los
linfocitos T citotxicos (CTLs), que en consecuencia eliminan las clulas
que expresan el vector . La sntesis de protenas de vectores
defectuosos podra resultar de la expresin del gen que falla o de la
complementacin del desarrollo del vector en clulas diana por
secuencias E1 integradas por funciones codificadas de la clula
hospedadora con actividad parecida a E1, o por protenass similares
codificadas por otros virus. La hiptesis de destruccin de CPL, ocurre
en contra de anteriores informes en que los adenovirus CTLs estaban
restringidos, al menos en algunos haplotipos para las protenas E1.
Cualquiera que sea el mecanismo en los ratones, las cuestiones reales
son , ocurren estos mecanismos en primates, especialemente humanos,
y si es as, es posible erradicar los efectos? Por ejemplo, la expresin de
la protena del adenovirus E3 gp19 podran reducir la respuesta de
inmunidad del hospedador al vector debido a que esta reduccin es una
funcin normal en el ciclo de vida del virus de tipo salvaje. Otros
acercamientos experimentales incluyen la incorporacin de una
mutacin sensible a la temperatura en el gen E2 para que la protena de
unin al ADN desfavorezca la expresin del gen vrico. Otro
acercamiento es la eliminacin de parte de la regin E4 para el mismo
propsito.

Ya que el ADN del adenovirus raramente se integra, muchas aplicaciones

de la terapia gnica usando vectores de adenovirus requerir una
administracin repetida. Los estudios de dosis repetidas revelan que los
animales pueden volverse resistentes a mltiples administraciones y ala
expresin del gen posterior. Este fenmeno vara con la dosis y el tipo
de administracin y es el sujeto de un intenso estudio. Para los
procedimientos que conlleva la administracin por va de la corriente
sangunea, por ejemplo, al hgado, una explicacin posible es el
desarrollo de anticuerpos neutralizantes humorales. El objetivo de
nuevo es comprender los mecanismos involucrados, as disear vectores
mejorados capaces de evadir los mecanismos de vigilancia.

Un estudio cuidadoso de las respuestas inflamatorias e inmunes definir

para cada aplicacin si existe una ventana teraputica para el uso de los
vectores de adenovirus en la cual la eficacia es evidente y sin toxicidad
asociada. Esta definicin esdifcil porque los resultados obtenidos en
animales raramente predicen lo que ocurrir en humanos. Sin duda,
esta consideracin ha impulsado el argumento para administrar vectores
de terapia gnica a humanos en lo que sera un estado muy temprano
del desarrollo de la droga.

La propensin de algunos vectores de adenovirus a marcar clulas

tratadas para la destruccin se puede usar para aventajar la destruccin
de clulas cancergenas. El uso de vectores suicidas que codifican
agentes citotxicos que a menudo producen efectos presentes junto con
la respuesta inmune provocada en parte por el propio vector podra
probar una aplicacin efectiva de antitumores para los adenovirus.
8.2.3 ADENOASOCIADOS

Las dificultades en generar el vector AAV suficiente han impedido la

disponibilidad de muchos datos animales. Los tratamientos ex vivo de
fibroblastos y clulas hematopoyticas resultaron en la expresin de
genes de globina y el producto gnico de la anemia de Fanconi. La
aplicacin in vivo da vectores para la tirosn hidroxilasa en el cerebro y
vectores que codifican CFTR en conejos y monos que tambin han sido
analizados. Hasta la fecha la expresin ha sido de larga duracin, y los
efectos contrarios de la administracin del vector no han sido
notificados. Mientras se llevan a cabo experimentos con dosis ms altas
necesitaremos establecer si los vectores AAV evitan alguno de los
problemas inflamatorios y de inmunidad vistos con los vectores de
adenovirus y si es as, por qu?

Juan Jos Oliva

Se acaba de graduar como licenciado en Biologa por la Universidad de

Granada

(Esta es la segunda parte de este artculo )

NDICE DE LA SEGUNDA PARTE:

9. Estrategias teraputicas

9.1 Estrategias ex vivo

9.2 Estrategias in vivo

9.3 Terapia gnica in vivo o in vitro?

9.4 Otras estrategias utilizando cidos nucleicos

10. Aplicaciones de la terapia gnica en humanos

10.1 Fibrosis qustica

10.2 Fibroblastos de la piel usados en terapia gnica

10.3 Terapia gnica aplicada a hepatocitos

10.4 Linfocitos modificados genticamente

10.5 Utilizacin de clulas hematopoyticas en la expresin de clulas
en animales

10.6 Deficiencia de adenosn desaminasa en humanos

10.7 Transferencia de mioblastos usada para tratar la distrofia

muscular de Duchenne

10.8 Terapia gnica en la cura del cncer

10.9 Terapia gnica en infeccin por HIV

11. La terapia gnica en el plano jurdico

12. Terapia gnica: perspectivas futuras y consecuencias

12.1 Cuestiones econmicas

12.2 Perspectivas futuras

12.3 Consecuencias de la terpia gnica

13. El negocio de la salud

14. La tica en la terapia gnica

9. ESTRATEGIAS TERAPUTICAS
9.1 ESTRATEGIAS EX VIVO

El tratamiento est basado en la obtencin previa de clulas del

paciente procedentes de un tejido u rgano de inters. A continuacin
se procede a la disgregacin de las mismas y su mantenimiento en
condiciones de cultivo de tejidos in vitro, en donde las clulas son
posteriormente transfectadas por el " gen teraputico" utilizando para
ello un vector adecuado. Las clulas transfectadas son seleccionadas en
funcin de su capacidad para expresar el gen exgeno de forma estable
y persistente. Las clulas as seleccionadas son amplificadas y
recolectadas con el fin de ser reimplantadas al paciente. Tambin se
puede utilizar lneas celulares alognicas en aquellos casos en los que el
rgano o tejido de inters no puede ser extrado con facilidad o que
ofrece dificultada in vitro.

MTODOS DE TRANSFERENCIA GNICA IN VITRO

Mtodos no virales
Qumicos: Fosfato clcico.

Fsicos: Electroporacin, Microinyeccin, Bombardeo de partculas

Fusin: Complejos ADN-liposomas

Endocitosis mediada por receptor: Complejos ADN-protena, Complejos ADN-cpsida/

envoltura viral , Inmunoliposomas/liposomas destinados.

Mtodos virales
Adenovirus

Retrovirus

Virus Adeno-asociados

Herpesvirus.

9.2 ESTRATEGIAS IN VIVO

El tratamiento est basado en la administracin sistemtica de la

construccin gnica de inters. Aunque el ADN puede ser administrado
de forma directa lo habitual es recurrir a la ayuda de algn vector que
facilite el proceso de transferencia del gen y permita la entrada y
localizacin intracelular del mismo, de tal forma que ste resulte en un
gen funcionante. As mismo, es importante recurrir a vectores con
destinos especficos dentro del organismo lo cual permite la entrega
celular selectiva del gen en un determinado rgano o tejido, sin
requerir para ello procedimientos traumticos o quirrgicos.

MTODOS DE TRANSFERENCIA GNICA IN VIVO

Mtodos no virales
Inespecficos

ADN desnudo

Complejos ADN-liposomas
 Especficos

Mediados por receptor

Complejos ADN-protena

Inmunoliposomas/liposomas destinados

Mtodos virales
Adenovirus

Retrovirus

Virus Adeno-asociados

Herpesvirus

9.3 TERAPIA GNICA IN VIVO O IN VITRO ?

La decisin sobre si se debe llevar a cabo in vitro o in vivo la

transferencia de genes depende de un gran nmero de factores,
incluyendo los rasgos fisiolgicos del tejido diana daado, la naturaleza
del tejido con respecto a los genes que deben ser transferidos, la
facilidad para transferir los genes dentro de las clulas, la habilidad
para llegar hasta ese tejido diana, su respuesta frente al mtodo de
transfeccin, etc. As, el hecho de elegir un tipo de estrategia u otra es
resultado de extensos y laboriosos estudios para cada tipo de trastorno.

De modo que no hay un patrn generalizado para cada enfermedad , y

por tanto los investigadores se encuentran cada vez, con ms obstculos
que resolver a la hora de llevar a cabo el ensayo. Por otra parte,
algunos resultados, in vitro dan esperanzas sobre su aplicacin in vivo,
pero sin embargo los datos obtenidos de experiencias in vivo rozan en la
mayora de los casos el duro y desolador fracaso. Lo cual dificulta an
ms si cabe las aplicaciones y desarrollo de tcnicas en la terapia
gnica.

9.4 OTRAS ESTRATEGIAS UTILIZANDO CIDOS NUCLEICOS

Como ya hemos visto la terapia gnica supone la manipulacin de las

clulas utilizando procedimientos destinados tanto a reparar e
incorporar nuevos genes en la clula como tambin a bloquear e inhibir
la sobreexpresin de los mismos con fines teraputicos.
OLIGONUCLETIDOS ANTISENTIDO

Los oligonucletidos son secuencias cortas de cidos nucleicos diseados

para unirse a secuencias especficas de ADN (formacin de ADN triplex)
o ARN (formacin de heteroduplex ARN-ADN). Los oligonucletidos
antisentido son complementarios de secuencias especficas de un
determinado ARN mensajero (secuencia sentido) . La formacin de un
heteroduplex bicatenario sentido-antisentido bloquea la traduccin del
mensaje gentico a protena. Las estrategias antisentido tienen un gran
potencial teraputico para inhibir la expresin de genes en patologas
tales como el cncer, enfermedades autoinmunes y enfermedades
infecciosas como el SIDA. Sin embargo, su utilizacin en clnica se ha
visto limitada por su corta vida media en la circulacin sistemtica y su
dificultad para acceder con actividad funcional al citoplasma y/o ncleo
celular.

Ms adelante en el apartado sobre aplicaciones sobre el cncer se

explicar este tipo de estrategia con mayor profundidad.

REPARACIN GNICA MEDIANTE OLIGONUCLETIDOS

Es una estrategia destinada a reparar genes cuya alteracin es originada

por una mutacin puntual conocida y el objetivo es activar
selectivamente los mecanismos celulares de reparacin del ADN, el el
lugar de la mutacin. Para ello se disean oligonucletidos especficos
para secuencias genmicas adyacentes al lugar de la mutacin, en cuyo
extremo el oligonucletido lleva un agente capaz de lesionar el ADN ,
mediante la formacin de un enlace covalente con el nucletido
responsable de la mutacin . La lesin selectiva del nucletido mutado,
desencadena el proceso celular de reparacin del ADN que conduce a
una normalizacin estructural y funcional del gen.

RIBOZIMAS

El trmino ribozima ha sido introducido para describir molculas de ARN

con actividad enzimtica. Se ha identificado una enorme variedad de
motivos catalticos de ribozimas, todos los cuales catalizan reacciones
en sustratos de ARN.Estas reacciones llevan a cabo la rotura y ligacin
de las cadenas en sitiosespecficos. Una caracterstica comn para todos
los ribozimas es el requerimiento del in de un metal con carga
divalente, como el magnesio Mg+2 , que participa en la reaccin
qumica. Diferentes centros catalticos de ribozima han sido
incorporados en ARNs antisentido, de tal forma que le dan la capacidad
de aparearse con un ARN diana que son sustratos para dichos centros
cortndolos en sitios especficos. La actividad del centro cataltico de
ribozima da el corte y destruccin del ARN diana. Aparejando el
ribozima con el sustrato necesitara poco tiempo para cortar el ADN
diana, inactivndolo funcionalmente.

Una vez que la diana ha sido cortada, el ribozima puede disociarse de

los productos cortados y repetir el ciclo de unin , rotura y disociacin.
La habilidad de los ribozimas para cortar dianas y despus reciclarlas
proporciona una ventaja sobre los ARN antisentido estandar; as acta
estequiomtricamente, y no destruye la funcin del ARN diana.

Los ribozimas pueden ser producidos qumica, bioqumicao

biolgicamente, y algunas caractersticas de los oligodesoxinucletidos
antisentido tales como modificaciones qumicas en la cadena o en las
uniones entre nucletidos, pueden ser incorporadas dentro de la
molcula del ribozima sinttico, as aade estabilidada la molcula.

La especificidad de apareamiento de bases, puede ser usada para dirigir

los ribozimas a sus dianas, de ese modo se sugiri desde etapas muy
tempranas en el conocimiento de los ribozimas que estas molculas
nicas podran ser creadas por ingeniera para reconocero aparearse con
bases del ARN diana de cualquier clula o virus.

Aunque se han hecho significativos progresos en la ingenieria de

ribozimas, todava hay un montn de cosas que deben ser aprendidas en
orden para optimizar la funcin del complejo de los ribozimas en el
comportamiento intracelular. Hasta estos das, la mayora de
experimentos intracelulares con ribozimas han sido llevados a cabo con
los ribozimas denominados "cabeza-martillo" (hammerhead). De
cualquier manera, otros motivos de ribozimas, tales como los
llamados "horquilla" (hairpin), comparte mucho de los mismos
requerimientos bsicos para maximizar la eficacia intracelular. As, la
aplicacin con xito del ribozima "cabeza-martillo" debera proporcionar
valiosas lecciones para aplicaciones de otros motivos de ribozimas.

La simplicidad del dominio cataltico de "cabeza-martillo" lo ha hecho

popular en el diseo de ribozimas que actan en trans. Los
requerimientos en el sitio de corte son relativamente simples, y
virtualmente cualquier UX (donde X es U, C o A) pueden ser dianas,
aunque la eficiencia de la reaccin de rotura vara entre diferentes
combinaciones.

Por otro lado una versin de ingeniera del ribozima "horquilla", tambin
llamado "grapa", ha sido capaz de cortar y reciclar mltiple variedad de
dianas en trans. Aunque hay una serie de cambios en el sustrato para
este tipo de ribozima. Entre stos, incluye una G obligatoria junto al
sitio de rotura en el 3'. Por otro lado, hay bastante flexibilidad en las
combinacionesde secuencia gua-sustrato, lo que hace que tenga un
potencial xito contra una amplia variedad de ARN diana. Estos ARNs
catalticos son relativamente simples y pueden ser construidos para
esconder secuencias que faciliten el apareamiento de bases frente a un
ARN deseado.

Hay cinco reas de investigacin que podran llevar a un aumento en la

eficacia intracelular de los ribozimas. Estos son:

El reparto de ribozimas a clulas apropiadas.

La eficiente expresin de los ribozimas en estas clulas.

La co-localizacin de los ribozimas y el sustrato de ARN diana en el mismo

compartimento.

La especificidad de los ribozimas para reconocer y cortar slo la diana del sustrato de
ARN.

El aumento del reciclaje del sustrato mediado por los ribozimas.

1) Reparto de ribozimas

El efectivo uso de ribozimas como agentes teraputicos depende de los

mtodos ideados en el reparto de construcciones de genes de ribozimas
para que de la expresin de los ribozimas en las clulas dianas
apropiadas.

El reparto se puede llevar a cabo por los diferentes mtodos que hemos
visto. Hasta el da de hoy, el sistema ms explotado se hace usando
vectores de retrovirus. Estos vectores pueden ser construidos para
esconder entre la ARN polimerasa II y III unidades de transcripcin para
la expresin de ribozimas . De cualquier manera, la utilidad general de
los vectores retrovricos en la terapia gnica basada en los ribozimas
puede ser limitada por la baja eficiencia de transduccin en clulas
primarias, debido a la integracin al azar del ADN viral y la frecuente
silenciacin transcripcional de los genes codificados.

Otro vector desarrollado para este reparto son los virus adenoasociados
(AAV) los cuales tienen una elevada eficiencia de transduccin y la
potencial integracin en una localizacin nica en un cromosoma. Los
adenovirus por su parte no garantizan la integracin del vector viral. En
mtodos virales sin embargo no dan el reparto de los genes de ribozimas
ex vivo, lo cual dificulta un poco la manipulacin y el xito del sistema.

2) Estrategias de expresin de ribozimas

La eleccin del contexto de la secuencia del promotor para la expresin

intracelular de los transcritos de ribozimas, es uno de las decisiones ms
importantes que necesitan ser hechas para una aplicacin intracelular
con xito de ribozimas. Las mayores consideraciones son la eleccin de
un sistema de expresin ( ejemplo, inducible, especfico del tejido o
promotores constitutivos) , y los posibles efectos adversos o tiles de
secuencias en cis- que se requieren para dar el "cap" en el ARN, la
terminacin del transcrito y la exportacin desde el ncleo al
citoplasma.

De modo esquemtico presentaremos algunas de las ltimas

innovaciones en este campo.

a) Representa fusiones del represor (R) de la tetraciclina (TET) con el

virus del herpes simple (HSV) y su transactivador VP16; las fusiones
estn unidas a el operador de TET que est posicionado aguas arriba de
un promotor basal. En ausencia de tetraciclina, el complejo se une a la
regin operadora, activando la transcripcin. En presencia de
tetraciclina, la transcripcin es "apagada" porque el represor interacta
con el antibitico y no puede alargarse la unin a los operadores. UTR
son regiones no trasladables.

b) y c) representan promotores en cassette de la polimerasa III

derivados de un ARNt. La ribozima reemplaza o parte del lazo del
pseudouracilo por un aceptoraminoaclico (en b), est insertado
dentro del anticodn del lazo (en c).

En ambos casos, las cajas A yB estn insertadas intactas y son

requeridas para la expresin; una hilera de 5 timinas (uracilos en ARN)
terminan la transcripcin.
d) muestra una representacin de un promotor para un ARN nuclear
pequeo (ARNns) U6. Este es un promotor de polimerasa III similar a el
del ARNt; de cualquier manera, los elementos de regulacin del
promotor estn aguas arriba de la regin que codifica el "maduro" . La
construccin de ribozima est posicionada inmediatamente despus de
la seal para dar el "cap" (una pequea estructura en lazoy un corto
tramo de nucletidos unidos o adyacentes) as una apropiada unin del
cap al transcrito puede tener lugar. La terminacin de la transcripcin
est sealizada por una regin de 5 timinas (uracilos en ARN). DSE
representa potenciadores a larga distancia, y PSE es un elemento de
secuencia prxima. El transcrito de la polimerasa II y del promotor U6
se les unen la caperuza, mientras que los ARNt transcrito no tienen.

3) Co-localizacin de ribozimas y ARNs diana

Las estrategias para potenciar la accesibilidad del ARN diana

juntamente con la ribozima en un complejo compartimento intracelular
es un aspecto intensamente estudiado por ser de inters en la
optimizacin de la funcin intracelular de la ribozima.

Las primeras investigaciones fueron llevadas a cabo por Sullenger y Cech

, que demostraron que la co-localizacin de un ribozima con el ARN
diana daba una mejora importante en la eficiencia de un ribozima
"cabeza-martillo". En este experimento el ribozima y la diana estn co-
localizados va vector retroviral. As el ribozima era slo efectivo
cuando los ARNs eran co-empaquetados.

Todava se conoce poco sobre los mecanismos que regulan las vas de
movimiento de transcripcin a translacin para la mayora de los ARNs.

Los transcritos nucleares estn procesados y migran a travs de vas

especficas. No se puede pronosticar por tanto la ruta y la distribucin
de los transcritos nucleares. As, hay numerosos ejemplos de ARNs que
se localizan en regiones especficas del citoplasma. La estrategia de co-
localizacin puede cojer la ventaja de varios eventos de procesamiento
post-transcripcional que tienen lugar en el ncleo de la clula.

La insercin de ribozimas que actan en trans- en ARNs que son dirigidos

dentro del ncleo, pueden ser usados para concentrar ribozimas dentro
del ncleo.
La co-localizacin de ribozimas con ARNm en el ncleo puede ayudar a
aumentar la posibilidad de la interaccin ribozima-diana antes de que la
translacin ocurra en el citoplasma.

Para muchas dianas, el mejor compartimento para la interaccin con un

ribozima puede determinarse slo empricamente. Por lo tanto, es
importante que diferentes estrategias se intenten en orden para
determinar cual es la ms eficaz para un ribozima dado y combinacin
de diana.

4) Reciclaje del sustrato por los ribozimas

El apareamiento especfico de bases determina la sellecin de un

ribozima para una diana. Como todas las secuencias de ribozimas tienen
diferente potencial en las interacciones de apareamiento de bases, una
acumulacin de datos de diferentes experimentos de ribozimas
requeridos para una rigurosa valoracin de combinaciones ptimas en la
composicin y longitud de las secuencias que aparean. A su vez,
mutaciones en el sitio de rotura pueden afectar a la eficiencia del
ribozima.

Como conclusin, podemos decir que los ribozimas son ARNs catalticos
que pueden actuar como una endoribonuclesa de secuencia especfica,
para lo cual utilizan unas Secuencias Gua Internas (IGS) que le permiten
unirse a secuencias complementarias (antisentido) de un determinado
ARN. Mediante mutaciones del elemento IGS es posible cambiar la
especificidad del ribozima hacia un ARN especfico conteniendo las
secuencias complementarias a la nueva secuencia de la regin IGS. Se
han aprobado ensayos clnicos utilizando ribozimas en pacientes con
SIDA, con el fin de intentar degradar molculas especficas de ARN en
las clulas infectadas con el VIH.

10. APLICACIONES DE LA TERAPIA

GNICA EN HUMANOS
Existe una gran esperanza para pacientes afectados que puedan ser
tratados por terapia gnica, por la cual, se le sustituye un gen defectivo
por un gen normal. An as, los obstculos que supone la terapia gnica
son muy importantes. Se necesita mucha informacin sobre la patologa
molecular de un desorden gentico, antes de que los investigadores
puedan decidir si este desorden es factible a la terapia gnica, y si es
as, tambin habra que tener en cuenta diferentes asusntos sociales y
icos. El gen en cuestin debe ser clonado y adems debe existir una
manera segura de introducir el gen en las clulas. Los primeros
experimentos en los que clulas tratadas genticamente o manipuladas,
y fueron introducidas en pacientes humanos comenzaron en 1.989, y las
primeras pruebas clnicas sobre terapia gnica, para las eficiencia de
adenosin desaminasa, comenzaron el Septiembre de 1.990.

A continuacin discuteremos las tcnicas de terapia gnica empleadas

en las diferentes enfermedades humanas as como sus problemas y
resultados.

10.1 FIBROSIS QUSTICA

Se han utilizado muchos experimentos en los que se usaron cultivos

celulares para encontrar un camino eficiente para introducir genes
humanos en clulas sin que sufran reordenamientos u otras alteraciones
que puedan afectar a la expresin gnica, es decir, que el gen
introducido sea estable.

El gen para la fibrosis qustica (CF) era un objetivo importante para la

terapia gnica. In vivo se haban descrito anormalidades en la
conductancia en los canales de cloro, y una lnea celular CF- expresaba
el mismo defecto. Esta lnea celular se utiliz en ensayos que
intentaban estudiar la actividad del gen CF introducido en la clula. Uno
de los vectores que ms se han utilizado en la lucha contra la fibrosis
qustica ha sido el vector retroviral. Un ADNc para el gen regulador de
la conductancia transmembrana de la fibrosis qustica (CFTR) era
construido por el solapamiento de tres clones ADNc, y un ADNc
completo era clonado en un vector retroviral. Las clulas CF- eran
infectadas por un vector retroviral que llevaba un gen CFTR, y la clula
con el provirus integrado eran seleccionadas por su resistencia al G418.
Las clulas expresaban el gen CFTR. Los datos ms interesantes
procedan de las medidas del grado de funcionamiento de los canales
para el cloro. El flujo aninico de las clulas en respuesta a una
estimulacin por la adenilato ciclasa proporciona una conductancia para
el cloro semejante. En ausencia de un determinado estimulador de la
adenilato ciclasa, el flujo aninico de las clulas CF- y de las clulas CF-
que contienen el gen CFTR introducido se pierde. Si se le adiciona este
determinado activador de la adenilato ciclasa, el flujo aumenta
rpidamente en clulas CF- con CFTR , pero en las clulas CF- el flujo
permaneca bajo. Se utilizaron tcnicas electrofisiolgicas para
determinar si la conductancia para el cloro influa en ese flujo aninico.
Estos experimentos mostraron que las corrientes de cloro se detectaban
nicamente en las clulas CF- con CFTR. Significativamente, la
respuesta de las clulas CF- con CFTR es comparable con las respuestas
traqueales humanas normales y alienta la esperanzas de que la terapia
gnica para la fibrosis qustica , usando vectores retrovirales
directamente sobre el epitelio pulmonar por medio de aerosoles, sea
posible.

10.2 FIBROBLASTOS DE LA PIEL USADOS EN TERAPIA GNICA

Un tipo de clulas que sirve como vehculo para transferir genes son los
fibroblastos de la piel. Estas clulas han sido usadas en pacientes
afectados de mucopolisacaridosis, que es una enfermedad hereditaria
que se caracteriza por la deficiencia de enzimas lisosomiales. Los
fibroblastos se obtienen fcilmente crecen bien en cultivo, y pueden ser
infectadas eficientemente con vectores retrovirales. Por ejemplo, las
clulas de un paciente afectado por la enfermedad de Gaucher
(deficiencia de glucocerebrosidasa) eran infectadas con un vector
retroviral que contena un ADNc de la glucocerebrosidasa. Los niveles de
enzima en las clulas infectadas alcanz el nivel de las clulas
normales.

En el caso de la deficiencia de adenosn desaminasa, los fibroblastos de

la piel infectados con un retrovirus que llevaba un ADNc de ADA
produca ms ADA que las clulas normales. Los investigadores calculan
que se necesitan ms de 4x10e8 fibroblastos tratados genticamente
para producir efecto teraputico en pacientes.

Una cuestin importante sera conocer si los fibroblastos de la piel

podran sintetizar y secretar gran cantidad de una protena que no es un
producto normal de esa clula. Por ejemplo, podra un fibroblasto de la
piel tratado genticamente ser usado para producir el factor IX en
pacientes con hemofilia B? Los fibroblastos humanos son infectados in
vitro por un vector retroviral basado en un MoMLV, que contiene un
ADNc del factor IX dirigida por un promotor intensificador de un
citomegalovirus. Por radioinmunoensayo sedetermin que estas clulas
infectadas producan gran cantidad de factor IX. Este factor IX es
completamente funcional e indistinguible del factor IX original del
plasma.

Como conclusin, los ltimos avances a la hora de perfeccionar las

tcnicas tanto en el cultivo de clulas de la piel como de producir
vectores estables y fiables para expresar e introducir informacin
gentica en estas clulas, unidos a la relativa facilidad con que estos
cultivos son transplantados , hacen suponer que,en aos venideros, la
piel ser uno de los primeros y ms atractivos sistemas para corregir
enfermedades mediante terapia gnica, contribuyendo as a la
revolucin de los mtodos teraputicos que esta nueva disciplina, sin
duda, introducir en la Medicina.

10.3 TERAPIA GNICA APLICADA A HEPATOCITOS

Otro tejido diana para la terapia gnica es el hgado . Un gran nmero

de enfermedades metablicas hereditarias afectan al hgado, y el
transplante de hgado ha sido utilizado para tratar estas enfermedades y
otras como son la hipercolesterolemia y hemofilia. Estas tcnicas se han
desarrollado a partir de aislamiento y cultivo de hepatocitos. Ejemplos
de la utilizacin de estos hepatocitos es el estudio y tratamiento por
terapia gnica de la hipercolesterolemia en humanos. Esta es una
enfermedad hereditaria causada por mutaciones en el receptor de la
lipoprotena de baja densidad (LDLR), y aquellos pacientes que son
homozigticos para la mutacin del gen de LDLR generalmente mueren
por un ataque al corazn antes de los 20 aos. En este experimento los
vectores retrovirales que llevan el gen para el LDLR humano se usan
para infectar cultivos de hepatocitos. Se obtenan lneas celulares que
eran capaces de degradar las lipoprotenas de baja densidad a un nivel
ms o menos normal. Hasta ahora este experimento slo se ha utilizado
en cultivos celulares , aunque es uno de los ms seguros a probar en
individuos.

Un experimento que se quiere hacer en humanos y que ahora slo se

hace en ratones es transferir los genes alfa-1 antitripsina humanos
(hAAT) y el gen beta-galactosidasa de E. coli a hepatocitos.

10.4 LINFOCITOS MODIFICADOS GENTICAMENTE

Un sistema de entrega a clulas de melanomas malignos est siendo

utilizada en experimentos clnicos. Los linfocitos infiltrantes en tejidos
(TILs) son linfocitos que se infiltran el tumores slidos y que pueden
matar clulas tumorales si se administran junto a la interleuquina 2 (IL-
2),que es un factor decrecimiento de linfocitos. Cuando los TILs eran
aislados de melanomas malignos, estimulados en su crecimiento en un
cultivo tisular con IL-2, y se inyectaban de nuevo al paciente, en
ocasiones producan la regresin del melanoma. Para intentar conocer
como los TILs trabajan in vivo, es importante conocer cuantos de los
TILs transplantados sobreviven y si alcanzan los tumores. Una estrategia
que se ha desarrollado para seguir los TILs inyectados al paciente es
marcarlos con retrovirus. La primera vez que se hizo este experimento
en clulas humanas genticamente modificadas se utiliz un vector
retroviral que llevaba el gen de resistencia a la neomicina. Antes de que
los experimentos clnicos comenzaran, se ha visto que los TILs eran
eficientes y establemente infectadas con un vector, que eran muy
resistentes al G418 y de que la integracin retroviral no alteraba la
caracterstica de crecimiento de las clulas. Cinco pacientes fueron
tratados con estos TILs. Se le retir al tumor a cada paciente y los TILs
se hicieron crecer en un cultivo con interleuquina-2 . Las clulas
infectadas con un vector retroviral en los que los genes gag,
pol y env fueron sustituidos por el gen para la resistencia a la
neomicina. El porcentaje de las clulas en las que el neogn se haba
integrado establemente era del 1-11%. Los pacientes recibieron al
menos 10e11 TILs que procedan de sus propios tumores. Muestras de
sangre tomadas en das siguientes fueron sometidas a la PCR, y se vio
que los TILs modificados genticamente que contenan el neogn
estaban presentes en tres pacientes. Sesenta das despus slo se
detectaba en dos pacientes. An as, se encontraron clulas que
contenan el neogn en muestras de tejido tumoral, pero no est claro
si estas clulas tomaron este neogn por suerte o por transferencia de
un vector. La conclusin que se sac, es que los TILs son tiles para
tratar clulas tumorales, pero todava no se ha comprobado el
rendimiento que puede sacarse de esta facultad ya que los resusltados
son contradictorios segn diferentes pruebas.

10.5 UTILIZACIN DE CLULAS HEMATOPOYTICAS EN LA EXPRESIN DE

CLULAS EN ANIMALES

De la misma manera que el retrovirus acta como un vector para

transportar un gen a una clula, la clula puede ser considerada como
un vector en el siguiente paso del proceso, que es transportar el gen al
cuerpo del paciente. Qu requisitos deben cumplir estas clulas? Deben
ser fciles de obtener, crecer bien en cultivo y de soportar la infeccin
retroviral. Despus de la infeccin, la clula vector debera ser fcil de
devolver al paciente y debera continuar viva por varios meses,
preferentemente por el bien del paciente.Las clulas de la mdula
poseen algunas de estas caractersticas. La mdula contiene clulas
stem que pueden dar lugar a todas las clulas de la serie
hematopoytica. La infeccin de estas clulas stem hace que aparezcan
diversas que contengan el gen teraputico. Tambin se han utilizado las
clulas de la mdula para tratar enfermedades hematopoyticas, en
otras palabras, las tcnicas para reconstruir la mdula de los pacientes
se est trabajando intensamente. Uno de los mayores inconvenientes de
usar clulas de la mdula como vectores celulares, es que tienen
dificultad de producir altos niveles de expresin del gen introducido. En
uno de los experimentos, el gen intacto de la beta-globina humana con
secuencias adyacentes en 3' y 5' son usadas en la cosntruccin de
retrovirus. El retrovirus que lleva el gen de la beta-globina se inyectaba
en las clulas de la mdula y posteriormente se vio que eritrocitos que
procedan de estas clulas medulares llevaban beta-globina funcional.

10.6 DEFICIENCIA DE ADENOSIN DESAMINASA EN HUMANOS

Se debe a un trastorno autosmico recesivo. Su deficiencia origina una

disfuncin intensa en las clulas T y B , que provoca la muerte de los
pacientes antes de los dos aos de edad por infeccin masiva. Se
comenz a estudiar su tratamiento por terapia gnica en 1.990 para una
mutacin en el gen adenosn desaminasa. Los nios aquejados de este
mal eran incapaces de iniciar una respuesta inmunitaria ante las
infecciones y estaban abocados a una vida muy limitada, ( "nios
burbuja"). Sin una especial atencin moran irremediablemente.

Dos nios de cuatro y nueve aos con deficiencia de ADA estn

recibiendo terapia gnica. De los nios se aislan linfocitos T, a los que
se les introduce un gen ADA normal usando un vector retroviral, y son
devueltos a los pacientes. Los nios han estado recibiendo clulas con
genes corregidos cada uno o dos meses durante un ao y estos nios
mostraron mejoras clnicas significativas. Ahora son capaces de iniciar
una respuesta inmunitaria y se ha producido una importante decrecin
del nmero de infecciones. El nio de menor edad, que ha sido tratado
por ms tiempo, puede llevar una vida completamente normal. Estos
resultados son muy esperanzadores, y si la terapia gnica en clulas
stem de la mdula avanza, no ser necesario un injerto continuo de
clulas modificadas.

Actualmente, el tratamiento preferido esel transplante de mdula sea

de un donante HLA idntico, que puede producir una curacin completa
aunque conlleva una alta morbilidad . Pero menos de un 30% de los
pacientes tienen un hermano HLA idntico. La sustitucin enzimtica no
consigue una restitucin completa y produce otros efectos txicos. Un
tratamiento sustitutorio consiste en inyectar el enzima ADA combinada
con polietilenglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de
la enfermedad.Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de
eficacia inconstante.

Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace

ya ms de cuatro aos ensayos clnicos de transferencia gnica de ADA
hacia los linfocitos T perifricos, previamente tratados in vitro. Aunque
algunos pacientes experimentaron una notable mejora clnica e
inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y
no llegan a normalizarse todos los ndices de la funcin inmunitaria. En
opinin de algunos, ni en este pionero ensayo ni en otros existen
evidencias inequvocas de que el tratamiento gentico ha producido
beneficios teraputicos . Los riesgos de posible mutagnesis insertiva de
genes relacionados con el cncer, despus de repetidas transferencias
retorvirales, no se han visto confirmadas hasta el momento . Pero los
modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos
clnicos en Italia y Pases Bajos. Segn sus autores, en uno de estos
ltimos ensayos la transferencia gentica haba funcionado y se haba
conseguido la reconstitucin inmunitaria. En todo caso, es preciso tener
en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo tambin inyecciones
rutinarias de ADA sinttica, y estos tratamientos convencionales podran
ser responsables en buena parte de su buena salud.

10.7 TRANSFERENCIA DE MIOBLASTOS USADA PARA TRATAR LA

DISTROFIA MUSCULAR DUCHENE

Los mioblastos son las clulas stem del msculo esqueltico. Durante el
desarrollo, los mioblastos se fusionan para formar fibras musculares
multinucleadas. Un pequeo nmero de mioblastos no se fusionan y
forman clulas individuales, llamadas clulas satlite, que se situan
entre las membranas de las fibras musculares y de la matriz extracelular
que cubre las fibras musculares. Las clulas satlite poseen la habilidad
de fusionarse con otras clulas satlite y fibras musculares para tomar
parte en la regeneracin muscular. Los mioblastos se convierten as en
las clulas vector ideal para transportar genes a las fibras musculares.

Un obstculo en la terapia gnica de la DMD es que el gen y su ADNc son

muy grandes. Esto se ha conseguido superar por la construccin con un
ADNc completo para la distrofina, que se puede expresar en clulas. Dos
ADNc bibliteca ( A y B ) fueron construidos en los cuales la
reversotranscriptasa fue directamente a comenzar la sntesis de las
primeras cadenas de ADN en dos puntos del ARN mensajero de la
distrofina. Estos puntos se especificaron por suplantar dos primers que
hibridaban por la mitad (biblioteca A) o con el extremo 3' (biblioteca B)
del ARN mensajero. Estos clones contenan 78Kb. del extremo 5' del gen
y 8 Kb. fueron aisladas del extremo 3' de la biblioteca A y B
respectivamente. Estos clones fueron solapados en 18 Kb. y se ligaron a
una porcin de un sitio de restriccin para dar un ADNc completo. Esto
se clon en un vector SV40 y se transfect por electroporacin en
clulas COS. Usando anticuerpos para la distrofina demostraron que se
produca una molcula correcta de distrofina en las clulas COS, y
estudios inmunofluorescentes demostraron que se localizaba en la
membrana celular. Aunque estos experimentos demuestran que genes
grandes como el de la distrofina pueden ser manipulados in vitro, pero
puede pasar mucho tiempo hasta que esta terapia pueda tener
aplicaciones clnicas.

10.8 TERAPIA GNICA EN LA CURA DEL CNCER

El diagnstico del cncer a nivel molecular permitir un pronstico ms

preciso; pero an podemos llegar ms lejos utilizando una terapia
gnica que tiene como finalidad la destruccin selectiva de la clula
tumoral. La prdida del oncosupresor p53 puede ser corregida
introduciendo una copia sana en la clula neoplsica; la sobreexpresin
del oncogen k-ras tambin puede suprimirse introduciendo el gen k-ras
antisentido que inactive su expresin o bloquee sus ARNs. Los retrovirus
permiten introducir genes, potencialmente suicidas, en el seno de un
tumor ya que infectarn e insertarn su ADNc en clulas en divisin; los
adenovirus, aunque no integren en el huesped pueden permanecer
activos el tiempo suficiente para destruir el tumor. Tambin es posible
introducir en el tumor o en el organismo genes inmunoestimulantes,
como la interleuquina (IL2) , que potencialmente protege de distintos
tipos de cncer y de sus recidivas. Las inmunotoxinas son el resultado
de acoplamiento de toxinas muy letales (como la diftrica o la ricina) a
anticuerpos monoclonales especficos de carcinomas, constituyendo las
denominadas bombas biolgicas, puesto que son como proyectiles
letales dirigidos contra clulas tumorales. Por ltimo , la terapia gnica
permite elaborar vacunas a partir de las propias clulas tumorales de un
paciente por manipulacin ex vivo y reinsercin en el organismo de
partida.

Dentro del campo de las aplicaciones de la terapia gnica en el hombre,

se puede considerar el cncer como el rea ms importante y de ms
rpida expansin.

SUSTITUCIN DE ONCOSUPRESORES DEFECTUOSOS POR INGENIERIA GENETICA

Las propiedades neoplsicas de numerosos cultivos celulares pueden

revertirse con frecuencia, al insertar una copia normal de un
oncosupresor como pueden ser rb, dcc o p53. Es muy posible que la
introduccin de p53 en un tumor que carezca de la funcin de este gen,
pueda restaurar la normalidad tisular. Se estn realizando ensayos
clnicos en los que se depositan broncoscpicamente en las
inmediaciones de un tumor de pulmn , retrovirus que llevan una copia
intacta de p53. La eficacia de esta terapia se ver incrementada si en
vez de hacer llegar al tumor un nico oncosupresor, se elaboraran "lotes
gnicos" de varios oncogenes y oncosupresoresque simultneamente
corrijan las alteraciones acumuladas en las clulas del tumor. Un nico
vector que porte varios oncogenes/oncosupresores o una mezcla de
vectores que contenga cada uno un tipo de oncogenes/oncosupresores
son las dos modalidades con las que se especula en la actualidad.

INHIBICIN MOLECULAR DE LA EXPRESIN DE ONCOGENES

Tanto los tumores slidos como las leucemias y linfomas exhiben

activacin mutacional o sobreexpresin de oncogenes u oncosupresores
mutados ; la malignidad de las clulas podra desaparecer impidiendo la
expresin de los oncogenes y oncosupresores por administracin de
pequeos oligodesoxinucletidos complementarios a los ARNs
mensajeros y ADNs correspondientes.

Debemos aclarar, sin embargo, que este tipo de tratamiento difiere

sustancialmente de las terapias genticas tradicionales. En la mayora
de los tratamientos genticos, se suministran genes enteros y sanso para
sustituir las verisones que faltan o que son defectuosas e incapaces de
dirigir la sntesis de una protena necesaria. Los oligonucletidos no
pueden producir protenas. Su virtud radica en la capacidad para
bloquear la expresin de genes existentes.

Los oligonucletidos antisentido son la primera de las nuevas medicinas

genticas que han llegado a la etapa de ensayo clnico. De su
potencialidad teraputica se sospech ya a principios de los 80, cuando
se descubri que ciertos microbios, adems de fabricar ARNs
mensajeros, tambin producan de forma natural ARN antisentido. La
explicacin ms lgica para este comportamiento pareca ser que el
organismo utilizaba las molculas antisentido como forma de regular la
expresin gnica. Si el ARN antisentido se empareja con su molcula
complementaria de ARN mensajero, cabe pensar que bloquear la
maquinaria celular encargada de traducir en protenas la cadena con
sentido.

Las clulas vegetales y animales emplean a veces la estrategia

antisentido para controlar la expresin gnica. Con la ayuda de las
tcnicas del ADN recombinante crearon genes que producan versiones
antisentido de ciertos ARN mensajeros seleccionados. Cuando se
introducan esos genes en la clulas se comprobaba que, en efecto,
ocasionalmente se consegua disminuir la produccin de la protena
cifrada por la cadena de ARN que era blanco del antisentido.

Los resultados sugeran la posibilidad de disear molculas antisentido

que funcionasen a la manera de drogas e impidiesen selectivamente la
traduccin. Sin embargo, para utilizarlas como tales drogas, haba que
enviarlas al interior de las clulas del cuerpo, y hacerlo de una forma
fcil y eficaz. En la mayora de los casos, lo mejor sera administrar
pequeos fragmentos de antisentido sintticos, en vez de genes
enteros.

La construccin del primer oligmero surgi en 1.978, reconoca el ARN

mensajero del virus del sarcoma de Rous y disminua su replicacin en la
clula lo que indicaba que haba bloqueado la produccin de protenas
vricas.

Dos consideraciones a la hora de fabricar un oligonucletido son:

primero, los oligonucletidos sin modificar portan una carga negativa en
la cadena del grupo fostato. Las molculas dotadas de carga suelen
tener dificultades para atravesar las membranas celulares, que no estn
cargadas. La mayora de los investigadores daban por supuesto que los
oligmeros con muchas cargas seran incapaces de entrar eficazmente
en las clulas. En segundo lugar, las clulas poseen numerosas enzimas
que degradan el ADN forneo. Caba pensar entonces en una pronta
degradacin de los oligmeros que consiguiesen entrar en las clulas.

Para ello reemplazaron un tomo de oxgeno de cada grupo fosfato por

un grupo metilo (-CH3 ). Convertan as los fosfatos cargados
negativamente en unidades sin carga: los metilfosfonatos. De esa
menera los oligonucletidos entraban mejor en las clulas y resistan el
ataque enzimtico. Pero al eliminar las cargas, los oligmeros se volvan
hidrofbicos y se hacan insolubles en soluciones acuosas, esta falta de
solubilidad puede dificultar la produccin en masa.

Otra alternativa a los metilfofonatos era intercambiar un tomo de

oxgeno de los grupos fosfato por un tomo de azufre cargado
negativamente. Estos oligmeros fosfotiolados son conocidos
como oligos S, que son solubles en agua, fciles de producir y reistentes
a la degradacin enzimtica.

Los oligonucletidos antisentido pueden bloquear la traduccin al menos

de dos maneras. Obstaculizan la "lectura" normal del ARN con sentido.
y, adems, al unirse al ARN mensajero estimulan a una enzima
(ribonucleasa H) que corta, y por tanto destruye, al ARN mensajero que
participa en la unin.

Los oligonucletidos son muy caros y la estabilidad de los compuestos

debe mejorarse. Habr que elaborar mtodos ms idneos para
introducirlos en las clulas en las cantidades adecuadas.

Una nueva estrategia gentica est basada en los

llamados trplices, que son oligonucletidos sintticos que actan
igualmente pero a nivel del ADN, en este caso una tercera banda se
acomoda entre las dos existentes en el surco mayor de la forma B del
ADN. Hoy sabemos que los oligonucletidos suelen unirse a una de las
cadenas de la doble hlice, y slo a las bases pricas de esa cadena
mediante uniones de tipo Hoogsteen. As, los oligonucletidos son
capaces de unirse a la regin de control del gen diana, para impedir que
los factores de transcripcin iniciasen dicho proceso.

Hasta el momento in vitro, han tenido xito oligonucletidos contra ras,

p53, myc, myb, bcr-abl, bcl-2 y contra el factor de crecimiento
semejante a la insulina.
Se encuentran el fase clnica la utilizacin de oligonucletidos contra el
factor de crecimiento similar a la insulina (IGF-1) que va asociado al
desarrollo de tumores cerebrales malignos (glioblastomas). En la fase
preclnica, se introdujeron in vitro molculas de ARN antisentido en
clulas tumorales procedentes de un glioblastoma de rata, estas clulas
se inyectaron en ratas genticamente idnticas con tumores cerebrales.
Los tumores desaparecieron incluso en ratas con tumores extendidos a
otras partesdel cuerpo. Las clulas introducidas desencadenaron una
respuesta inmunolgica estimulando clulas T citotxicas que
erradicaron el tumor o los tumores a la vez que protegieron al
organismo de la aparicin de nuevos microtumortes. En las pruebas
clnicas, son clulas del propio paciente las que se modifican ex vivo
con la introduccin del ARN antisentido. Se ha elegido ARN en vez de
ADN para el bloqueo del ARN mensajero de IGF-1 porque los hbridos
ARN-ARN son ms estables que los ADN-ARN.

La inhibicin de la expresin del oncogen ras se puede conseguir in vitro

con la insercin en la clulas tumorales de genes que transcriban un
ARN mensajero antisentido, complementario al ARN mensajero normal
del oncogen ras. Estos antigenes eliminan especficamente la
produccin del producto ras anormal a nivel de ARN mensajero por
hibridar con l , impidiendo as que sean sustrato de traduccin por los
ribosomas celulares. El mayor problema de esta terapia gnica es
asegurarse de que todas las clulas tumorales reciben el oligonucletido
antisentido, ya que cualquiera que escape tendr una ventaja
proliferativa sobre las otras y prevalecer induciendo de nuevo el
tumor.

El segundo mtodo de bloqueo del oncogn ras acta a nivel de

protena. La protena Ras ocupa una posicin importantsima en la
transmisin deseales para que la clula responda a los factores de
crecimiento. Las mutaciones Ras producen una transmisin continua de
seales de proliferacin independientemente de la presencia de los
factores estimulantes. Tanto la protena Ras normal como la mutada
precisan de una transformacin o maduracin que las convierta en
protenas biolgicamente activas y esta modificacin consiste en una
farnesilacin, es decir, la adquisicin de un grupo farnesil que permitir
a la protena anclarse en su lugar habitual de la membrana celular,
desde donde transmite la seal de proliferacin. La farnesil transferasa
es la enzima que normalmente facilita el grupo farnesil; as, inhibidores
de la enzima impedirn que Ras adquiera su forma biolgicamente
activa. El compuesto CBBX ( cistena, 2 Benzodiacepinas y un
aminocido variable) es muy buen inhibidor de la farnesil transferasa y
parece incuo para las clulas. Clulas transformadas en cancerosas por
haberles introducido un gen ras mutado, se incuvaron en presencia del
compuesto CBBX, impidindose de modo muy eficiente la farnesilacin y
observndose un crecimiento tpico de clulas normales no cancerosas.
La inhibicin no ha de ser total puesto que las clulas necesitan una
cierta cantidad de Ras para funcionar correctamente; adems hay otras
protenass que han de farnesilarse para adquirir su capacidad funcional.
Es necesario controlar muy bien las dosis para que se inhiba la enzima lo
suficiente para impedir un crecimiento incontrolado, pero permitiendo
el resto de las funciones de la clula.

La inhibicin de oncogenes en clulas tumorales in vitro es un requisito

imprescindible para su utilizacin in vivo. En animales de
experimentacin (ratas) estas tcnicas han logrado la desaparicin de
tumores experimentales sin aparicin de recidivas o secuelas de otro
tipo.

INSERCIN TUMORAL DE VECTORES SUICIDAS: EXPRESIN CONSTITUTIVA O SELECTIVA

Los vectores suicidas que se emplean para erradicar tumores son

preferentemente retrovirus defectivos en los que los genes propios del
virus ( gag, pol y env) han sido sustituidos por un gen de seleccin (neo)
y por otro gen capaz de inducir su propia muerte. Un ejemplo de gen
suicida es el gen de la timidina quinasa (tk) del Herpes simplex (HS),
que al expresarse en la clula tumoral confiere sensibilidad al
antibitico antiherptico ganciclovir. La quinasa del Herpes no es tan
estricta como su homloga celular y fosforila anlogos de la guanina
(ganciclovir o aciclovir), que pueden as ser insertados e incorporados
en la molcula del ADN paralizando la replicacin y provocando la
muerte celular.

Solamente aquellas clulas que hayan adquirido la quinasa del Herpes

incorporarn clulas en divisin, caracterstica diferencial de las cluas
tumorales que se desarrollan en tejidos especializados, las cuales
normalmente ya no se dividen. El cerebro adulto es uno de los rganos
en los que no hay divisiones celulares en condiciones normales. El
sistema se ha puesto a punto en la rata, donde pueden ser inducidos
tumores cerebrales malignos por inyeccin directa de clulas
neoplsicas.
Los retrovirus portadores del gen tk del HS se introdujeron en las clulas
murinas empaquetadoras que poseen en su genoma un retrovirus
defectivo. Este retrovirus defectivo es poseedor de los genes que se
eliminaron del retrovirus para convertirlo en vector ( gag, pol y env ),
pero carece de una regin imprescindible para el empaquetamiento de
la partcula; estas clula murinas se convierten entonces en fbricas de
retrovirus teraputicos y se denominan clulas productoras. La
introduccin en el seno de un tumor cerebral de clulas productoras
origina un gran nmero de retrovirus que infectarn lgicamente las
clulas prximas del tumor. Al cabo de unos das, en los que cada vez
ms clulas tumorales adquieren el retrovirus teraputico, se inicia el
tratamiento de la rata con el ganciclovir, que , efectivamente es capaz
de provocar el suicidio de todas las clulas tumorales .

En humanos, el mismo tratamiento de tumores cerebrales malignos por

terapia gnica con retrovirus portadores del gen tk del Herpes, se
encuentra en la actualidad en fase de ensayos clnicos; el tratamiento
del enfermo con ganciclovir produce en algunos casos la disminucin del
tumor tratado. Tratamientos similares se estn aplicando tambin a
otros tipos de tumores, como melanomas cutneos o cnceres de ovario.

Una variante ms versatil y selectiva se podra conseguir aadiendo al

gen suicida un promotor de clulas tumorales. Se conocen algunos genes
que se expresan preferentemente en determinados tumores, en muchos
de estos casos se han aislados los promotores y se han acoplado enzimas
que confieren un efecto suicida.

Un promotor especfico de un tipo de tumores impedira que la enzima

suicida se expresara en cualquier otra clula distinta a la neoplsica,
aunque pudiera ser infectada por el retrovirus teraputico por
encontrarse en fase proliferativa. Se prevee su suso clnico en un futuro
prximo para hepatomas, melanomas, cnceres de mama y cnceres de
pncreas.

INMUNOTOXINAS PARA COMBATIR EL CNCER

Con el descubrimiento de los anticuerpos monoclonales surgi la idea de

elaborar inmunotoxinas para el tratamiento del cncer acoplando
anticuerpos tumorales especficos a toxinas mortales. Estas
inmunotoxinas se uniran y mataran clulas neoplsicas. Se les
denomin bombas biolgicas o balas mgicas, ya que funcionan como
proyectiles dirigidos para hacer blanco en clulas cancerosas. Problemas
de toxicidad en las aplicaciones teraputicas pusieron de relieve que
simplemente pegando un anticuerpo a una toxina no se curara el
cncer. Aunque no se han resuelto todos los problemas originales,se
puede decir que las inmunotoxinas actuales estn muy mejoradas y ya
se estn realizando ensayos clnicos que permitiran muy pronto evaluar
el alcance de esta tecnologa en la cura del cncer. Para eliminar un
cncer humano todas las clulas neoplsicas deben quedar expuestas a
suficiente cantidad de inmunotoxina como para provocar su destruccin
sin causar daos adicionalesen las clulas normales. Esto requiere una
alta especificidad, estabilidad del compuesto, penetrabilidad en la
clula diana y efecto celular letal.

La estructura de la inmunotoxina empez siendo la inmunoglobulina G

(Ig G) completa unida a la toxina por un puente disulfuro. Una vez ya en
el interior de la clula el puente disulfuro se reduce liberando la toxina.
Un paso adelante lo constituy la sustitucin de toda la molcula de Ig
G por una parte de ella. El tratamiento de la Ig G con algunas proteasas,
como la "pepsina" o la "ficina", genera fragmentos heterodmeros (Fab')2
y Fab' unidos entre s por puentes disulfuro. Cada dmero est formado
por una cadena pesada (H) y una ligera (L) unidas por un puente
disulfuro por la parte constante. Los frgamentos Fab' se pueden unir
directamente a toxinas por medio de enlaces disulfuro creados como
consecuencia de la reduccin de (Fab')2.

La ventaja de Fab frente a la inmunoglobulina G entera es su menor

tamao, lo cual facilita notablemente la penetracin en la clula. Los
conjugados toxina-Fab' pueden crearse bien por ingeniera gentica
fusionando a nivel de ADN las regiones que codifican por cada parte, o
bien por medio de un enlace qumico que una las dos partes in vitro.

Las partes variables de Fab', unidas por un puente disulfuro y que

constituyen las Fv-Tx. Slo se pueden obtener por ingeniera gentica
fusionando a nivel de ADN las regiones codificantes correspondientes,
pero son algo inestables. La inclusin de un pptido de conexin
estabilizador en las molculas recombinantes (Fv cs-Tx) ha solucionado
este problema.

La especificidad la da el anticuerpo monoclonal. Los anticuerpos

monoclonales son ms especficos que los polivalentes, por estar
dirigidos contra una pequea parte especfica de la protena (epitopo) y
no contra su totalidad.
Los anticuerpos deberan estar dirigidos contra las partes especficas de
las protenas que estuvieran en los tumores normales. Por ejemplo, los
anticuerpos autnticamente especficos de carcinomas deberan
reconocer las formas mutadas de las molculas que controlan el
crecimiento celular pero en sus versiones normales. En la mayora de los
casos no se consigue una especificidad tan precisa y la mejor
aproximacin son los anticuerpos cuasi-especficos que reaccionan con
antgenos que se expresan predominantemente en determinados
carcinomas y muy poco en las clulas normales.

Otros requisitos para que la inmunotoxina sea eficiente son :

que el antgeno est en la superficie de la clula , de ah que se utilicen receptores o

carbohidratos de membrana;

que el complejo antgeno-anticuerpo se interne eficazmente al citoplasma celular por

endocitosis, y

que se libere la toxina mortal por reduccin de los puentes disulfuro que la unen con
la mitad inmunolgica.

Las toxinas que ms se utilizan son la ricina, la toxina diftrica y la

exotoxina de Pseudomonas. Las tres matan la clula inhibiendo la
snteis de protenas a nivel de los ribosomas. Son muy eficientes,
necesitndose muy pocas molculas para inactivar todos los ribosomas
celulares. Sus genes han sido clonados, caracterizados y parcialmente
alterados para mejorar sus propiedades txicas. El mayor inconveniente
de las toxinas es que pueden reaccionar indiscriminadamente con
cualquier clula causando toxicidad inespecfica. Se han conseguido
delecciones gnicas que eliminan una pequea regin de ADN
responsable de la interaccin toxina-clula; ello disminuye
notablemente la toxicidad inespecfica evitando que toxinas conjugadas
o aisladas, puedan causar la muerte de otros tipos celulares.

El efecto antitumoral de la toxina es mucho ms rpido ( unos siete das

) que el desarrollo de una respuesta inmunolgica seria. An no
disponemos de la inmunotoxina perfecta que permita matar todas las
clulas tumorales sin producir efectos ms o menos deletreos en el
resto del organismo.

La causa principal de estos decepcionantes resultados es que las

inmunotoxinas no llegan realmente a todas las clulas tumorales,
particularmente en los tumores slidos. Los motivos de esta
inaccesibilidad son varios: poca vascularizacin del tumor, una gran
presin del fluido intersticial en los ndulos tumorales, presencia de
membranas basales envolviendo el epitelio tumoral y ocultamiento de
los posibles antgenos antitumorales que deberan exhibirse en las
membranas de las clulas neoplsicas. Todo esto contribuye a que la
efectividad de las inmunotoxinas no haya alcanzado an las espectativas
esperadas.

INCREMENTO DE LA INMUNOGENICIDAD TUMORAL Y VACUNAS CONTRA EL CNCER

Ciertas molculas producidas en la clula tumoral pueden convertirse en

antgenos de rechazo. Las clulas tumorales producen al menos dos
tipos de antgenos que pueden ser reconocidos por las clulas T
citotxicas:

Los productos de los oncogenes, es decir, protenas aberrantes distintas a las

originadas por los protooncogenes y exclusivas de clulas tumorales.

Antgenos tumorales formados por los productos de genes embrionarios que no se

expresan en las clulas normales de adultos.

Claramente la habilidad para crear respuestas contra antgenos propios

especficos de tejido puede ser de gran utilidad para el tratamiento de
cnceres derivados de rganos no esenciales como la prstata, pero por
otra parte los antgenos especficos de tejido pueden crear problemas
de autoinmunidad, que deben ser superados.

Recientemente se han utilizado vacunas trumorales para el tratamiento

de pacientes con tumores slidos. Las estrategias empleadas han sido
variadas y los resultados inconsistentes. Sistemticamente clulas
tumorales irradiadas se mezclaban con diversos coadyuvantes, como el
bacilo de Calmette-Guern, para estimular la respuesta inmunolgica.
La inclusin de coadyuvantes no pareci incrementar la accin mediada
por las clulas T, pero en algunos casos las clulas tumorales irradiadas
mostraron un rechazo inmunolgico. Desgraciadamente, en la mayora
de los casos la magnitud de la respuesta fue pequea, y no se consigui
erradicar tumores ya establecidos.
PERSPECTIVAS DE LA TERAPIA GNICA Y MOLECULAR

Todos los tratamientos de terapia gnica que se han descrito estn ms

indicados para cnceres de tipo metasttico que primario; dado que an
hoy no se conoce el alcance de la curacin, es preferible que los
pacientes hayan agotado otros mtodos de curacin y que los riesgos de
la terapia gnica sean menores de los derivados de la evolucin de la
propia enfermedad.

Hay muchos problemas pendientes : cmo transferir de manera estable

y eficiente a tumores in vivo; cmo evitar los riesgos de infeccin vrica
en pacientes y operadores; cmo generalizar los tratamientos de terapia
gnica,...

La eficiencia de toda esta tecnologa en la cura de una de las mayores

"plagas" de nuestra sociedad es an nfima para el numero de trastornos
que se ocasionan y a su especial rpidez y avance de la enfermedad. La
solucin por tanto no es enfocar la respuesta a un nico tratamiento
teraputico, sino combinar con diferentes tcnicas (quimioterapia,
radioterapia, tratamientos farmacolgicos de ltima generacin, terapia
gnica,....) las habilidades de stos, y preparar mediante estudios
detallados y especficos la mejor respuesta al caso. As, que an hoy
tras decadas de estudio y lucha por curar esta enfermedad , y aunque
estos avances resulten ser esperanzadores solo nos cabe preguntarnos si
ser la respuesta definitiva a tanto tiempo de espera y en muchos casos
de impotencia y resignacin.

10.9 TERAPIA GNICA EN INFECCIN POR HIV.

La terapia gnica para el HIV est destinada a realizar muchos

propsitos. Los propsitos son proteger clulas no infectadas residuales
y eliminar clulas infectadas. Pero lo que ms se intenta es reducir la
infeccin en personas infectadas y evitar la expansin del virus a travs
de la poblacin.

Haremos un breve repaso del ciclo infectivo del virus a travs de estos
esquemas:

OBJETIVOS POTENCIALES DE LA TERAPIA GNICA PARA INFECCIN POR EL HIV

La mayora de los procesos del ciclo viral tiene puntos vulnerables que
pueden ser desvaratados con mtodos genticos.
Algunos aspectos como son la transcripcin y translacin son llevadas a
cabo por la maquinaria de la clula hospedadora es probable que la
inhibicin siginificativa pueda llevar a la muerte celular. Procesos
especficos del virus son utilizados como puntos de arranque: la entrada
en la clula, la transcripcin inversa, o la integrcin. La interaccin
entre los ARN tat y rev con protenas es un punto claramente vulnerable
al igual que el empaquetamiento del ARN genmico.

INMUNIZACIN POR PROTENAS DEL HIV

La expesin in vivo de una protena viral puede ser utilizada como una
vacuna gentica para atacar al virus. Usando sistemas con virus
influenza en modelos animales han demostrado la eficacia de esta
vacuna gentica, en la cual una inyeccin directa de ADN plasmdico
puro que codifica protenas virales lleva a una expresin persistente de
los genes virales.

En infeccin por HIV es importante conservar regiones del virus

genmico como inmunognico porque el virus posee gran habilidad de
mutacin y de evitar respuestas neutralizantes. se ha visto que en
pacientes con SIDA que la evasin de la respuesta inmune contra
epitopos especficos de las clulas T citotxicas pueden ocurrir incluso
en porciones relativamente conservadas del HIV, como es el gag. La
entrega de genes virales junto a genes que codifcan molculas
inmunoestimulatorias, como la molcula B7/BB1, es otro desarrollo
potencial.

El pg160, protena precursora de la envuelta expresada en clulas

singnicas, est siendo utilizada para inducir respuestas inmunitarias
humoralesy celulares en ratones.

Una vez que clulas que desarrollan la inmunidad expresan la protena

inmunognica probablemente sern destruidas por contener un virus
transcipcionalmente activo. La gran proporcin de clulas infectadas
albergando un virus latente persistir y proveer un pozo del que
emergern mutantes capaces de evitar la respuesta inmunitaria.

Es por esto por lo que la inmunizacin con protenas del HIV sigue
siendo muy difcil por no decir casi imposible, al menos con la
tecnologa actual. Adems hay que sumar el hecho de que es un virus
con una elevada tasa de mutacin, con lo cual la creacin de inmunidad
para un tipo de producto gnico puede verse intil si el virus cambia por
mutacin.

INHIBICIN MEDIADA POR INTERFERN

ADNs copia de interferones han sido clonados e insertados en vectores

para su expresin constitutiva o inducible en clulas diana. El
tratamiento con interfern induce algunas protenas celulares una de las
cuales ( RBP 9-27 ) aparentemente interacta con la estructura en bucle
del ARN que codifica rev y puede inhibir la expresin de protenas gag-
rev dependientes.

DESTRUCCIN AUTOLTICA DE CLULAS INFECTADAS

Se han desarrollado varias estrategias para que clulas infectadas por

HIV se autodestruyan. La subunidad A de la toxina diftrica (DT-A) est
codificada por un gen que puede ser utilizado como un gen suicida
inducible. Slo una pequea molcula de DT-A puede ser suficiente para
matar a una clula. Otros genes letales que se usan incluyen a la
timidina quinasa de HSV (tk) , que es incua al menos que en el medio
haya ganciclovir o aciclovir. En caso de la presencia de estos
compuestos, que pueden ser fosforilados por la tk ( como ya dijimos en
su aplicacin en el cncer ), la clula muere. Otros resultados
prometedores se han obtenido usando in vitro la toxina quimrica CD4
de Pseudomonas que mata clulas que producen el pg120 del virus.

Esta forma de terapia tiene inconveniente que reside en la interaccin

tat-LTR. El LTR del HIV es un promotor muy promscuo , que es activado
por un gran nmero de protenas adems de tat, incluyendo factores
transcripcionales como los de los citomegalovirus. Hay un control
limitado de la expresin del gen suicida inducible por tat, y la
destruccin de la clula puede ocurrir bajo otras circunstancias que no
sean la infeccin por HIV.

INTERFERENCIA DIRECTA CON PROCESOS VIRALES

La interferencia en la replicacin viral se puede hacer por interrupcin

de procesos virales como son la entrada en la clula, o ms fcilmente,
en la salida, aqu el ADN del provirus no es un objetivo prctico.
Para aumentar la posibilidad de inhibicin antes de la integracin del
HIV probablemente se necesite la produccin constitutiva de genes
antivirales.

- La interferencia se puede realizar por varios mtodos . Uno de ellos es

la modificacin de la molcula CD4. Bloqueando la molcula CD4 para
que el pg120 viral no pueda adsorberse sobre l es una proposicin
esperanzadora. In vitro se ha visto tambin que clulas mutantes para el
CD4 no reconocen la glicoprotena de la envoltura del HIV por lo que son
resistentes ante la infeccin del virus. Otra manera sera inyectar
grandes cantidades de CD4 en la sangre, pero se ha visto que la dosis
requeridapara que sea detectable en el plasma, es ms alta de lo
esperada.

Otros se realizan utilizando terapia basada en nucletidos, de los que

hay tres clases de ARN antivirales y que son: el ARN antisentido, los
ribozimas y el ARN decodificante.

- El ARN antisentido para el LTR de HIV es entregado por un vector AAV,

y produce una reduccin superior al 90% de las replicacin del HIV. Estas
molculas antisentido necesitan estar presentes en ms nmero que su
secuencia diana, lo que dificulta su produccin y eficacia.

- Sin embargo, los ribozimas, como se regeneran despus de cada

interaccin cataltica no se requieren en gran cantida. Los ribozimas
anti-HIV expresados establemente en clulas HeLa-CD4+ pueden inhibir
la replicacin del HIV. Este mismo efecto se produce en blancos que
posean la integrasa RT y las regiones tat y env.

ESTRATEGIAS CENTRADAS EN PROTENAS

Protenas mutantes pueden a veces interferir en la funciones normales.

Esto se conoce como fenmeno transdominante negativo , en el que
un pequeo nmero de protenas mutantes pueden interferir en los
efectos de una gran cantidad de protenas normales. Las protenas ms
utilizadas para este experimento son las protenas tat y rev.

Tambin se ha visto que en mutantes dominantemente negativos de la

protena de la envoltura puede inhibir la produccin de HIV, y mutantes
dominantemente negativos en el dominio de unin a CD4 pueden reducir
la cantidad de CD4 y disminuir la produccin del virin.
SECUESTRO EN TRANS DE PROTENAS

En teora se pueden secuestrar algunas protenas estructurales del virus.

El secuestro de una envoltura viral por un CD4 que contiene una seal
de retencin del retculo endoplasmtico, se ha podido ver en varios
experimentos . Cadenas sencillas de anticuerpos se han desarrollado
para secuestrar la protena de envoltura en el retculo endoplasmtico.
La co-transfeccin de cadenas sencillas de anticuerpos especficos para
pg120, tambin reduce los niveles de partculas HIV infecciosas, sin
afectar al nivel de produccin de la protena gag.

Estas metodologas son particularmente sensibles al acercamiento de la

terapia gnica y parece probable que dentro de los prximos 5-10 aos
una combinacin de terapias, incluyendo agentes farmacolgicos y
agentes de terapia gnica, puedan ser usados en concierto para
minimizar la propagacin del HIV dentro de un individuo afectado y de
este modo prolongar su vida libre de enfermedad. Una vacuna basada
en la terapia gnica es tambin una seria posibilidad. El HIV por si
mismo puede paradjicamente llegar a ser una valiosa arma teraputica
y la terapia gnica del SIDA puede llegar a ser el campo pionero para el
desarrollo de acercamientos similares a otros agentes infeccionsos.

11. LA TERAPIA GNICA EN EL PLANO

JURDICO
El Derecho es un instrumento para configurar la actuacin social, y en
particular el Derecho Penal debe estar atento a los avances sociales de
cualquier tipo y mucho ms a los progresos tcnicos que sirven para
mejorar el sistema de vida de los ciudadanos. Sin embargo, El Derecho
reacciona de una forma ms lenta a las expectativas que se producen en
la sociedad (avances tecnolgicos), esta falta de sincrona motiva que a
veces existan vacios jurdicos que producen en la cuidadana una cierta
sensacin de indefensin.

Algunos avances tecnolgicos con fines meramente teraputicos

esconden intereses menos loables como pueden ser el mejoramiento de
la especie. Es aqu cuando el ordenamiento jurdico ha de intervenir
regulando y protegiendo estos avances.

A la hora de legislar hay que tener en cuenta:

 Las posibilidades actuales, futuras y futuribles de la ingeniera gentica.

Los riesgos presentes, futuros y futuribles existentes en la manipulacin gentica.

Los principios jurdicos que determinan los lmites de licitud de las intervenciones
manipuladoras.

Los sistemas de control y las tcnicas de reglamentacin de stos.

El esfuerzo del legislador espaol en dar respuesta a estos interrogantes

encuentra su plasmacin en la Ley del 28 de Diciembre de 1.988, la cual
contiene las autorizaciones, prohibiciones y sanciones sobre la donacin
y utilizacin de embriones y fetos humanos, o de sus clulas, tejidos u
rganos con fines diagnsticos, teraputicos, de investigacin o
experimentacin.

En este punto encontramos a la doctrina dividida, pues distinguimos a

un sector minoritario que afirma la suficiencia jurdica de esta Ley, y un
sector mayoritario que considera la ya mencionada Ley como
insuficiente, reclamando una tutela eficaz de estos bienes a nivel penal.

Basndonos ya en el Cdigo Penal de 1.995, donde se recoge bajo la

denominacin de "Delitos relativos a la Manipulacin Gentica" ( Ttulo
V del Libro 2 ) desarrollado en los artculos 159 al 162 inclusive,
podemos diferenciar dos bloques. Uno el ms directamente relacionado
con la manipulacin gentica propia, y un segundo bloque ms distante
del concepto de manipulacin al que afecta, de manera impropia o de
ninguna manera.

Por tanto nos centraremos en el primer bloque compuesto por el

artculo 159, que protege la integridad de la especie y su normal
desarrollo , y el artculo 161 que defiende la intangibilidad del
patrimonio gentico humano en su apartado primero, y la identidad
gentica de cada uno de los ciudadanos que integran la especie humana
en su apartado nmero dos.

En atencin a este bloque y por contraposicin es lgico afirmar que

slo supone una limitacin a la manipulacin gentica, ya que acepta el
inters teraputico de esta aplicacin.

Artculo 159. Contempla dos hiptesis diferenciadas por la comisin

subjetiva de la conducta:
a) Tipo doloso. Referido al 159.1 del CP. Castiga la manipulacin
gentica realizada de forma voluntaria conociendo de su ilicitud.

b) Tipo imprudente. Referido al 159.2 del CP. La diferencia con el 159.1

est en que la manipulacin es lcita (teraputica), sin embargo, va a
ser castigada porque el manipulador infringe los ms elementales
cuidados profesionales (actuando de manera temeraria).

Artculo 161. Tenemos ahora dos partes diferenciadas:

161.1. Va a castigar la fecundacin del vulo que persigueun fin que no

sea la procreacin humana.

161.2. Va a castigar la creacin de seres humanos idnticos por

clonacin u otros procedimientos dirigidos a la seleccinde la raza.

Referente a todo esto, el Parlamento Europeo aprob , el 16 de Marzo

de 1.989, la Resolucin sobre los Problemas ticos y Jurdicos de la
Manipulacin Gentica, que recomienda la prohibicin de los
experimentos destinados a la investigacin de laclonacin en humanos,
De igual forma se pronunci el Consejo de Europa.

Adems del delito que supone la manipulacin gentica, el Cdigo Penal

de 1.995 castiga, persigue y sanciona a los resultados originados por la
manipulacin. Es el caso de los delitos de lesiones recogidos en el Libro
2, Ttulo III y IV centrado en : las lesiones stricto sensu , en persona , y
lesiones producidas a nivel fetal (conocido jurdicamente
como nasciturus = el que va a nacer ). De forma ms concreta y
especfica mencionamos el articulado que recoge ambas ideas.

Lesiones stricto sensu: Art. 147, art.148, art.149, art. 150, art.152.

Lesiones al nasciturus: Art. 157, art.158.

Como antecedentes al Cdigo Penal de 1.995 es importante destacar los

artculos 420, 421 del Cdigo Penal de 1.973.

En cuanto a la terapia gnica en la lnea germinal, nos remite a la Ley

sobre Tcnicas de Reproduccin Asistida, que admite la terapia gnica
(art. 1.3) en embriones y fetos en el tero nicamente si se cumplen
ciertos requisitos, entre ellos el de disponer de una lista de
enfermedades en las que la teraputica sea posible desde criterios
estrictamente cientficos. Dicha lista debe aprobarla el Gobierno de la
nacin por Real Decreto (disposicin final 10,d) siempre que no se
influya en los caracteres hereditarios no patolgicos ni se busque la
selleccin de los individuos o la raza 8, art. 13.3c y d, resp.).

12. TERAPIA GNICA: PERSPECTIVAS

FUTURAS Y CONSECUENCIAS
12.1 CUESTIONES ECONMICAS

Datos econmicos indican que los costes de los primeros aos de

transplantes cardiacos son unos 90.000$ por paciente (dolares de 1.983)
en los EEUU, sera razonable preguntarse si la terapia gnica ser otra
tecnologa cara a medio plazo. Si se emplea en transplantes de mdula
sea, en la terapia gnica humana ser trabajada intensamente y
supondra unos considerables costes iniciales. Pero an cuando nadie
asigna un valor econ,mico en el mejoramiento de la calidad de vida de
los pacientes curados, lo ms seguro es que algn da la terapia gnica
costar considerablemente menos que la hospitalizacin repetitiva por
enfermedades como la anemia falciforme o la fibrosis qustica. En
breve, para pacientes que sufran alguna enfermedad gentica causado
por el defecto en un gen, la terapia gnica se puede convertir en un
mtodo de cura bastante costoso.

En un futuro ms lejano, las perspectivas para la terapia gnica en

humanos todava no estn claras . Pero si se rompiese el eslabn entre
el transplante de mdula sea y la terapia gnica, sta se podra aplicar
a un crculo de pacientes ms extensos. Por ejemplo, si vectores
especficos para un particular tipo de clula diana se pudiera
desarrollar, la combinacin vectro/gen, quiz pueda ser administrada
de forma intravenosa. Aeste nivel, si alguna vez se alcanza, la medicina
setars en el umbral de una nueva era para el tratamiento de ms de
3.000 desrdenes genticos que afecten a nuestra especie.

12.2 PERSPECTIVAS FUTURAS

El rango potencial y la versatilidad de la terapia gnica han sido

perfilados en puntos anteriores de este trabajo. esta es una nueva
forma de intervencin teraputica a un nivel molecular, con
aplicaciones en muchas reas del tratamiento mdico que engloba
desde la correccin de un locus individual de un defecto gnico
heredado por inmunizacin, tratamiento de enfermedades infecciosas
hasta el cncer. Esta es tambin una nueva farmacologa. Mientras
muchos frmacos corrientes persiguen modificar procesos endgenos
por la aplicacin de novedosos, compuestos artificiales, la terapia
gnica reparte un agente biolgicamente activo muy especfico a un
sitio determinado y a la vez con la posibilidad de permanentes,
transitorios o inducibles estadosde la expresin. Como un nuevo
frmaco debe ser testado en el contexto de la herencia. La
heredabilidad requiere dos funciones: primero, la transmisin de la
informacin de generacin eln generacin, y segunda, la expresin de la
herencia.

Transmisin y expresin estn separadas a nivel molecular, y , en

organismos multicelulares, a nivel celular. La determinacin celular va
seguida por la diferenciacin en un estado temprano que separa
irreversiblemente el linaje somtico de los portadores potenciales de
informacin a la siguiente generacin: las clulas de la lnea germinal.
La exprewsin del gen teraputico puede ser afectada transitoriamente
por el uso de vectores que no se integran o por clulas diana con una
vida biolgica limitada. Si, como es normal, la expresin es requerida a
largo plazo, deberemos usar vectores que se integren o
autoreplicativos. Estos son ms difciles de distribuir y controlar.El
material gentico en un cromosoma est influido directamente por
partes del genoma cercanas y distantes que actan en cis y trans. Esto
no es una sorpresa ya que uno de los mayores problemas con la
transferencia gnica como prctica corriente es la expresin a largo
plazo del gen transducido cuando la transferencia se produce en
secuencias mnimamente contextuales. La familia del gen de la globina
lo ilustra bastante bien. El control de la expresin depende de cuatro
regiones distantes aguas arriba reconocidas por su hipersensibilidad
ADNasa I y se les llam regiones para el control del locus (LCRs). An
con estas regiones incluidas la transferencia del gen de la globina era
imprescindible ya que se poda reorganizar de diferentes maneras.

Cmo podemos solventar este problema? En principio se comenz a

"limpiar" la construccin de motivos de interferencia extraos por
esacaneo de las secuencias del vector que actuaban como seales cis,
las cuales podran ser las responsables de las distintas formas de
reorganizar, y se intent posteriormente eliminarlos sistemticamente
por deleccin o por mutacin puntual dirigida.
La sustitucin por un gen anormal o no funcional por recombinacin
homloga es una segunda posibilidad, y tericamente, la forma ideal de
terapia gnica. Hasta ahora esto se ha ido practicando sucesivamente
en lneas celulares o en clulas stem embrionarias de animales. La
confianza que nos proporciona los procesos celulares endgenos para la
recombinacin son insatisfactoriamente bajos. Sin embargo, desde hace
aos se conocen

enzimas que catalizan la escisin e insercin de material gentico por

reconocimiento de una secuencia nucleotdica particular, esto es lo que
se est usando en la transferencia de genes eucariticos. El sistema
mejor conocido es el sistema cre/loxP de los bacterifagos. La enzima
cre reconoce una secuencia oligonucleotdica particular y corta una
pieza de material gentico existente entre dos deesas secuencias, y
despus ligar los extremos del material gentico cortado. Las
secuencias que cortan las enzimas se llaman loxP. Introduciendo sitios
loxP se crean sitios de insercin y delecciones especficas en clulas
stem embrionarias.

Una tercera posibilidad es intentar transferir una unidad gentica

grande que contenga el gen y todo la unidad llevar asociada regiones
de control junto a genes accesorios en un formato autorreplicativo. A
esto se le llama cromosoma artificial , y que nos supera las limitaciones
en el tamao del ADN que puede ser transportado a base de vector. Esto
se ha demostrado utilizando vectores YAC (cromosoma artificial de
levadura) para crear ratones transgnicos. Los cromosomas artificiales
tambin evitan los problemas en el control del sitio de integracin del
ADN exgeno. Los centrmeros y telmeros de levadura parece que no
son funcionales en clulas de mamferos por lo que el objetivo ms
corriente sera la produccin de vectores de cromosomas artificiales que
lleven los centrmeros y telmeros que combinen la habilidad de
transportar grandes piezas de ADN (varios cientos de kilobases), con la
capacidad de segregacin com un cromosoma independiente en
sincrona con el genoma del hospedador en la clula en divisin.

Por ltimo,varios sistemas estn siendo explorados para el reparto de

hormonas, factores de coagulacin, anticoagulantes, y otros agentes
teraputicos. Cuando sus genes estn introducidos dentro de
fibroblastos o clulas del endotelio vascular, sus productos pueden ser
detectados en sangre durante diversos perodos de tiempo. Estudios
recientes en ratones sugieren que mioblastos pueden ser
particularmente ventajosos como clulas diana para el reparto de
protenas recombinantes. Transferencia gnica in vitro seguida por el
reinjerto de las clulas est siendo explorado para restaurar funciones
de enfermedades crnicas del sistema nervioso. Si se consigue probar
como efectivo tales tcnicas de implantacin combinadas con los genes
transfectados podran ofrecer un nuevo camino de tratamiento para
desrdenes crnicos tales como el Parkinson o la enfermedadad de
Alzheimer.

En otoo de 1.998, French Anderson uno de los pioneros de la terapia

gnica propuso una solicitud de aprobacin de un protocolo para el
estudio de la terapia gnica in utero. Anderson se propone tratar dos
enfermedades genticas muy graves; la alfa-talasemia, enfermedad
fatal de la sangre, debida a un defecto del gen de la hemoglobina, y una
deficiencia inmunitaria grave, SCID (Severe Combined Inmune
Deficiency), resultado de la carencia de un gen esencial, el del enzima
adenosina desaminasa (ADA).Se propone ensayar el mtido en fetos
portadores de estas anomalas genticas, cuyas madres hayan decidido
abortar. Slo despus de la interrupcin del embarazo podrn los
investigadores verificar la eficacia del tratamiento. Todava se
necesitarn de dos a tres aos de trabajo en vectores y de ensayos en el
animal para que estos proyectos sean tcnicamente aceptables. Si la
terapia gnica in utero se revela eficaz, el principal problema tico
que, con el tiempo,suscitar este tipo de intervencin en el feto ser el
riesgo de modificacin de las clulas del grupo germinal, precursoras de
las clulas sexuales y, por tanto, del patrimonio gentico que se
transmite a la descendencia. Ahora bien, la prohibicin de la terapia
goza de consenso. El proyecto de convencin de biotica del Consejo de
Europa, por ejemplo,excluye tal posibilidad. Incluso del RAC
(Recombinant Advisory Committee), rgano del National Institutes of
Health (NIH).

12.3 CONSECUENCIAS DE LA TERAPIA GNICA

La modificacin del material gentico de una clula afecta tanto a la

clula como a sus descendientes. Hay un gran debate de los peligros
potenciales del uso de un tratamiento que disea deliberadamente
cambios genticos que son potencialmente propagables.
Estos miedos se centran sobre todo en las alteraciones genticas de la
lnea germinal. Se cree que los riesgos de estos tratamientos. Pero,
cules son estos riesgos?

MUTAGNESIS

Todas las integraciones cromosmicas, aparte de los cambios

homlogos, poseen el potencial de alteracin de locis endgenos
fortuitos y por lo tanto producir mutagnesis, que puede derivar en
oncognesis.

Si realizamos la terapia gnica en clulas somticas nosotros no

transmitiremos los genes manipulados en esas clulas somticas a las
futuras generaciones pero alteramos la lnea gentica del individuo. La
intervencin directa en las clulas somticas difiere del tratamiento
mdico convencional slo en que aqu hay una clara y directa conexin
entre la terapia y la seleccin gentica.

En el caso de sndromes causados por locis dominates el conjunto

completo de genes est representado por los individuos afectados. Su
xito reproductivo por lo tanto influye directamente en el tamao de
este conjunto en la siguiente generacin. Si los individuos llevan alelos
no reproductivos, la fecuencia del gen en la poblacin est mantenida
por que ocurran nuevas mutaciones.

En las enfermedades genticas ligadas al sexo, recesivo en la mujer y

dominante en el hombre. Como el nmero de afectados es mucho mayor
(todos los machos que lleven el alelo se vern afectados) la influencia
del xito de la terapia en la frecuencia gnica ser tambin mayor.

La modificacin deliberada de la lnea germinal tendria efecto sobre la

estructura de la poblacin slo por una transformacin gentica a gran
escala o alternativamente donde el genoma mutado tenga una alta
ventaja selectiva. Un hecho preocupante sera la introduccin de
resistencia a una enfermedad patgena. Si slo "los elegidos" son
protegidos de la enfermedad podri existir la posibilidad de un gran
cambio gentico en la poblacin Sera la terapa gnica en la lnea
germinal realmente necesaria? La terapia gnica somtica, tiene un
efecto directo sobre el paciente individual pero alguna transformacin
gncia de la lnea germinal puede slo tener efectos sobre la
descendencia an no nacida. Esto por lo tanto no afectar al paciente
que eat siendo tratado. Con las posibilidades de investigacin de
prenatales de la preimplantacin tanto como de la donacin de esperma
y vulos y adopcin es muydifcil ver como la intervencin deliberada en
la lnea germinal puede ser ticamente justificable. No obstante esta
idea ser ms profundizada en el siguiente apartado, sobre la tica en
la terapia gnica.

13. EL NEGOCIO DE LA SALUD

El hecho de que la terapia gnica sea una tecnologa minuciosa, con
dificultades tcnicas, muy lenta y no menos potencial como arma
teraputica en la cura de muchas enfermedades, hizo apostar desde el
principio en este campo a la mayora de las empresas de biotecnologa y
grandes grupos farmaceticos. Actualmente estas empresas invierten
millones y millones de dolares en este mercado.

En Marzo de 1.998, Transgne empez a cotizar en la bolsa de

Estrasburgo. Su cotizacin simultnea en el Nasdaq y el Nouveau March
(mercados burstiles norteamericano y francs, especializados en
valores de alta tecnologa y de crecimiento), le permiti ganar 613
millones de francos (unos 15.000 millones de pesetas ).

Fue a partir de los 90 cuando se produjo el alza en estas empresas

cuando entraron bolsa llegando a ganar no menos de 174 millones de
dlares ( unos 24.000 millones de pesetas ) entre 1.993 y 1.995. As , los
grandes grupos farmaceticos empezaron su inversin en estas nuevas
empresas llegando incluso a comprar compaias enteras o a fusionarlas.
Por ejemplo, en 1.995 se compraron por 729 millones de dlares ( ms
de 100.000 millones de pesetas ) cuatro sociedades de terapia gnica:
Rhone-Poulenc adquiri Applied Inmune Sciences, Sandoz (que se
fusionara ms adelante con Ciba para dar Novartis ) compr Genetic
Therapy Inc. (GTI), Chiron (que posteriormente sera adquirida por Ciba
y se integrara por lo tanto en Novartis) se hizo con Viagene y Schering
Plough compr Canji.

Pero tras el informe publicado por los Intitutos Nacionales de Salud

(NIH) sobre los resultados sobrevalorados y la eficacia clnica de los
protocolos se produjo una gran caida en bolsa de estos grupos. Salvo los
grandes grupos farmaceticos que por su potencia financiera aguantaron
el generalizado descalabro. La mayora de las empresas "pequeas" de
terapia gnica no lograron ganar ms de 69 millones de dlares ( unos
10.000 millones de pesetas ) desde el final de 1.995 hasta la primavera
de 1.998. Mientras empresas farmaceticas aprovechaban el bache de
otros para invertir en 10 aos unos 800 millones de dlares (ms de
110.000 millones de pesetas ).

Debido a que los productos de terapia gnica son el resultado de la

unin del gen y un vector encargado de transportarlo (en la mayora de
los casos), el objetivo de todas estas empresas era adquirir el dominio
en estos dos componentes bajo objetivos de rentabilidad como factor
comn. Aunque actualmente la terapia gnica no tiene una consistencia
suficiente para determinar cul ser la tecnologa de transferencia que
se impondr a las otras. Se supone que en el futuro no habr una
tecnologadominate sino diferentes mtodos segn el tipo de patologas
tratadas, el rgano implicado, y eventualmente las caractersticas del
gen. Esto implica que las empresas no pueden invertir todos sus
esfuerzos en una sola aplicacin, sino tomar o disponer de una base
tecnolgica lo ms amplia posible.

As por ejemplo, empresas como Transgne tienenacceso tanto a

vectores virales y no virales. Haciendo ms incapi sobre estos ltimos,
pues en palabras de Bernad Gilly, director de Transgne, " a largo plazo
el futuro pertenece sin duda a los vectores no virales, pero todava
queda mucho trabajo por hacer antes de que sus rendimientos les
permitan competir con las cualidades de los vectores virales".

Adems, las empresas de terapia gnica tienen que acceder a los genes.
Esto plantea un nuevo problema en este duro mercado, pues la mayora
de los genes importantes estn patentados y su acceso o su licencia es
sumamente costosa econmicamente. As las diferentes empresas han
ido abrindose camino en el mundo de los acuerdos y licencias. Por
ejemplo, Transgne tiene un acuerdo con Human Genome Sciences
(HGS) una de las empresas con los mayores bancos de genmica
funcional (estudio sistemtico de la funcin de genes descubiertos,
adems de su estructura) . Este acuerdo le da a Transgne una licencia
exclusiva para un nmero mximo de 10 genes seleccionados del banco
de datos de la empresa norteamericana. As Transgne tiene acceso
durante 10 aos por unos 4000 millones de pesetas, invertidos en forma
de una participacin del 10% de su capital.

Por otro lado Cell Genesys espera basar su poltica en la patente de los
genes descubiertos por sus equipos y en adquirir licencias de los que han
sido descubiertos en los laboratorios pblicos. Novartis por su parte
accede a los bancos de Incyte, adems est invirtiendo 250 millones de
dlares durante 10 aos en su propio centro de genmica funcional en
La Jolla (California).

En cuanto a la reglamentacin de los protocolos son diferentes segn

sea en EEUU o en Europa, debido a que en Europa hay ms limitaciones
y mayor grado de exigencia.Aqu la terapia gnica est encuadrada en
dos directrices, una sobre el confinamiento y la otra sobre la
diseminacin de Organismos Genticamente Manipulados (OGM).
Actualmente en revisin por el Parlamento Europeo.

En cuanto al confinamiento, la nueva versin parece que se orienta

hacia una cierta simplificacin. Aunque esto depende mucho de los
pases. Ms rigurosos en Blgica y Francia, por ejemplo, que en Gran
Bretaa.

Por lo que respecta a la diseminacin de OGM, su revisin europea

parece preveer un reforzamiento de las restricciones a la utilizacin de
productos de terapia gncia.

No es por tanto casualidad que una aplastante mayora de pruebas

clnicas se realicen en EEUU. Tanto ms cuando que en Europa, aunque
el registro de los productos surgidos de las biotecnologas corresponde
exclusivamente a la Agencia Europea del Medicamento, la
reglamenteacin de pruebas clnicas se deja a cada estado, lo que no
simplifica el proceso.

Desde la ultima primavera se viene preparando en Europa una directiva

con una reflexin especfica sobre la terapia gnica, que tendra que
permitir una armonizacin.

En un futuro las empresas de terapia gnica que logren un da

comercializar sus productos no sern slo las que habrn sabido poner a
punto los productos ms seguros, ofreciendo la mejor relacin calidad-
precio, sino tambin las que habrn establecido la mejor estrategia de
propiedad y patente.

As, este derecho a patentes y a diversos trabajos e investigaciones

garantizan tanto una batalla legal como una batalla contra el tiempo,
por encontrar los mejores genes, vectores y tcnicas de transferencia.
Lo que a menudo en vez de ser un incentibo a la hora de acortar la
espera a nuevos descubrimientos, roza tintes mercantilistas y rastreros.
Ya que si una empresa posee cierta informacin, no es que sea reticente
a compartirla, sino que en la mayora de los casos se niega a ninguna
publicacin de su trabajo para por un lado, evitar plagios, y por otro
sacar jugo econmicamente a su descubrimiento. No podemos entender
como algo tan universal como es la salud personal, puede ser motivo
para crear increbles fortunas y enrriquecimiento a unos pocos. De ah
el ttulo del apartado, "el negocio de la salud", pues debajo de todo este
montaje, de buscar soluciones a tantas enfermedades, se esconde el
instinto egosta, materialista y podrido de ciertos grupos que se
denominan "farmaceticos", que en vez de aportar ayuda lo que hacen
es limitarla, entienden la salud como un privilegio ms que como un
derecho. Cmo se puede jugar con la salud de la gente tan vilmente. No
rechazamos que este tecnologa es cara y necesita de un personal y unas
infraestructuras al alcance de muy pocas empresas, y que sus productos
en la mayora de los casos, y tecnolgicamente hablando, son grandes
obras de ingeniera gentica. Pero la razn para que estos productos
que son la salvacin para tanta gente se vean retenidos y filtrados,
dirigidos, y en la mayora de las veces concebidos, para gentes de clase
alta capaces de costearlos, o en pases capaces de poder distribuirlos,
roza los ms internos sentimientos de crueldad. Recordemos que para
mucha gente es el vil metal lo que mueve el mundo, para ellos no hay
gloria sin dinero.

Sin irnos ms lejos, merece mencin el caso del Dr. Manuel Elkin
Patarroyo que ha donado su vacuna sinttica contra la malaria a la
Organizacin Mundial de la Salud (OMS). Sin beneficios, ni lucro, cuando
podra haberla vendido por una gran cantidad a tantas empresas
farmaceticas que le presionaban por la patente. Hechos como ste son
los que refuerzan la idea de que el hombre tiene, a veces, en sus manos
el poder para salvar vidas, y debemos aprender a repartirlo equitativa y
solidariamente en beneficio de todos.

14. LA TICA EN LA TERAPIA GNICA

Si analizamos el concepto de tica, nos encontramos con que es "la
parte de la Filosofa que trata la moral y las obligaciones del hombre".
Cabe preguntarnos qu cuestiones morales y obligaciones hacia el
hombre surgen como resultado de la terapia gnica. Durante todo este
trabajo hemos mantenido un tono meramente descriptivo de la
tecnologa de la terapia , sin asomarnos a estas obligaciones y moral de
la que hablbamos antes.
La terapia sea gnica o no, surge para "readaptar", volver al individuo a
un estado "normal", un estado saludable. As, lo primero que nos debe
sugerir este comentario es que, el fin ltimo de la terapia gnica debe
ser ayudar, reanudar en el individuo una vida normal

en la que pueda seguir con un ritmo cotidiano al igual que lo llevaba

antes de sufrir la enfermedad. Sigue as un principio Aristotlico sobre
la bsqueda de la Felicidad.En este caso la Felicidad encarnada en el
trmino de salud. Es la antigua lucha del hombre sobre las dificultades
hacia su nivel de Felicidad, el interminable camino hacia un destino
prspero.

Pero no nos deviemos del enfoque inicial, por qu una tica? Cules
son las obligaciones del hombre? Recordemos que en ese viaje, en ese
caminar a "lomos" de la terapia gnica viajan valores menos puros, ms
, si cabe decirlo, mundanos y oscuros. Es el riesgo de que no consigamos
llegar a ayudar, sino esconder tras esta ayuda motivos crueles y
perversos sobre acciones que moralmente son despreciables.
Lgicamente son estas ideas las que nos desvan de nuestro camino
solidario. Son estos instintos internos, nuestra otra cara, la que lucha
por vencer nuestra conciencia y tica y aduearse de nuestra voluntad.

Pero quines o qu son esas voces profundas que tantas veces nos
tientan? La terapia gnica es un instrumento muy poderoso para que sea
utilizado con ideas distintas a las de su concepcin.

Quin nos dice que al aplicar esta tecnologa no se "despertaran" alelos

defectivos o deletreos? En un individuo hay multitud de genes
reprimidos, algunos de ellos letales, encerrados como en una "caja de
Pandora" esperando una oportunidad para librarse de su prisin. El
riesgo de estos tratamientos est en su aplicacin a nivel gentico, con
lo cual sin un control y especificidad adecuada podran despertar esos
genes dormidos o librarles de su represin. Actuaran "devastando" reas
de nuestro organismo, aduendose del control celular y finalmente
acabando con la vida del individuo. As, quin nos dice que esto no
ocurrir? Sabemos realmente si esto es slo una utopa?

Del mismo modo, cabra preguntarnos, los nuevos productos de la

terapia gnica tendran caractersticas antignicas? Esto quiere decir,
que si una vez formada la nueva protena resultante del tratamiento,
dara una reaccin inmunolgica en el individuo por autoinmunidad
pudiendo llegar incluso a la muerte. Son suficientes los estudios
previos para llegar a conclusiones que permitan determinar estos
efectos o nos estamos precipitando?

En el caso de vectores virales, ya sabemos que hemos eliminado su

potencial infectivo y destinado a su servicio teraputico. Pero, estamos
completamente seguros que no pueden reaparecer estas caractersticas?
Estamos seguros que los tenemos perfectamente controlados? Si lo
pensamos framente llegamos a ideas muy poco esperanzadoras.
Creemos que el hombre con su tecnologa puede "domesticar" a
organismos que tras varios millones de aos de evolucin han creado
mecanismos de escape tan maravillosos y efectivos que cabe pensar en
una suprema "inteligencia molecular" ? Un virus capaz de sobrepasar
barreras, de luchar eficientemente en "guerra armamentstica" con su
hospedador, en que la evolucin le ha dotado de mltiples mecanismos
para superarse a s mismo, cmo la arrogancia del hombre llega hasta
afirmar un control absoluto en una casi perfecta mquina de la
naturaleza? En la famosa novela "Parque Jursico" hay una frase que
desarrolla esta idea, " la vida siempre encuentra un camino". Estos virus
forman parte de una unidad podramos llamarla, multifuncional, no
importa que unos caigan, los que queden pueden mutar, recombinarse
genticamente, ser seleccionados creando una nueva estirpe ms
fuerte, ms efectiva, ms resistente.

Podemos ganar una batalla, pero la guerra sigue, y sin embargo

alardeamos de un control, de unas cadenas que en cualquier momento
pueden ser rotas. Es el tan repetido hecho de dominacin por el
hombre, pero ahora a nivel microscpico. An creemos que somos los
reyes de la Creacin, que somos el ltimo peldao en la escalera de la
Evolucin. Nuestra visin antropocntrica nos ciega en hechos que no
tienen validez absoluta. Quizs los tengamos retenidos ahora, pero
seguro que no por mucho tiempo. Pronto se librarn de sus "grilletes" y
seguirn sus ciclos infectivos ,ahora alterados, pero con el mismo fin de
siempre desde hace millones de aos, perpetuarse.

De otro lado, hemos dotado a la produccin de los tratamientos de un

control, de una regulacin. Pero, son seales propias las que inducen
su elaboracin? Su eficacia es constante? Son fiables? De nuevo nos
topamos con una extensa rea sin descubrir, no conocemos mucho de la
regulacin en eucariotas y sin embargo, podemos "jugar al mecano"
dando construcciones que luego probamos para ver si da resultado. Y
an as, quin nos dice que un resultado favorable no se deba a otro
tipo de interacciones celulares? Qu resultado celular tendra esto?
Basamos la eficacia en nuestra construccin, y sin embargo es
completamente falso. Creemos que es una imprudencia el aplicar
tratamientos que cabra denominarlos de "hipotticos", pues realmente
desconocemos todas sus implicaciones. Y lo ms grave, quin nos dice
que a largo plazo esto no pueda ocasionar mutagnesis o alterar otras
funciones celulares o alteraciones en el ADN a gran escala? Seramos
emisarios de la fatalidad al calificar como teraputico algo que ms
tarde alterara la salud o incluso destinara irremediablemente a
modificaciones, cncer o muerte a muchos pacientes, por el mero hecho
de que no conocamos todas las respuestas a tantas preguntas.
Esperemos que esto no pese en nuestras conciencias por ser cmplices
sumisos y callados de un descalabro evolucional.

Destacar tambin el riesgo en la terapia gnica en la lnea germinal. El

hecho de que se produzca mutagnesis, recombinaciones u otros
procesos en terapia gnica somtica no deja de ser, an despus del
dao al paciente, un duro revs. Pero an as el dao est retenido en
el individuo, no se expande. Caso contrario es la terapia en lnea
germinal. Aqu cualquier modificacin del repertorio gentico se
transmitir a las sucesivas generaciones. Estaremos modificando as la
especie? Bajo nuestro punto de vista y an despus de los beneficios
teraputicos no nos cabe otra respuesta y es que s. Los nuevos
descendientes seran genticamente distintos a nosotros, y es aqu
donde surgen multitud de preguntas, seran considerados individuos de
una nueva especie? Tendran los mismos derechos y obligaciones?
Tendran la misma dignidad que los dems humanos?...

Es en nuestra opinin algo muy grave. El hombre en su evolucin ha ido

cambiando su patrimonio gentico por medio de mutacin, seleccin,
migraciones,... y todo bajo la direccin de una Seleccin Natural que
filtraba, cribaba a los "mejores", los ms adaptados. As, el patrimonio
gentico ha ido alcanzando rangos ms complejos y predestinados por la
Evolucin. Sin embargo,ahora el hombre pretende manipular genes en
los nuevos descendientes, adquiriendo un papel supremo, obteniendo
una categora en la cual su aplicacin perdurar en el tiempo. Cabe
preguntarnos, es necesario una terapia gnica en la lnea germinal?
Estamos engaando cuando queremos decir terapia gnica? La respuesta
a la primera pregunta es de difcil solucin. El saber que un nuevo hijo
nacer enfermo si no se le aplica la terapia o incluso nacer muerto, no
cabe ms respuesta que la de aprobacin al mtodo teraputico. El
amor a un hijo prevalece frente a los riesgos a correr.Pero apartando
este hecho , quines somos nosotros para tomar el mando? Quines
somos nosotros para obrar y "jugar a ser Dios", para crear nuevas
especies? Y es aqu donde recordamos una frase ya expuesta sobre la
peligrosidad del maluso de la terapia gnica. Bajo la clasificacin de
terapia se incluiran protocolos para "crear" nios con ventajas
adaptativas, sera entonces un mejoramiento de la especie. Una nueva
raza de "superhombres" creados con fines oscuros, dara lugar a una
nueva forma de marginacin social, "la marginacin gentica" de los
menos adaptados.Desarrollaramos hombres a nuestro antojo, adaptados
a diversas condiciones, con oculto destino. Esto sera una de las mejores
armas creadas por el hombre. Cul sera el lmite? Hasta donde
deberamos manipular? Estamos llegando al borde del precipicio y no
deseamos parar. Hemos matado a la Seleccin? Nos hemos colocado
su corona y la hemos desterrado? Quizs no, quizs sea de nuevo la
arrogancia, el poder que creemos tener, algn da todo se volvera
contra nosotros, pero hasta entonces quizs ya hubieramos acabado con
nuestra especie. En palabras de Hobbes, " el hombre es un lobo para el
hombre". Nuestra necesidad de conocer todo, nuestra curiosidad nos
lleva a veces a indagar en terrenos en los que nunca deberamos haber
entrado, lemos el aviso pero lo ignoramos, y justificamos conductas
perversas con la careta de que su fin ser solidario. En verdad, que
nuestro ansia de conocer, controlar y dominar no tiene lmites y eso
ser nuestra perdicin. Como dice French Anderson, " el concepto de
mejoramiento de la especie es un ejemplo de una pendiente
resbaladiza, una vez que te embarcas es muy duro parar".

Ya dijimos en el anterior apartado que la salud es un derecho universal.

El hombre es el nico animal que adems de su propio "armamento", su
inmunidad creada por la Naturaleza, ha conseguido mediante la
medicina atacar, perseguir y eliminar las enfermedades que nos han
ostigado. Pero, si recordamos uno de los principios bsicos de la teora
de la Seleccin Natural, " los ms adaptados son los que sobreviven".
Esto provocaba que el resto mora o no se reproduca, con lo cual la
especie era "purificada" genticamente. Ya que slo participaban para
la nueva generacin los genotipos ms adaptados.El hecho es que el
hombre al aplicar tratamientos sobre individuos enfermos ha "rescatado"
personas no adaptadas, y as se ha acumulado un lastre que arrastra la
especie humana. Los realmente elegidos se han visto diluidos en el
conjunto de la poblacin. La especie se ha vuelto heterognea, mixta,
donde conviven individuos "rescatados" e individuos "adaptados".
Lgicamente el hombre no puede permitir seguir las leyes de la
seleccin al dejar morir a los menos adaptados, pero esto plantea un
problema, llegarn a perderse una gran cantidad de individuos
"rescatados" en el futuro? El que la especie no sea uniformemente
adaptada traer consecuencias evolutivas? An no podemos responder a
estas cuestiones, pero si en nuestras manos est el ayudar a una
persona, sin duda correremos el riesgo.

Como conclusin y dejando un poco la tica, pensamos que aunque al

valorar los beneficios y los riesgos de los tratamientos los datos no nos
hagan estar de acuerdo con su aplicacin, la impotencia, la angustia y
el dolor por ver como seres queridos se mueren sin poder auxiliarles nos
obliga a saltar barreras en nuestra concepcin de lo ticamente justo
para soar, con que si al menos pudimos ayudarles en llegar a esa
Felicidad utpica de la hablabamos al principio, nuestra Felicidad la
abremos alcanzado.

BIBLIOGRAFA

Pgina Web de la universidad de Valencia sobre terapia gnica

Pgina Web de la universidad de Leicester, curso 335, Lecture Notes,

Gene Therapy (Peel)

Una leccin sobre vectores usados en terapia gnica

Watson. Recombinant DNA. 2 edicin. Cap. 14. Cap 28.

Ann. Rev. Microbiology, Vol 49, Ao 1.995.

British Medical Bulletin, Vol 51, Ao 1.995, n 1 , pp 45-55.

Izquierdo, M. Biologa molecular del cncer. Cap 10

The Ethics of Human Gene Therapy. LeRoy Walters. Nature, vol 320, pg
225-227. 20 de marzo de 1.996.

Investigacin y Ciencia, n 221, ao 1995.

Investigacin y Ciencia, n 230, ao 1.995.

British Medical Bulletin, Vol 51, Ao 1.995, n 1 , pp 226-234.

-British Medical Bulletin, Vol 51, Ao 1.995, n 1, pp 149-166.

Apuntes de la asignatura de Virologa del prof. Antonio Luis Extremera.

Curso 1.997-98. Universidad de Granada.

John J. Rossi. Trends in Biochemical Sciences. Agosto 1.995. Vol 13. pg

301-306.

Mang Yu, Eric Poeschla y Flossie Wong-Staal. Gene Therapy (1.994) Vol
1, pg 13-26.

Kenneth W. Culver y R. Michael Blaese. Trends in Genetics. Mayo 1.994.

Vol. 10 n5

GWG Wilkinson y L K Borysiewicz. British Medical Bulletin, 1.995, Vol 51,

n 1, pp 205-216.

Fernando Larcher, Marcela Del Ro y Jos Luis Jorcano. Mundo

Cientfico. Febrero 1.999. 198. pg 38-42.

W French Anderson. Mundo Cientfico. Febrero 1.999. 198 . pg 43-47.

"Delivering therapeutic genes-matching approach and aplication".

Trends in Biochemical Sciences. Mayo 1.993. Vol11.

Antoine Kichler y Olivier Danos. Mundo Cientfico. Febrero 1.999. 198.

pag 48-50.

Inder M. Verma y Robert K. Naviaux. Current opinion in Genetics and

Development. 1.991, Vol 1. pg 54-59.

Pierre Lehn. Mundo Cientfico. Febrero 1.999.!98. pg. 51-52.

W. French Anderson. Science. 26 de Octubre de 1.984. Vol 226.

pg.401-408.

Catherine Ducruet. Mundo Cientfico. Febrero 1.999. 198. pg. 53-57.

Catherine Ducruet, Michel Callon, Vololona Rabeharisoa. Mundo

Cientfico. Febrero 1.999, 198. pg.58-60.
Mark A. Kay y Savio L.C. Woo. Trends in Genetics. Julio 1.994. Vol. 10.
n7

J.P. Schofield y C.T. Caskey. British Medicall Bulletin. !.995. Vol. 51. n
1. pp 56-71.

Jean-Paul Gaudillire y Ilana Lwy. Mundo Cientfico. Febrero 1.999.

198. pg. 61-64.

A. Dusty Miller.Nature. 11 de Junio 1.992. Vol. 357.

Richard A. Morgan y W. French Anderson. Ann. Rev. Biochemical. 1.993.

Vol. 62. pg. 191-217.

"Curso sobre Derecho Penal" Parte Especial. Volumen I. Dirigido por

Manuel Cobo del Rosal. Ed. Marcial Pons, ediciones jurdicas y sociales
S.A. Madrid 1.996. Pg. 175-189.

Garca Miranda CM. " La regulacin jurdica de la clonacin de seres

humanos. Cuadernos de Biotica, " 1.997. Volumen II. Pg 913-918.

Fred Levine y Theodore Friedmann. Current opinion in Biotechnology.

1.991. Vol. 2 . pg. 840-844.

John J. Rossi. British Medical Bulletin. 1.995. Vol. 51. n 1. pp. 217-225.

W. French Anderson. Sciences. 8 de Mayo 1.992. Vol 256.

Miguel Moreno: aspectos ticos y sociales de la terapia gnica

AGRADECIMIENTOS
A los profesores Antonio Luis Extremera y Enrique Iaez por su desinteresada ayuda a
la hora de proporcionar articulos bibliogrficos de este trabajo y algunas direcciones
de internet.

A Juan Manuel Gabella Gonzlez por su inestimable ayuda en el apartado de " la

terapia gnica en el plano jurdico".

A Rafael Nisa Martnez y Francisco Prez Fernndez.

 Miguel Moreno

Modelos y presupuestos en la
divulgacin de los avances en terapias
gnicas y clonacin"
Cursos de verano del Centro Mediterrneo (Universidad de Granada) Almucar, 15-
19 de Septiembre de 1997

1997 Miguel Moreno Muoz. Prohibida la reproduccin sin el permiso

expreso del autor. Este material es un borrador. Prohibido citarlo sin
consentimiento del autor

Introduccinmodestos resultados en la
transferencia de genes a humanos con
finalidad teraputica son presentados
a menudo en la prensa y en la
literatura divulgativa como logros
espectaculares y verdaderas
revoluciones en el tratamiento de
enfermedades como el cncer, el SIDA
o la diabetes. Algunos presupuestos
bsicos en esta literatura son los
siguientes:
Las principales enfermedades pueden ser descritas a nivel molecular,
que sera el nivel adecuado para explicar su gnesis.

Esto nos obliga a distinguir entre "genes defectuosos" y "genes sanos",

entre "instrucciones genticas defectuosas" y "programa gentico
adecuado".

El tratamiento adecuado consiste en "reprogramar" las instrucciones

errneas, en sustituirlas por otras correctas o en compensar las errneas
aadiendo otras adecuadas.

La realidad es mucho ms compleja y requiere indagar qu se entiende

por terapia gnica (TG) en sus diferentes aplicaciones. Adems, nos
exige clarificar la terminologa utilizada. En los ltimos aos han
proliferado las propuestas de ensayos clnicos que difcilmente
podramos considerar "teraputicos" en sentido estricto, es
decir, destinados a curar o aliviar el sufrimiento producido por
enfermedades graves asociadas a alteraciones genticas, hereditarias o
no. No deberamos considerar "terapias gnicas" las destinadas a
prevenir el desarrollo de enfermedades hereditarias, conforme a los
datos derivados de un anlisis gentico "revelador de propensiones" a las
mismas; ni las de carcter preventivo, contra infecciones generalizadas
de origen viral; o las transferencias gnicas destinadas a identificar los
fenmenos (genticos, fisiolgicos, cromosmicos, etc.) implicados en
la etiologa de una enfermedad especfica (su fin primario es el
diagnstico, que en muchas ocasiones de poco sirve para la terapia).

Aunque la expresin "terapia gnica" significa, en su origen,

Introduccin de material gentico exgeno (natural o recombinante) en
sujetos humanos para corregir deficiencias celulares expresadas en el
nivel fenotpico, con el tiempo se ha ido "ensanchando" hasta incluir
transferencias gnicas de naturaleza preventiva y aquellas que
contribuyen al avance de la investigacin mdica. Probablemente no
existan confusiones al respecto entre los especialistas, y todos sepan
reconocer cundo se usa en sentido estricto y cundo en sentido amplio.
Pero frecuentemente no tienen en cuenta el hecho de que, adems de
ellos, tambin hablan de "terapia gnica" expertos en biotica,
abogados, filsofos, polticos, representantes de organizaciones sociales
y religiosas, etc., muchos de los cuales desconocen su significado
preciso en gentica clnica y recurren al significado ms comn. No
debera extraar, pues, que muchos asocien a dicha expresin algo ms
que "intervenciones estrictamente teraputicas en el ser humano"; ni
que en las sociedades contemporneas, las intervenciones etiquetadas
como "terapia gnica" susciten temores, recelos y animadversin.

Este solapamiento de significados (estricto/amplio) es visto por algunos

como una va para colar subrepticiamente, bajo la etiqueta saludable
de "terapia", lo que no pasan de ser intervenciones genticas
difcilmente justificables desde el punto de vista cientfico y (por lo
mismo) tico, como transferencias de carcter preventivo u orientadas
al diagnstico clnico. Una reflexin similar parece dar la razn a
quienes se oponen a este tipo de tcnicas basadas en el argumento de la
"pendiente resbaladiza" [slippery slope]: Si se acepta cualquier tipo de
TG, ser muy fcil dar el salto de intervenciones "razonables" a otras
mucho ms controvertidas, simplemente ampliando el rango de
connotaciones de la expresin "terapia gnica".

Las situaciones confusas inciden particularmente en las legislaciones

que comienzan "desde cero", y en relacin con la TG muchos pases
estn obligados a legislar ex nihilo. Esto significa que pueden imponerse
restricciones excesivas a la investigacin basadas en malentendidos muy
difundidos y, entre otras cosas, cerrar la puerta a cualquier tipo de
medicina predictiva o crear serios problemas de interpretacin legal
para el futuro. Torres y otros han propuesto incluso eliminar una
expresin tan ambigua como "terapia gnica", y buscar expresiones
alternativas para cada tipo de intervencin. Pero nadie sabe a priori el
tipo de intervenciones que sern posibles en el futuro. Por eso propone
Torres esta clasificacin elemental:

1. Desde el punto de vista biolgico, deberamos hablar de

transferencia gnica, que puede ser en lnea germinal o en lnea
somtica.
2. Atendiendo a sus objetivos, tendramos que hablar de
transferencia gnica:
a. Con finalidad mdica (prevencin, investigacin -
diagnstico clnico- y terapia);
b. Con finalidad no mdica (ingeniera gentica humana
orientada a la mejora[enhancement] de caractersticas o a
la eugenesia).
I. Las terapias gnicas (TG) como
aproximacin novedosa a las
enfermedades hereditarias
1. Limitaciones de la terapia gnica en humanos

El primer objetivo de la identificacin y clonacin de genes

responsables de enfermedades de origen gentico es el diagnstico
precoz, prenatal o postnatal. Pero diagnsticos eficaces sin terapia
posible satisfacen poco a los afectados. La identificacin de genes
humanos mediante tcnicas de ingeniera gentica constituye, no
obstante, el primer paso para desentraar las bases moleculares y
fisiopatolgicas de una enfermedad. Conocidas stas, las estrategias de
investigacin pueden ir en dos direcciones:

Va farmacolgica, para intentar compensar las consecuencias fisiolgicas del

disfuncionamiento celular;

va gentica, buscando la introduccin de un gen forneo -el transgn- en las clulas

afectadas, para que sustituya al gen anmalo. Este enfoque es el que corresponde a la
terapia gnica.

Desde los primeros intentos (no autorizados) de terapia gnica por

Martin Cline en 1979-1980 hasta hoy. Lo ideal sera colocarlo dentro de
uno de los cromosomas de la clula diana, en sustitucin del gen
anmalo. Pero, de momento, el recurso a la tcnica ms eficaz est
vedada en humanos. La recombinacin homloga se ha mostrado
operativa en ratn, permitiendo una modificacin estable y definitiva
de las clulas embrionarias germinales, transmisible a la descendencia.
Pero esta posibilidad en el hombre es rechazada unnimemente por
todos los comits internacionales de biotica. Slo queda el recurso a la
adicin gnica: el gen defectuoso sigue presente en el cromosoma, y el
transgn introducido puede permanecer fuera del ncleo o de los
cromosomas en forma de ADN no cromosmico (episoma).

Otra alternativa sera la introduccin al azar del transgn en el genoma,

con el riesgo de alterar la funcin de algn gen esencial. Las
precauciones frente a estas estrategias tan imprecisas consisten en
impedir la propagacin y transmisin del sistema de transferencia del
gen (el vector) y comprobar si la insercin del gen forneo no conlleva
la inactivacin de algn gen del hospedador o la activacin de algn
proto-oncogn.

2. Mtodos de transferencia gnica

Dependiendo de las caractersticas de la clula, del tejido o del rgano

a modificar se opta por una manipulacin in vitro u otra in vivo, con o
sin reimplantacin de las clulas modificadas. En los ensayos de
transferencia gentica, el gen normal (ADNc) es clonado en un vector de
expresin -un agente que transporta el ADNc al tejido diana donde, bajo
la regulacin de un promotor (parte de la secuencia de ADN que activa
al gen) se hace activo. Estos elementos de expresin son construidos
normalmente en virus defectuosos capaces de reproducirse con ayuda
de una lnea celular. El empleo de virus modificados parece altamente
efectivo en la distribucin del gen hasta el lugar elegido, pero no puede
replicarse. Por eso los retrovirus son el vector preferido, aunque
ltimamente se han comenzado a utilizar adenovirus y virus herpes
como agentes diseminadores eficaces. La eleccin de una
manipulacin in vivo o in vitro condiciona la del sistema de
transferencia del gen:

1. Un tipo de terapia gnica se basa en modificar genticamente in

vitro un conjunto de clulas que forman un "organoide", especie
de microfbrica que, una vez implantado en el organismo,
produce la protena necesaria, la cual llega hasta el organismo
donde se necesita por el torrente sanguneo.
2. Cuando el objetivo son clulas o tejidos que pueden renovarse a
partir de clulas precursoras como las del tejido hematopoytico
(la mdula sea), la piel (queratinocitos y fibroblastos), los
endotelios (recubren la cara interna de los vasos sanguneos y
linfticos), el hgado y los msculos (mioblastos), se extraen y
cultivan las clulas y son expuestas a la accin de un retrovirus
que les transfiere el gen. Al dividirse, transmiten el transgn a las
clulas hijas. Slo se reinyectan al paciente aquellas clulas en las
que el transgn se ha integrado y funciona correctamente. Esta
estrategia ex vivo empleando vectores construidos a partir de
retrovirus es la ms utilizada recientemente contra ciertos tipos
de cncer.
3. Para clulas quiescentes (completamente diferenciadas y que se
dividen poco o nada) y las asociadas a funciones mecnicas o
 estructurales (msculo estriado, msculo cardaco o pulmones) se
sigue la estrategia in vivo, aplicada con cierto xito a una
enfermedad pulmonar -la mucoviscidosis- y en principio adecuada
para enfermedades neuromusculares o neurodegenerativas. Los
vectores adenovricos y otros sintticos como los liposomas son los
ms adecuados en estos casos.

Muchos atribuyen las limitaciones de las tcnicas de transferencia

gnica disponibles al desconocimiento de las caractersticas que debe
reunir el vector adecuado. Por esta razn buena parte de la
investigacin reciente se est centrando en la eleccin y diseo de
nuevos vectores ms eficaces, creando incluso centros especializados
para desarrollar este tipo de investigacin.

3. Enfermedades genticas humanas candidatas a la TGH

Las enfermedades hereditarias provocadas por la carencia de una

enzima o protena son las ms idneas para estos tratamientos. Pero
tambin aquellas en las que no importa demasiado el control preciso y
riguroso de los niveles de la protena cuya produccin se pretende
inducir mediante manipulacin gentica (como el factor VIII de la
sangre, por ejemplo). Se trata, normalmente, de enfermedades
monognicas, originadas por la alteracin de un nico gen recesivo
anmalo y en las que basta la mera presencia del producto gnico para
corregir el defecto.

A finales de los 80 se consideraban alteraciones idneas para ser objeto

de tratamiento gnico la enfermedad de Lesch-Nyhan (provocada por la
ausencia de la enzima HPRT -hipoxantina-guanina fosforribosil
transferasa-, que provoca grave deficiencia mental y tendencia
compulsiva al automutilamiento) e inmunodeficiencias como PNP (muy
grave, provocada por la carencia de una purina nuclesido fosforilasa)
y ADA (la que padecen los "nios burbuja", en los que la falta del enzima
adenosin desaminasa les deja absolutamente indefensos contra
cualquier agente patgeno, obligndoles a vivir en un ambiente
absolutamente estril). En estos casos se conocan y haban sido
clonados los genes implicados. Bastara una pequea presencia de los
productos gnicos necesarios para corregir la alteracin, y unos niveles
ligeramente superiores de los mismos no parece tener consecuencias
negativas. Las clulas implicadas en la produccin de estos enzimas se
hallan en la mdula sea, lo cual plantea el problema adicional de
hallar donantes compatibles para iniciar el tratamiento. Los
experimentos indican que el tratamiento gnico de algunas clulas
extradas a los enfermos y su posterior reinsercin est siendo eficaz -al
menos en ADA-, y que, tras dos o ms aos de tratamiento se ha
conseguido la relativa normalizacin del sitema inmune y la
restauracin de la inmunidad celular y humoral, gracias en parte a
ventajas de crecimiento que las clulas tratadas genticamente parecen
tener sobre las anmalas

Aparte de la mdula sea, los tejidos humanos mejor conocidos eran

hasta hace muy poco la piel y la sangre. En otras clulas se plantean
mltiples problemas para extraer las clulas necesarias, cultivarlas
durante el tiempo requerido para manipularlas genticamente y ser
reimplantadas al paciente. El bajo nmero de clulas madre en la
mdula sea, no diferenciadas todava -antes de constituir las clulas
especficas de la sangre- y problemas en su reconocimiento han
constituido un importante obstculo para la TG. Adems, ninguna de las
tcnicas disponibles a comienzos de los 90 permita insertar un gen en
su locus o lugar cromosmico especfico dentro de la clula diana.

A finales de 1994, las posibilidades y aplicaciones de los tratamientos

gnicos se ampliaron notablemente, con diferentes resultados segn las
lneas celulares manipuladas:

3.1. Tratamiento gnico de enfermedades hepticas:

Los experimentos con ratones transgnicos, bioqumica y

fenotpicamente modificados, han permitido evaluar la eficacia
teraputica de la transferencia gnica somtica de vectores
adenovirales con replicacin alterada que codificaban el ADNc de la
ornitina transcarbamilasa (OTC). La duracin de su expresin est por
determinar todava, creo, pero los primeros resultados parecen
esperanzadores. Algo parecido puede decirse sobre la expresin de
beta-galactosidasa y a 1-antitripsina humana en hepatocitos aislados en
modelos transgnicos. A pesar de los problemas tcnicos que persisten
en relacin con la transferencia ex vivo de clulas y de la duracin
limitada de la expresin teraputica, hay al menos dos protocolos
clnicos aprobados para la transferencia ex vivo de genes al hgado. Los
tratamientos van destinados a pacientes con insuficiencia heptica
aguda y al tratamiento de la hipercolesterolemia familiar. De manera
global, la precaucin y el estudio detenido de los protocolos clnicos
presentados seguirn siendo la norma, mientras persistan los problemas
de expresin transitoria y grado de eficacia insuficiente en el
tratamiento gentico heptico tanto in vivo como ex vivo.

3.2. Hemoglobinopatas y tratamiento gnico de clulas hematopoyticas:

El dominio adquirido en los trasplantes de mdula sea y la capacidad

que tienen las clulas primordiales hematopoyticas (CPH) para
reconstituir totalmente la mdula sea, hacen del sistema
hematopoytico un candidato idneo para el tratamiento gnico. Las
inmunodeficiencias combinadas severas (ADA), las hemoglobinopatas
(talasemias), las deficiencias de adhesin leucocitaria y las
enfermedades de depsito lisosomal (enfermedad de Gaucher) han
acaparado la mayor parte de las investigaciones en tratamiento gnico.
Recientemente se han identificado los genes responsables de tres
enfermedades inmunitarias ligadas al cromosoma X, y diversos tipos de
leucemia, el cncer y el SIDA estn siendo objeto de intensos estudios
que incluyen aproximaciones teraputicas de tipo gentico. En las CPH
los vectores retrovirales parecen ser, de momento, los ms eficaces
para la transferencia.

ADA (trastorno autosmico recesivo; frecuencia: 25% de las ICS): Su

deficiencia origina una disfuncin intensa en las clulas T y B, que
provoca la muerte de los pacientes antes de los 2 aos de edad por
infeccin masiva. Actualmente, el tratamiento preferido es el
trasplante de mdula sea procedente de un donante HLA idntico, que
puede producir una curacin completa aunque conlleva una alta
morbilidad. Pero menos de un 30% de los pacientes tienen un hermano
HLA idntico. La sustitucin enzimtica no consigue una restitucin
inmunitaria completa y produce otros efectos txicos. Un tratamiento
sustitutorio, consistente en inyectar el enzima ADA combinada con
polietilenoglicol (PEG) permite en ciertos casos frenar los efectos de la
enfermedad. Pero es un tratamiento muy caro, ininterrumpido y de
eficacia inconstante.

Tras numerosos experimentos en organismos modelo, se iniciaron hace

ya ms de cuatro aos ensayos clnicos de transferencia gnica de ADA
hacia las clulas T perifricas, previamente tratadas in vitro. Aunque
algunos pacientes experimentaron una notable mejora clnica e
inmunitaria, los resultados difieren considerablemente de unos a otros y
no llegan a normalizarse todos los ndices de la funcin inmunitaria. En
opinin de algunos, ni en este ensayo pionero ni en otros existen
evidencias inequvocas de que el tratamiento gentico ha producido
beneficios teraputicos. Los riesgos de posible mutagnesis insertiva de
genes relacionados con el cncer, despus de repetidas transferencias
retrovirales, no se han visto confirmados hasta el momento. Pero los
modestos resultados han estimulado otras propuestas de ensayos
clnicos en Italia y Pases Bajos. Segn sus autores, en uno de estos
ltimos ensayos la transferencia gentica haba funcionado y se haba
conseguido la reconstitucin inmunitaria. En todo caso, es preciso tener
en cuenta que los pacientes estuvieron recibiendo tambin inyecciones
rutinarias de ADA sinttica, y estos tratamientos convencionales podran
ser responsables en buena parte de su buena salud.

Enfermedad de Gaucher: Autosmica recesiva, es producida por el

derivado proteico de un gen que codifica la enzima glucocerebrosidasa.
El trasplante alognico de mdula sea ha corregido la enfermedad en
algunos pacientes, pero ya se ha conseguido la trasferencia gnica
retroviral de un gen recombinante normal de la glucocerebrosidasa en
clulas madre de ratn, seguida de la expresin proteica en macrfagos
diferenciados a partir de clulas madre transducidas.

Las hemoglobinopatas representan el trastorno gentico ms frecuente

en humanos, y la mayor parte de los experimentos con tratamiento
gnico persiguen la expresin regulada de altos valores del gen de la
globina utilizando vectores retrovirales. Pero a mediados de 1994 no se
haba conseguido la expresin regulada de los genes de la globina
utilizando vectores retrovirales.

3.3. Tratamiento gentico del cncer:

Parece que procesos cancergenos hereditarios como el retinoblastoma,

poliposis adenomatosa familiar, cncer de mama y melanoma estn
relacionados con un gen nico que predispone al paciente a presentar
neoplasia. Leucemia y linfomas no hereditarios parecen provocados por
nuevas mutaciones (translocaciones, a menudo) que confieren un nuevo
rasgo gentico a la clula maligna. La correccin gnica de todas las
clulas malignas implicadas en procesos cancergenos constituye un
desafo sorprendente.

Inmunoterapia contra el cncer. Muchos estudios han intentado

incrementar la cantidad y citotoxicidad especifica de los linfocitos que
reaccionan con las clulas tumorales. Los primeros intentos incluan el
marcaje de unas clulas inmunes llamadas linfocitos de infiltracin
tumoral (TILs, tumor-infiltrating lymphocytes) para seguir el progreso
del tratamiento contra el melanoma maligno. Steven Rosenberg, uno de
los ms conocidos investigadores sobre el cncer de los NIH, consigui
en 1990 la aprobacin definitiva para una segunda aplicacin de la
terapia gnica a pacientes con casos avanzados de melanoma, cncer de
piel que anualmente mata a unos 28.000 ciudadanos en EE.UU. El
enfoque adoptado por Rosenberg reconoce las limitaciones del recurso a
fuerzas externas (radiacin, quimioterapia y ciruga) con los pacientes
cancerosos y propone una estrategia basada en los propios mecanismos
internos del cuerpo, como la terapia gnica, para conseguir que el
propio cuerpo rechace la enfermedad. Rosenberg y su equipo extrajeron
linfocitos de infiltracin tumoral procedentes de los tumores de
pacientes con melanoma. Los TILs fueron introducidos en una solucin
de interleuquina-2, una sustancia natural que potencia su efecto
destructor, y posteriormente expuestos a retrovirus de leucemia de
ratn manipulados. El sistema de transporte y distribucin de Rosenberg
haba sido neutralizado y dotado mediante tcnicas de ADN
recombinante con un gen humano. Este gen codifica un factor de
necrosis tumoral (TNF), una protena que interfiere con el suministro de
sangre al tumor y debilita las clulas tumorales. Los virus alterados se
insertan ellos mismos junto con su gen polizn dentro del material
gentico de los TILs, y estos son inyectados en la sangre de los
pacientes con melanoma. Conforme a las previsiones, los TILs activados
se hospedaran en los tumores como si fuesen misiles teledirigidos,
atacando las clulas cancerosas y a la vez liberando el factor
antitumoral (txico) para ayudar a exterminarlos.

Un ao despus, sin embargo, el comit de asesores cientficos

del National Cancer Institute's Division of Cancer Treatment cuestion
la fiabilidad y algunos elementos cruciales de los experimentos de
Rosenberg, negndole un contrato de 3,9 millones de dlares por 3 aos
para desarrollar clulas TIL en un laboratorio independiente. Han
fallado varios aspectos importantes en los dos aos de experimentacin.
Aunque los TILs s se dirigan al tumor, no lo hacen los modificados con
el TNF. Parece que algo relacionado con la insercin del TNF interfiere
con su capacidad para hospedarse en el tumor. El resultado es que la
mayor parte de los linfocitos modificados quedan atrapados en el
hgado, bazo y pulmones, donde probablemente son destruidos. Y la
expresin no regulada en estos rganos del TNF puede originar procesos
txicos secundarios.
Otro mtodo basado en la inmunoterapia ("vacunacin gentica" o
inmunoterapia activa) trata de aumentar el carcter "extrao" de las
clulas tumorales para estimular la accin antitumoral de las clulas
asesinas (linfocitos T y macrfagos) del sistema inmunitario. Las clulas
tumorales producen en su superficie unas protenas anmalas capaces
de activar las clulas asesinas. Algunos tumores incluso son portadores
de antgenos propios ("antgenos asociados a los tumores") que
permanecen "silenciosos" en las clulas normales. Esto ocurre con
productos gnicos descubiertos en algunos melanomas humanos, las
protenas MAGE (melanoma antigen) y MART (melanoma antigen
recognized by T-cells) descubiertas recientemente por los equipos de T.
Boon y Rosenberg, respectivamente. Normalmente, los antgenos son
presentados a las clulas inmunitarias en forma de fragmentos por las
protenas del complejo mayor de histocompatibilidad (HLA) presentes
en las superficies de las clulas. Pero una de las diferencias
fundamentales entre las clulas normales y las tumorales est en que
estas ltimas no presentan correctamente los antgenos tumorales. Esta
es una de las caractersticas que se pretenden modificar.

Incremento de la inmunogenicidad de las clulas tumorales: Mediante

modificacin gentica se intenta potenciar la respuesta inmunitaria
dirigida contra el tumor. Se utilizan diversas protenas especficas,
especialmente citoquinas y molculas de adhesin celular
(interleuquina-2, interleuquina-4, el TNF, etc.) que no producen ningn
efecto sobre el crecimiento de las clulas tumorales in vitro pero
inhiben el crecimiento del tumor in vivo. En ratn, las clulas tumorales
son eficazmente rechazadas cuando han sido manipuladas mediante
tcnicas de ingeniera gentica para expresar diversas citoquinas o bien
el complejo principal de histocompatibilidad. Esto hace pensar que en
humanos, el protocolo debera incluir la eliminacin de una parte del
tumor, la transduccin de las clulas in vitro con las formas de
expresin adecuadas y el reimplante de estas clulas tumorales al
paciente. Se han aprobado diversos protocolos clnicos en todo el mundo
para la transferencia in vitro a clulas tumorales de genes de citoquinas
(IL-2, IL-4, el interfern g , el GM-CSF o factor estimulante de colonias
de granulocitos-macrfagos, etc.) para diferentes tipos de cncer:
colorrectal, de mama, melanoma maligno, neuroblastoma, carcinoma
de pulmn, de rin, etc.

Otros ensayos persiguen la utilizacin de genes protectores, mediante

la transferencia de genes que incrementen la resistencia a varios
frmacos en clulas madre de pacientes con tumores slidos o leucemia
y permitan niveles superiores de quimioterapia para erradicar la
enfermedad residual. Otros estudios proponen utilizar genes
destructores como los de la toxina diftrica y los que codifican el TNF
para eliminar las clulas cancerosas; o el empleo de "genes suicidas",
que transforman un producto no txico (por ejemplo, un antivrico como
el aciclovir) en un veneno que provoca la muerte de las clulas. Otros
enfoques del tratamiento gnico contra el cncer pretenden el marcaje
de las clulas malignas con protenas codificadas por genes de supresin
tumoral como el p53 (alterado en el 50% de los casos) o ras (alterado
slo en el 30%). In vitro, las clulas malignas a las que se ha transferido
la forma natural del p53 ya no tienen capacidad tumorignica o la
tienen ms dbil que las clulas originales.

Muy recientemente, se ha desvelado el funcionamiento de otro gen muy

directamente implicado en la supresin de tumores, el p16. De
momento, se estn diseando los vectores para introducirlo
adecuadamente en las clulas tumorales y conseguir su expresin con
arreglo a las previsiones. Pero el propio director de equipo, el espaol
Manuel Serrano, reconoce las dificultades inherentes todava a las
terapias gnicas y deposita ms esperanzas en el diseo de alguna
molcula por sntesis qumica capaz de imitar la accin del gen p16.

Todas estas alternativas presentan numerosos inconvenientes todava.

Sigue siendo difcil extraer y modificar clulas tumorales. Slo una
fraccin de ellas -poco controlable- resulta manipulable para una
posible fabricacin de vacunas parciales. No todos los tumores son
fsicamente accesibles. El problema ms importante lo constituye la
elevada eficacia necesaria en la transferencia de las clulas modificadas
a las clulas neoplsicas, de modo que no perjudiquen a las normales.
Por ltimo, la manipulacin de clulas tumorales con genes inhibidores
de la proliferacin celular como el p53 requiere la modificacin
de todas las clulas tumorales, y como la mayora de cnceres proceden
de una cascada de anomalas genticas, la reversin de una sola de ellas
no bastara seguramente para detener la enfermedad.

3.4. Tratamiento gentico de las clulas respiratorias:

Para la fibrosis qustica (enfermedad autosmica recesiva, que afecta a

1/2.500 recin nacidos blancos) existe un tratamiento convencional
(fluidificacin de las secreciones del sistema respiratorio, tratamiento
de las infecciones y sustitucin de las enzimas pancreticas). Se ha
descubierto recientemente el gen implicado en la enfermedad, el
regulador de la conductancia transmembrana (CFTR), lo que ha
supuesto un importante avance hacia su tratamiento gnico. Se estn
siguiendo estrategias in vivo para el tratamiento de la FQ, ms
adecuadas y viables que las ex vivo. Despus de algunos intentos con
ratones (instilacin traqueal de un adenovirus recombinante con
replicacin defectuosa que codifica el CFTR) con buenos resultados -
aunque la expresin del gen no ha durado ms de 42 das- se aprobaron
varios ensayos clnicos en humanos utilizando un vector adenoviral con
CFTR y transferencia gentica de un complejo ADN-liposoma. Los riesgos
de toxicidad parecen descartados en los primeros intentos y basta algo
tan sencillo como un inhalador para conseguir la expresin del gen y
aliviar en un 30% los sntomas de la enfermedad.

3.5. Tratamiento gentico muscular

En ratones se ha conseguido la sustitucin de las secuencias anmalas

del gen mutante por secuencias normales, corrigiendo as el defecto
gentico.

4. Uso teraputico de cidos nucleicos anti-sentido

Una aproximacin sorprendentemente novedosa al control de la

expresin gentica consiste en la inyeccin de secuencias cortas de
nucletidos o sondas de cidos nucleicos anti-sentido, obtenidas por
sntesis qumica, que se unen al ARN nuclear y bloquean su
procesamiento o salida desde el ncleo; otras veces se unen
directamente al gen para impedir su transcripcin en ARN. Como es
obvio, este tratamiento es el adecuado para situaciones en las que se
trata de bloquear el funcionamiento de un gen cuyo producto resulta
nefasto para el organismo. Segn las previsiones iniciales, estamos ante
una tcnica enormemente especfica, probablemente decisiva para la
regulacin controlada de genes especficos, cuyo dominio podra
acelerarse gracias al conocimiento detallado de la secuencia de todos
los genes humanos que el PGH terminar proporcionando.

En octubre de 1993, la Agencia Nacional Francesa de Investigacin sobre

el Sida aprob un ensayo que propona el empleo de una secuencia
antisentido, producida por la empresa norteamericana Hybridon, para
inhibir la replicacin del VIH. De la estrategia antisentido se esperaban
adems importantes aplicaciones en todas aquellas enfermedades
humanas de claro componente gentico, incluyendo el cncer, las
enfermedades cardiovasculares, las inmunes -alergias-, las autoinmunes
y las infecciones virales.

Sin embargo, los resultados conseguidos hasta hoy (octubre de 1995)

indican que la tcnica debe afrontar todava numerosos imprevistos y lo
mejor que se puede decir es que los compuestos antisentido no
funcionan tal y como los investigadores esperaban. Las impresiones de
uno de los investigadores directamente implicados en el diseo de este
tipo de oligonucletidos son ilustrativas: "The assumption is that we are
designing oligonucleotides that dont interact with anything besides
[their targets]"; "Many people are worried that a lot of the positive
effects reported are not just antisense but other nonantisense
mechanisms as well" (Cy Stein, Columbia Univ.). Estas limitaciones de la
tcnica [y del "enfoque"?], tras numerosos ensayos clnicos, han
provocado que varios expertos critiquen la excesiva rapidez con que se
ha dado el salto, en este caso como en otros, del laboratorio a la
clnica. Por consiguiente, habr que seguir perfeccionando la tcnica
hasta que funcione con arreglo a las perspectivas. Se ha sugerido que no
basta dirigir los oligonucletidos al gen diana, sino que ser preciso
disear molculas antisentido capaces de interactuar con las protenas
asociadas al gen, implicando ms mecanismos y niveles que el gentico.
El fracaso inicial en las primeras aplicaciones de esta tcnica apunta a
la tesis que con mayor detalle expongo en el captulo seis: la mayor
parte de la investigacin biomdica se desarrolla dentro de un
paradigma de investigacin centrado casi exclusivamente en un nivel, el
gentico, que es necesario pero que, a la luz de otros muchos estudios
ofrecidos por la literatura experimental, se est revelando claramente
insuficiente para la comprensin de las enfermedades que consideramos
"genticas".

5. Ventajas de las TG y perspectivas a corto plazo

Como hemos visto, en los dos ltimos aos se han producido progresos
sustanciales dirigidos a la correcin gentica de enfermedades
hereditarias. La aproximacin gentica se ir imponiendo
progresivamente por varias razones:

1. Evita las complicaciones potenciales del trasplante, puesto que se

introduce el gen normal en el propio tejido somtico del paciente.
 2. En un tratamiento ideal, el gen corrector sera diseminado en una
lnea celular auto-regeneradora, que replicara el gen transferido
y se replicara a s misma, eliminando la necesidad de una terapia
repetitiva. Ya hemos comentado los logros parciales en la
expresin prolongada de los genes transferidos (tratamiento de la
deficiencia de ADA y de la FQ, por ejemplo). Recientemente,
James Wilson y su equipo en la universidad de Michigan
consiguieron resultados positivos en el tratamiento de la
hipercolesterolemia familiar.
3. Procedimientos tcnicos como la recombinacin homloga evitan
el azar biolgico de los vectores virales y permite realizar la
sustitucin del gen defectuoso por un gen normal. Se ha
conseguido una recombinacin autntica en cultivos de clulas
humanas y de ratn usando grandes segmentos de ADN
introducidos mediante microinyeccin o por electroporacin
(mediante la cual se induce a las clulas diana a absorber el ADN
extrao). Este mtodo, una vez perfeccionado lo suficiente, tiene
la ventaja de que permite reemplazar genes defectuosos por
genes normales, en lugar de integrar los genes correctos (va
vector retroviral) entre las clulas portadoras del gen defectuoso.
4. El mismo procedimiento est siendo ampliamente utilizado como
un medio para obtener ratones transgnicos, de gran inters
mdico porque permiten construir modelos animales de
enfermedades humanas con los que experimentar y desarrollar
posibles terapias. En relacin con la corea de Huntington, por
ejemplo, puesto que conocemos la mutacin gentica que la
provoca, podramos reproducirla mediante ingeniera gentica en
los genes homlogos del ratn. El ratn se convertira as en un
modelo para estudiar las maneras de evitar la enfermedad, al
menos hasta que aparezca una terapia capaz de corregir las
consecuencias de esta trgica alteracin. Toda una variedad de
enfermedades humanas estn siendo reproducidas en ratn para
determinar las estrategias teraputicas adecuadas. En concreto,
para el estudio de enfermedades del sistema inmune se dispone
ya un amplio muestrario de modelos murinos. Aparte de sistemas
modelo para es estudio de enfermedades, los ratones transgnicos
estn siendo utilizados tambin como biorreactores.

La TG est dando sus primeros pasos, pero los resultados publicados en

los ltimos diez o doce meses justifican que las perspectivas a medio
plazo sean alentadoras. Las cuestiones ticas suscitadas por las posibles
aplicaciones de estas tcnicas se tratarn en el captulo 5.

II. Interrogantes tico-jurdicos

planteados por la terapia gnica
Los progresos de la ingeniera gentica han llevado a desarrollar
poderosos mtodos de diagnstico. Pero hacen posible, adems,
diversas intervenciones en el material gentico humano. Entre todas,
destaca por sus potencialidades la terapia gnica, entendida como "la
curacin de enfermedades o defectos graves debidos a causas genticas,
actuando directamente en los genes, mediante la adicin, modificacin,
sustitucin o supresin de genes". Es aplicable a defectos genticos de
diversa ndole: i) hereditarios, cuando son transmitidos por Alos genes
de los padres; ii) No hereditarios, cuando las anomalas se producen por
errores imprevistos en la formacin de las clulas sexuales;
y iii) congnitos, cuando ocurren durante el desarrollo embrionario. Por
el momento, se trata en su mayora de intervenciones para corregir
defectos de origen monognico. Como especificamos en el captulo
anterior, cabe distinguir intervenciones en clulas somticas y en
clulas de la lnea germinal.

1. TG somtica

La terapia por transferencia gnica en tejidos somticos plantea

cuestiones ticas muy limitadas, puesto que el xito o el fracaso en el
intento afectar slo al paciente enfermo. El asunto entra dentro de las
preocupaciones tpicas en torno a cualquier tipo de experimentacin
con humanos, exactamente dentro del clculo de beneficios y riesgos
para el individuo. Existe unanimidad en exigir una evaluacin cuidadosa
del riesgo que implica el uso de vectores virales, incluyendo su
capacidad para infectar las lneas celulares del progenitor y el potencial
dao colateral de la insercin.

Las intervenciones sobre clulas somticas (en el pncreas, por

ejemplo, para combatir la diabetes) no afectan, en principio, a la
dotacin gentica de la persona sometida a ellas, pues no intervienen
en los procesos reproductores del ser humano. Pero, desde el punto de
vista jurdico, las clulas somticas y sus componentes (incluidos los
genticos) forman parte de la integridad personal (fsica o psquica del
individuo), dentro de lo que podramos considerar como subcategora de
"integridad gentica" y, por consiguiente, se benefician de la proteccin
jurdico-penal otorgada a ese bien jurdico. De lo dicho podemos derivar
algunas conclusiones de carcter tico-jurdico:

La TG en la lnea somtica se circunscribe, en su calificacin jurdico-penal, a la

valoracin jurdica de cualquier tratamiento, sin perjuicio de las matizaciones que
corresponde tener en cuenta cuando se trata de un tratamiento nuevo o en fase de
experimentacin, esto es, de que constituya lo que se viene conociendo como
"experimentacin teraputica", que implica el sometimiento a las directrices y
limitaciones generales comnmente aceptadas sobre esta modalidad teraputica
(principalmente la ponderacin de riesgos y beneficios y el consentimiento informado
del interesado).

La TG somtica conforme a la lex artis no slo es en principio lcita, sino que ni

siquiera realiza el tipo de los delitos de lesiones corporales.

Cualquier otra accin no teraputica, que comporte la alteracin o modificacin de

los componentes genticos de las clulas de una persona, realiza el tipo de lesiones
corporales, en la medida en que suponga un menoscabo en su integridad corporal, o
en su salud fsica o mental (art. 420 del CP espaol), dependiendo el tipo aplicable de
las medidas asistenciales que sean necesarias para su sanidad, de ser sta posible
(arts. 420, 421 582 del CP espaol), o de cul sea la configuracin de estos delitos
en el CP que resulte aplicable.

Romeo Casabona considera estas acciones lcitas, no obstante, si estn

amparadas por una causa de justificacin, donde juega una funcin
primordial el consentimiento del interesado (portador del bien jurdico
protegido) y la eficacia que en relacin con la integridad corporal o la
salud le reconozca a dicho consentimiento el ordenamiento jurdico
correspondiente (frecuentemente a travs del n1 11 del art. 8 del CP:
ejercicio legtimo de un derecho o profesin, siempre que se encuentre
apoyo en algn sector del ordenamiento jurdico).

2. Transferencia gnica en lnea germinal. Objeciones

La transferencia de genes a clulas germinales (gametos, cigoto) o a

embriones humanos tiene poca demanda prctica, de momento, y
suscita importantes reservas, sobre todo cientficas, pero tambin
ticas. Es probable que el diagnstico de embriones llegue a ser pronto
una realidad en la atencin mdica, como ha sucedido en los estudios
con ratn. Si esta opcin est disponible para una pareja que desea
evitar la transmisin a su descendencia de una enfermedad heredada de
modo recesivo, parecera ms lgico permitir la implantacin de un
embrin normal (tres de cada cuatro) en lugar de intentar la correccin
de un embrin afectado (uno entre cuatro). Las tecnologas actuales de
transferencia y sustitucin tienen tasas de xitos notablemente bajas
(1/1.000-1/100.000) o dan lugar a recombinaciones ilegtimas en las que
el gen se inserta en lugares indebidos, a veces en medio de otro gen.
Tales inserciones al azar han provocado enfermedades en embriones de
ratn. Por tanto, la correccin de alteraciones mediante transferencia
gnica en la lnea germinal no slo plantea controversias sino que
ofrece, adems, poco valor prctico para el ser humano.

Con esta clase de tcnicas pueden barajarse, en principio, los mismos

criterios que para las intervenciones en la lnea somtica. No se plantea
la cuestin de la proteccin de los gametos y del cigoto totipotente
como tales, sino la capacidad reproductora de individuos que presentan
anomalas en sus clulas reproductoras o que se manifiestan
inmediatamente despus de su unin.

No obstante, la TG en lnea germinal plantea otros problemas ticos y

jurdicos de ndole mayor. Aunque en el futuro pueda contribuir a
erradicar defectos genticos en las estirpes intervenidas, tambin
tendr efectos de modificacin definitiva del componente gentico
intervenido y de transmisin a las generaciones sucesivas, cuya
trascendencia para la especie humana no se conoce todava con
precisin ni es posible, por lo mismo, controlar sus potenciales efectos
negativos, en su mayora todava desconocidos. Los recelos ante efectos
imprevisibles llevaron a algunos especialistas a proponer una prohibicin
absoluta de esta modalidad teraputica y a solicitar otros un
aplazamiento o moratoria hasta que se tenga ms informacin al
respecto. Unos pocos, en fin, entienden que no deben cerrarse
totalmente las puertas a esta terapia en la medida en que no se pueden
apreciar por el momento riesgos reales para el ser humano como
especie, siempre y cuando se garantice su no transmisin, va
reproductiva, a otros seres humanos, y pueda establecerse, en caso
contrario, un seguimiento y control de sus consecuencias en varias
generaciones posteriores [?]. Las puntualizaciones habituales sobre el
asunto destacan tres aspectos:
 1. Determinar qu debe entenderse en estos casos por terapia en
sentido estricto y su posible diferenciacin de las manipulaciones
con fines de transferencia gnica experimental o encaminada a
una mejora genotpica o fenotpica.
2. Puesto que otras intervenciones no teraputicas en la lnea
germinal sern transmitidas genticamente a la descendencia,
procede determinar si est presente algn otro bien jurdico que
trasciende a la colectividad, digno de proteccin y sobre el cual
sea necesaria su identificacin.
3. Esta segunda consideracin orientara respecto a si debe ser lcita
y permitida cualquier manipulacin en la lnea germinal; o, de no
serlo, sobre si la prohibicin debe trasladarse al mbito penal y
constituir delito.

A la vista de la situacin actual, parece ms prudente tica y

jurdicamente apoyar la tesis de la moratoria en lo que se refiere
exclusivamente a la terapia en la lnea germinal. Romeo Casabona no
considera oportuno, por el momento, la incriminacin de estas prcticas
experimentales en la investigacin. Es partidario de que permanezcan
"en el mbito de lo ilcito administrativo y en el de la toma de
decisiones sobre restricciones en la concesin de fondos pblicos de
apoyo a esas actividades y a la investigacin de las que sean tributarias,
sin perjuicio de admitir como alternativa que puedan realizarse, previa
aprobacin de comits de expertos, con fines teraputicos en cada caso
concreto y previa ponderacin de las garantas que se ofrezcan de
evitacin de mutaciones o aberraciones no deseables".

3. El Derecho espaol no excluye la TG en lnea germinal:

Nos remite a la Ley sobre Tcnicas de Reproduccin Asistida, que

admite la terapia gnica (art. 1.3) en embriones y fetos en el tero
nicamente si se cumplen ciertos requisitos, entre ellos el de disponer
de una lista de enfermedades en las que la teraputica sea posible
desde criterios estrictamente cientficos. Dicha lista debe aprobarla el
Gobierno de la nacin por Real Decreto (disposicin final 10, d),
siempre que no se influya en los caracteres hereditarios no patolgicos
ni se busque la seleccin de los individuos o la raza (art. 13.3.c y d,
resp.).
"La amplitud de los trminos de este ltimo requisito permite pensar que la Ley
espaola no excluye, en principio, la TG en la lnea germinal, sin perjuicio de las
restricciones que pueda introducir a este respecto la lista de enfermedades
mencionada cuando se publique."

4. La seleccin de sexo con fines teraputicos

Relacionada con la TG est la seleccin de sexo con fines teraputicos,

como medio de impedir la transmisin de enfermedades hereditarias
ligadas a los cromosomas sexuales, as como la creacin de mosaicos
genticos beneficiosos por medio de la ciruga, al transplantar clulas,
tejidos y rganos de los embriones o fetos a enfermos en los que estn
biolgica y genticamente alterados o falten, tambin permitidos por la
Ley (art. 8.2.c de la Ley 42/1988). No se contempla la seleccin de sexo
con fines distintos.

5. Otro argumento en favor de posibles transferencias gnicas en lnea

germinal a humanos

Algunos autores delimitan un campo especial de reflexiones sobre la

manipulacin en lnea germinal, relacionado con la "ventaja gentica".
En veterinaria, se est desarrollando una intensa investigacin sobre la
resistencia a enfermedades. Debera ser tenida en cuenta tambin la
resistencia humana a la enfermedad? Caskey habla, por ejemplo, de la
prdida generalizada en la especie humana de uricasa (sus
consecuencias son la enfermedad de la gota), de sntesis de vitamina C
(su carencia provoca escorbuto) y el gen de resistencia a la gripe
(incrementa la sensibilidad a la gripe). Es perfectamente imaginable
que en el futuro, de alguna manera, la manipulacin gentica de un
individuo en la lnea germinal pueda ser emprendida para introducirle o
reintroducirle el gen de resistencia a la enfermedad. De ser as, las
consideraciones sobre el riesgo-beneficio tendrn que cambiar
significativamente respecto a las que figuran en las orientaciones
institucionales vigentes (las del Institutional Review Board, por
ejemplo): el principal problema tico ser el riesgo de daos actuales
en comparacin con el beneficio para la salud de las futuras
generaciones.

El papel de las mutaciones somticas en las enfermedades adquiridas ya

es evidente en las neoplasias celulares T y B. Puesto que los mtodos
basados en el ADN son (eventualmente) precisos y de alta sensibilidad,
muchos confan en que esta tecnologa experimentar una notable
expansin en el diagnstico precoz de la malignidad. Lo que no est tan
claro es si un nmero sustancial de desrdenes tienen un gen para
susceptibilidad que pueda ser detectado.

Alteraciones como el xeroderma pigmentoso, el sndrome de Bloom y la

anemia de Fanconi, en las que la reparacin de los defectos en el ADN
termina en un incremento de la susceptibilidad a mutaciones en
muchos loci, entraran en una categora aparte. Los modelos del
retinoblastoma, neurofibromatosis, enfermedad de von Hippel-Lindau,
enfermedad de Gardner y otras proporcionan una primera aproximacin
a la susceptibilidad para la malignidad. En estos casos, un alelo
heterocigoto hace a un individuo susceptible de desarrollar un tumor
maligno. Los entusiastas del PGH confan en una rpida mejora de la
capacidad para identificar genticamente susceptibilidades en los
individuos, incluyendo la incorporacin de estas tcnicas al repertorio
de procedimientos comunes para vigilancia y prevencin de
enfermedades genticas. Presumiblemente, la "vigilancia gentica"
basada en el anlisis del ADN aadir precisin y exactitud predictiva al
diagnstico prenatal; con el tiempo, puede que tambin eficacia
teraputica, aunque para desarrollar este segundo aspecto se necesiten
nuevos enfoques en la investigacin.

6. Consideraciones a la luz de los ltimos avances

Los ltimos informes sobre resultados de diferentes ensayos de TG y el

uso de cidos nucleicos antisentido ilustran a la perfeccin las
implicaciones ticas de una investigacin biomdica enfocada desde un
enfoque metodolgico reduccionista que, unida a una falta
[deliberada?] de rigor semntico entre los especialistas, ha llevado a
ensayar en humanos tcnicas de TG de escaso fundamento cientfico,
muy necesitadas de estudio bsico preliminar.

Quizs la inclusin de la expresin "terapia gnica" en el ttulo sea la

nica manera de colar ciertos protocolos clnicos a los comits
encargados de su revisin o de presentarlos como Apolticamente
rentables; y es probable que los ensayos se hayan realizado con
pacientes terminales. Pero desde un punto de vista tico considero
inadmisible que sea a posteriori cuando el equipo de expertos revele su
total desconocimiento de los procesos in vitro relacionados con la
tcnica. El hecho de que las primeras lecciones para continuar la
investigacin en animales se hayan aprendido con humanos y animales
se comenta por s solo. Uno se pregunta qu resultados "prometedores"
se ofrecieron al comit encargado de aprobar los protocolos clnicos
para decantarlo por su aceptacin, cuando los propios expertos
reconocen, una vez terminados los primeros ensayos en humanos, que
"nunca supieron cmo funcionaba in vitro". Sin embargo, esto no
debera restar valor a una investigacin que ha proporcionado
conocimientos de gran valor sobre la biologa humana y el tipo de
material gentico a transferir, aunque por ahora fallen las estrategias
para introducirlo de manera eficaz.

6.1 Sobre la eficacia de las TG realizadas hasta ahora:

Los artculos ms recientes que evalan la eficacia de las primeras TG y

sus efectos a largo plazo inducen a pensar que, hasta ahora, ms que
"terapia gnica" se ha estado practicando "ingeniera gentica humana"
con intencin supuestamente teraputica, escasamente avalada por los
resultados. En este sentido, el riguroso informe sobre terapias gnicas
encargado por Harold Varmus, director de los NIH (EE.UU.) a un
comit ad hoc de 14 expertos, daba un diagnstico acertado de la
situacin: "los investigadores saltan inmediatamente, en algunos casos,
del descubrimiento del "gen de una enfermedad a intentar una terapia
gnica, sin utilizar previamente el hallazgo como base de trabajo para
tratamientos ms convencionales". No se duda que esta investigacin
ser de enorme utilidad algn da. Pero "debe dedicarse ms esfuerzo a
intentar contestar preguntas bsicas en el laboratorio y menos a probar
terapias en pacientes". El informe reconoce que "a rush of prematurely
optimistic publicity risks eroding public confidence and damaging the
field" y aconseja a los investigadores mostrarse "more restrained" en la
comunicacin de sus hallazgos y a la hora de suscitar expectativas
relacionadas con la TG. Segn Stuart Orkin (Harvard Medical
School), "there was a uniform feeling that there has been an overselling
of current research in the field, wich has led to an inaccurate
perception of success. Despite anecdotal claims to the contrary, clinical
efficacy has not been definitively demonstrated in any gene therapy
protoco"l. Por eso no entiendo cmo personas supuestamente
conocedoras de la cuestin juegan a despertar expectativas
injustificadas que pueden contribuir a motivar decisiones reproductivas
irresponsables en posibles destinatarios: "De una forma un poco
arbitraria podemos dividir las aplicaciones mdicas ms inmediatas del
conocimiento del genoma en diagnsticos y teraputicas. Estas ltimas
se pueden subdividir en directas (terapia gnica propiamente dicha) y
en indirectas (farmacologa)".

6.2 En relacin con el empleo de sondas de cidos nucleicos antisentido:

Esta tcnica fue presentada en sus comienzos como "terapia

antisentido", por ms que se hallaba en fase de estricta
experimentacin inicial. Conforme a las previsiones, tendra un gran
impacto en el tratamiento de las principales enfermedades humanas
(cncer, enfermedades cardiovasculares, inmunes -alergias- y
autoinmunes, etc.), reforzado por el conocimiento detallado de la
secuencia de todos los genes humanos que aportara el PGH. Despus de
haberse aplicado a humanos en varios protocolos recientes, las ltimas
conclusiones sugieren, una vez ms, que donde se dijo "terapia" slo
hubo "ingeniera", con un desconocimiento alarmante de aspectos
bsicos del ensayo que debieran haberse estudiado in vitro ms
exhaustivamente. Me remito, de nuevo, a las ltimas impresiones de
varios expertos directamente implicados en la investigacin: "lo mejor
que se puede decir es que "los compuestos antisentido no funcionan tal
y como los investigadores esperaban"; (...)"estamos diseando
oligonucletidos que no interactan con nada ms all de su objetivo";
(...) "muchos temen que buena parte de los efectos positivos dados a
conocer se deban no precisamente a mecanismos antisentido sino a
otros mecanismos adicionales implicados". Y, otra vez a posteriori, los
lamentos: "Es demasiado pronto para aplicar estas tcnicas a humanos,
cuando ni siquiera sabemos cmo funcionan en el tubo de ensayo. De
cara al futuro inmediato no se proyectan "terapias", sino "ensayos de
ingeniera gentica" destinados a aplicar las lecciones aprendidas con
humanos y animales". Y la correcin del enfoque inicial apunta hacia
una aproximacin no exclusivamente genmica: no basta dirigir los
oligonucletidos al gen diana, sino que ser preciso disear molculas
antisentido capaces de interactuar con las protenas asociadas al gen,
implicando ms mecanismos y niveles que el gentico.

7. Dos ltimos ejemplos ilustrativos

El primer ensayo de transferencia gnica a humanos de Anderson,

Blaese y Rosenberg en 1990, usando clulas de retrovirus transformadas
para potenciar la respuesta inmunitaria contra melanomas malignos
pretenda verificar que la infeccin retroviral no afectaba las
propiedades funcionales de las clulas en las cuales el gen transferido
se usaba como marcador. A pesar de ser considerado por todos el primer
ensayo de terapia gnica, no fue un caso de tratamiento teraputico,
sino simplemente un experimento de cara a la investigacin bsica. La
expresin "TG" habra que reservarla para tratamientos dirigidos a
corregir alteraciones fenotpicas. Dos ejemplos de TG gnica de
sustitucin fueron los ensayos para la ADA y la fibrosis qustica.

Un aspecto importante de la discusin en el futuro ser determinar qu

es una enfermedad y un riesgo en el contexto de una medicina
genmica preventiva. Hay un cierto consenso entre los expertos en no
considerar aconsejable ni admisible la TG en lnea germinal ni la TG
perfectiva, orientada a mejorar ciertas caractersticas o rasgos de un
individuo. Pero algunos casos se prestan a debate.

Se ha aprobado un protocolo de ensayo de multirresistencia a frmacos

importante para pacientes con un cncer avanzado. Mediante tcnicas
de transferencia gnica se capacita a las clulas de la mdula de un
paciente para que resistan los devastadores efectos secundarios de la
quimioterapia. Este incremento de la resistencia natural de las clulas
hematopoyticas podra convertirse en una terapia fundamental contra
el cncer. En este caso, no se trata de eliminar o sustituir un gen por
otro que sintetice correctamente un producto necesario, puesto que los
niveles de expresin MDR en las clulas de tejido hematopoitico de los
pacientes bajo tratamiento es normal. Lo que hacemos es introducir
molculas informacionales que codifican la produccin de sustancias
supuestamente tiles para destruir las causas de las clulas
cancergenes, las condiciones bajo las que se desarrollan y, finalmente,
los efectos de la enfermedad. De hecho, la insercin del gen MDR
supone incrementar un rasgo natural de nuestras clulas, y esto es lo
que significa enhancement en el contexto de la transferencia gnica
humana. Un gen MDR adicional mejora la resistencia de nuestras clulas
contra los frmacos anti-cncer, p.ej., y le proporciona al individuo una
propiedad que puede durar bastante ms de lo que requiere el propio
tratamiento, puesto que ADN exgeno introducido por un retrovirus en
el genoma de la clula puede persistir en las clulas infectadas.
Estamos, pues, ms bien ante un caso de ingeniera gentica humana
perfectiva que ante un ensayo de TG. Aunque la mejora no constituye
en s misma el propsito de la transferencia, esto no significa sino
que la mejora mediante transferencia gnica se convierte en mero
medio en el contexto de una patologa. De ah a que la TG se aplique
para la mejora perfectiva como un fin, sin ms referencia a patologas
concretas, no hay ms que un paso.
III El caso de la clonacin
NOTA: esta seccin est escrita en forma de notas de orador. En breve
aparecer un artculo elaborado.

La Tcnica (clulas mamarias totalmente diferenciadas

(reprogramacin)

No deberamos hablar de "fotocopias genticas":

El vulo contiene ADN mitocondrial propio

Difcilmente las instrucciones genticas de Dolly se vern sometidas a la misma

presin de idnticos estmulos en el medio intrauterino.

Interacciones complejas entre genes y entorno

Peculiar insercin en el medio externo (ambiente, interacciones sociales...)

El ADN es un programa de instrucciones abiertas y muy flexibles.

La utilidad de Dolly como animal no es aplicable, normalmente, al ser

humano:

Sera grande en combinacin con tcnicas de IG y transferencia de genes tiles para

producir medicamentos u otras sustancias.

Se obtiene un individuo molde / rentable y se copia cuanto se quiera.

Mantener intactos genotipos de valor probado.

Recuperar especies en vas de extincin

Riesgos:

Prdida de diversidad gentica

Tendencia a la uniformidad en ganado

Aplicable a humanos? Muy probablemente, antes o despus. Cundo?

 En combinacin con un eventual TG imaginable

En hipotticas circunstancias personales / prdida de seres queridos

Observaciones:

Un individuo clnico tendra la misma dignidad que los dems humanos

Ni su individualidad ni sus derechos como persona ser varan reducidos

Nunca sera una "copia comportamental" de nadie (ni Hitler ni Einstein)

Nuestra identidad depende mucho ms del nivel neuronal que del gentico.

Identidad gentica no es sinnimo de identidad biolgica ni identidad personal

Reflexin crtica:

Quin decide qu es "genotipo probado" para sugerir que merece ser copiado?

Quin es nadie para condicionar caracterstas biolgicas de terceros?

Quin prefiere saberse fruto de un diseo humano y no del azar evolutivo?

Podran condicionar estas reflexiones la personalidad de un individuo?

Hay ms informacin y comentarios sobre la clonacin en este sitio web

(artculos de Enrique Iez):

Tras las huellas de Dolly

Clonacin: aspectos tcnicos
Clonacin: aspectos ticos
Para informacin cientfica sobre la terapia gnica, vase el artculo de Juan
Jos Oliva

1997 Miguel Moreno Muoz