Unidad2 Mediosdecultivo

Cultivo de tejidos vegetales I
Unidad 2. Medios de cultivo
Sexto semestre
Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 0
ndice
Unidad 2. Medio de cultivos ...................................................................................... 2

Presentacin de la unidad ........................................................................................ 2
Propsitos de la unidad ............................................................................................ 2
Competencia especfica............................................................................................ 3
2.1. Resea histrica del cuitivo de tejidos vegetales.............3
2.1.1. Los primeros aos.......4
2.1. 2. La era de desarrollos tcnicos................................................................. 5
2.1.3. El pasado reciente y la era presente........8
2.2. Medio de cultivo........10
2.2.1. Ingredientes....13
2.2.2. Preparacin.19
2.3. Reguladores de crecimiento vegetal.....25
2.3.1. Auxinas26
2.3.2. Citocininas..28
2.3.3. Giberelinas..30
2.3.4. cido abscsico..31
2.3.5. Etileno..32
Actividades ............................................................................................................. 32
Autorreflexiones ...................................................................................................... 32
Cierre de la unidad ................................................................................................. 33
Para saber ms ...................................................................................................... 33
Fuentes de consulta.33
Anexo ..................................................................................................................... 35

Presentacin de la unidad
Despus de una inmersin a conceptos variados, al

descubrimiento de la anatoma de la planta y a los
componentes de una clula, en esta unidad se busca
descubrir cmo el Cultivo de tejidos vegetales fue
construyndose hasta el da de hoy.
El primer cultivo de tejidos de plantas exitoso, fue

desarrollado por Gottlieb Haberlandt, en el inicio del siglo
XX; a partir de ese momento, el desarrollo del
conocimiento en este campo implic entre muchas otras
Figura 1. Gottlieb
cosas la elaboracin de medios de cultivo y el
Haberlandt en 1903.
(Laimer M. y Rcker W.,
descubrimiento de reguladores de crecimiento, puntos
2003). que tambin se abordarn en esta unidad.
Propsitos de la unidad
Analizar el contexto histrico del cultivo de

tejidos vegetales.
Comparar los diferentes medios de cultivo
empleados en cultivo in vitro.
Analizar las necesidades de reguladores de
crecimiento en el establecimiento de un cultivo in
vitro en relacin a su destino final.

Competencia especfica
Clasificar los diferentes tipos de medios de cultivos y

reguladores de crecimiento, para su empleo en el cultivo
de tejidos vegetales con el fin de establecer un cultivo in
vitro en laboratorio, considerando el destino final del
cultivo.
2.1. Resea histrica del cultivo de tejidos vegetales
El cultivo de clulas y tejidos, tambin referido como cultivo in vitro, axnico o estril, es
una herramienta importante, ya sea en estudios bsicos o en aplicaciones comerciales.
Quizs el paso ms temprano hacia el cultivo de tejidos de plantas fue hecho por Henri-
Louis Duhumel du Monceau en 1756, quien, durante sus estudios pioneros sobre la
cicatrizacin de plantas, observ la formacin de callos (Gautheret, 1985).
Estudios extensivos por medio del microscopio, condujeron al desarrollo independiente y

casi simultneo a la teora celular de Schleiden y Schwann (1839). Esta teora sostiene
que la clula es la unidad de estructura y funcin en un organismo, y por lo tanto es capaz
de autonoma. Esta idea se puso a prueba por varios investigadores, pero el trabajo de
Vchting (1878) sobre la formacin de callos y sobre los lmites a la divisibilidad de
segmentos de plantas fue quizs el ms importante. Mostr que la parte superior de un
segmento de tallo, siempre produce yemas o brotes y la parte inferior, callos o races,
independientemente del tamao, hasta alcanzar un segmento muy delgado. Tambin
demostr el desarrollo polar y reconoci que era una funcin de las clulas y su ubicacin
con relacin a los extremos cortados.
Las bases tericas para el cultivo de tejidos de plantas fueron propuestas por Gottlieb
Haberlandt en la Academia Alemana de Ciencias en 1902 sobre sus experimentos
relativos al cultivo de clulas individuales. l opin lo siguiente: [a] mi conocimiento, no
se han hecho intentos organizados de manera sistemtica al cultivo de clulas vegetativas
aisladas de plantas superiores. Sin embargo, los resultados de tales experimentos de
cultivos deben dar una idea interesante para las propiedades y potencialidades que posee
la clula como un organismo elemental (Haberlandt, 1902). l experiment sin xito, con
clulas aisladas de hojas y otras clulas funcionalmente diferenciadas, aun as, predijo
que se podra cultivar con xito embriones artificiales a partir de clulas vegetativas. As

estableci claramente el concepto de totipotencia e indic adems que la tcnica de

cultivos de clulas vegetales aisladas en solucin nutritiva permite la investigacin de los
problemas importantes a partir de un nuevo enfoque experimental. Sobre la base de
1902 y su experimentacin pionera antes y despus, Haberlandt se reconoce
justificadamente como el padre del cultivo de tejidos de plantas. Mayores detalles sobre
los primeros eventos pioneros en el cultivo de tejidos vegetales se pueden observar con
los trabajos de White (1963), Bhojwani y Razdan (1983) y Gautheret (1985).
2.1.1. Los primeros aos
Usando un enfoque diferente, Kotte (1922) (un estudiante de Haberlandt y Robins), logr
cultivar pices de races aisladas. Este enfoque del uso de explantes con clulas
meristemticas condujo al cultivo exitoso e indefinido de pices de races de tomate por
White (1934). Estudios posteriores permitieron para el cultivo de races un medio definido
completo. Tales cultivos de races fueron usados inicialmente para estudios virales y ms
tarde como una herramienta importante para los estudios fisiolgicos (Street, 1969). El
xito tambin se logr con el cultivo de yemas por Loo (1945) y Ball (1946).
El cultivo de embriones tuvo tambin su inicio a principios del siglo XX, cuando Hanning
en 1904, cultiv satisfactoriamente embriones de crucferas y Brown en 1906 embriones
de cebada. Esto fue seguido por el exitoso rescate de embriones a partir de semillas no
viables de una cruza entre Linum perenne X L. austriacum (Laibach, 1929). Tukey (1934)
fue capaz de permitir el desarrollo de un embrin completo de algunas especies de
maduracin temprana de rboles frutales, proporcionando de este modo una de las
primeras aplicaciones del cultivo in vitro.
Los primeros y verdaderos cultivos de tejidos vegetales se obtuvieron por Gautheret

(1934, 1935) a partir del tejido del cambium de Hacer pseudoplatanus. Tambin tuvo xito
con explantes similares de Ulmus campestre, Robina pseudoacacia y Salix caprea,
usando el medio de la solucin de Knop con agar solidificado, glucosa y clorhidrato de
cistena (cistena-HCl). Posteriormente, la viabilidad de uso del cido indol-actico y el
suplemento de vitaminas del grupo B permitieron que los tejidos pudieran estar en
crecimiento continuo e incluso lograr diferenciar races y brotes, esto fue reconocido en
las demostraciones casi simultaneas de Gautheret y Nobcourt (1939) con tejidos de raz
de zanahorias y de White (1939) con tejido tumoral de un hbrido entre Nicotiana glauca X
N. langsdorffii, el cual no requiri de la auxina. Todos los explantes iniciales utilizados por
estos pioneros incluyeron el tejido meristemtico. Estos resultados sientan las bases para
el aumento dramtico en el uso de los cultivos in vitro en las dcadas posteriores.

2.1.2. La era de desarrollos tcnicos
Las dcadas de 1940, 1950 y 1960 proveyeron de tiempos exitosos para el desarrollo de
nuevas tcnicas y para el mejoramiento de aquellas ya disponibles. La aplicacin del agua
de coco (frecuentemente referidas como leche de coco) por Van Overbeek et al. (1941)
permitieron el cultivo de embriones jvenes y otros tejidos recalcitrantes, incluyendo de
monocotiledneas. De igual forma el establecimiento de cultivos de callos de varias
especies, incluyendo de dicotiledneas leosas y herbceas, de gimnospermas tales
como tejidos de agalla de la corona (tumor en plantas causado por Agrobacterium
tumefasiens). Tambin en este mismo periodo de tiempo, fue reconocido que las clulas
en cultivo experimentan varios cambios, incluyendo prdida de sensibilidad o habituacin
al aplicar auxinas (Gautheret, 1942, 1955), as como la variabilidad de meristemos
formados de callos (Gautheret, 1955; Nobcourt, 1955). Sin embargo, fue durante este
periodo, que la mayora de las tcnicas in vitro empleadas en la actualidad se desarrollan
en gran medida.
Estudios por Skoog y sus asociados mostraron que la adicin de adenina y altos niveles
de fosfato permitieron que tejidos de mdula (pith) no meristemtica fueran cultivados
produciendo brotes y races, pero solo en la presencia de tejido vascular (Skoog y Tsui,
1948). Estudios posteriores usando cidos nuclecos permitieron descubrir la primera
citocinina (cinetina) como el producto de degradacin del DNA de esperma de arenque
(Miller et al., 1955). La disponibilidad de cinetina, increment posteriormente el nmero de
especies que pueden ser cultivadas indefinidamente, pero quizs lo ms importante, es
que permiti reconocer el balance exgeno de auxinas y citocininas en el medio influye el
destino morfogentico de callos de tabaco (Skoog y Miller, 1957). Un alto nivel relativo de
auxina/cinetina, favorecen el enraizamiento, a la inversa, conducen a la formacin de
brotes, y los niveles intermedios a la proliferacin de callos. Este modelo morfognico ha
sido adecuado para operar en numerosas especies. Citocininas nativas fueron
descubiertas subsecuentemente en varios tejidos, incluyendo en el agua de coco
(Letham, 1974). Adems se reportaron independientemente por Reinert, (1958, 1959) y
Steward et al. (1958) la formacin de yemas de brotes unipolares y races, la formacin de
embriones bipolares somticos (zanahoria).
El cultivo de clulas individuales (y pequeos agregados celulares) fue obtenido mediante

agitacin de cultivo de callos de Tagetes erecta y tabaco, colocados subsecuentemente
sobre papel filtro, permaneciendo en l los callos bien establecidos, dando as origen al
llamado cultivo madre (Muir et al. 1954, 1958). Posteriormente, las clulas individuales
pueden ser crecidas en medio lquido, en los cuales los tejidos pueden ser crecidos.
Bergmann (1959) incorpor clulas individuales en una capa de 1 mm de medio slido
donde fueron formadas algunas colonias. Esta tcnica es ampliamente usada para clonar
clulas y en cultivo de protoplastos. El primer cultivo a gran escala de clulas de plantas

fue reportado por Tulecke y Nickell (1959), quin hizo crecer clulas en suspensin de
Ginkgo, Holly (Ilex), Lolium y rosas en simples garrafones de 20 litros.
Vasil y Hildebrandt (1965), utilizando agua de coco como un aditivo al medio fresco
finalmente realizaron el sueo de Haberlandt de producir una planta completa (tabaco) a
partir de una clula individual, demostrando as la totipotencia de las clulas de plantas.
Los primeros medios nutritivos usados para el crecimiento de tejidos de plantas in vitro
fueron basados en la formulacin de nutrientes para plantas completas. Las soluciones de
Knop y la de Uspenski y Uspenskia fueron muy usadas proveyendo al menos 200 mg/l de
las sales totales. Heller (1953), basado en estudios sobre zanahorias y en tejidos de
enredadera de Virginia, increment la concentracin de sales dos veces, y Nitsh y Nitsh
(1956) incrementaron posteriormente la concentracin de sales a 4 g/l, basados en sus
trabajos con la alcachofa de Jerusaln. Sin embargo, estos cambios no proporcionaron el
crecimiento ptimo para tejidos, siendo requeridos frecuentemente complementos, tales
como el extracto de levadura, la protena hidrolizada y el agua de coco. En diferentes
aproximaciones basadas en el estudio de la ceniza de los callos de tabaco, Murashige y
Skoog (1962) desarrollaron un nuevo medio. Las concentraciones de algunas sales fuero
25 veces ms que las de la solucin de Knop. En particular el nivel de NO3- y NH4+ fueron
muy altos y el arreglo de micronutrientes se increment. Esta formulacin permiti un
incremento en el nmero de especies de plantas cultivadas, muchas de ellas empleando
solo un medio definido consistiendo de macro y micro nutrientes, una fuente de carbono,
nitrgeno reducido, vitaminas del grupo B y reguladores de crecimiento.
Ball en 1946, produjo con xito plntulas por cultivo de extremos de brotes, pero la
importancia de esta conclusin no fue reconocida sino hasta que Morel (1960), usando
esta aproximacin obtuvo orqudeas libres de virus, realizando una potencial propagacin
clonal. Este potencial fue rpidamente explotado, particularmente con ornamentales. Los
primeros estudios de White (1934) mostraron que el cultivo de los extremos de raz (cofia)
era libre de virus. Posteriormente Limmaset y Cornuet (1949) observaron que la
concentracin de virus en los brotes era muy lentos. Esto fue confirmado cuando plantas
libres de virus de Dhalia se obtuvieron a partir de plantas infectadas al cultivar extremos
de brotes (Morel y Martin, 1952). La eliminacin de virus fue posible ya que el tejido
vascular, en el que el virus se encuentra, no se extiende a los pices de brotes o races.
El mtodo fue posteriormente refinado por Quack (1961) y es ahora usado rutinariamente.
Las tcnicas para el cultivo in vitro de partes florales y semillas fueron desarrolladas
durante este periodo. El primer intento de un cultivo de ovarios fue realizado por LaRue,
C.D. (1942), quien obtuvo un crecimiento limitado de ovarios acompaados por enraizado
de pedicelos en muchas especies. Comparados a estudios con embriones, el xito del
cultivo de vulos fue muy limitado.

En la polinizacin y fertilizacin in vitro fueron pioneros Kanta, K. et al. (1962) usando

Papaver somniferum. La propuesta involucr el cultivo de vulos extirpados y granos de
polen en el mismo medio, emplendose para producir hbridos inter-genricos e inter-
especficos. Aos antes, Tuleke (1953) obtuvo colonias de clulas en cultivo a partir de
granos de polen de Ginkgo, y Yamada et al. (1963) obtuvieron callos haploides a partir de
anteras de Tradescantia reflexa. Sin embargo fue hasta los resultados de Guha y
Maheshwari (1964, 1966) que las plantas aploides pudieron ser obtenidos de cultivos de
anteras de Datura innoxia, abriendo una nueva era a la andrognesis. Plantas haploides
de tabaco fueron obtenidas por Bourgin y Nitsh (1967), conformando de esa manera la
totipotencia de los granos de polen.
Los protoplastos, o clulas de plantas sin sus paredes celulares, fueron aisladas primero
de manera mecnica a partir de tejidos plasmolizados hace ms de 100 aos por Klercker
en 1892, y la primera fusin fue lograda por Kster en 1909. Sin embargo, esta tecnologa
permaneci sin explotar hasta el uso de celulasa fungal por Cocking (1960),
acomodndose a esta nueva era. En la dcada de 1970, la disponibilidad comercial de
enzimas degradadoras de pared celular, permitieron su amplio uso y el desarrollo de la
tecnologa de protoplastos. La primera demostracin de totipotencia de protoplastos fue
realizada por Takebe et al. (1971), quien obtuvo plantas de tabaco a partir de protoplastos
mesoflicos. Esto fue seguido por la generacin de la primer planta hibrida inter-especfica
(Nicotiana glauca X Nicotiana langsdorffii) realizada por Carlson et al. (1972).
Braun (1941) mostr que en el girasol Agrobacterium tumefaciens puede inducir tumores,
no solo en sitios inoculados pero tambin a puntos distantes. Estos tumores secundarios
se encontraron libres de la bacteria y estas clulas pueden ser cultivadas sin auxinas
(Braun y White, 1943). Otros experimentos mostraron que tejidos de agalla de la corona,
libres de bacterias, contenan un principio activo inductor de tumores (PIT), el cual fue
probablemente una macromolcula (Braum 1950). La naturaleza del PIT, fue elaborada
en la dcada de 1970 (Zaenen et al. 1974), pero el trabajo de Braum sirvi de base para
las transformaciones basada en Agrobacterium. Hay que sealar que el hallazgo de
Ledoux (1965) en donde clulas de plantas podan tomar e integrar DNA, permaneci en
polmica por un tiempo mayor a esa dcada.

2.1.3. El pasado reciente y la era presente
Basndonos en la disponibilidad de las diferentes tcnicas in vitro discutidas en los

prrafos anteriores, no es de sorprender, que lo que se inici en la dcada de 1960,
origin un incremento en las aplicaciones a los varios problemas en biologa bsica,
agricultura, horticultura y forestera a travs de las dcadas de 1970 y 1980. Estas
aplicaciones pueden ser divididas convenientemente en cinco grandes reas: a)
comportamiento celular, b) modificacin y mejoramiento de plantas, c) plantas libres de
virus y almacenamiento de germoplasma, d) propagacin clonal y e) formacin de
productos.
Durante la dcada de 1990 la expansin contina en las aplicaciones de las tecnologas in

vitro se observan en un incremento en el nmero de especies de plantas. Las tcnicas del
cultivo de tejidos de plantas han sido empleadas en todo tipo de plantas, incluyendo
cereales y pastos (Vasil y Vasil, 1994), legumbres (Davey et al. 1994), cultivos de
vegetales (Reynolds, 1994), papa (Jones, 1994) y otras races y cultivos de tubrculos
(Krikorian, 1994), semillas de aceite (Palmer y Keller, 1994), frutas de zonas templadas
(Zimmerman y Swartz, 1994) y tropicales (Grosser, 1994), cultivo de plantaciones frutales
(Krikorian, 1994), rboles forestales (Harry y Thorpe, 1994), y por supuesto plantas
ornamentales (Debergh, 1994). Como se ha podido ver hasta ahora, la aplicacin de la
tecnologa de clulas in vitro va ms all de la micropropagacin y abarca a todos los
mtodos in vitro que son relevantes o posibles para la especie y el problema(s) del que se
trate. Sin embargo, slo se ha logrado un xito limitado en la explotacin de la variacin
somaclonal o en la regeneracin de plntulas tiles a partir de clulas mutantes; de igual
manera, la promesa inicial de la tecnologa de protoplastos permanece en gran medida
sin cumplirse. Se est avanzando en la extensin de la tecnologa de criopreservacin
para el almacenamiento de germoplasma (Kartha y Engelmann, 1994). Progresos tambin
se estn realizando en la tecnologa de semillas artificiales (Redenbaugh, 1993).
El cultivo de clulas ha permanecido como una herramienta importante en el estudio de

biologa de plantas, por ejemplo, sobre cambios cromosmicos en cultivos celulares
(Kaeppler y Phlilips, 1993) y del ciclo celular (Komamine et al. 1993; Trehin et al. 1998).
Los cultivos celulares han permanecido como herramientas extremadamente importantes
en el estudio del metabolismo primario.; por ejemplo, el uso de clulas en suspensin
para desarrollar sistemas de transcripcin in vitro (Suguira, 1997) o la regulacin del
metabolismo de carbohidratos en transgnicos (Stitt y Sonnewald, 1995). El desarrollo de
tcnicas de cultivo de clulas de plantas medicinales, ha permitido la identificacin de ms
de 80 enzimas de la biosntesis de alcaloides (Kutchan, 1998). Informacin similar surge
de la utilizacin de cultivos celulares para estudios moleculares y bioqumicos en otras
reas del metabolismo secundario, generando as actividad de investigacin sobre
ingeniera metablica sobre la produccin de metabolitos secundarios (Verpoorte et al.
1998).

Los cultivos de clulas permanecen como herramienta importante en estudios de

morfognesis. Estudios moleculares, fisiolgicos y bioqumicos han permitido mejores
entendimientos sobre la citodiferenciacin (Fukuda, 1997), organognesis (Thorpe, 1993;
Thompson & Thorpe, 1997), y embriognesis somtica (Nomura & Komamine, 1995;
Dudits et al., 1995).
Avances en la biologa molecular permitieron en ingeniera gentica, inserciones precisas

de genes a partir de diversos sistemas biolgicos.
La ola inicial de investigacin en

biotecnologa de plantas ha sido conducida
principalmente por industrias de semillas y
agroqumicos y ha sido concentrada en
rasgos agronmicos de relevancia directa
a estas industrias, notamente al control de
insectos, malezas y enfermedades de
plantas (Fraley, 1992). Al presente, ms de
100 especies de plantas han sido
manejadas genticamente incluyendo casi todos los principales cultivos de
monocotiledneas y de un nmero en incremento de algunas plantas leosas. La
investigacin comn est dirigida a los sistemas de transferencia de genes para todos los
cultivos de importancia econmica. La siguiente ola en biotecnologa agrcola est
relacionada con los progresos con aplicaciones biotecnolgicas de inters al
procesamiento de alimentos, especialmente de industrias qumicas y farmacuticas.
El nfasis comn e importancia de la biotecnologa de plantas puede ser extrada de las
conclusiones de Congresos Internacionales de Cultivo de clulas y tejidos de plantas, por
ejemplo, el ocurrido en Israel en junio de 1998 Biotecnologa de plantas y biologa in vitro
en el siglo XXI o el ocurrido en Estados Unidos en junio de 2002 con el tema
Biotecnologa de plantas y ms all.
Ambos congresos fueron desarrollados a travs de un programa cientfico que se centr

en los acontecimientos ms importantes, tanto en desarrollos bsicos como en los
aplicados, en las reas de cultivo de tejidos vegetales y de biologa molecular y su
impacto en la mejora de las plantas y la biotecnologa. En ellos se muestra claramente al
cultivo de tejidos de hoy y hacia dnde se dirige (esto es, el cultivo de tejidos vegetales
como un socio igual con la biologa molecular), como una herramienta de la biologa
bsica de las plantas y en diversas reas de aplicacin. De hecho los avances en la
biotecnologa aplicada de plantas estn totalmente en juego y es, sin duda el estmulo al
progreso cientfico fundamental, que sigue siendo la mejor esperanza para lograr una
agricultura sostenible y estable medioambientalmente. Los avances realizados en los

ltimos 100 aos con la tecnologa in vitro ha ido mucho ms all de lo que Haberlandt y
los otros pioneros hubiera imaginado.
2.2. Medio de cultivo (Beyl CA, 2005)
La seleccin del medio de cultivo de tejidos vegetales, depende de la especie a ser

cultivada. Algunas especies son sensibles a la salinidad o con diferentes requerimientos
de reguladores de crecimiento de plantas (RCP). La edad de la planta tambin tiene
efecto. Por ejemplo, tejidos juveniles habitualmente regeneran races ms rpidamente
que un tejido adulto. Es importante tambin el tipo rganos a cultivar; por ejemplo, las
races requieren tiamina. Cada efecto de cultivo tiene sus requisitos, tales como auxinas
para la induccin de races adventicias, y la variacin de la relacin citocinina: auxina para
la iniciacin y desarrollo de brotes adventicios.
El desarrollo de las formulaciones de los medios de cultivo fue el resultado de pruebas

sistemticas y de experimentacin. La tabla 1 provee una comparacin de la composicin
de los ms comnmente empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus
componentes en miligramos por litro y unidades molares (para lectura de frmulas
qumicas, dirjase al anexo de esta unidad). El medio Murashige y Skoog (MS) (1962) es
el medio de cultivo de tejidos base ms adecuado y ms comnmente empleado para
regeneracin de plantas a partir de tejidos y callos. Este medio fue desarrollado para
desarrollar plantas de tabaco y est basado principalmente sobre los anlisis de minerales
obtenidos de tejidos de la planta de tabaco. Este medio es alto en sales, debido al
contenido de sales de K y N. El medio Linsmaier y Skoog (1965) es bsicamente el medio
de Murashige y Skoog (MS) (1962) con respecto a sus porciones inorgnicas, en donde
solo el inositol y la tiamina HCl (tiamina clorhidrato) quedan entre los componentes
orgnicos. Para contrarrestar la sensibilidad a las sales de algunas especies leosas,
Lloyd y McCow (1980) desarrollando el medio para plantas leosas (WPM).
El medio de Gamborg (B5) (Gamborg et al., 1968) fue diseado para el cultivo de callos
de soya, y contiene menos cantidades de nitratos y particularmente sales de amonio que
el medio MS. Sin embargo el medio B5 fue originalmente desarrollado con el propsito de
obtener callos o par el uso en cultivos en suspensin, es adecuado para trabajar como
medio basal en la regeneracin de plantas completas. Sheck y Hildebrandt (1972)
desarrollaron el medio SH para el cultivo de callos de mono y dicotiledneas. El medio de
White (White, 1963), fue diseado para el cultivo de races de tomate, este tiene una baja
concentracin de sales en relacin al medio MS. El medio de Nitsch (Nitsch y Nitsch,
1969) fue desarrollado para el cultivo de anteras, contiene una concentracin intermedia
de sales entre el medio MS y el de White.

Muchas compaas venden mezclas preparadas y empaquetadas de las recetas ms

conocidas. Estas son fciles de hacer ya que solamente es necesario disolver el
contenido del paquete, mezclar en un volumen especfico de agua. Estas pueden ser
adquiridas como sales, vitaminas, o como mezcla entera con o sin reguladores de
crecimiento, agar y sacarosa. Esto es muy conveniente, ya que es menos propenso a
incluir errores individuales, y se evitan tener almacenadas soluciones innecesarias. Sin
embargo, estos son ms caros que si se elaboran los medios por s mismos.

Tabla 1.Composicin de cinco medios de cultivo de tejidos ms comunes en concentraciones de miligramos por litro y concentraciones
molares (Beyl CA, 2005)
Compuesto MS Gamborg B5 WP Nitsch and Nitsch Schenk and Hildebrandt White
Macronutrientes en mg/l (mM)
NH4NO3 1650 (20.6) - 400 (5.0) - - -
NH4H2PO4 - - - - 300 (2.6) -
(NH4)2SO4 - 134 (1.0) - - - -
CaCl22H2O 332.2 (2.3) 150 (1.0) 96 (0.7) 166 (1.1) 151 (1.0) -
Ca(NO3)24H2O - - 556 (2.4) - - 288 (1.2)
MgSO47H2O 370 (1.5) 250 (1.0) 370 (1.5) 185 (0.75) 400 (1.6) 737 (3.0)
KCl - - - - - 65 (0.9)
KNO3 1900 (18.8) 2500 (24.8) - 950 (9.4) 2500 (24.8) 80 (0.8)
K2SO4 - - 990 - - -
KH2PO4 170 (1.3) - 170 (1.3) 68 (0.5) - -
NaH2PO4 - 130.5 (0.9) - - - 16.5 (0.12)
Na2SO4 - - - - - 200 (1.4)
Micronutrientes en mg/l (mM)
H3BO3 6.2 (100) 3.0 (49) 6.2 (100) 10 (162) 5 (80) 1.5 (25)
CoCl26H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) - - 0.1 (0.4) -
CuSO45H2O 0.025 (0.1) 0.025 (0.1) 0.25 (1) 0.025 (0.1) 0.2 (0.08) 0.01 (0.04)
Na2EDTA 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 37.3 (100) 20.1 (54) -
Fe2(SO4)3 - - - - - 2.5 (6.2)
FeSO47H2O 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 27.8 (100) 15.4 (54) -
MnSO4H2O 16.9 (100) 10.0 (59) 22.3 (132) 18.9 (112) 10.0 (59) 5.04 (30)
KI 0.83 (5) 0.75 (5) - - 0.1 (0.4) -
MoO3 - - - - - 0.001 (0.001)
Na2MoO42H2O 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.25 (1) 0.1 (0.4) -
ZnSO47H2O 8.6 (30) 2.0 (7.0) 8.6 (30) 10 (35) 1 (3) 2.67 (9)
Orgnicos en mg/l (M)
Mio-inositol 100 (550) 100 (550) 100 (550) 100 (550) 1000 (5500) -
Glicina 2.0 (26.6) - 2.0 (26.6) 2.0 (26.6) - 3.0 (40)
c. nicotnico 0.5 (4.1) 1.0 (8.2) 0.5 (4.1) 5.0 (40.6) 5.0 (40.6) 0.5 (4.1)
Pirodoxina HCl 0.5 (2.4) 0.1 (0.45) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.5 (2.4) 0.1 (0.45)
Tiamina HCl 0.1 (0.3) 10.0 (30) 1.0 (3.0) 0.5 (1.5) 5.0 (14.8) 0.1 (0.3)
Biotina - - - 0.2 (0.05) - -

2.2.1. Ingredientes (Beyl CA, 2005)
El crecimiento y desarrollo de explantes in vitro es el producto de la gentica, del medio

ambiente que lo rodea y componentes del medio de cultivo de tejidos.
El medio de cultivo de tejidos consiste de 95% de agua, macro y micro-nutrientes, RCP,

vitaminas, azcar (ya que las plantas no son fotosintticamente competentes), y en
algunas ocasiones varios materiales orgnicos simples o complejos. Considerndolo todo,
cerca de veinte diferentes componentes son generalmente necesarios.
Agua
Agua de alta calidad es un ingrediente requerido del medio de cultivo de tejidos de

plantas. De manera ordinaria, el agua de la llave contiene cationes, aniones, partculas de
varios tipos, microorganismos, y gases que la hacen no til para su uso en el medio de
cultivo de tejidos. Existen varios mtodos para tratar el agua, incluyendo filtracin a travs
de carbn activado para remover compuestos orgnicos y cloro, des-ionizar o
desmineralizar haciendo pasar agua a travs de resinas de intercambio inico para
remover impurezas ionizadas disueltas, y la destilacin, la cual elimina muchos iones e
impurezas particuladas, qumicos voltiles y no voltiles, materia orgnica y
microoganismos. El proceso de smosis inversa, remueve el 99% de impurezas ionizadas
disueltas, este proceso hace uso de membranas semipermeables a travs del cual una
porcin de agua es forzada a atravesar bajo presin; el resto del agua conteniendo
impurezas es eliminado. El mtodo universalmente ms fiable para la purificacin de agua
para el cultivo de tejidos es un tratamiento de desionizacin seguida por una o dos veces
la destilacin en vidrio, aunque la simple desionizacin algunas veces es usada
satisfactoriamente. En algunos casos, los nuevos equipos de purificacin por smosis
inversa (Milli-RO, Millipore, RO pure, Barnstead, Bion, Pierce), combinado
con cartuchos de intercambio inico, adsorcin, y equipos por filtrado con membrana, han
reemplazado la tradicional destilacin de agua en vidrio.
Elementos inorgnicos minerales
As como el crecimiento de plantas in vivo requiere muchos elementos diferentes, ya sea

del suelo o de fertilizantes el crecimiento de tejidos de plantas in vitro requiere una
combinacin de macro y micronutrientes (ver Tabla 2). La seleccin de las micro o macro
sales y sus concentraciones es dependiente de la especie. El medio MS es muy popular
ya que muchas plantas reaccionan a l favorablemente; si no es as, ser debido al alto
contenido de sales.

Los macronutrientes son requeridos en cantidades milimolares (mM) en la mayora de los

medios basales de plantas. El nitrgeno (N) es generalmente suministrado en forma de
iones de amonio (NH4+) y nitrato (NO3-); sin embargo es usado tambin en algunas
ocasiones en forma de fuentes orgnicas complejas, tales como la urea, aminocidos
tales como la glutamina, o casena hidrolizada, la cual es una mezcla compleja de
aminocidos y amonio. Aun as muchas plantas prefieren NO3- a NH4+, y pueden
diferenciarse en el balance correcto de los dos iones para un ptimo crecimiento y
desarrollo in vitro para las especies seleccionadas.
Tabla 2. Soluciones (100X) de macro y micro nutrientes del medio Murashige y

Skoog (MS) (Beyl CA, 2005)
Stock (100X) Componente Cantidad

Nitrato NH4NO3 165.0 g
KNO3 190.0 g
Sulfato MgSO47H2O 37.0 g
MnSO4H2O 1.7 g
ZnSO47H2O 0.86 g
CuSO45H2O 250 mga
Haluros CaCl22H2O 44.0 g
KI 83.0 mg
CoCl26H2O 250 mga
PBMo KH2PO4 17.0 g
H3BO3 620.0 mg
Na2MoO4 25.0 mg
NaFeEDTAc FeSO47H2O 2.78 g
NaEDTA 3.74 g
Para notas a, b y c, leer el texto.
Adems, el suministro de nitrgeno, potasio, magnesio, calcio, fsforo y azufre en el

medio de cultivo como diferentes compuestos, referenciados como macro-sales. MgSO4
provee de ya sea magnesio y azufre; NH4H2PO4, KH2PO4 o NaH2PO4 proveen de fsforo;
CaCl22H2O o Ca(NO3)24H2O provee de calcio; y KCl, KNO3 o KH2PO4 provee de potasio.
El cloro es provisto por el KCl y/o CaCl22H2O.
Las micro-sales tpicas incluyen boro (H3BO3), cobalto (CoCl26H2O), hierro (un complejo
de FeSO47H2O y Na2EDTA, o raramente, Fe2[SO4]3), manganeso (MnSO4H2O),
molibdeno (NaMoO3), cobre (CuSO45H2O) y zinc (ZnSO47H2O). Las micro-sales son
necesarias en concentraciones ms bajas (micromolar [M]) que los macro-nutrientes.

Algunos medios contienen muy pocas cantidades de yodo (KI), pero cantidades
suficientes de muchos de los elementos traza, ya que stos pasan inadvertidos como
contaminantes inorgnicos en muchos qumicos de grado reactivo (ver Tabla 2).
Con respecto a la tabla 2, su objetivo es preparar una solucin concentrada o stock, por
lo que el nmero de gramos o miligramos indicados en la columna de cantidad debe ser
adicionado a 1000 ml de agua des-ionizada para preparar 1 litro de la solucin stock
necesaria.
Posteriormente, para cada litro de medio a elaborar, deben ser usados 10 ml de cada
solucin stock.
Para preparar una solucin stock 100X para alguno de los medios listados en la Tabla 1,
multiplicar la cantidad del qumico listado en la tabla por 100 y disolver en un litro de agua
desionizada-destilada.
Con respecto a la nota a para CuSO45H2O, considerar lo siguiente: ya que esta

cantidad (250 mg) es muy pequea para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de
CuSO45H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada, para despus adicionar 10 ml de
esta solucin a la solucin stock de sulfatos.
b para CoCl26H2O, proceder de manera similar, ya que esta cantidad es muy pequea
para pesarla convenientemente, disolver 25 mg de CoCl26H2O en 100 ml de agua
desionizada-destilada, despus adicionar 10 ml de esta solucin a la solucin stock de
haluros.
c Mezclar el FeSO47H2O y el NaEDTA juntos y calentar ligeramente hasta que la

solucin se torne naranja. Almacenar en frascos mbar o protegerla de la luz.
Compuestos orgnicos
El azcar es una muy importante parte de cualquier medio de cultivo, y su suministro es

esencial para el crecimiento in vitro y desarrollo del cultivo. Muchos cultivos de plantas por
varias razones estn inhabilitados para fotosintetizar de manera efectiva, incluyendo una
organizacin celular y desarrollo de tejidos insuficientes, falta de clorofila, intercambio
limitado de gases y CO2 en el recipiente del cultivo de tejidos, y pobres condiciones
medioambientales, tales como baja luz. Una concentracin de 20-60 g/l de sacarosa
(disacrido formado por glucosa y fructosa) es el ms frecuentemente usada fuente de
carbono o energa, ya que este azcar es tambin sintetizada y transportada naturalmente
por la planta. Pueden ser usados otros tipo de mono disacridos o azcares alcohol
tales como glucosa, fructosa, sorbitol y maltosa. La concentracin de azcar elegida

depende del tipo y edad del explante en el cultivo. Por ejemplo, embriones muy jvenes
requieren una alta concentracin relativa de azcar (>3%). Para yemas de mora in vitro, la
fructosa es mejor que la sacarosa, glucosa, maltosa, rafinosa o lactosa (Coffin et al.
1976). Para manzanos, el sorbitol y la sacarosa soportan igual de bien, la iniciacin de
callos y crecimiento, pero el sorbitol es mejor para el durazno despus de cuatro
subcultivos (Oka y Ohyama, 1982). El azcar (sacarosa) comprado ordinariamente en el
mercado es generalmente adecuado, pero que su origen sea solamente de caa de
azcar, ya que el proveniente de maz es principalmente fructosa. La caa de azcar es
purificada y, de acuerdo a los anlisis de los productores de azcar, ste consiste de
99.94% sacarosa, 0.02% de agua y 0.04% de otros materiales (elementos inorgnicos
tales como rafinosa, fructosa y glucosa). Las sales de nutrientes contribuyen
aproximadamente entre el 20-50% del potencial osmtico del medio de cultivo, quedando
responsable la sacarosa del resto. La contribucin de la sacarosa al potencial osmtico se
incrementa cuando este es hidrolizado a glucosa y fructosa durante el autoclaveado. Esto
debe de ser tomado en consideracin cuando se desarrollan procedimientos sensibles
tales como el cultivo y aislacin de protoplastos.
Las vitaminas son sustancias orgnicas que forman parte de enzimas o cofactores para
funciones metablicas esenciales. De las vitaminas, slo la tiamina (vitamina B1 a 0.1-5.0
mg/l) es esencial en un cultivo, ya que est involucrada en el metabolismo de
carbohidratos y en la biosntesis de algunos aminocidos. Es usual adicionar al medio de
cultivo de tejidos tiamina HCl. El cido nicotnico, tambin conocido como niacina,
vitamina B3, o vitamina PP, forma parte de una coenzima respiratoria y es usada en
concentraciones entre 0.1 y 0.5 mg/l. El medio MS contiene tiamina-HCl, as como otras
dos vitaminas, el cido nicotnico y la piridoxina (vitamina B6) en la forma HCl. La
piridoxina es una coenzima importante en muchas reacciones metablicas y es usada en
medios en concentraciones de 0.1-1.0 mg/l. La biotina (vitamina H) es adicionada
comnmente a medios de cultivo de tejidos a 0.01-1.0 mg/l. Otras vitaminas que son
comnmente usadas son el cido flico (vitamina M; 0.1-0.5 mg/l), riboflavina (vitamina B2;
0.1-10 mg/l), cido asprtico (vitamina C; 1-1000 mg/l), cido pantotenico (vitamina B5;
0.5-2.5 mg/l), tocoferol (vitamina E; 1-50 mg/l) y cido p-aminobenzoco (0.5-1.0 mg/l).
El inositol es algunas veces caracterizado como uno de las vitaminas del complejo B, pero
es realmente un azcar alcohol involucrado en la sntesis de fosfolpidos, pectinas de
pared celular y sistemas de membranas en citoplasma celular. Esta es adicionada a
medios de cultivo de tejidos a concentraciones de 0.1-1.0 g/l y ha sido demostrado
necesario para algunas mono, dicotiledneas y gimnospermas.
Adems, otros aminocidos son algunas veces usados en medios de cultivo de tejidos.
Estas incluyen L-glutamina, asparagina, serina y prolina, que son usadas como fuentes de
nitrgeno orgnico reducido, especialmente para inducir y mantener la embriognesis
somtica. La glicina, un aminocido simple, es un aditivo comn, ya que es esencial en la

sntesis de purinas y constituye una parte del anillo de porfirinas en la estructura de la

clorofila.
Compuestos orgnicos complejos son un grupo de suplementos indefinidos tales como

casena hidrolizada, leche de coco (el lquido del endospermo del coco, i.e. agua de
coco), jugo de naranja, jugo de tomate, jugo de uva, jugo de pia, savia de abedul, pur
de pltano y as por el estilo. Estos compuestos son usados frecuentemente cuando no
existe ninguna otra combinacin de componentes conocidos definidos para producir el
crecimiento y desarrollo deseado. Sin embargo, la composicin de estos suplementos es
bsicamente desconocida y pueden variar de un lote a otro, causando respuestas
variables. Por ejemplo, el agua de coco (usada en una dilucin de 50-150 ml/l), es una
fuente natural de zeatina (RCP) y su concentracin no solo difiere entre cocos jvenes y
maduros, sino tambin entre cocos de la misma edad.
Algunos compuestos de complejos orgnicos son usados como fuentes de nitrgeno

orgnico, tales como el hidrolizado de casena, una mezcla de cerca de 20 diferentes
aminocidos y amonio (0.1-1.0 g/l), peptona (0.25-3.0 g/l), triptona (0.25-2.0 g/l), y
extracto de malta (0.5-1.0 g/l). El extracto de levadura (0.25-2.0 g/l) es usado ya que
contienen altas concentraciones y alta calidad de vitaminas del grupo B.
Las poliaminas, particularmente putrescina y espermidina, son algunas veces benficas
para la embriognesis somtica. Las poliaminas son tambin cofactores para la formacin
de races adventicias. La putrescina es capaz de sincronizar el proceso de embriognesis
de la zanahoria.
El carbn activado es til para la absorcin de los pigmentos cafs y negros y de

compuestos fenlicos oxidados. Este es incorporado al medio en concentraciones de 0.2-
3.0% (p/v). Es til para absorber otros compuestos orgnicos, incluyendo RCP, tales
como auxinas y citocininas, y otros materiales tales como vitaminas, y quelatos de hierro y
zinc (Nissen y Sutter, 1990). Los efectos de RCP son minimizados al adicionar carbn
activado cuando se transfieren explantes a medios sin RCP. Otras caractersticas del uso
de carbn activado es que cambia el medioambiente luminoso al oscurecer el medio, de
tal forma que auxilie en la formacin y crecimiento de races. Puede tambin promover
embriognesis somtica y mejorar el crecimiento y organognesis de especies
maderables.
Reguladores de crecimiento de plantas (RCP)
Los RCP ejercen efectos importantes a bajas concentraciones (0.001-10M). Ellos

regulan la iniciacin y desarrollo de brotes y races sobre explantes y embriones en
medios de cultivo semislidos o lquidos.

La tabla 3 provee una comparacin de la composicin de los ms comnmente

empleados medios de cultivo de tejidos con respecto a sus componentes en miligramos
por litro y unidades molares.
Ellos estimulan tambin la divisin y expansin celular. Aunque algunas veces un

explante es autotrfico y puede producir sus propios RCP, generalmente, los RCP deben
ser suministrados en el medio de cultivo para el crecimiento y desarrollo del cultivo.
Los ms importantes tipos de RCP usados en el cultivo de tejidos son las auxinas y las
citocininas. El efecto relativo de las relaciones entre auxinas y citocininas sobre la
morfognesis de cultivo de tejidos fue demostrado por Skoog y Miller en 1957 y sirve de
base para las manipulaciones del cultivo de tejidos de plantas en la actualidad.
Ms adelante estudiaremos de manera ms profunda este tema.
Agar y sistemas de soporte alternativo
El agar es usado para solidificar el cultivo de tejidos (gel). Este capacita al explante a ser
colocado en contacto preciso con el medio (sobre la superficie o embebido en l), pero
permanece aireado. El agar es un polisacrido de alto peso molecular que puede enlazar
el agua y es obtenida de algas marinas. El agar es adicionado al medio en intervalos de
concentraciones de 0.5 a 1.0% (p/v). Altas concentraciones de agar resultan en un medio
duro. Si una concentracin baja de agar es empleada (0.4%) o si el pH es bajo, el medio
estar tan suave y no gelificar apropiadamente. La consistencia del agar puede tambin
influir en el crecimiento. Si es muy duro, el crecimiento de la planta ser reducido. Si es
muy suave, pueden resultar plantas hiperhdricas (Singha, 1982). Para gelificar
apropiadamente, un medio con 0.6% de agar debe tener un pH por encima de 4.8.
Algunas veces el carbn activado en el medio interfiere con la gelificacin. En cultivos de
tejidos tpicos el agar se fusiona a 65C y se gelifica a 45C aproximadamente.
El agar tambin contiene contaminantes orgnicos e inorgnicos, la cantidad de ellos
vara entre las distintas marcas comerciales. Contaminantes comunes son: cidos
orgnicos, compuestos fenlicos, cidos grasos de cadena larga. Un anlisis del
fabricante, muestra que los agares Difco Bacto contienen (cantidades en ppm): 0.0-0.5
cadmio; 0.0-0.1 cromo; 0.5-1.5 cobre; 1.5-5.0 hierro; 0.0-0.5 plomo; 210.0-430.0
magnesio; 0.1-0.5 manganeso y 5.0-10.0 zinc. Generalmente se realizan ensayos en los
cultivos de tejidos vegetales de plantas para determinar el tipo de agar que se debe
emplear. Una calidad pobre del agar puede interferir o inhibir el crecimiento de cultivos.
La agarosa es frecuentemente usada cuando se cultivan protoplastos o clulas
individuales. La agarosa es un extracto purificado el agar que deja atrs grupos de
agaropectina y sulfatos.

Gomas tales como Gelrite y Phytagel son alternativas de agentes gelificantes. Estn
hechas de polisacridos producidos por una bacteria. En lugar de ser traslcidas (como el
agar) son claras, por lo que es mucho ms fcil de detectar la contaminacin.
Soportes mecnicos tales como puentes de papel filtro o plataformas de polietileno, no

dependen de un agente gelificante. Pueden ser usados con medios lquidos que circulen
mejor, manteniendo al explante en la superficie para que siga siendo oxigenado.
2.2.2. Preparacin
El primer paso para elaborar un medio de cultivo es el de aprovisionarse de todos los

materiales y equipos necesarios para tal fin, por ejemplo:
Balanza, potencimetro, autoclave, campana de flujo laminar, refrigerador, destilador,

des-ionizador, parrilla de agitacin y de calentamiento, vaso de precipitados de 1 l, matraz
volumtrico de 1 l, parrilla, barra magntica, balanza, pipetas, varias soluciones stock
(soluciones madre, ver tabla 2), frascos para almacenar soluciones y medios preparados,
etc.
Aunque esperamos que ya se maneje adecuadamente las formas de medir concentracin,

se incluyen algunos ejemplos para clarificar cualquier duda.
Unidades de concentracin
Aunque es posible obtener la concentracin de sustancias por otras vas, el siguiente

listado provee algunos mtodos para indicar la concentracin encontrada en la literatura
de cultivo de tejidos vegetales.
Porcentaje basado sobre el volumen (v/v). Usado para diluir el agua de coco,
jugo de tomate y de naranja. Por ejemplo, si deseamos 100 ml de agua de coco al
5%, requerimos tomar 5 ml de agua de coco y diluirlo con agua hasta alcanzar 100
ml.
Porcentaje basado en peso (p/v). Frecuentemente usado para expresar
concentraciones de agar o azcar. Por ejemplo, para preparar una solucin al 1%
de agar, es necesario disolver 10 g de agar en un litro de medio nutritivo.
Solucin molar. Para ello es necesario recordar que un mol (M) corresponde al
mismo nmero de gramos como peso molecular corresponda (nmero de
Avogadro), por lo tanto una solucin 1M representa el peso molecular de la
sustancia en un litro de solucin, y 0.01 M representa 0.01 veces el peso

molecular contenido en un litro de solucin. Por lo que una solucin milimolar (mM)
representa 0.001 veces el peso molecular contenido en un litro. Las sustancias
tales como los RCP estn activas a concentraciones de micromoles (M). La
concentracin molar es usada exactamente para comparar la reactividad relativa
entre diferentes compuestos. Por ejemplo, a la concentracin 1 M de AIA (cido
indol actico) puede contener el mismo nmero de molculas que 1 M de
cinetina, aunque realizando las conversiones correspondientes, esto puede ser
tambin dichas en unidades basadas al peso (mg/ml). La tabla 3, ilustra la
conversin entre concentraciones molares y las dadas en mg/l.
Miligramos por litro (mg/l). Aunque no es posible comparar sustancias con
exactitud molecular, esta es una forma simple para realizar clculos y usarlo en
pesos directos. Cada medicin directa es usada comnmente en los
macronutrientes y en RCP. Un miligramo por litro significa el colocar 1 mg de la
sustancia deseada en un volumen final de 1 litro de solucin. Recuerde que 1 mg
= 0.001 g (10-3 g).
Microgramos por litro (g/l). Este es usado con micronutrientes y tambin en
algunas ocasiones con RCP. Significa 1 g de una sustancia y se lleva a un
volumen de 1 L de solucin. 1 microgramo = 0.001 o 10-3 mg = 0.000001 o 10-6 g.
Partes por milln (ppm). Algunos componentes de medios son expresados en
ppm, 1 ppm es igual a 1 mg/l.
Las instrucciones para preparar medios de cultivo, se describen en la Tabla 4. Estas

instrucciones describen la preparacin del medio MS, pero puede ser efectivo para
preparar cualquier otro medio: slo seguir los mismos pasos y sustituir los componentes
de las soluciones madre de macro y micronutrientes del medio deseado. Omitir el agar si
lo que se desea es producir medio lquido para un cultivo en suspensin. Los RCP
pueden ser personalizados para el medio deseado, cuando sea necesario el inicializar a
callos, brotes, races o para algn otro propsito.

Tabla 3. Reguladores de crecimiento de plantas (RCP) (Beyl CA, 2005)
mg/l equivalentes para M equivalentes para

Regulador de concentraciones M concentraciones en mg/l
Abreviatura P.M.
Crecimiento de Plantas
0.1 1.0 10.0 100.0 0.1 0.5 1.0 10.0
c. abscsico ABA 264.3 0.0264 0.264 2.64 26.4 0.38 1.89 3.78 37.8
Benciladedina BA 225.2 0.0225 0.225 2.25 22.5 0.44 2.22 4.44 44.4
Dihidrozeatina 2hZ 220.3 0.0220 0.220 2.20 22.0 0.45 2.27 4.53 45.3
c. giberlico GA3 346.4 0.0346 0.346 3.46 34.6 0.29 1.44 2.89 28.9
c. indolactico AIA 175.2 0.0175 0.175 1.75 17.5 0.57 2.85 5.71 57.1
Ac. Indolbutrico AIB 203.2 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.49 2.46 4.90 49.0
Sal de potasio de AIB K-IBA 241.3 0.0241 0.241 2.41 24.1 0.41 2.07 4.14 41.4
Cinetina Cin 215.2 0.0215 0.215 2.15 21.5 0.46 2.32 4.65 46.7
c. naftalenactico ANA 186.2 0.0186 0.186 1.86 18.6 0.54 2.69 5.37 53.7
Picloram Pic 241.5 0.0241 0.242 2.42 24.2 0.41 2.07 4.14 41.4
Zeatina Zea 219.2 0.0219 0.219 2.19 21.9 0.46 2.28 4.56 45.6
2-isopentenil adenina 2-iP 203.3 0.0203 0.203 2.03 20.3 0.49 2.46 4.92 49.2
c. 2-4 2,4-D 221.04 0.0221 0.221 2.21 22.1 0.45 2.26 4.52 45.2
diclorofenoxiactico

Tabla 4. Preparacin paso a paso de un medio de cultivo (Beyl CA, 2005)
Paso Instrucciones y comentarios
Para preparar un litro de medio de cultivo, colocar

la mitad del volumen de agua desionizada-
destilada en un vaso de precipitados y colocar una
1
barra magntica en l. Colocar el vaso sobre la
parrilla de agitacin y encenderla para promover el
mezclado de los diferentes componentes.
Adicionar 10 ml de la solucin stock correspondiente (ver

2
Tabla 2): nitratos, sulfatos, haluros, PBMo y NaFeEDTA.
Adicionar el volumen apropiado del stock de vitaminas. En

3 este momento, adicionar las cantidades apropiadas de
inositol (generalmente 100 mg) y sacarosa (entre 20 y 30
g/l).
4 Adicionar el volumen necesario del stock de RCP planeado.
Ajustar el pH usando 0.1-1.0 N de NaOH o HCl

dependiendo si deseamos bajarlo o
subirlo. Para la mayora de los
medios, el pH debe de encontrarse
5
entre 5.4 y 5.8. Finalmente
ajuste el volumen final (1
litro) con agua desionizada-
destilada.
Para usar el medio lquido, se puede distribuir el medio

en frascos apropiados de acuerdo a un plan determinado
y llevarlo a la autoclave para esterilizacin.
6
Si el plan es usar medio slido, pesar la cantidad
necesario de agar o agente gelificante al medio lquido.
Colocar el medio de cultivo de tejidos sobre la placa de

calentamiento y agitar o usar el horno de microondas. Verificar

previamente el nivel de calentamiento del horno de microondas.
Distribuir en los frascos apropiados, colocar en autoclave para
esterilizacin. Esterilizar por 15 min a 121C. Si son grandes cantidades
de frascos, el tiempo de esterilizacin deber prolongarse.
Si el plan es el de distribuir el medio despus
de la esterilizacin (tales como en cajas de
petri estriles), cerrar los frascos con tapones
de algodn cubrindolo posteriormente con
una hoja de aluminio. Una vez el medio est
tibio para que la mano lo tolere (cerca de
60C), puede proceder a transferir el medio dentro de una campana de
flujo laminar a las cajas de petri.
El ajuste del pH es un paso esencial. El cultivo de

clulas de plantas prefiere un pH ligeramente cido,
generalmente entre 5.3 y 5.8. Cuando el pH es
menor a 4.5 o mayor a 7.0, el crecimiento y
desarrollo in vitro es inhibido. Esto es debido
probablemente a muchos factores, incluyendo RCP,
tales como el AIA y el cido giberlico, que llegar a
ser menos estables; se precipitan los fosfatos y las Figura 2. Autoclave horizontal
sales inicas; la vitamina B1 y el cido pantotnico (SciPh, 2013).
son menos estables; se reduce la toma de iones de
amonio; se cambia la consistencia del agar (el agar
se licua a pH bajo).
El ajuste del pH es el ltimo paso antes de adicionar y disolver el agar para despus
distribuirlo en frascos de cultivo y autoclavearlo o esterilizar. Si el pH no se encuentra en
los intervalos establecidos, ste debe ser ajustado usando NaOH para elevar el pH o HCl
para bajarlo (0.1-1.0N). Mientras que el KOH puede ser usado, cuando existe un
indeseable incremento de iones de sodio. El pH en un medio de cultivo generalmente
decae de 0.3 a 0.5 unidades despus del autoclaveado y despus cambia a travs del
periodo de cultivo, debido a la oxidacin y a la toma diferencial y secrecin de sustancias
del crecimiento de tejidos.

Finalmente, es importante sealar que las fotografas son solamente un apoyo para
imaginar el proceso, por lo que los colores mostrados aqu, son solo para resaltar la
imagen, esto es entonces, que las soluciones stock son incoloras y al final el medio de
cultivo permanece incoloro. El uso en nuestro caso de una autoclave horizontal, como la
mostrada en el paso 6, implica ordenar los frascos conteniendo el medio de cultivo
impidiendo que estos queden inclinados o que puedan derramarse.
Elaboracin de soluciones stock de sales minerales
Las sales minerales pueden ser preparadas como soluciones madre o soluciones stock
de 10 a 100 veces (10X a 100X) la concentracin especificada en el medio. Las sales
minerales son frecuentemente agrupadas en dos soluciones stock, una para macro-
elementos y una para micro-elementos, pero al menos que stos se mantengan
relativamente diluidos (10X), la precipitacin puede ocurrir. Con la finalidad de producir
soluciones ms concentradas, el mtodo preferido es el de agrupar los componentes por
los iones que ellos contienen, tales como nitratos, sulfatos, haluros, fsforo (P), boro (B),
molibdeno (Mo) y hierro (Fe) hacindolos en stocks de 100X. La tabla 2 lista las
soluciones stock para el medio MS para una concentracin final de 100X, lo cual
significa que 10 ml de cada solucin stock ser usada para elaborar un litro de medio de
cultivo. Algunas soluciones stock requieren pasos extras para obtener los componentes
de la solucin (por ejemplo, el stock de NaFeEDTA), o que requieran una dilucin serial
para obtener la cantidad de componentes traza de la solucin stock (sulfatos o haluros).
Algunas veces la cantidad de componentes particulares necesarios para el medio de
cultivo de tejidos es tan pequea que hace difcil el pesar la cantidad incluso para el
stock 100X. Por lo que estas cantidades tan pequeas no pueden ser pesadas
exactamente, la tcnica de diluciones seriales es usada. El siguiente ejemplo ilustra cmo
una dilucin serial puede ser empleada para obtener la cantidad correcta de un
componente (en este caso CuSO45H2O) del medio de cultivo para su apropiada solucin
stock.
De acuerdo a las notas de la tabla 2, la solucin stock pide 2.5 mg de CuSO45H2O

como parte del stock de sulfatos del medio MS. Se elabora una solucin stock
intermedia colocando 25 mg de CuSO45H2O en 100 ml de agua desionizada-destilada.
Despus de agitar vigorosamente, usar 10 ml de la solucin, el cual contendr la cantidad
deseada de 2.5 mg, y colocarla en la solucin stock de sulfatos. Este procedimiento
requiere solo de una dilucin serial pero algn componente puede ser sujeto a una o ms
diluciones para obtener la cantidad deseada. Una vez que la solucin stock se ha
realizado, es necesario etiquetar adecuadamente el frasco que lo contiene, con el fin de

evitar errores y prevenir el mantener inadvertidamente de la solucin stock en reserva

por mucho tiempo, un ejemplo de etiquetado se muestra a continuacin.
Solucin stock NITRATOS Tipo de solucin stock

(100X)
Tipo de medio
Murashige y Skoog (1962)
Instrucciones
Use 10 ml/l de medio
Fecha de elaboracin
14/09/2013
Nombre de quin lo
Jorge Mndez elabor
2.3. Reguladores de crecimiento vegetal (Gaba, VP, 2005)
El proceso de crecimiento y desarrollo de plantas, tales como la germinacin, elongacin

del tallo, crecimiento y desarrollo de hojas, el florecimiento y crecimiento y maduracin de
frutos, son controlados por los reguladores de crecimiento de plantas (RCP) llamados
comnmente pero de manera incorrecta hormonas de plantas.
El estudio de la funcin de RCP puede ser complejo, ya que varios RCP trabajan de
manera tpica en concierto con algunos otros y sus concentraciones en la planta cambian
con el tiempo, estacin del ao y etapa de desarrollo. Algunos RCP son sintetizados
localmente por las clulas para su propio consumo, mientras que otras son sintetizadas
en un rgano y transportado a otras partes de la planta para una accin especfica, por lo
que en este caso su actividad puede ser muy similar a una hormona para la planta y son
referidos como RCP endgenos. En esta seccin solo se describirn los RCPs naturales y
sintticos identificados y comnmente suministrados a plantas intactas y a cultivo de
tejidos, esto es RCP exgenos.

La concentracin de RCP exgenos en los tejidos es determinada por la tasa relativa de

sntesis y la tasa de degradacin (consumo) o conjugacin. Los RCP exgenos son
aplicados a plantas en el campo para obtener respuestas agrcolas importantes, tales
como la defoliacin del algodn o el crecimiento o el madurado de frutas tales como uvas
y duraznos. En el cultivo de tejidos vegetales, pequeos explantes son transferidos al
medio de cultivo. Frecuentemente cada explante es muy pequeo como para tener el
RCP necesario para una respuesta al desarrollo o al crecimiento. Sin embargo,
suministrando el medio con RCP exgenos es posible estimular la respuesta deseada del
tejido de planta, incluyendo el efecto de los RCP endgenos presentes en el explante.
Diferentes RCP anlogos tienen diferentes efectos, dependiendo de la estructura qumica,
tejido de planta y genotipo. Algunas veces es necesario mezclar diferentes RCP del
mismo o diferente tipo para obtener el resultado deseado, o para obtener tratamientos
secuenciales con diferentes RCP.
Aunque el papel de los RCP en el cultivo de tejidos vegetales es crtico, los RCP
interactan dentro de importantes determinantes biolgicos. El factor ms importante en el
cultivo de tejidos vegetales, es el genotipo; en otras palabras, la habilidad gentica del
material vegetal para producir la respuesta deseada. Por ejemplo, algunas especies o
cultivos regeneran brotes, o producen embriones somticos, con una relativa pequea
estimulacin, mientras que otros no. De forma adicional, el estado fisiolgico del material
vegetal podr determinar la respuesta biolgica. Por lo tanto, ciertas partes de plantas
(explantes) tendrn una mejor respuesta que otros en el mismo lapso de tiempo.
Existen cinco principales grupos de RCP endgenas: auxinas, citocininas, giberelinas,
cido abcsico y etileno. Muchos de stos grupos tienen mltiples roles en el crecimiento y
desarrollo de plantas, y son muy usadas para la manipulacin de plantas en el cultivo de
tejidos. Todos ellos pueden ser divididos en tres grupos, mismos que a continuacin se
revisarn.
2.3.1. Auxinas
El primer RCP aislado fue la auxina endgena (natural), cido indol-3-actico (AIA) (Fig.
3A). El AIA es rpidamente degradado ya sea en el medio de cultivo o en la planta, sin
embargo existen anlogos qumicos ms estables con los que pueden ser sustituidos.
Son llamados auxinas, debido a su actividad biolgica similar al AIA. Auxinas sintticas
tales como el 2,4-D (Fig. 3B), el cido 3-indol butrico (AIB) (Fig. 3C) y al cido 1-
naftalenactico (ANA) (Fig. 3D) son los ms frecuentemente usados. Es interesante notar
en las auxinas las similitudes de las estructuras qumicas.

Figura 3. Estructuras qumicas de algunos RCP tipo auxinas. (A) c. Indol-3-actico (AIA); (B)
cido 2,4-diclorofenoxiactico (2,4-D); (C) cido 3-indol-butirico (AIB); (D) cido 1-naftalenactico
(ANA) (Gaba, VP, 2005).
Las auxinas tienen diversos papeles en el cultivo de tejidos, de acuerdo a su estructura

qumica, su concentracin y al tejido de la planta a ser afectado. Las auxinas causan la
produccin de callos y races tanto como el crecimiento en extensin de tallos. Las
auxinas generalmente estimulan la elongacin celular, la divisin celular en el tejido del
cambium, y junto con la citocininas (prxima seccin), estimulan la diferenciacin del
floema y del xilema. Adems, a altas concentraciones de una auxina exgena puede ser
inducido la embriognesis somtica. La funcin esencial de auxinas y citocininas es la
reprogramacin de clulas somticas que haban estado previamente en un estado de
diferenciacin. La reprogramacin causa desdiferenciacin y los rediferenca a una nueva
va de desarrollo. De esa manera, una clula que haba sido destinada a desarrollarse
como parte de una hoja, por ejemplo, puede llegar a ser embriognica, produciendo
embriones somticos. El mecanismo por el cual una auxina causa desdiferenciacin no es
aun conocido. Altas concentraciones de auxinas exgenas pueden causar toxicidad, en
gran parte porque ellas estimulan la produccin de etileno, el cual causa inhibicin al
crecimiento.
Ejemplo: enraizado de brotes in vitro, el requerimiento de auxinas
Frecuentemente es necesario enraizar brotes in vitro, con el objetivo de convertir los

brotes a una planta funcional para as transferirlos a un invernadero. Los brotes con races
generalmente crecen rpido en un cultivo. En muchas especies de plantas (e.g. especies
de Nicotiana, pepino, especies de Acacias y algunos cultivos de rosas) la generacin de
races en brotes in vitro se realiza fcilmente despus de la transferencia de un medio de
regeneracin, que por lo general contiene un alto nivel de citocinina, a un medio sin RCP.

El tratamiento con auxinas in vitro es anlogo a los tratamientos para enraizados con
auxinas practicados por los jardineros. Las auxinas pueden inducir la iniciacin radicular
despus de pocas horas de su aplicacin. Comnmente el AIA (0.6-60 M), AIB (2.5-1.5
M) y/o ANA (0.25-6 M) son usados para promover el enraizado in vitro. No todas las
auxinas indicadas tienen la misma eficiencia de promover el enraizado, su efectividad
vara con la especie de planta, aunque rutinariamente no tiene importancia el tipo de
auxina usada para enraizar. Es importante notar que la concentracin de auxina provee
una mayor cantidad de races pero esa concentracin no produce mayores tasas de
sobrevivencia.
Ocasionalmente mezclas de auxinas, usualmente a bajas concentraciones comparadas

cuando se emplean solas, pueden promover la iniciacin radicular mientras que auxinas
individuales no muestran actividad, como se ha visto en el olivo, Eucalyptus, Hevea y
Vitis. Altas concentraciones de auxinas pueden ser requeridas para inducir el
enraizamiento, las cuales pueden causar efectos colaterales indeseables, tales como la
inhibicin al crecimiento de races inducidas y disturbio subsecuente del crecimiento de la
planta.
2.3.2. Citocininas
Las citocininas causan divisin celular. Cada divisin celular puede dirigir a regeneracin
de brotes in vitro, por estmulo a la formacin de brotes apicales meristemticos y,
subsecuentemente a yemas. El trmino citocinina es usado para componentes con
actividad biolgica similar. Adems, la divisin celular causada por citocininas puede
producir callos no diferenciados. Generalmente, un alta concentracin de citocininas
bloquear el desarrollo de races. Las citocininas pueden causar la liberacin de
dominancia apical de brotes, por lo tanto estimular el crecimiento de yemas laterales
resultando en mltiples formaciones de brotes. La primera citocinina aislada fue la cinetina
(Fig. 4A); un poco despus de su descubriendo, la adenina fue identificada como
poseedora de actividad de citocininas (Fig. 4C), tales como muchos derivados de la
adenina (Fig. 4). La zeatina (Fig.4C) y la N6-2-isopentenil adenina (2-iP; Fig. 4D) son otras
dos citocininas que se encuentran de forma natural que se usan frecuentemente en cultivo
de tejidos. Adicionalmente, la citocininas sinttica 6-benciladenina (BA) (tambin conocida
como 6-bencil aminopurina [BAP]; Fig. 4E) y thidiazuron (TDZ, Fig. 4F) son tambin
usadas en el cultivo de tejidos vegetales. La zeatina ribsido es un ejemplo de un RCP
acomplejado con una molcula de azcar, alterando sus propiedades biolgicas de un
RCP (Fig. 4 G).

Figura 4. Estructuras qumicas de algunos RCP tipo citocininas. (A) cinetina; (B) adenina; (C)
zeatina; (D) N6-2-isopentenil adenina (2-iP); (E) 6-benciladenina; (F) thidiazuron (TDZ); (G) zeatina
ribsido (Imgenes transcritas de Gaba, BP, 2005).

Ejemplo: Uso de citocininas en micropropagacin
La micropropagacin es la produccin en masa de plantas in vitro para propsitos

comerciales. La micropropagacin es realizada a travs de la multiplicacin de brotes
seguido del enraizamiento (generalmente tambin in vitro), o ms raramente de
embriognesis somtica. La multiplicacin de brotes, proceso que como ya se indic es
de tipo industrial, con el fin de producir gran nmero de plantas libres de patgenos para
horticultura, donde el costo del producto final es importante. En el diseo de un proceso
de micropropagacin, lo mejor es evitar las formas inestables de multiplicacin, tales
como callos, debido a la probable variacin somaclonal. Por ello, la va principal para
micropropagacin es el de utilizar brotes auxiliares, conocidos por su estabilidad gentica.
La multiplicacin de brotes es inducida por la aplicacin de citocininas exgenas en el

medio de crecimiento. Las citocininas aplicadas rompen la dominancia apical de brotes
(en plantas dicotiledneas), estimulando el crecimiento de yemas auxiliares a brotes. Una
alta concentracin de citocininas aplicadas puede causar el crecimiento de pequeos
brotes, los cuales fallan al desarrollo.
2.3.3. Giberelinas
Las giberelinas son otra tipo de RCP con cerca de 100 diferentes variantes identificadas
de varias fuentes, todas ellas basadas en la misma estructura de giberelano. La actividad
de giberelinas exgenas aplicadas vara con el tipo de giberelinas y la especie de plantas
tratadas. Las giberelinas comnmente aplicadas en el cultivo de tejidos vegetales es el
GA3, tambin conocida como cido giberlico (Fig. 5A). Aunque las giberelinas tienen
importantes papeles en el ciclo de vida de plantas (controlando longitud del tallo,
florecimiento y secado del fruto), en el cultivo de tejidos el GA3 ha sido generalmente
usado para estimular ya sea la elongacin del brote o la conversin de yemas a brotes.
GA3 interfiere con la iniciacin de las yemas en estados muy tempranos de la formacin
del meristemo, por lo que puede reducir la produccin de brotes in vitro si se adiciona a
los cultivos de tejidos vegetales en la etapa de iniciacin de brotes. De forma similar, GA3,
reduce la formacin de races y la embriognesis in vitro. Por lo anterior, para usos
prcticos, es necesario optimizar los efectos de la etapa especfica de GA3.
Ejemplo: Efecto de giberelinas en la prolongacin (extencin) de tallos
Las giberelinas fueron descubiertas debido al efecto de la estimulacin del crecimiento

sobre la elongacin de plantas. Las giberelinas son principalmente usadas en el cultivo de
tejidos vegetales para estimular la elongacin celular, produciendo por lo tanto elongacin
de brotes. El uso de giberelinas en un medio de elongacin es un mtodo valioso para

convertir yemas a brotes funcionales. Por ejemplo, en algunas variedades de meln y

calabacn despus de la induccin de brotes sobre el medio con AB (5 M), la elongacin
de brotes es mejor estimulada con un medio con una concentracin reducida de
citocininas (0.5 M) y la adicin de AG3 (1.5-3 M).
Figura 5. Estructuras qumicas de RCP de acciones variadas. (A) cido giberlico (GA3); (B) cido
abscsico (ABA); (C) etileno; (D) ancymidol (imgenes transcritas de Gaba, BP, 2005).
2.3.4. cido abscsico
El cido abscsico (ABA; Fig. 5A) ha sido principalmente usado en cultivo de tejidos
vegetales para facilitar la maduracin de embriones somticos. En ciertas especies, los
embriones no pueden ser madurados adecuadamente por la falta de ABA exgeno. La
funcin del ABA exgeno es similar durante el desarrollo de semillas en plantas
monocotiledneas, dicotiledneas y conferas. El ABA induce la formacin de protenas
esenciales LEA (late embriogenesis abundant) encontradas en etapas de embriognesis
tarda en ya sea embriones somticos o sexuales. Ocasionalmente, ABA puede estimular
algn proceso de regeneracin y, raramente, puede tambin reducir la produccin de
embriones somticos. ABA es el nico integrante de esta clase.

2.3.5. Etileno
El etileno es el nico RCP gaseoso natural (Fig. 5C). A pesar de que el etileno se conoce
sobre todo en biologa de plantas por sus efectos en la maduracin de frutas, este es
naturalmente producido por todos los rganos de la planta superior en una manera
controlada. En el cultivo de tejidos de plantas, el etileno producido endgenamente puede
acumular en un recipiente cerrado a niveles que son perjudiciales para el crecimiento y
desarrollo de plantas. El resultado en especies sensibles al etileno, se muestra en un
sndrome tpico de la reduccin de la elongacin del tallo, restringido crecimiento de hojas,
prematura senescencia foliar y, algunas veces, incremento en el crecimiento de yemas
auxiliares. Mejorando concentraciones de etileno, se puede estimular la formacin de
callos, reduciendo la regeneracin de yemas y brotes. La embriognesis somtica puede
ser afectada por la concentracin de etileno bajas concentraciones estimula, mientras
que altas concentraciones lo inhiben.
Actividades
La elaboracin de las actividades estar guiada por tu docente en lnea, mismo

que te indicar, a travs de la Planeacin didctica del docente en lnea, la dinmica
que t y tus compaeros (as) llevarn a cabo, as como los envos que tendrn que
realizar.
Para el envo de tus trabajos usars la siguiente nomenclatura: BCTV1

_U2_A1_XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la asignatura, U2 es la
unidad de conocimiento, A1 es el nmero de actividad, el cual debes sustituir
considerando la actividad que se realices, XX son las primeras letras de tu nombre, Y
la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu apellido materno.
Autorreflexiones
Para la parte de autorreflexiones debes responder las Preguntas de

Autorreflexin indicadas por tu docente en lnea y enviar tu archivo. Cabe
recordar que esta actividad tiene una ponderacin del 10% de tu evaluacin.
Para el envo de tu autorreflexin utiliza la siguiente nomenclatura:

BCTV1 _U2_ATR _XXYZ, donde BCTV1 corresponde a las siglas de la
asignatura, U2 es la unidad de conocimiento, XX son las primeras letras de tu

nombre, y la primera letra de tu apellido paterno y Z la primera letra de tu

apellido materno
Cierre de la unidad
Hemos realizado un breve atisbo sobre la historia en el desarrollo de medios de cultivo,

conocemos ahora que el cultivo de tejidos vegetales es importante comercialmente y en la
actualidad se emplea como una herramienta de investigacin en campos
multidisciplinarios.
Uno de los principales pasos para desarrollar estas tcnicas es el de conocer los
diferentes ingredientes que conforman el medio de cultivo y su funcin, por lo que en la
siguiente unidad, concluiremos con la construccin del conocimiento relacionada al
establecimiento fsico de un laboratorio de cultivo de tejidos vegetales.
Para saber ms
Catlogo de medios de cultivo de tejidos vegetales, Sigma-Aldrich.

http://www.sigmaaldrich.com/life-science/molecular-biology/plant-biotechnology/plant-
tissue-culture/product-lines.html
Academia Alemana de Ciencias

http://www.leopoldina.org/en/about-us/
Fuentes de consulta
La gran mayora de citas se encuentran referenciadas directamente en los documentos

revisados de Smith HR (2013) y Trigiano RN - Gray DJ (2005).
Beyl CA, (2005). Getting started with tissue culture: Media preparation, sterie technique,
and laboratory equipment. En: Trigiano RN y Gray DJ. Plant development and
biotechnology. USA: CRC Press. ISBN 0-8493-1614-6
Bhojwani, S.S., y Razdan, M.K. (1983). Plant tissue culture: Theory and practice:
Developments in crop science. Amsterdam: Elsevier.
Gautheret, R.J. (1985). History of plant tissue and cell culture: A personal account. En:
I.K. Vasil (Ed.) Cell culture and somatic cell genetics of plants (Vol. 2, pp. 1-59). New
York:Academic Press.

Haberlandt, G. (1902). Kulturversuche mit isolierten Pflanzenzellen. Sitzungsber. Akad.

Wiss. Wien, Math,-Naturwiss. Kl., Abt. 1, 111, 69-92.
Laimer M. y Rcker W. (Eds) 2003. Plant Tissue Culture, 100 years since Gottlieb
Haberlandt. Vienna: Springer-Verlag Wien. ISBN 978-3-211-83839-6
SciPh (2013). Science photo library. London, UK. http://www.sciencephoto.com/
Thorpe T.A. (2013). History of plant cell culture. En: Smith HR. Plant Tissue Culture,
techniques and experiments (2 ed.). USA: Academic Press. ISBN 978-0-12-415920-4.
White, P.R. (1963). The cultivation of animal and plant cells (2 ed.) New York: Ronald
Press.

ANEXO
Nombres de algunos compuestos qumicos que aparecen en esta etapa.
Compuesto Nombre
NH4NO3 Nitrato de amonio

NH4H2PO4 Fosfato de amonio monobsico
(NH4)2SO4 Sulfato de amonio
CaCl22H2O Cloruro de calcio dihidratado
Ca(NO3)24H2O Nitrato de calcio tetrahidratado
MgSO47H2O Sulfato de magnesio
heptahidratado
KCl Cloruro de potasio
KNO3 Nitrato de potasio
K2SO4 Sulfato de potasio
KH2PO4 Fosfato de potasio monobsico
NaH2PO4 Fosfato monosdico anhidro
Na2SO4 Sulfato de sodio
H3BO3 c. Brico
CoCl26H2O Cloruro de cobalto hexahidratado
CuSO45H2O Sulfato de cobre pentahidratado
Na2EDTA cido etilendiaminotetraactico,
sal disdica
Fe2(SO4)3 Sulfato frrico
FeSO47H2O Sulfato ferroso heptahidratado
MnSO4H2O Sulfato de manganeso hidratado
KI Ioduro de potasio
MoO3 Trixido de molibdeno
Na2MoO42H2O Molibdato de sodio dihidratado
ZnSO47H2O Sulfato de zinc heptahidratado

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Cultivo de tejidos vegetales I

Unidad 2. Medios de cultivo

Cultivo de tejidos vegetales I

Unidad 2. Medios de cultivo

Unidad 2. Medio de cultivos ...................................................................................... 2

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 1

Unidad 2. Medios de cultivo

Despus de una inmersin a conceptos variados, al

El primer cultivo de tejidos de plantas exitoso, fue

Analizar el contexto histrico del cultivo de

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 2

Clasificar los diferentes tipos de medios de cultivos y

2.1. Resea histrica del cultivo de tejidos vegetales

Estudios extensivos por medio del microscopio, condujeron al desarrollo independiente y

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 3

estableci claramente el concepto de totipotencia e indic adems que la tcnica de

2.1.1. Los primeros aos

Los primeros y verdaderos cultivos de tejidos vegetales se obtuvieron por Gautheret

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 4

2.1.2. La era de desarrollos tcnicos

El cultivo de clulas individuales (y pequeos agregados celulares) fue obtenido mediante

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 5

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 6

En la polinizacin y fertilizacin in vitro fueron pioneros Kanta, K. et al. (1962) usando

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 7

2.1.3. El pasado reciente y la era presente

Basndonos en la disponibilidad de las diferentes tcnicas in vitro discutidas en los

Durante la dcada de 1990 la expansin contina en las aplicaciones de las tecnologas in

El cultivo de clulas ha permanecido como una herramienta importante en el estudio de

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 8

Los cultivos de clulas permanecen como herramienta importante en estudios de

Avances en la biologa molecular permitieron en ingeniera gentica, inserciones precisas

La ola inicial de investigacin en

Ambos congresos fueron desarrollados a travs de un programa cientfico que se centr

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 9

2.2. Medio de cultivo (Beyl CA, 2005)

La seleccin del medio de cultivo de tejidos vegetales, depende de la especie a ser

El desarrollo de las formulaciones de los medios de cultivo fue el resultado de pruebas

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 10

Muchas compaas venden mezclas preparadas y empaquetadas de las recetas ms

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 11

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 12

2.2.1. Ingredientes (Beyl CA, 2005)

El crecimiento y desarrollo de explantes in vitro es el producto de la gentica, del medio

El medio de cultivo de tejidos consiste de 95% de agua, macro y micro-nutrientes, RCP,

Agua de alta calidad es un ingrediente requerido del medio de cultivo de tejidos de

Elementos inorgnicos minerales

As como el crecimiento de plantas in vivo requiere muchos elementos diferentes, ya sea

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 13

Los macronutrientes son requeridos en cantidades milimolares (mM) en la mayora de los

Tabla 2. Soluciones (100X) de macro y micro nutrientes del medio Murashige y

Stock (100X) Componente Cantidad

Para notas a, b y c, leer el texto.

Adems, el suministro de nitrgeno, potasio, magnesio, calcio, fsforo y azufre en el

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 14

Con respecto a la nota a para CuSO45H2O, considerar lo siguiente: ya que esta

c Mezclar el FeSO47H2O y el NaEDTA juntos y calentar ligeramente hasta que la

El azcar es una muy importante parte de cualquier medio de cultivo, y su suministro es

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 15

Universidad Abierta y a Distancia de Mxico 16

sntesis de purinas y constituye una parte del anillo de porfirinas en la estructura de la

Compuestos orgnicos complejos son un grupo de suplementos indefinidos tales como

Algunos compuestos de complejos orgnicos son usados como fuentes de nitrgeno