Universidad Galileo

Sede Quetzaltenango
Facultad de Ciencias de la Salud

Supervisora:
Licda Andrea Daz Cano

Estudiante:
Byron Estuardo Fuentes

Carnet:
14006340

MANUAL DE BACTERIOLOGIA

Curso:
Practica Supervisada
 Manual de Baceriologa

Tincin de Gram
Introduccion

La tincin de Gram permite diferencias a las clulas bacterianas como gram positivas si
resisten la decoloracin con alcohol acetona o gram negativas si no la resisten. La capacidad de
resistir esta decoloracin se encuentra en el grosor de la pared celular. Esta pared celular tiene
como principal componente el pptidoglucano, y su funcin es dar forma a la bacteria, conferir
rigidez y tamao a la clula y permite que la clula bacteriana soporte altas presiones
osmticas. Las bacterias gram positivas poseen una pared celular gruesa conformada por varias
capas interconectadas de pptidoglucano que corresponden hasta un 90% de la pared celular.
Por el contrario las bacterias gram negativas nicamente poseen una fina capa de
pptidoglucano que constituye el 20% de la pared celular. (Cisternas, 2007) (Koneman, Allen,
Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004).

El pptidoglucano es una molcula formada por disacridos constituidos por N-

acetilglucosamina y N-acetilmurmico unidos por enlaces (14) que se repiten
indefinidamente, asimismo la N-acetilglucosamina se une con un tetrapptido conformado por
L y D alanina, D-cido glutmico y lisina o cido diaminopimlico. La composicin de este
tetrapptido vara entre especies bacterianas. Esto permite que la pared celular sea rgida y
brinde proteccin a la clula bacteriana (Cisternas, 2007) (Raisman, 2005)

El colorante principal en esta tincin el cristal violeta, el cual es un colorante bsico. Este
colorante ingresa en todas las clulas bacterianas y crea un complejo insoluble con el mordiente
que es el colorante de lugol. Posteriormente se trata a las bacterias con el decolorante alcohol-
acetona el cual disuelve o desorganiza la pared celular de las bacterias gram negativas, que causa
la liberacin del complejo cristal violeta-lugol de la clula bacteriana. Por el contrario en las
clulas gram positivas el decolorante permite la deshidratacin de la pared celular cerrando los
poros y reteniendo el complejo cristal violeta-lugol. Por ltimo se utiliza como colorante
secundario la safranina, la cual colorea todas las clulas que hayan perdido el complejo cristal
violeta-lugol (Cisternas, 2007).

Figura 1.1 Estructura molecular del pptidoglucano El pptidoglucano se encuentra formado

por enlaces (14) entre N-acetilmurmico y N-acetilglucosamina. Se observa la presencia de
un tetrapptido unido al N-acetilmurmico el cual vara en composicin dependiendo de la
especie bacteriana (Raisman, 2005)
Figura 1.2 Pared celular bacteriana Se observa las diferencias entre la composicin de la
pared celular entre bacterias gram positivo y gram negativo. (Raisman, 2005)
 M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Microscopio ptico
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Portaobjetos
Asa de nicromo en punta
Cultivo en medio slido de Staphylococcus sp.
Cultivo en medio slido de Escherichia coli
Alcohol 70%
Solucin salina estril
Cristal violeta
Lugol
Alcohol acetona
Safranina
Agua
Aceite de inmersin

PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Coloque una gota de solucin salina pequea en un portaobjeto rotulado y con su
asa estril tome una colonia pequea del medio slido con Staphylococcus sp.
Emulsifique la colonia en la gota de solucin salina. Esterilice su asa.
4. Permita que se seque el frote y fjelo pasando la parte posterior del portaobjetos
sobre la parte alta de la llama del mechero. Repita esto de 4 a 5 veces.
5. Repita los pasos 3 y 4 con el medio con Escherichia coli.
6. Cuando ya tenga los dos frotes proceda a teir siguiendo los pasos que se detallan
en el siguiente cuadro.
 Tabla 1 Pasos para la tincin de Gram

Colorante Tiempo de coloracin Procedimiento

Cristal violeta 1 minuto Cubrir el frote. Terminado el
tiempo de coloracin lavar con
agua y quitar el exceso de agua.
Lugol 1 minuto Cubrir el frote. Terminado el
tiempo de coloracin lavar con
agua y quitar el exceso de agua.
Alcohol acetona -- Cubrir el frote e inmediatamente
lavar con agua y quitar el exceso
de agua.
Safranina 1 minuto Cubrir el frote. Terminado el
tiempo de coloracin lavar con
agua y quitar el exceso de agua.

7. Terminada la coloracin, secar el frote y observar al microscopio. Primero debe

enfocar en 10x y posteriormente enfocar en 100x agregando una gota de aceite de
inmersin.
8. Realizar los diagramas correspondientes.
9. Descarte los portaobjetos utilizados.
10. Desinfecte su rea de trabajo con alcohol al 70% y algodn. Descarte los guantes
utilizados y lvese las manos.
 Tincin de Ziehl Neelsen
Baciloscopas

Introduccion
Mycobacterium sp. son microorganismo cido resistente, esto significa que pueden resistir
una decoloracin con alcohol cido luego de ser teidas con carbol fucsina debido a la
presencia de cidos miclicos en su pared celular. El complejo Mycobacterium tuberculosis
comprende las especies de M. tuberculosis, M. microti, M. africanum y M. bovis, y se considera
el agente etiolgico ms frecuente de tuberculosis (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger,
& Winn, 2004).

La tcnica de baciloscopas comprende un mtodo semicuantitativo de deteccin de bacilos

cido alcohol resistente (BAAR) en muestras de esputo. Esta tcnica deber realizarse de forma
estandarizada para poder obtener resultados comparables y vlidos. La especificidad de esta
prueba es superior al 98% ya que la mayora de BAAR que se observan en una muestra de
esputo corresponde a M. tuberculosis. La sensibilidad es menor al 90% ya que se requiere que
se encuentren por lo menos 5,000 bacilos por mL de expectoracin para que puedan ser
detectados al microscopio. Es por esto que es necesario realizar un muestreo seriado

(Laboratorio Nacional de Salud (LNS), 2008):

1. Primera muestra en la primera consulta, inmediatamente al detectar un paciente con
sintomatologa relacionada con tuberculosis.
 2. Segunda muestra a la maana siguiente, al despertarse el paciente en ayunas sin
enjuagarse ni lavarse la boca debe recolectar la muestra.
3. Tercera muestra al momento de entregar la segunda muestra en el laboratorio.

Es importante recordar que las muestras de esputo son altamente infecciosas, por eso se
debe de tomar todas las consideraciones necesarias para evitar la inhalacin de aerosoles.
Asimismo es necesario realizar desinfecciones del rea de trabajo con hipoclorito de sodio al
1% seguido de una limpieza con alcohol al 70%. El personal que manipule las muestras de
esputo debe utilizar lentes, mascarilla N95 y guantes como medidas de proteccin (LNS, 2008).

M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Mascarilla N95
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Alcohol 70%
Metanol 95%
Hipoclorito de sodio al 1%
Aplicadores de madera
Portaobjetos nuevos desgrasados (sumergirlas en alcohol al 95% y pasarlas por la
llama del mechero antes de usarlas)
Papel peridico
Carbol fucsina
Alcohol cido 3%
Azul de metileno
Muestra de esputo
 PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables y su mascarilla. Desinfecte
su rea de trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Colocar papel peridico humedecido en hipoclorito de sodio al 1% sobre el rea de
la mesa de trabajo donde se van a procesar las muestras.
4. Identificar el portaobjetos donde se realizar el extendido.
5. Con un aplicador de madera con el extremo quebrado, seleccione una pequea
porcin de la parte ms densa y purulenta de la muestra.
6. Realice un extendido fino y uniforme circular u ovalado de no ms de 2 cm de
dimetro y djelo secar a temperatura ambiente.
7. Fijar el extendido pasando la lmina por la llama del mechero.
8. Cubrir el extendido fijado a la llama con carbol fucsina y calentar suavemente por
debajo de la lmina con el mechero de alcohol o un hisopo de alambre con torunda
de algodn humedecida con metanol al 95% hasta que se observe la produccin de
vapores blanquecinos a partir del colorante.
9. Mantener la emisin de vapores durante 5 minutos. Evitar que el colorante hierva.
10. Lavar con agua el colorante y quitar el exceso de agua de la lmina.
11. Cubrir el extendido con alcohol cido al 3% durante 1 minuto.
12. Lavar con agua y quitar el exceso de agua de la lmina.
13. Cubrir el extendido con azul de metileno durante 30 segundos.
14. Lavar con agua y quitar el exceso de agua de lmina. Permitir que el extendido se
seque y observar al microscopio en objetivo de 100x.
 15. Realizar la observacin de campos y la identificacin de BAAR, los cuales se vern
de color rojo a rosado, alargados y pueden presentar ramificaciones o formas
filamentosas.
16. La observacin del extendido debe realizarse de forma sistemtica y estandarizada,
observando de izquierda a derecha del extendido los campos microscpicamente
tiles (se observa la presencia de clulas bronquiales o leucocitos teidas de azul)
17. Realizar el reporte segn los siguiente parmetros

Nmero de BAAR observados Nmero de campos a

Resultado
por campo Observer
Ninguno 100 No se observan bacilos cido
alcohol resistentes.
1-9 BAAR en todo el 100 Reportar el nmero exacto de
Extendido Realizar un segundo bacilos observados en 100 campos
extendido
Promedio menor a 1 por 100 Positivo (+)
Campo
Promedio de 1 a 10 por 50 Positivo (++)
Campo
Promedio mayor a 10 por 20 Positivo (+++)
Campo
 FORMA DE REPORTAR

Nmero de bacilos
Nmero de campos observados
Promedio de bacilos /campo
Resultados

Nmero de bacilos
Nmero de campos observados
Promedio de bacilos /campo
Resultados
 Aislamiento bacteriano en medio
slidos
Introduccion
Un medio de cultivo es una sustancia con un conjunto de nutrientes que permiten el
crecimiento de microorganismos. El medio a seleccionar depender de la naturaleza de la
investigacin que se desee realizar, as como del microorganismo que se busca. Las tcnicas de
inoculacin de bacterias permiten la obtencin de microorganismo en cultivos puros, lo cual
facilita su identificacin (Brooks, Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).

Inocular significa introducir artificialmente una porcin de muestra que corresponde a un

inculo, dentro de un medio adecuado, con el fin de iniciar un cultivo bacteriano. Para lograrlo
es necesaria una incubacin del medio inoculado, la cual debe realizarse bajo condiciones de
temperatura, atmsfera y humedad especficas que permitan el crecimiento del
microorganismo deseado. Esta inoculacin puede realizarse en cultivos con medio lquido,
slido o semislido dependiendo de la cantidad y el tipo de agente solidificante que se utilice
(Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004)

Aislar consiste en separar un tipo de microorganismo de una poblacin que puede

contener varios tipos. Asimismo se puede mencionar que a partir de una bacteria se puede
obtener el crecimiento de una colonia pura, por lo que es necesario seleccionar una tcnica
que permita el aislamiento de dicha bacteria. A continuacin se describen las tcnicas ms
utilizadas.
 TCNICA POR ESTRAS PARALELAS:
Se realiza una inoculacin inicial densa con un asa esterilizada. Posteriormente se esteriliza
nuevamente el asa y se gira la placa 90 y se realizan estras paralelas entre s que toquen 2 o
3 veces el inculo inicial. Este procedimiento se repite 2 veces, hasta que por ltimo sin
esterilizar el asa se realiza un ltimo estriado en la superficie de la caja que ha quedado sin
inocular.

Figura 1.1 Tcnica de aislamiento por estras. Se observa la realizacin

del inculo inicial y el estrado en todo el medio de cultivo
 TCNICA POR ESTRAS CONTINUAS:
En esta tcnica se utilizar la totalidad de la placa de Petri y se realizarn estras a todo lo ancho
de la placa. Esta tcnica se utiliza cuando se desea obtener una gran cantidad de crecimiento.

Figura 1.2 Tcnica de aislamiento por estras continuas.

M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa de nicromo en argolla
Cultivo en medio slido y en medio lquido de Staphylococcus sp.
Cultivo en medio slido y en medio lquido de Escherichia coli
Agar sangre de carnero al 5%
Agar McConkey
Alcohol 70%
Incubadora
Frasco para cultivo en microaeroflia
 PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Esterilice el asa, espere a que enfre y seleccione una colonia del medio slido con
Staphylococcus sp. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar sangre de
carnero al 5% mediante la tcnica de estras paralelas.
4. Esterilice el asa, espere a que enfre y tome un inculo del medio lquido con
Staphylococcus sp. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar sangre de
carnero al 5% mediante la tcnica de estras continuas.
5. Esterilice el asa, espere a que enfre y seleccione una colonia del medio slido con
Escherichia coli. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar McConkey
mediante la tcnica de estras paralelas.
6. Esterilice el asa, espere a que enfre y tome un inculo del medio lquido con
Escherichia coli. Posteriormente realice la inoculacin del medio agar McConkey
mediante la tcnica de estras continuas.
7. Incube las cajas a 35C durante 24 horas, las cajas de agar sangre del carnero al 5%
en microaeroflia y las de agar McConkey en aire ambiental.
 Pruebas de identificacin
Staphylococcus
Catalasa, Coagulasa y Manitol Sal

Introduccion
El gnero Staphylococcus est conformado por bacterias esfricas organizadas en racimos
irregulares que a la tincin de Gram se tien con cristal violeta, no son mviles y pueden crecer
en ambientes aerbicos o microaeroflicos. Estas bacterias crecen en un gran nmero de
medios de cultivo, fermentan carbohidratos y pueden producir pigmentos que van desde
blanco hasta amarillo (Brooks, Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).

Las bacterias de este gnero pueden pertenecer a la microbiota normal de piel y mucosas,
pero actan como patgenos potenciales causando desde infecciones en heridas hasta shock
sptico. Este gnero cuenta con hasta 40 especies siendo las ms frecuentes: Staphylococcus
aureus, Staphylococcus epidermidis y Staphylococcus saprophyticus (Brooks, Carroll, Morse,
Mietzner, & Butel, 2013).

Para el cultivo de este gnero es necesario una incubacin a 37C, pero la formacin de
pigmento se da a temperaturas entre los 20-25 C. Las colonias en medios slidos son redondas,
lisas, convexas y brillantes. Pueden presentar hemlisis beta cuando crecer en medios con
sangre. Para la identificacin se utilizan tres pruebas: catalasa, coagulasa y manitol sal (Brooks,
Carroll, Morse, Mietzner, & Butel, 2013).
 Catalasa
Principio: La catalasa es una enzima que descompone el perxido de
hidrgeno (H2O2) en agua y oxgeno. La mayora de las bacterias aerbicas
y anaerobias facultativas poseen esta enzima. El perxido de hidrgeno se
forma como uno de los productos finales de oxidacin del metabolismo
aerobio de los carbohidratos. Si este se acumula, resulta letal para las
bacterias.

Coagulasa
Principio: La coagulasa es una enzima que tiene actividad similar a
la protrombina capaz de convertir el fibringeno en fibrina, dando como
resultado la formacin de un cogulo visible. Esta enzima ayuda a la
bacteria a formar una barrera alrededor del sitio de infeccin limitando el
sitio de infeccin.
Esta enzima puede presentar de dos formas, libre y unida. La coagulasa
unidad es tambin conocida como factor de agrumacin, la cual se
encuentra unida a la pared celular bacteriana y permite la formacin de
bandas de fibrina que hace que se agrupen en grumos visibles. La
coagulasa libre es secretada al medio exterior y permite la formacin de
un cogulo de fibrina.
Staphylococcus aureus es la nica especie de este gnero que posee esta
enzima.

Manitol Sal
Principio: El medio manitol sal es un medio selectivo y diferencial. Las
bacterias que crecen en un medio con alta concentracin de sal y
fermentan el manitol, producen cidos que modifican el pH del medio y
hacen virar el indicador de pH de color rojo a amarillo.
 M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa de nicromo en argolla
Cultivo bacteriano de 18-24 horas de incubacin en agar sangre de carnero al 5%
Alcohol 70%
Perxido de hidrgeno al 3%
Plasma con EDTA
Agar manitol sal en placa o en tubo

PROCEDIMIENTO
CATALASA

1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de

trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Coloque en un portaobjetos una gota de perxido de hidrgeno al 3%
4. Con el asa de nicromo coloque una colonia sobre la gota de perxido de hidrgeno
al 3%. Debe tener cuidado de no levantar el medio de cultivo ya que los eritrocitos
poseen esta enzima.
5. La aparicin rpida y sostenida de burbujas o efervescencia durante los primeros
20-30 segundos es indicativo de una reaccin POSITIVA.
6. Si no se observa burbujas ni efervescencia es una reaccin NEGATIVA.

COAGULASA UNIDA

1. Trabaje con rea limpia y cerca del mechero.

2. Coloque 2 gotas de agua o solucin salina estril sobre un portaobjetos limpio
3. Emulsifique una colonia del cultivo con un asa de nicromo en argolla en el agua o
solucin salina.
4. Colocar una gota de plasma con EDTA sobre la colonia en el portaobjetos.
5. Mezclar con un palillo de madera estril.
6. La formacin de precipitado blanco o la aglutinacin de las colonias dentro de los
primeros 15 segundos se considera una reaccin POSITIVA.
7. Si luego de 2 minutos no se observa la formacin de precipitado o aglutinacin de
las colonias, la reaccin se considera NEGATIVA.
8. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%, descartar
los guantes y lavarse las manos.

COAGULASA LIBRE

1. Trabaje con rea limpia y cerca del mechero.

2. Coloque 5 mL de plasma con EDTA en un tubo estril.
3. Inocule una colonia del cultivo con un asa de nicromo en argolla en el tubo.
4. Incubar durante 4 horas a 37C.
5. La formacin de un cogulo dentro del tubo se considera una prueba POSITIVA.
6. Si luego de las 4 horas de incubacin no se observa formacin de cogulo, se debe
incubar durante 18 horas a 20-25C. La formacin de un cogulo dentro del tubo se
considera una prueba POSITIVA.
7. Si luego de la segunda incubacin no se observa formacin de cogulo la prueba es
NEGATIVA.

CRECIMIENTO EN MANITOL SAL

1. Trabaje con rea limpia y cerca del mechero.

2. Realice un estrado por agotamiento en la caja o tubo de agar manitol sal con la
bacteria. Utilice un asa en argolla.
3. Incubar durante 18-24 horas a 35C en aerobiosis.
4. Si se obtiene crecimiento bacteriano y cambio de color del medio de cultivo de rojo
a amarillo la prueba se considera POSITIVA.
7. Si no hay crecimiento bacteriano ni cambio de color del medio la prueba se
considera NEGATIVA. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con
alcohol al 70%, descartar los guantes y lavarse las manos.
8. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.

Pruebas de
identificacin de
Enterobacterias
 Oxidasa, Tsi, Lia, Mio, Citrato,
Urea

Introduccion

Las enterobacterias corresponden a un grupo grande y heterogneo de bacilos gram

negativo fermentadores de carbohidratos. Son microorganismos ubicuos, presentes en suelo,
agua, vegetacin y el intestino de animales y el ser humano. Estas bacterias pueden causar
una gran variedad de enfermedades en el ser humano como infecciones de tracto urinario,
bacteremia o afectaciones a nivel gastrointestinal (Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009).

Los miembros de esta familia son bacilos de tamao intermedio (0.3 a 1 x 1 a 6 m) gram
negativo que pueden ser inmviles o mviles con flagelos pertricos y no forman esporas.
Todos los miembros pueden crecer rpidamente de forma aerobia o anaerobia en varios
medios nutritivos (agar sangre de carnero al 5%) o selectivos (agar McConkey). Tienen
requerimientos nutricionales sencillos, fermentan la glucosa y citocromo oxidasa negativos
(Murray, Rosenthal, & Pfaller, 2009).

Las pruebas de identificacin de estas bacterias se basan en la capacidad de realizar

ciertas reacciones bioqumicas y para eso se utiliza una serie de medios de cultivo que
permiten determinarlas como agar TSI, agar LIA, agar MIO, agar Citrato y caldo o agar Urea.

CITOCROMO OXIDASA
Principio: Esta prueba permite detectar la presencia de la enzima
citocromo oxidasa. Esta enzima se encuentra presente en la cadena de
respiracin aerobia y se encuentra en bacterias aerobias, microaeroflias y
anaerobios facultativos. Se utiliza el colorante tetrametilo de p-
fenilendiamina el cual es incoloro en estado reducido y al estar en
contacto con la enzima citocromo oxidasa se torna de color prpura
intenso.
 Agar TSI

Principio: Permite detectar la utilizacin fermentativa de la

glucosa, lactosa o sacarosa, la formacin de gas y la produccin
cido sulfhdrico (H2S).
Componentes del medio:
Aporte de nutrientes: extracto de carne y pluripeptona
Carbohidratos fermentables: lactosa, sacarosa y glucosa. Debido a
la concentracin de glucosa el medio esta se presenta en el fondo
del tubo, quedando la lactosa y sacarosa en el pico del tubo.
Produccin de H2S: tiosulfato de sodio a partir del cual se
genera H2S, este se une al
hierro presente en el sulfato de hierro y amonio produciendo un
precipitado de color negro.
Indicador de pH: rojo fenol, el cual cambia a amarillo cuando el
medio se acidifica.
c. Lectura del medio: Si se produce un cambio en el fondo del
tubo de rojo-naranja a amarillo, significa que el medio se acidific
por la fermentacin de la glucosa. Si el cambio se produce en el
pico del tubo, se realiz la fermentacin de la lactosa y/o
sacarosa. Si no hay cambio en el tubo, la bacteria no utiliza ningn
carbohidrato de forma fermentativa. Si hay produccin de gas se
observar la formacin de burbujas dentro del medio. La
produccin de H2S se evidencia por la formacin de un precipitado
color negro que difunde en el medio de cultivo.

Agar LIA
 Principio: Permite detectar la descarboxilacin y desaminacin de
la lisina, la formacin de gas y la produccin cido sulfhdrico (H2S).

Componentes del medio:

Aporte de nutrientes: extracto de levadura y peptona.
Carbohidratos fermentables: glucosa. La lisina es el aminocido
que permite determinar la presencia de enzimas descarboxilasas o
desaminasas.
Produccin de H2S: tiosulfato de sodio a partir del cual se genera
H2S, este se une al hierro presente en el sulfato de hierro y
amonio produciendo un precipitado de color negro.
Indicador de pH: prpura de bromocresol. A un pH igual o menor a
5.2 se torna Amarillo y a un pH de 6.8 o mayor, es color prpura.
Lectura del medio: Si se produce un cambio en el fondo del tubo de
prpura a amarillo, significa que el medio se acidific por la
fermentacin de la glucosa. Si la bacteria posee enzimas
descarboxilasas o desaminasas el medio se tornar color prpura
o violeta. Si hay produccin de gas se observar la formacin de
burbujas dentro del medio. La produccin de H2S se evidencia por
la formacin de un precipitado color negro que difunde en el
medio de cultivo.

Agar MIO

Principio: Permite detectar la movilidad bacteriana, la

produccin de indol y la descarboxilacin de la ornitina.
Componentes del medio:
Aporte de nutrientes: extracto de levadura, peptona y
triptena. La triptena aporta triptfano para la
determinacin de la enzima triptofanasa que permite
la produccin de indol.
 Carbohidratos fermentables: glucosa. La ornitina
es el aminocido que permite
determinar la presencia de la enzima ornitina
descarboxilasa.
Indicador de pH: prpura de bromocresol. A un pH igual
o menor a 5.2 se torna amarillo y a un pH de 6.8 o
mayor, es color prpura.

Lectura del medio: Para determinarla movilidad de la

bacteria el medio posee una menor concentracin de
agar como agente solidificante. Si el crecimiento de la
bacteria se da en todo el medio, la movilidad es positiva.
Si el crecimiento de la bacteria nicamente se da en la
estra de inoculacin, la movilidad es negativa. Si se
produce un cambio en el tubo de prpura a amarillo,
significa que el medio se acidific por la fermentacin
de la glucosa. Si la bacteria posee la enzima ornitina
descarboxilasas el medio se tornar nuevamente de
color prpura o violeta. Para la deteccin de indol es
necesario agregar de 3-4 gotas de reactivo de Kovacs. Si
al entrar en contacto con el medio este se torna de
color rojo, la prueba es positiva; si permanece de color
amarillo la prueba es negativa.

Agar Citrato

Principio: Permite determinar si la bacteria puede utilizar el citrato como

nica fuente de carbono.
Componentes del medio:
Aporte de nutrientes: citrato es la nica fuente de nutrientes y de carbono
presente en el medio.
Indicador de pH: azul de bromotimol. Este es de color amarillo cuando el pH
es menor a6.0 y se torna azul cuando el pH de 7.6 o mayor.
 Lectura del medio: Si se produce un cambio en medio de verde a azul,
significa que la bacteria puede utilizar el citrato como fuente de carbono.

Agar o caldo Urea

Principio: Permite si la bacteria posee la enzima ureasa, la cual hidroliza la

urea y libera amonio produciendo una alcalinizacin del medio. La
utilizacin de un medio slido permite detectar a los productores lentos de
ureasa.

Componentes del medio:

Aporte de nutrientes: triptena. Al medio se le agrega un suplemento que
contiene urea al 40% para determinar la presencia de la enzima ureasa.
Carbohidratos fermentables: glucosa. Su fermentacin ocasiona una
acidificacin del
Indicador de pH: rojo de fenol. A un pH igual o menor a 6.5 se torna amarillo
y a un pH
de 8.5 o mayor, es color rosado a fucsia.
Lectura del medio: Si se produce un cambio en el fondo del tubo de rosa a
amarillo, significa que el medio se acidific por la fermentacin de la
glucosa. Si la bacteria posee enzima ureasa
el medio se tornar color rosa intenso a fucsia.

Figura 1.1 Inoculacin de batera bioqumica para la enterobacterias.

El orden de los
medios es TSI, LIA, MIO, urea y citrato. Para el agar TSI se realiza una
picadura en el centro del medio y se estra el slant. LIA se realiza tres
picaduras en el medio y se estra el slant. MIO una picadura en el medio.
Citrato y urea se estra el slant.
 M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa de nicromo en punta
Palillos de madera
Cultivo bacteriano de 18-24 horas de incubacin en agar McConkey
Alcohol 70%
Reactivo de Kovacs
Discos para la prueba citocromo oxidasa
Agar TSI en tubo
Agar LIA en tubo
Agar MIO en tubo
Agar citrato en tubo
Agar urea en tubo
Incubadora

PROCEDIMIENTO
CITOCROMO OXIDASA

1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de

trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Seleccione una colonia aislada del medio de cultivo con un palillo y colquela
en el disco de citocromo oxidasa.
4. La aparicin de un color prpura intenso durante los primeros 10-15 segundos es
indicativo de
una reaccin POSITIVA.
5. Si no hay cambio de color la reaccin NEGATIVA. No leer los resultados luego de los
15 segundos.
 TSI, LIA, MIO, Citrato y Urea

1. Trabaje con rea limpia y cerca del mechero.

2. Seleccione una colonia aislada del medio de cultivo con su asa en punta
previamente esterilizada y proceda a la inoculacin de los medios de cultivo como
se muestra en la figura 1.1.
3. Incubar a 35-37 C durante 18-24 horas en aerobiosis. Procure no cerrar
completamente los tubos de cultivo.
4. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%,
descartar los guantes y lavarse las manos.

LECTURA DE RESULTADOS
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Revise los medios TSI, LIA, citrato y urea y anote los resultados segn lo descrito
anteriormente.
4. Para el medio MIO, anote los resultados de las pruebas de movilidad y ornitina.
Adicione de 3-4 gotas del reactivo de Kovacs al medio anote el resultado.
5. Compare los resultados obtenidos con la tabla de identificacin de enterobacterias
que se
encuentra en el anexo de este manual.
6. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%,
descartar los guantes y lavarse las manos.
7. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
 Urocultivo
Introduccion
Las vas urinarias se encuentran divididas en dos partes, la superior que comprende los riones,
pelvis renal y urteres, y la inferior que comprende la vejiga urinaria y uretra. Las infecciones de
las vas urinarias suelen ser ascendentes, es decir que se originan en la vejiga y ascienden por los
urteres hasta los riones. Estas infecciones tambin pueden ser el resultado de la distribucin
por va hematgena de bacterias dentro del glomrulo y corteza renal, situacin frecuente en
pacientes con septicemia (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004).

Una infeccin del tracto urinario se define como la presencia y multiplicacin

microorganismos en la va urinaria con invasin de los tejido y que cursa con un gran nmero
de bacterias en la orina. Sin embargo, pueden encontrarse bacterias en orina sin que exista
infeccin (De Cueto, 2013). Toda la mucosa de las vas urinarias no permite el crecimiento de
microbiota, con excepcin de la mucosa uretral, es por eso que el cultivo de orina permite
identificar la presencia de infeccin, siempre y cuando la muestra haya sido recolectada
correctamente. La tcnica ms utilizada es la recoleccin del chorro medio. En esta tcnica se
le solicita al paciente que lave sus genitales con agua y jabn y que posteriormente descarte la
primera porcin de orina la cual arrastrar las bacterias que se encuentren en la uretra. La
porcin media de la orina es recolectada y procesada (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger,
& Winn, 2004).

El diagnstico de certeza de la infeccin del tracto urinario se realiza mediante un cultivo

de orina en el cual se cuantifican la cantidad de bacterias presentes por mililitro de muestra.
Se considera que un recuento de 100,000 o ms unidades formadoras de colonia por mililitro
(UFC/mL) es indicativo de infeccin. Si el nmero es inferior debe valorarse cada caso en
particular (De Cueto, 2013).

Para realizar este la cuantificacin de bacterias es necesario utilizar un asa calibrada a un

volumen en particular, generalmente para 0.001mL de muestra, por lo que cada colonia que se
obtenga corresponde a 1000UFC/mL. Los medios a utilizar deben ser selectivos y nutritivos que
permitan el crecimiento de los principales patgenos como son Escherichia coli, Staphylococcus
aureus, Estreptococos del grupo D, entre otros. Los medios ms utilizados son agar sangre de
carnero al 5% y agar McConkey. Tambin pueden ser utilizados medios diferenciales como el
chromo agar o agar cled (Koneman, Allen, Janda, Schreckenberger, & Winn, 2004).

Figura 1.1 Procedimiento para inoculacin de cultivo de orina. Primero se realiza una estra
en el centro del medio de cultivo con el asa calibrada, luego se procede a distribuir la muestra
en todo el medio mediante estras paralelas.
 M ATERIALES Y EQUIPO
Mechero bunsen
Guantes descartables
Fsforos o encendedor
Marcador permanente punta fina
Algodn
Asa plstica descartable con argolla calibrada a 0.001mL
Asa de nicromo en argolla
Agar sangre de carnero al 5%
Agar McConkey
Agar Cromo
Alcohol 70%
Muestra de orina en frasco estril

PROCEDIMIENTO
1. Lvese las manos y colquese los guantes descartables. Desinfecte su rea de
trabajo con alcohol al 70% y algodn.
2. Encienda el mechero bunsen y ajstelo hasta tener una llama de color azul estable.
3. Rotule las cajas de agar sangre de carnero al 5% y agar McConkey con el nombre
del paciente y la fecha de procesamiento.
4. Homogenice la muestra mediante movimientos circulares, dejando el frasco sobre
la mesa. Destape la muestra y sumerja el asa estril en el centro del frasco son
tocar las paredes ni el fondo.
5. Realice una estra en el centro del agar sangre de carnero al 5%.
6. Repita el paso 4 y realice una estra en el centro del agar McConkey.
7. Distribuya la muestra en toda la caja de ambos medios de cultivo con su asa de
nicromo en argolla previamente esterilizada.
8. Incube ambos medios a 37C durante 24 horas, la caja de agar sangre de carnero al
5% en microaeroflia y la de agar McConkey en aire ambiental.
9. Si no obtiene crecimiento a las 24 horas, contine la incubacin por otras 24 horas.
De no obtener crecimiento se reporta como NEGATIVO A LAS 48 HORAS DE
INCUBACIN.
10. Si a las 24 horas se obtiene crecimiento, realizar un conteo de las colonias
obtenidas, si estas superan las 100,000 UFC/mL, realizar la identificacin y prueba
de sensibilidad antimicrobiana.
11. Cuando finalice su trabajo debe desinfectar el rea con alcohol al 70%, descartar
los guantes y lavarse las manos.