Compusi de Sinteza Din Clasa Dimetilxantinelor

Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T.
Popa Iai
Facultatea de Farmacie
Disciplina de Analiza Medicamentului
Tez de doctorat
EVALUAREA ANALITIC A UNOR COMPUI

DE SINTEZ DIN CLASA
DIMETILXANTINELOR
Doctorand
BALINT (TAMBA) Adriana
Conductor stiinific
Prof. Dr. LAZR Mihai Ioan
- 2014 -
1

Teza de doctorat cuprinde:
226 pagini
312 figuri
83 tabele
1 schem
146 indicaii bibliografice
n acest rezumat se pstreaz numerotarea din tez pentru cuprins, tabele, figuri i scheme.
Cuvinte cheie: metilxantine, cromatografie, analiz spectral, spectrometrie, rezonan magnetic

nuclear, infrarou, ultraviolet.
2

CUPRINS
INTRODUCERE 7
STADIUL CUNOATERII 11
CAPITOLUL I
DATE PRIVIND COMPUII METILXANTINICI 13
I.1. COFEINA 13
STRUCTURA CHIMIC 14
PROPRIETI FIZICO-CHIMICE 14
DATE TERMICE 14
DATE TERMOGRAVIMETRICE 14
ANALIZA TERMODIFERENIAL 15
DATE SPECTRALE 15
SPECTRUL UV 15
SPECTRUL IR 16
SPECTRUL DE MAS 16
SPECTRUL RMN 17
DIFRACIA RAZELOR X 19
BIOSINTEZA COFEINEI 19
EXTRACIA COFEINEI 20
METABOLISMUL COFEINEI 22
I.2. TEOBROMINA 24
STRUCTURA CHIMIC 25
DATE SPECTRALE 25
SPECTRUL UV 25
SPECTRUL IR 25
SPECTRUL RMN 26
SPECTRUL DE MAS 27
I.3. TEOFILINA 27
STRUCTURA TEOFILINEI 28
DATE TERMICE 28
ANALIZA TERMIC DIFERENIAL 28
CALORIMETRIA PRIN SCANARE DIFERENIAL 28
DATE SPECTRALE 29
SPECTRUL UV 29
SPECTRUL IR 29
SPECTRUL DE MASA 30
BIOSINTEZA TEOFILINEI 30
CAPITOLUL II
ACIUNEA FARMACOLOGIC A METILXANTINELOR 31
II.1. ACIUNEA FARMACOLOGIC A COFEINEI 31
II.2. ACIUNEA FARMACOLOGIC A TEOBROMINEI 35
II.3. ACIUNEA FARMACOLOGIC A TEOFILINEI 36
ACIUNEA ANTIOXIDANT A METILXANTINELOR 37
ACIUNEA CITOSTATIC A METILXANTINELOR 38
CAPITOLUL III
METODE DE ANALIZ CALITATIV I CANTITATIV A 41
METILXANTINELOR
III.1. METODE SPECTROMETRICE 41
III.1.1. UV-VIS 41
III.1.2. IR 46
III.1.3. RMN 47
III.2. METODE CROMATOGRAFICE 49
III.2.1. CROMATOGRAFIA PE STRAT SUBIRE 49
III.2.2. METODE HPLC 52
III.3. METODE ELECTROFORETICE 56
CROMATOGRAFIA ELECTROCINETIC MICELAR CAPILAR 56
III.4. METODE TERMICE 58
III.5. METODE CUPLATE 63
CONTRIBUII PROPRII 65
3

CAPITOLUL IV
ANALIZA CROMATOGRAFIC A COMPUILOR XANTINICI 67
IV.1. ANALIZA PE STRAT SUBIRE 67
Compusul C1 68
Compusul C2 68
Compusul C3 69
Compusul C4 70
Compusul C5 70
Compusul C6 71
Compusul C7 72
Compusul C8 73
IV.2. DETERMINAREA DENSITOMETRIC A COMPUILOR C3 i C8 73
Compusul C3 74
Compusul C8 74
CONCLUZII 75
CAPITOLUL V
ANALIZA SPECTRAL N UV A DERIVAILOR METILXANTINICI 77
INTRODUCERE 77
MATERIAL I METOD 79
Compusul C1 80
Compusul C2 81
Compusul C3 82
Compusul C4 82
Compusul C5 83
Compusul C6 84
Compusul C7 84
Compusul C8 84
CONCLUZII 85
CAPITOLUL VI
ANALIZA IR A DERIVAILOR METILXANTINICI 87
INTERPRETAREA SPECTRELOR 87
CARACTRISTICILE SPECTRALE N IR ALE COMPUILOR 88
METILXANTINICI ANALIZAI
ANALIZA IR A COMPUILOR XANTINICI 88
MATERIAL I METOD 88
Compusul C1 89
Compusul C2 90
Compusul C3 91
Compusul C4 92
Compusul C5 93
Compusul C6 94
Compusul C7 95
Compusul C8 96
CONCLUZII 97
CAPITOLUL VII
ANALIZA HPLC A COMPUILOR METILXANTINICI 99
MATERIAL I METOD 100
CONDIIILE CROMATOGRAFICE 100
REZULTATELE METODEI 100
DISCUIA REZULTATELOR 104
CONCLUZII 107
CAPITOLUL VIII
ANALIZA RMN A COMPUILOR METILXANTINICI 109
Compusul C1 110
Compusul C2 118
Compusul C3 124
Compusul C4 130
Compusul C5 136
Compusul C6 139
Compusul C7 143
4

Compusul C8 148
CONCLUZII 153
CAPITOLUL IX
VALIDAREA UNOR METODE HPLC PENTRU COMPUII 157
METILXANTINICI C5 I C8
PARAMETRII DETERMINAI PRINCIPII TEORETICE 157
COMPATIBILITATEA SISTEMULUI 157
SPECIFICITATEA METODEI 157
ACURATEEA METODEI 158
LINIARITATEA 158
VALIDAREA METODEI DIN MATRICE FARMACEUTIC 158
PRECIZIE - REPETABILITATE 158
LIMITA DE DETECIE I DE CUANTIFICARE 159
DEPISTAREA VALORILOR ABERANTE - TEST DIXON 159
COMPUSUL C5 159
DESCRIEREA METODEI 159
REZULTATE PARAMETRI DETERMINAI 159
ACURATETEA METODEI 162
LINIARITATEA 163
VALIDAREA METODEI DIN MATRICE 167
FARMACEUTIC
CONCLUZII 172
COMPUSUL C8 172
DESCRIEREA METODEI 172
LINIARITATEA 176
VALIDAREA METODEI DIN MATRICE 182
FARMACEUTIC
CONCLUZII 186
CAPITOLUL X
DETERMINAREA COMPUSULUI C4 DINTR-O MATRICE 187
FARMACEUTIC
STABILIREA CONDIIILOR DE ANALIZ HPLC A COMPUSULUI C4 187
LINIARITATEA 190
VALIDAREA METODEI DIN MATRICE FARMACEUTIC 192
CONCLUZII 197
CAPITOLUL XI
METODA SPECTROMETRIC UV-VIS PENTRU DETERMINAREA 199
COMPUSULUI C3
ROBUSTEEA 200
5

LINIARITATEA 202
PRECIZIA METODEI 205
EXACTITATEA METODEI 206
TESTUL COCHRAN Q 207
CONCLUZII 208
CONCLUZII GENERALE 209
BIBLIOGRAFIE 213
LISTA LUCRRILOR TIINIFICE PROPRII 225
6

MOTIVAREA ALEGERII SUBIECTULUI TEZEI I OBIECTIVELE PROPUSE
Metilxantinele ocup un rol important i promitor n schemele terapeutice actuale. Se cunosc aciunile
farmacologice ale cofeinei, teobrominei i teofilinei. Pe plan global, la aceti compui s-au adugat noi derivai cu
structura de baz xantinic, sintetizarea lor cunoscnd n ultimii ani un trend ascendent.
Capitolul I face o trecere n revist a datelor analitice asupra cofeinei, teobrominei i teofilinei, care
reprezint modelul metilxantinelor naturale i de sintez, precum i cel al substanelor analizate de noi.
Capitolul II prezint proprietile farmacologice ale cofeinei, teobrominei i teofilinei, insistnd asupra
celor mai importante dintre ele. Referindu-ne la cofein am scos n eviden aciunea de stimulare a cortexului, cea
de stimulare al centrilor respirator i a miocardului, a diurezei, a secreiei gastrice i a metabolismului bazal.
Teobromina se caracterizeaz prin cteva aciuni specifice structurii sale (aciunea bronhodilatatoare i cea
diuretic). Pentru metilxantinele prezentate am evideniat cteva noi aciuni precum cea antioxidant i
anticanceroas.
Proprietile fizico-chimice ale metilxantinelor cunoscute i prezentate, au constituit ghidul pentru elaborarea
metodelor de analiz ale noilor compui metilxantinici investigai.
Capitolul III prezint, pentru metilxantinele naturale, metodele instrumentale care au dus la elucidarea
structurii formelor polimorfe, la identificarea i cuantificarea lor. S-au evideniat metodele spectrometrice (UV-
VIS, IR, RMN), metodele cromatografice (CSS, HPLC), metodele termice (TA, DSC), difracia razelor X i
metodele cuplate utilizate.
Pentru fiecare metod au fost detaliate anumite aspecte analitice care au fost de folos n desfurarea cercetrilor
din cadrul tezei.
Pornind de la o serie de opt compui, metilxantine nou sintetizate n laborator i puse la dispoziie cu
amabilitate de ctre Prof. Univ. Dr. Lenua Profire, din cadrul Disciplinei de Chimie Farmaceutic, Facultatea de
Farmacie, U.M.F. Gr. T. Popa Iai, am iniiat un studiu analitic asupra caracteristicilor lor fzico-chimice.
n acest scop au fost urmrite o serie de obiective:
1. Stabilirea unor metode cromatografice simple pentru identificarea compuilor xantinici. Evaluarea
comportamentului spectral n UV al xantinelor, stabilirea i validarea unor metode spectrale de evaluare
cantitativ.
2. Efectuarea unui studiu cromatografic HPLC pentru identificarea i evaluarea acestor compui i a
produilor de degradare. Metodele HPLC au fost validate pentru aplicarea lor n evaluarea cantitativ din
matrici sintetice i biologice.
3. Efectuarea unui studiu spectral n IR pentru elucidarea structurilor sintetizate i pentru urmrirea
structural a compuilor rezultai n urma unor degradri.
4. Elucidarea structurii metilxantinelor printr-un studiu de tip 1H-RMN i 13C-RMN.
5. Validarea unei metode de analiz HPLC pentru una din cele opt metilxantine.
6. Determinarea unui compus metilxantinic dintr-o matrice farmaceutic.
7

CONTRIBUII PROPRII
CAPITOLUL IV: ANALIZA CROMATOGRAFIC A COMPUILOR XANTINICI
Metilxantinele analizate au fost:
COMPUSUL C1, P1 CH3

N
7-[2-hidroxy)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-1,3- O
N
dimetilxantina H3C N
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C2, P2 CH3

N
7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- O
N
H3C N
bromo-1,3-dimetilxanthina Br
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C3, P3 CH3

N
N
H3C N
nitro-1,3-dimetilxantina NO2
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C4, P4 CH3

N
N
H3C N
(imidazol-1-il)-1,3-dimetilxantina N N
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C5, P5 CH3

N
N
H3C N
(piperidin-1-il)-1,3-dimetilxantina N
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C6, P6 CH3

N
7-[2-hidroxiy)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8- O
N
H3C N
(morfolin-4-il)-1,3-dimetilxantina N O
N
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
COMPUSUL C7, P7 CH3

N O
7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3- O
N
H3C N
metil-5-oxo-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina N
N N CH3
H
O H2C N
CH3
CH CH2
HO O O
8

COMPUSUL C 8, P8
7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-
dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina
IV.1. Analiza pe strat subire

S-a efectuat analiza cromatografic pe strat subire a celor opt compui cu un Automatic TLC Sampler III ATS3
CAMAG. Suport cromatografic folosit: Plci de aluminiu cu silicagel F 254. Vizualizare: UV: 254, 274, 277 nm.
Sistem de solveni:
Nr. Sisteme developare Nr. Sisteme developare
1 Acetat de etil-metanol 27: 30 5 Cloroform-etanol-acid formic 88:10:2
2 Cloroform-etanol tamponat la pH 1.8) 9:1 6 Cloroform-diclormetan-isopropanol 4:2:1
3 Aceton-cloroform-n-butanol-:amoniac 3:3:4:1 7 Diclormetan-etanol (bac saturat cu 90:5
soluie de hidroxid de amoniu 30%)
4 Benzen-aceton 3:7 8 Acid acetic-isopropanol-toluen 1:12:6
Valorile Rf calculate n trei sisteme cromatomatografice pentru cei 8 compui sunt nscrise n sinteza tabelelor
IV.1-8.
Tabelele IV.1-8. Valorile Rf pentru C1-8.
Proba Sistem solveni Rf x 100 Proba Sistem solveni Rf x 100
1 50 1 50
1 5 48 5 5 45
8 35 8 40
1 60 1 60
2 5 49 6 5 50
8 47 8 40
1 70 1 45
3 5 60 7 5 40
8 40 8 35
1 55 1 65
4 5 50 8 5 45
8 39 8 40
IV.2. Determinarea densitometric compuilor C3 i C8
S-au analizat densitometric compuii C3 i C8 n UV. S-au utilizat: Plci TLC de sticl acoperite cu silicagel GF
254 (Merck); Sistemul de developare 1; Soluiile compuilor 3, i 8 ce conin 100-500 g/ml; Micropipete seringi;
Aparat: Densitometru CD-60; software ProQuant. Determinarea s-a efectuat msurnd absorbana prin reflecie la
250 nm.
Fig.IV.26. Curba de calibrare densitometric a C3. Fig.IV.28. Curba de calibrare densitometric a C8.
9

CAPITOLUL V.
ANALIZA SPECTRAL N UV A DERIVAILOR METILXANTINICI
Probele au fost analizate cu ajutorul unui spectrofotometru Agilent 8453 monfascicul, utilizndu-se
metanol ca i solvent de comparaie. Spectrofotometrul Agilent UV-VIS a fost folosit pentru nregistrarea
spectrelor i pentru aplicarea tehnicilor de derivatizare. Derivata de ordin 1 s-a aplicat pentru identificarea
maximele de absorbie.
Rezultate. Spectrele de absorbie n UV ale compuilor C1(P1) - C8 (P8):

2
P1 P2 P3
2 2
Absorbance (AU)
Absorbance (AU)
Absorbance (AU)
0 0 0
200 250 300 350 175 200 225 250 275 300 325 350 175 200 225 250 275 300 325 350
2
Wavelength (nm) Wavelength (nm) 2
Wavelength (nm)
P4 2 P5 P6
Absorbance (AU)
Absorbance (AU)
Absorbance (AU)
0 0 0
175 200 225 250 275 300 325 350 175 200 225 250 275 300 325 350 175 200 225 250 275 300 325 350
Wavelength (nm) Wavelength (nm) Wavelength (nm)
4 4
P7
P8
Absorbance (AU)
Absorbance (AU)
2 2
0 0
175 200 225 250 275 300 325 350 175 200 225 250 275 300 325 350
Wavelength (nm) Wavelength (nm)
Fig. V.1.b Spectrele de absorbie n UV ale compuilor C1(P1) - C8 (P8).
Spectrul de absorbie i spectrul derivat de ordinul 1pentru cei 8 compui este prezentat n figurile V.2-9.
Fig.V.2. Spectrul de absorbie (a) i spectrul derivat de ordinul unu (b) pentru P1.
Fig.V.3. Spectrul de absorbie (a) i spectrul derivat de ordinul 1(b) pentru P2.
10

Fig.V.5. Spectrul de absorbie (a) i spectrul derivat de ordinul 1 (b) pentru P4.
11

Fig.V.9. Spectrul de absorbie (a) i spectrul derivat de ordin 1 (b) pentru P8.
Concluzii
1. Identificarea derivailor xantinici s-a realizat pe baza capacitii de absorbie n UV a acestor compui datorit
prezenei gruprilor cromofore de pe nucleu.
2. Spectrele de absorbie au prezentat similariti datorit structurii apropiate, derivaii fiind doar difereniai prin
prezena anumitor nuclee i grupri n poziia 7 la inelul purinic.
3. Derivata spectral de ordinul unu a dus la scderea n intensitate a maximelor de asborbie, i a permis
evidenierea mai clar a maximelor, reuindu-se prin aceast tehnic creterea specificitii spectrale a metodelor de
identificare i cuantificare.
4. Datele spectrale obinute pot fi folosite la elaborarea i validarea unei metode de analiz calitativ i cantitativ a
substanelor sintetizate i din matrici farmaceutice i biologice.
CAPITOLUL VI.
ANALIZA IR A COMPUILOR METILXANTINICI
Material i metod
Analizele IR au fost efectuate folosind un spectrofotometru Tensor 27 Opitcs FT-IR Bruker, Germania, domeniu
spectral de 7500-370 cm-1, separator de fascicule, rezoluie <1 cm-1, precizia numerelor de und < 0,01 cm-1,
precizie fotometric < 0,1% T, semnal zgomot (minim) - 5 sec > 6000, rezoluia 4 cm-1, interferometru aliniat
permanent, viteza de scanare - 3 viteze, 2.2 - 20 KHz i detector - DATGS.
Rezultate
Fig.VI.2. Spectrul IR al compusului 1.

974.20
825.03
802.42
772.19
761.63
747.95
668.21
3270.11
1689.66
1652.53
1545.43
1507.45
1448.07
1409.33
1372.60
1268.95
1226.34
1110.53
1064.33
1044.77
1025.95
Legtura C-O de ntindere a gruprii de alcool teriar

este evideniat n toate spectrele prin absorbie la 1170
0.25
cm-1, n timp ce benzile de absorbie observate n

0.20
regiunea 1410-1310 cm-1, aparin legturii O - H.

Absorbance
0.15
Gruparea funcional eteric este evideniat n toate

spectrele prin absorbie n regiunea 1140-1070 cm-1.
0.10
Banda larg, observat n toi compuii, cu excepia

0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

probei P6, din regiunea 3200-3300 cm-1 este, de obicei,
Wavenumber (cm-1)
atribuit unei legturi O-H de ntindere.
G:\BOGDAN\xantine\proba 1.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010
Page 1/1
12

978.73
916.71
871.67
837.14
810.27
762.19
746.77
3281.55
3131.31
3066.48
2951.23
2870.72
1704.34
1653.38
1604.19
1542.19
1507.64
1454.06
1407.04
1359.55
1314.52
1279.98
1237.08
1213.22
1117.57
1043.89
Prezena atomului de brom n molecula compusului 2

0.30
(P2) d natere diverse tipuri de vibraii (700-600 cm-1

0.25
pentru legtura alifatic C-Br de ntindere sau 1500-

Absorbance
0.15 0.20
1000 cm-1 pentru legtura aromatic C-Br de intindere).

0.10
0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumber (cm-1)
Page 1/1
975.28
925.64
824.95
802.20
784.56
772.15
762.56
741.25
666.98
3117.53
2600.02
1690.41
1653.22
1545.21
1507.20
1479.98
1442.76
1409.65
1372.60
1312.92
1283.29
1237.79
1224.63
1186.34
1110.35
1044.31
1025.30
Proba P3 prezint o band de absorbie la 1181 cm-1,

0.30
0.25
atribuit, n general pentru legtura de ntinde simetric a

gruprii NO2 din compuii organici. Gruparea nitro arat
0.20
Absorbance
dou benzi de absorbie de la 1566 i 1315 cm-1,

0.15
atribuite vibraiilor de ntindere asimetrice i simetrice =

0.10
C-NO2.
0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumber (cm-1)
Page 1/1
960.33
889.61
839.79
822.50
807.64
747.71
735.38
680.98
3325.16
1697.53
1655.81
1604.77
1546.74
1509.31
1441.43
1406.01
1336.88
1299.05
1261.71
1244.97
1216.79
1201.75
1074.38
1035.97
1002.33

0.35
Proba P4 ar trebui s afieze benzile de absorbie

0.30
caracteristice legturii C = N de ntindere care apar de

0.15 0.20 0.25
obicei n regiunea IR 1655-1640 cm-1.

Absorbance
Din moment ce aceast vibraie se produce deja pentru

toi compuii analizai din cauza prezenei gruprii
0.10
amidice din molecula-mam, benzi de absorbie noi nu

0.05
se observ n spectrul IR nregistrat la proba P4. Totui,

absorbii de intensitate medie se observ la 1256 cm-1.
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumber (cm-1)
G:\BOGDAN\xantine\proba 4.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010 Aceast band este atribuit, n general vibraiilor
Page 1/1 legturii C-N de ntindere din compuii amidici.
979.38
914.70
873.77
834.51
807.94
793.77
771.39
757.91
743.15
664.43
3282.94
2930.59
1979.18
1705.51
1652.88
1602.73
1544.18
1508.06
1457.43
1428.37
1405.25
1358.48
1335.18
1313.52
1299.58
1275.03
1239.37
1213.48
1188.35
1170.75
1121.09
1111.27
1041.99
1005.19

0.30
Compusul 5 prezint n structura sa un nucleu

0.25
piperidinic care i las amprenta prin vibraiile de la

0.20
3263 (s); 2790 (s), 2730 (s), 2675 (m), 2635 (w); 1600-
Absorbance
1575 (w); IV, 817 (m), 735 (s) cm -1.

0.15 0.10
0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumber (cm-1)
Page 1/1
13

979.49
931.06
901.21
845.64
789.42
749.96
721.11
702.19
686.29
673.32
3098.93
2845.23
1690.23
1653.29
1616.69
1569.40
1516.67
1456.90
1403.86
1382.41
1347.96
1313.12
1276.74
1260.99
1218.89
1119.38
1110.65
1068.29
1047.17
1005.40
Spectrul IR nregistrat pentru proba P6 afieaz o banda
de absorbie nou la 1110 cm-1, de obicei, atribuit
0.25
legturii O-C de ntindere din compuii cu oxigen n

0.20
molecul (altele dect acizii carboxilici, esteri, cetone

Absorbance
0.15
anhidridele, etc), cum ar fi nucleul morfolinic. De

0.10
asemenea, benzile IR observate n regiunea 3200-2800

cm-1 sunt caracteristice nucleului morfolinic.
0.05
Mai mult dect att acest spectru prezinta doua benzi

slabe de absorbie la 901 cm-1 i 1220 cm-1, care au fost
3500 3000 2500 2000 1500 1000
Wavenumber (cm-1)
G:\BOGDAN\xantine\proba 6.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010 anterior atribuite inelelelor epoxidice sau oxiranice.
Page 1/1
981.48
916.78
875.88
836.22
810.04
794.64
760.09
745.37
666.95
3284.69
1707.11
1654.55
1604.63
1545.99
1509.96
1453.24
1407.42
1360.92
1336.85
1315.73
1282.21
1241.29
1215.34
1172.77
1123.09
1113.28
1043.88 In spectrul IR al compusului 7, P7 apar toate benzile de
0.30
absorbie caracteristice compusului, care a constituit

0.25
baza sintezelor celolali derivai metilxantinici.

Nucleul metilpirazolonic din structura compusului 7 i
0.20
Absorbance
las amprenta prin maximele caracteristice acestui

0.15
nucleu i apreciate a fi la 3127, 1597, 1525, 1498, 1454

0.10
cm-1.
0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumber (cm-1)
Page 1/1

979.67
915.05
874.02
834.04
808.52
792.77
758.26
743.93
3279.32
1700.80
1652.75
1602.68
1540.87
1508.01
1451.05
1410.26
1359.01
1334.81
1313.53
1299.73
1279.94
1239.18
1213.42
1171.04
1121.28
1042.05
Ca i n cazul compusului 7, derivatul P8 nscrie n

0.35
structura sa vibraiile de valen ale dimetilpirazolului,

0.30
substituentul din poziia 8 al nucleului xantinic ce sunt

0.15 0.20 0.25
situate la: 3500, 2200, 1610 1575, 1550, 1520, 1400,

Absorbance
1040 cm-1.
0.10
0.05
3500 3000 2500 2000 1500 1000

Wavenumber (cm-1)
Page 1/1
CAPITOLUL VII: ANALIZA HPLC A COMPUILOR METILXANTINICI

Material i metod. Determinrile cromatografice au fost efectuate pe un sistem HPLC, Surveyor Plus (Thermo -
Fisher Scientific, SUA) echipat cu Surveyor LC - Pompa, 400 Barr presiune maxim, un Autosampler i un
detector cu grup de fotodiode PDA cu 650 fotodiode sensibile. Software-ul ChromQuest a permis nregistrarea
fiecrui test cromatografic, dezvoltarea sensibilitii metodei on-line a fiecrui maxim de absorbie a componentei
analizate. S-a utilizat o faz staionar Phenomenex Inc. Au fost folosite coloane octadecilsilil C18 cu 250 mm
lungime, 4,6 mm diametru interior (SUA).
Rezultate
Prezena gruprilor hidroxipropoxi, fenil, acetamid pe molecul precum i pe ali substitueni de pe fiecare
compus analizat, a permis apariia unor abateri de maxime de absorbie n mediile pariale apoase ale fazei mobile
utilizate n determinri. Caracteristicile spectrale sunt nscrise n tabelul VII.1.
Tabel VII.1
Spectrele moleculare ale celor opt derivai metilxantinici
Comp. max max max max max max Comp. max max max max max max
P1 210 249 341 - P5 212 230 244 270 277 -
P2 211 230 245 270 277 - P6 221 260 297 -
14

P3 208 - 250 322 - - P7 213 229 244 270 276 345
P4 210 227 244 269 279 - P8 213 230 244 270 276 -
Identificarea fiecrui compus a fost efectuat cu ajutorul lungimii de und de 254 nm, drept canal discret al
detectorului PDA (Photodiode Aray). Cromatogramele pentru fiecare compus analizat sunt prezentate n figurile
VII.1-8.
Fig.VII.1. Cromatograma compusului C1. Fig.VII.2. Cromatograma compusului C2.
pda-254nm
P1-V8
600 600 800 pda-254nm 800
Retention Time
Name P2-V8
Retention Time
Name
500 500
600 600
400 400
mAU
mAU
400 400
mAU
mAU
300 300
200 200
200 200
2.958
2.693
4.608
5.943 p2
4.972
3.033
100 100
4.792
3.398
2.570
4.065 P1
0 0
0 0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Minutes
Minutes

pda-254nm pda-254nm
500 500
P3-V8 P4-V8
800 800
Retention Time Retention Time
Name Name
400 400
600 600
300 300
mAU
mAU
mAU
mAU
400 400
200 200
3.047
200 200
100 100
3.012
4.182 P3
5.430 P4
2.823
3.460
4.965
2.578
5.288
2.575
0 0 0 0
1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 3.5 4.0 4.5 5.0 5.5 6.0 6.5 7.0 7.5 8.0
Minutes Minutes

600 pda-254nm 600 pda-254nm
P5-V8 125 P6-V8 125
Retention Time Retention Time
Name Name
100 100
400 400
75 75
mAU
mAU
mAU
mAU
50 50
200 200
25 25
7.692 P5
4.488 P4
0 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes Minutes

pda-254nm pda-254nm
P7-V8 P8-V8
600 Retention Time 600 Retention Time
500 500
Name Name
400 400
400 400
300 300
mAU
mAU
mAU
mAU
200 200
200 200
100 100
7.890 P8
8.067 P7
0 0 0 0
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Minutes Minutes
15

Parametrii pentru caracterizarea calitii separrii ca, timpul de retenie, eficiena separrii, nalimea,
asimetria, picul i factorul de puritate sunt prezentate n tabelul VII.2.
Tabel VII.2.
Timpul de retenie, asimetria, talerele teoretice, nlimea, capacitatea picului, factorul de puritate
Proba
P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
Parameteri
Timp retenie 4.065 5.943 4.182 5.430 7.692 4.488 8.067 7.89
Asimetria 1.150 1.106 1.147 1.102 1.078 1.136 1.087 1.080
Talere teoretice 10193 10490 10070 10927 10796 12222 10723 10923
Inlimea 599135 777976 823126 494162 585562 124925 632307 555200
Picul 19.32 20.71 19.9 26.15 37.45 21.44 39.33 38.45
Factor de puritate 0.975 0.951 0.951 0.98 0.973 0.997 0.968 0.97
Bazat pe valoarea pKa de 7.7 a xantinelor i pe coeficientul de partiie (Poct) de -0.69 la pH-7.416, au fost
calculai coeficienii de partiie (Poct) pentru fiecare derivat cu ajutorul unui software ACD/Lab PubChem Log, n
scopul de a stabili diferenele din structurile parametrilor fizico-chimici. Valorile prezise pentru Poct ul fiecrui
compus sunt prezentate n tabelul VII.3.
Tabel VII.3.
Valorile prezise Poct utiliznd software-ul ACD/ Lab PubChem
Proba P1 P2 P3 P4 P5 P6 P7 P8
Parameteri
0.44 1.85 -0.29 1.07 1.23 -0.32 -0.48 -0.09
Poct
0.46 0.93 0.87 0.97 0.93 0.95 1.02 0.98
Aceste valori arat unele diferene minore pentru polaritatea acestor compui, n raport cu xantina, care a
avut o valoare de -0.69. Prezena gruprilor hidroxipropoxi, fenil, i acetamid a crescut aciditatea compuilor,
astfel nct, n medii pariale apoase, acetia au artat capacitate de ionizare. Avnd n vedere aceste proprieti
fizico-chimice, au fost luate n considerare trei medii de pH n dezvoltarea metodei (2.2, 7.2 i 10 pentru soluia
tampon).
De asemenea, pentru metoda gradientului a fost folosit o faz mobil ce const dintr-un amestec binar de
soluie tampon pH-7.2 i metanol i trei alternative n ceea ce privete programul de eluie. Avnd n vedere
condiiile cromatografice, atunci cnd procentul de metanol a crescut, valoarea pantei a fost pozitiv (4), Atunci
cnd coninutul de metanol a sczut n aceleai condiii, valoarea pantei a fost negativ (-4). n caz contrar, n eluia
izocratic, panta are valoarea de 0.
S-a folosit ulterior un design central composite experiment pentru a investiga efectele pH-ului pe o
metod izocratic (X1) precum i procedeul eluiei n gradient, cu variaia liniar a compoziiei metanolului (X2)
pentru rspunsurile considerate n procesul de separare (tabelul VII.4).
n scopul de a estima rspunsurile Y, care sunt rezultatul interaciunii a trei parametri inclui n
monitorizarea de evaluare cromatografic (factor de rezoluie YRs , talerele teoretice, YTp i asimetria YT) s-a aplicat
o analiz matematica de tip regresie multipl. n selecia variabil au fost considerai parametrii care ating pragul
de semnificaie (p < 0,1). Valorile sunt prezentate n tabelul VII.4.
Tabel VII.4
Parametrii de calitate ai metodei cromatografice n proiectarea factorial complet cu 2 factori, 3 niveluri i 9
determinri unice.
Bloc Factorii codai Nivelul Rspunsuri
factorilor
X1 X2 X1 X2 Rs T Tp
1 1.00000 -1.00000 10 -4 0.256 0.857 5626
1 -1.00000 1.00000 2.2 4 0.634 1.257 7256
3 -1.00000 -1.00000 2.2 -4 0.542 0.757 4566
2 0.00000 0.00000 7.2 0 3.244 1.104 10760
2 1.00000 1.00000 10 4 0.326 1.024 4265
3 -1.00000 0.00000 2.2 0 0.113 1.165 8832.5
2 1.00000 0.00000 10 0 1.385 1.145 4075.5
16

1 0.00000 1.00000 2.2 4 0.457 1.123 5721
3 0.00000 -1.00000 7.2 -4 0.866 0.724 6895
n scopul de a evalua predictibilitatea modelului, a fost efectuat o analiz a varianei, ANOVA (p< 0,1).
Sinteza valorilor pentru coeficienii polinomiali n conformitate cu ecuaia (1) este prezentat n tabelul VII.5.
Tabel VII.5.
Coeficienii modelului de rspuns statistic obinui prin analiza ANOVA
Tp T Rs
Efect St. Err p Efect St. Err p Efect St. Err p
b0 1.02 0.01 0.00 6444.11 848.56 0.02 0.87 0.06 0.00
b1 -0.11 0.07 0.24 -2236.83 4647.8 -0.48 -2.98 0.32 0.01
b2 -0.07 0.06 0.35 -3249.67 3600.15 0.46 -1.81 0.25 0.02
b11 -0.05 0.03 0.21 2021.83 1800.07 0.38 0.98 0.13 0.02
b12 0.30 0.05 0.03 -1066.75 3117.82 0.76 -1.57 0.22 0.02
b22 0.25 0.04 0.02 2314.96 2381.27 0.43 0.25 0.17 0.28
Rezultatul arat c datele au o bun compatibilitate cu ecuaiile de gradul al doilea pentru factorul de
rezoluie i asimetria cromatografic, parametrii care sunt direct afectai de performana general a metodei.
CAPITOLUL VIII: ANALIZA RMN A COMPUILOR METILXANTINICI

Material i metod.
Spectrometru Bruker Avance DRX 400 NMR
Spectrometru Bruker RMN Avance DRX 400. Cryo-magnet. 500 MHz. 11,70 Tesla. Calculator. Monitor.
Accesorii. Consola de control. Cryo-Diffusion, vas Dewar L 2025. -500 - filtru, capete de msurare. Software-ul.
Accesorii.
Solvent : DMSO.
Determinrile efectuate: 1H-RMN (Spectroscopia de Rezonan Magnetic Nuclear de Protoni), 13C-RMN
(Spectroscopia de Rezonan Magnetic Nuclear de Carbon), COSY (Correlated Spectroscopy) i DEPT
(Distortionless Enhancement by Polarization Transfer - o metod 13C-RMN).
Rezultate
COMPUSUL C1 (P1).
n tabelul VIII.1. sunt prezentate semnalele caracteristice spectrului 1HRMN i 13C-RMN nregistrate la o frecven
de 400 MHz.
Tabel VIII.1.
Maximele de absorbie identificate la pentru compusul 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)fenoxi]-propil-1,3-dimetil-xantina.
Deplasare () (ppm) Atribuire Deplasare () (ppm) Atribuire Deplasare () (ppm) Atribuire
13
1
H-NMR C-NMR
2.09 s, 3.09, 3H 23.8 C28 143.33 C8
2.5 s 27.7 - 147.87 C4
3.4 d,7.11, 6H 29.7 - 150.97 C26
3.571 d,5.49, 6H 39.51 m,C13, C17 154.49 C2
3.908 m,2.28, 2H 49.5 s, C12 167.75 C1
4.243 m,2.13, 2H 67.58 s, C10
4.502 m,1.05, 1H 70.16 s,C14
5.537 s,0.71, 1H 106.64 -
6.867 d,2.05, 2H 114.47 C22
7.482 d,2.03, 2H 120.42 C21-C23
8.007 s,1.50, 2H 132.76 C20-C24
9.7 s,1.00, 1H 140.6 C19
Spectrele de tip RMN pentru compusul 1 sunt prezentate n figurile VIII.1, 4 i 5.
17

Fig.VIII.1. Spectrul 1H-RMN (0.0-10,5 ppm).
Fig.VIII.4. Spectrul DEPT-RMN (10-190

ppm).
Fig.VIII.5. Spectrul 13C-RMN (10-190 ppm).
18

COMPUSUL C2 (P2)
Din perspectiva semnalelor caracteristice spectrului RMN, distribuia este prezentat n tabelele VIII.2 i VIII.3.
Tabel VIII.2 Deplasare chimic, caracteristicile semnalului, atribuirea atomilor din structur ale compusului C2.
Nr. Crt. Deplasare chimic () (ppm) Caracteristici semnal Atribuire
1. 2.01 S, 2.97, 3H C29
2. 2.52 S C26
3. 3.37 D, 5.89, 6H -
4. 3.45 D, 7.63, 6H C10, C12
5. 3.91 T, 2.05, 2H C18
6. 4.26 T, 1.84, 2H C14
7. 4.4 d, 0.95, 1H C15
8. 5.46 S, 0.88, 1H C16
9. 6.89 D, 1.99, 2H C21, C22
10. 7.45 D, 1.97, 2H C24, C25
11. 9.77 S, 1.00, 1H -
Tabel VIII.3 Caracteristicile spectrale determinate DEPT ale compusului C2
Nr. Crt Deplasare chimic () (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT*
1 23.8 S C28 +
2 27.7 S C12 +
3 29.7 D C10 +
4 49.5 S C13 -
5 67.58 S C14 +
6 70.16 S C17 -
7 106.3 - -
8 106.64 S C22
9 114.47 S C21, C23 +
10 120.42 S C20, C24 +
11 132.76 S C19
12 140.6 D C6 +
13 147.87 S C4
14 148.33 S C8
15 150.97 S C26
16 154.49 S C2
17 167.75 S C9
* + - semnal pozitiv caracteristic gruprilor metil, metin sau asociat cu un element electronegativ
* - - semnal negativ caracteristic gruprilor metilen.
COMPUSUL C3 (P3)
Din perspectiva semnalelor caracteristice spectrului RMN, distribuia este prezentat n tabelele VIII.4 i VIII.5.
Tabel VIII.4. Caracteristicile spectrale 1H-RMN ale compusului C3
Nr. Crt. Deplasare chimica () (ppm) Caractestici semnal Atribuire
1. 1.1 d, 1H, OH -
2. 2.01 s, 3.03, 3H C31
3. 2.5 s -NH
4. 3.238 d, 5.27, 5H -
5. 3.483 d, 5.49, 5H C10, C12
6. 3.922 m, 2.11, 2H C20
7. 4.224 m, 2.03, 2H C15
8. 4.5 m, 1.01, 1H C16
19

9. 5.5 s, 0.55, 1H O17
10. 6.844 d, 2.05, 2H C24, C26
11. 7.459 d, 2.02, 2H C23, C27
12. 8.008 d, 1.54, 2H - punte de hidrogen
13. 9.775 s, 1.00, 1H -
Tabel VIII.5. Caracteristicile spectrale DEPT pentru 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-nitro-1,3-dimetil-xantina
(compusul C3)
1 23.81 s C31 +
2 27.7 s C12 +
3 29.69 d C10 +
4 39.51 s
5 49.5 s C15 -
6 56.05 s
7 67.59 - C16 +
8 70.16 s C20 -
9 106.11 s C22
10 106.48 s C25
11 114.46 s C24, C26 +
12 120.42 s C23, C27 +
13 132.77 s C6
14 140.47 s C4 +
15 148.32 s C8 +
16 151.18 s C29
17 154.41 s C2
18 167.75 s C9
* + - semnal pozitiv caracteristic gruprilor metil, metin sau asociat cu un element electronegativ
* - - semnal negativ caracteristic gruprilor metilen.
COMPUSUL C4, (P4)

Semnalele caracteristice spectrului 1HRMN i 13C-RMN pentru compusul C4 sunt prezentate n tabelele VIII.6 i
VIII.7.
Tabel VIII.6. Caracteristicile spectrale 1H-RMN ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3-
dimetil-xantina (compusul 4).
Nr. Deplasare chimic () (ppm) Caractestici semnal Atribuire
Crt.
1. 2.01 s, 3, CH3 C33
2. 2.5 - -NH
3. 3.31 d, 3.53, 4H C18, C22
4. 3.37 d, 6.37, 6H C10, C12
5. 4.229 q, 1.00, 1H C19
6. 4.406 m, 1.99, 2H C16, 17
7. 4.527 t, 1.02, 1H C14
8 5.852 s, 0.97, 1H OH (20)
9. 6.906 d, 2.02, 2H 25, 29
10. 7.522 d, 2.00, 2H 26, 28
11. 9.917 s, 1.00, 1H
20

Tabel VIII.7. Caracteristicile spectrale 13C-RMN ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3-
dimetil-xantina(compusul C4).
1 23.8 s C33 +
2 27.31 s C17 +
3 27.84 d C12 +
4 29.75 s C10 +
5 29.78 s C16 +
6 44.87 s C18 -
7 68.05 s C22 -
8 87.26 s C14 +
9 114.73 s C25, C29 +
10 120.39 s C26, C28 +
11 133.3 s C6
12 150.8 s C4
13 152.9 s C8
14 153.54 s C2
15 156.32 s C31
16 161.6 s -
17 167.82 s C9
18 174.45 s -
COMPUSUL C5 (P5)
VIII.9.
Tabel VIII.8 Caracteristicile spectrale 1H-RMN pentru 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(piperidin-1-il)-1,3-
dimetil-xantina (compusul 5)
Nr. Crt. Deplasare chimic () (ppm) Caractestici semnal Atribuire
1. 2.009 s,3.10, 3H C34
2. 2.5 s -NH
3. 3.39 d, 10.21, 10H 5CH2
4. 3.959 s, 2.14, 2H C23
5. 4.2 d, 3.22, 3H C10
6. 5.47 s, 0.97, 1H OH
7. 6.821 s, 2.07, 2H C26, C30
8. 7.463 s, 2.07, 2H C27, C29
9. 9.771 s, 1.00, 1H
Tabel VIII.9. Caracteristicile spectrale 13C-RMN ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(piperidin-1-il)-1,3-
dimetil-xantina (compusul 5).
Nr. Crt Deplasare chimic () (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT
1 23.81 s C34 +
2 27.62 s C12 +
3 29.48 d C10 +
4 39.5 s C14
5 50.18 s C19 -
6 67.61 s C20 +
7 70.16 s C23 -
8 108.4 s C25
9 114.37 s C26, C30 +
10 129.03 s C27, C29 +
21

11 132.75 s C6
12 147.7 s C4
13 150.58 s C8
14 153.47 s C2
15 153.99 s C32
16 167.75 s C9
COMPUSUL C6 (P6)
VIII.11.
Tabel VIII.10. Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(morfolin-4-il)-1,3-dimetil-
xantina (compusul 6).
1. 2.5 s -NH (31)
2. 3.2 s, 3.20, 3H C34
3. 3.363 s, 7.74, 6H C22, C20
4. 3.479 t, 4.40, 4H C16, C6
5. 3.680 t, 4.33, 4H C3, C23
Tabel VIII.11.
Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(morfolin-4-il)-1,3-dimetil-xantina (compusul 6).
Nr. Crt, Deplasare chimic () (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT
1 27.48 s C16 -
2 29.53 s C4 -
3 39.5 s C7
4 40.13 s C32
5 45.73 s C22 +
6 65.36 s C20 +
7 102.28 s C25
8 148.61 s C14
9 151.16 s C9
10 152.69 s C12
11 154.64 s C34
12 174.45 s C10
COMPUSUL C7 (P7)
Semnalele caracteristice spectrului 13C-RMN pentru compusul C7 este prezentat n tabelul VIII.12.
Tabel VIII.12
Caracteristicile spectrale ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3-metil-5-oxo-pirazol-1-il)-1,3-dimetil-xantina (
compusul 7)
Nr. Crt Deplasare chimic () (ppm) Caracteristici Atribuire Prezenta DEPT
1 23.8 s C35 +
2 27.73 s C15 +
3 29.46 s C23 +
4 39.5 s -
5 50.18 s C17 -
6 67.61 s C18 +
7 70.16 - C24 -
8 108.38 s C3
9 109.15 s C26
10 114.37 s C27, C31 +
11 120.35 s C28, C30 +
12 124.35 s C29
22

13 129.01 s -
14 132.75 s C6
15 147.67 s -
16 147.81 s C13
17 150.56 s C5
18 150.8 s C8
19 153.4 s C9
20 153.99 s C33
21 167.73 s C11
22 174.46 s -
COMPUSUL C8 (P8)
VIII.14.
Tabel VIII.13.
Datele spectrale 1H-RMN ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetil-xantina.
1 2.01 S, 2.97, 3H C35
2 2.50 s, 1H -NH (32)
3 3.21 d, 5.25, 5H 2CH3 (C23, C21)
4 3.45 d, 7.63, 7H 2CH3 (C15, C16)
5 3.91 m, 3.919, 4H C17, C4
6 4.30 m, 1.86, 2H C24
7 4.40 s, 0.86, 1H C18
8 5.46 s, 0.89, 1H OH (19)
9 6.89 d, 1.99, 2H, C6H4 C27, C31
10 7.45 d, 1.97, 2H, C6H4 C28, C30
11 9.78 s, 1.00, 1H, pirazol C5
Tabel VIII.14
Caracteristici spectrale 13C-RMN ale 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetil-
xantina (compusul 8).
1 18.53 s C16
2 23.79 s C35 +
3 27.12 s C15 +
4 29.8 s C23 +
5 39.5 s -
6 50.71 s C17 -
7 67.6 s C18 +
8 70.16 - C24. -
9 108.4 s C3
10 109.3 s C26
11 114.9 s C27, C31 +
12 120.3 s C28, C30 +
13 124.4 s C29
14 129.01 s
15 132.75 s C6
16 147.7 s -
17 147.87 s C13
18 150.58 s C5
23

19 150.83 s C8
20 153.4 s C9
21 153.99 s C33
22 167.72 s C11
23 174.45 s -
Rezumnd rezultatele acestui capitol, se poate afirma c, pe baza analizelor multiple 1H-RMN, 13C-RMN i a unor
tehnici adecvate, cele opt metilxantine analizate corespund structurilor propuse.
CAPITOLUL IX: VALIDAREA UNOR METODE HPLC PENTRU COMPUII METILXANTINICI C5

I C8
Parametri determinai: - compatibilitatea sistemului, - specificitate, - linearitate, - interval, - exactitate, - precizie,

- limita de detecie i de cuantificare.
COMPUSUL 5, P5
Material i metod. Metoda s-a dezvoltat pe un cromatograf de lichide de nalt performan de tip Agilent, 1100
series echipat cu pomp cu presiune maxim de 400 barri, injector manual, detector DAD (Diode Array Detector)
i degazor. Faza staionar a constat dintr-o coloan cu suport din oel inoxidabil cu lungimea de 150 mm, diametru
intern de 4.0 mm, cu silice modificat pe suprafaa creia s-au grefat grupri octadecilsilil, mrimea particulelor
fiind de 3 m. Faza mobil a constat dintr-un amestec format din soluie acid formic 0,2% i acetonitril n
proporiile 35:65, iar eluia de tip izocratic la un debit de 0.9 ml/min. Temperatura de lucru a fost de 30oC, iar
detecia s-a efectuat la 254 nm. Volumul injectat a fost de 20 l, iar timpul de analiz de 10 minute.
REZULTATE PARAMETRI DETERMINAI
COMPATIBILITATEA SISTEMULUI. Rezultatele sunt nscrise n tabelul IX.1.
Tabel IX.1. Parametrii de determinare a compatibilitii sistemului
Parametru Compusul C5, (P5)
Timp de retenie 5,83
Factorul de capacitate, k 10,6
Rezoluie (Rs) 8,3
Factor de ntindere (T) 1.04
Numr de talere teoretice, N 7426
Puritea picului 0.996
Raport semnal/zgomot de fond (S/N) 625,3
Similaritatea (n raport cu spectrul de referin) 1.000
SPECIFICITATEA METODEI. S-a demonstrat c semnalul caracteristic componentului principal, P5, nu
interfer cu semnale secundare prezente pe cromatogramele prezentate. Figurile IX 1-4 ilustreaz selectivitatea
metodei prin demonstrarea separrii semnalului corespunztor analitului de semnale secundare interferente.
Fig.IX.1. Cromatograma soluie blanc placebo. Fig.IX.2. Cromatograma soluie standard 0,1 mg/ml.
24

Fig.IX.3. Cromatograma soluie standard (0,05 mg/ml). Fig.IX.4. Cromatograma soluie placebo-reconstituit.
ACURATEEA METODEI
Rezultatele sunt nscrise n tabelul IX.3
Tabel IX.3. Ariile, timpii de retenie i abateri determinate.
Proba P5
Nr det. Aria picului Abateri individuale absolute Timp de retenie Abateri individuale absolute
1 641 1.87 5.235 -0.0754
2 645 2.13 5.125 -0.1854
3 643 0.13 5.233 -0.0774
4 642.5 0.37 5.365 0.0546
5 644.1 1.23 5.423 0.1126
6 640.9 1.97 5.425 0.1146
7 642.7 0.17 5.369 0.0586
8 642.6 0.27 5.269 -0.0414
9 642.9 0.03 5.36 0.0496
10 644 1.13 5.3 -0.0104
11 MEDIE 642.87 MEDIA 5.31
12 STDEV 1.29 STDEV 0.10
13 RSD 0.20 RSD 1.80
Datele privind rezultatele determinrilor sunt nscrise n tabelul IX.4.
Tabel IX.4
Rezultatele testului de determinare a acurateei metodei
N Medie Deviaie standard SEM Varianta
INTERVAL
D1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
D2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
ANALIST
A1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
A2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
TOTAL
20 5.5612 0.28473 0.06367 0.08107
INTERACIUNE NTRE GRUPURI
Analist 1/D1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
Analist 1/D2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
Analist 2/D1 0 0 0 0 0
Analist 2/D2 0 0 0 0 0
ANOVA
DF Sum of Squares Mean Square F Value P Value
Interval 0 0 - -7.87E-299 1
Analist 0 0 - -7.87E-299 1
Model 0 1.25801 - -7.87E-299 1
Eroare 18 0.28236 0.01569 - -
TOTAL 18 1.54037 - - -
25

Arie
N Medie Deviatie SEM Varianta
standard
INTERVAL
D1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
D2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
ANALIST
A1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
A2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
TOTAL
20 5.5612 0.28473 0.06367 0.08107
INTERACTIE NTRE GRUPURI
Analist 1/D1 10 5.812 0.149 0.04712 0.0222
Analist 1/D2 10 5.3104 0.09578 0.03029 0.00917
analist 2/D1 0 0 0 0 0
analist 2/D2 0 0 0 0 0
ANOVA
DF Suma Media ptratic Valoare F Valoare P
patratic
Interval 0 -7.115-15 - -3.485-301 1
Analist 0 -7.11E-15 - -3.485-301 1
Model 1 13.14844 13.14844 3.70707 0.07108
Eroare 1 60.27294 60.27294 16.99334 7.123-04
TOTAL 17 60.29656 3.54686 - -
TOTAL
CORECTAT 18 120.5695 - - -
n cadrul determinrilor, deviaia standard relativ pentru arii este de 0,20%, valoarea medie a ariilor fiind
de 642,85, iar deviaia standard relativ a determinrilor pentru monitorizarea timpilor de 1,80%,. n aceste
condiii, se respect condiia privind repetabilitatea determinrilor pentru care valoare RSD<2%. Din punct de
vedere al varibilitii datelor n cadrul celor 2 grupuri, se constat c pentru un grad de certitudine de 95%, nu
exist o diferen semnificativ F = -7.87E-299 (F<p) n cazul determinrii timpilor de retenie i cu o valoare de -
3.485-301 F<p pentru cazul sursei de variabilitate 2 (analist).
n cazul studiului varibilitii mediilor determinate pentru factorul numrul 2, analist, se constat ca
valoarile parametrilor F sunt aceleai, deci i n acest caz nu exist o diferen statistic semnificativ. La analiza
inter-grupuri prin studiul interaciunii se constat c n cazul ambilor parametri studiai, timp de retenie i arie nu
exist o interaciune semnificativ, mediile celor dou grupuri la analiz nu prezint diferene majore, deci n acest
caz metoda prezint acurateea necesar (cu un grad de certitudine de 95%).
LINIARITATEA
Pentru studiul linearitii s-a utilizat proba P5. Soluie stoc de referin (SSR): 10.4 mg proba P5 s-a
dizolvat n 10 ml ap cu ultrasonare i s-a diluat la 25 ml cu metanol, rezultnd o concentraie de 0.416 mg/ml.
SR1: 0,10 ml SSR + 9,90 ml faz mobil. SR2: 0,25 ml SSR + 9,75 ml faz mobil. SR3: 0,50 ml SSR + 9,50 ml
faz mobil. SR4: 0,75 ml SSR + 9,25 ml faz mobil. SR5: 1,00 ml SSR + 9,00 ml faz mobil. SR6: 1,50 ml
SSR + 8,50 ml faz mobil. SR7: 2,00 ml SSR + 8,00 ml faz mobil.
Rezultate: Concentraiile teoretice i rezultatele sub forma ariilor obinute pe trei determinri consecutive ale
probelor anterior prezentate, impreun cu media determinrilor sunt prezentate n tabelul IX.5.
Tabel IX.5. Condiiile determinrilor
Concentraia
mg/ml
Aria picului 0.00416 0.0104 0.0208 0.0312 0.0416 0.0624 0.0832
1 320 641 1100 1532 1910.4 2965 3902
2 321.4 643.4 1105 1538 1920 2967 3925
3 320.5 639.7 1110 1534.5 1915 2966 3910
Media determinrilor 320.63 641.37 1105.00 1534.83 1915.13 2966.00 3912.33
Regresie liniar Y = a + bX
Panta 45046,9
Intercept 137,74
26

Interval de confiden pentru intercept 54,96-220,51
Deviaie standard rezidual 32,20
Coefficient de corelaie 0.9987
Concluzie. Metoda este liniar pe domeniul studiat, iar ntre concentraia probei i aria picului exist o legtur
direct, semnificativ statistic, gradul de dependen dintre cele dou variabile fiind de 99,87%.
VALIDAREA METODEI DINTR-O MATRICE FARMACEUTIC

Acurateea metodei analitice pentru determinarea probei P5 s-a realizat prin determinarea a trei soluii
placebo reconstituit. Excipienii au rolul de a simula condiiile existente n cadrul produsului analizat. Matricile
analizate corespund procentelor de 90% i 130% fa de concentraia maxim a domeniului de liniaritate
considerat.
Tabel IX.10. Valori experimentale

P5
% din
concentraia 91,57 108,97 128,00
int
Arie Timp de retentie Arie Timp de retentie Arie Timp de retentie
Seria 1 1399 5,962 1641 5,861 1862 5,786
Seria 2 1397 5,785 1639 5,851 1895 5,825
Seria 3 1398 5,682 1640 5,746 1859 5,766
Interpretarea valorilor experimentale.
91.57%
Concentraii Concentraii Regsirea Abaterea
teoretice regsite procentual procentual
0.029 0.027942 96.35243 3.647567
0.029 0.027898 96.19972 3.800281
0.029 0.02792 96.27608 3.723924
108,97%
0.034 0.033301 97.94391 2.056088
0.034 0.033257 97.81366 2.186344
0.034 0.033279 97.87878 2.121216
128%
0.04 0.038195 95.4866 4.513397
0.04 0.038925 97.31344 2.686559
0.04 0.038128 95.32053 4.679473
Regsirea procentual exprim oblicitatea experimental maxim la concentraiile studiate (100*Xr/Xa).
Valoarea maxim a abaterilor procentuale este 4,67, deci se respect condiia impus ca abaterile procentuale ale
regsirii sa fie mai mici dect 5. Valoarea medie a factorilor de recuperare este de 96,73%, deviaia standard a
prezentat valori de 1.14, iar deviaia standard relativ a fost de 1,51%. Considernd un interval de ncredere de
95%, domeniul de confiden este cuprins ntre 95,94% i 97,52%, fr a considera valoarea de 100%. Cu toate
acestea deviaia de la valorile teoretice este mic, sub 5%, deci valoarea medie a recuperrii este corespunztoare
scopului considerat.
PRECIZIE REPETABILITATE
Tabel IX.12. Valori experimentale.
Nr. det. Aria semnalului Abateri individuale Abateri procentuale
1 641 1.87 0.290883071
2 645 2.13 0.331326707
3 643 0.13 0.020221818
4 642.5 0.37 0.057554404
27

5 644.1 1.23 0.191329507
6 640.9 1.97 0.306438316
7 642.7 0.17 0.026443916
8 642.6 0.27 0.04199916
9 642.9 0.03 0.004666573
10 644 1.13 0.175774262
Media 642.87 Oblicitate -0.08361
Eroare standard 0.407717 Domeniu 4.1
Mediana 642.8 Minimum 640.9
Deviaie standard 1.289315 Maximum 645
Varianta probelor 1.662333 Suma 6428.7
Distribuie -0.24664 Nr. determini 10
Domeniu de confiden 641,94-643,79
Repetabilitatea a fost investigat prin analizarea a 10 probe la concentraia de 100%. Rezultatele au fost
sumarizate n tabelul IX.12. Deviaia standard relativ a fost de 0,199% iar domeniul de confiden a fost de 0,92
relativ la valoarea medie. Deci, toate valorile s-au nscris n acest domeniu.
LIMITA DE DETECIE I DE CUANTIFICARE

Tabel IX.13. Limita de detecie si de cuantificare
P5
coeficient de regresie-R 0.999365
R2 0.998731
coeficient ajustat 0.998477
eroare standard 50.15671
Panta 45046.97
LOD (mg/ml) 0.00334
LOQ (mg/ml) 0.011134
DEPISTAREA VALORILOR ABERANTE - TESTUL DIXON
S-au obinut urmtoarele date: Qcalculat = 0.012 pentru aria picului pentru P5. Q teoretic, cu pragul de semnificaie
= 0,001, este 0,568. Avnd n vedere c Qcalculat < Q teoretic, n toate cazurile, rezult c nu sunt valori aberante.
Picul corespunztor P5 nu coelueaz cu picurile corespunztoare altor substante, nu este extins, nu are alt aspect.
Nu se observ picuri parazite la acelai timp de retenie cu picul corespunztor substanei de analizat.
COMPUSUL 8, P8
Material i metod. Metoda s-a dezvoltat pe un cromatograf de lichide de inalta performanta de tip Agilent, 1100
series echipat cu pomp la o presiune maxim 400 barri, injector manual, detector DAD i degazor. Faza staionar
a constat dintr-o coloan cu suport din otel inoxidabil cu lungimea de 150 mm, diametru intern de 4.0 mm, ce
conine silice pe suprafaa creia s-au grefat grupri octadecilsilil, mrimea particulelor fiind de 3 m.
Faza mobil a constat dintr-un amestec format din soluie acid formic 0,2%, metanol i acetonitril n proporiile
35:45:20, iar eluia de tip izocratic la un debit de 1,2 ml/min.
COMPATIBILITATEA SISTEMULUI
Tabel IX.14. Rezultate parametri de compatibilitate
Parametrii P8
Timp de retenie 2,83
Factorul de capacitate, k 14
Rezoluie (Rs) 4,6
Puritatea picului 0.999
Raport semnal/zgomot de fond (S/N) 2125
Similaritate (n raport cu spectrul de referin) 1.000
SPECIFICITATEA METODEI
S-a demonstrat c semnalul caracteristic componentului principal, P8, nu interefer cu semnale secundare prezente
pe cromatogramele prezentate. S-au efectuat analize HPLC pentru soluiile standard, soluiile prob, pentru faza
mobil blanc i pentru soluiile placebo-reconstituite.
Rezultate: Figura IX.17.(a-c) ilustreaz selectivitatea metodei prin demonstrarea separrii semnalului corespunztor
analitului de semnale secundare interferente.
28

Fig.IX.17. HPLC cromatogramele pentru
demonstrarea selectivitii metodei.
Puritatea semnalelor cromatografice pentru concentraiile de 0,0104 mg/ml i respectiv 0,20 mg/ml
prezint valori de 0.993 i respectiv 0.998 ceea ce indic faptul c nu exist impuriti sau constituieni ale matricii
n cazul placebo reconstituit care s coelueze cu semnalele componenilor int.
ACURATEEA METODEI
Tabel IX.16. Ariile, timpii de retenie i abateri determinate.
PROBA P8 PARAMETRII
Nr det Aria picului Abateri individuale Timp de retenie Abateri individuale
1 1148 1.285714 2.425 0.027
2 1144 5.285714 2.423 0.029
3 1140 9.285714 2.438 0.014
D1
4 1152 2.714286 2.455 0.003
5 1152 2.714286 2.46 0.008
6 1148 1.285714 2.485 0.033
7 1152 2.285714 2.401 0.051
8 1155 2.714286 2.435 0.017
9 1145 5.714286 2.502 0.05
D2
10 1155 4.285714 2.482 0.03
11 1157 5.714286 2.433 0.019
12 1153 7.714286 2.485 0.033
MEDIA 1149.286 MEDIA 2.452
STDEV 5.224625 STDEV 0.031142
RSD 0.454598 RSD 1.270061
Tabel IX.17. Rezultatele testului ANOVA.
Timp de retenie
Grupuri Numr Suma Media Variana
D1 6 16.722 2.787 0.005076
D2 6 14.738 2.456333 0.001525
Sursa variaiei SS df MS F P-det F crit
Intre grupuri 0.328021 1 0.328021 99.3723 1.64E-06 4.964603
n cadrul grupului 0.033009 10 0.003301
29

Arie
Grupuri Numr Suma Media Variana
D1 7 8031 1147.286 18.2381
D2 7 8059 1151.286 31.57143
Sursa variaiei SS df MS F P-det F crit
Intre grupuri 56 1 56 2.248566 0.15958 4.747225
n cadrul grupurilor 298.8571 12 24.90476
n cadrul determinrilor, deviaia standard relativ pentru arii este de 0,45%, valoarea medie a ariilor fiind
de 1149.29, deviaia standard relativ a determinrilor pentru monitorizarea timpilor este de 1,27%, valoarea medie
fiind 2.45 minute. n aceste condiii, se respect condiia privind repetabilitatea determinrilor pentru care valoare
RSD<2%.
Din punct de vedere al varibilitii datelor n cadrul celor dou grupuri, determinate de sursa de varibilitate
considerat, interval de timp, se constat c pentru un grad de certitudine de 95%, exist o diferen semnificativ
F=99,37 (F>p) i F>Fcrit. n cazul determinrii timpilor de retenie. Pentru variabila arie, la validarea variaiei
mediilor determinate n cazul analizei n intervalul determinat, nu se constat diferene statistic semnificative,
Fdeterminat<Fcrit i distribuia datelor relev dispunerea acestora n intervalul considerat. (p>0.05).
La analiza inter-grupuri prin studiul interaciunii se constat c n cazul ambilor parametri studiai, timp de
retenie i arie nu exist o interaciune semnificativ, mediile celor dou grupuri la analiz nu prezint diferene
majore, deci n acest caz metoda prezint acurateea necesar (cu un grad de certitudine de 95%). Analiza
descriptiv inter-grupuri a determinat un interval de ncredere pentru arie cuprins ntre 2,43 i 2,47. n cazul ariilor
determinate, variabilitatea este cuprins ntre 1152,302 i 1146,269.
LINIARITATE
Pentru studiul linearitii s-a utilizat proba P8. Soluie stoc de referin (SSR): 12,4 mg proba P8 s-a
dizolvat n 10 ml ap cu ultrasonare i s-a diluat la 10 ml cu metanol, rezultnd o concentraie de 1,24 mg/ml. SR1:
1,00 ml SSR + 9,00 ml faz mobil (0,1240 mg/ml). SR2: 0,75 ml SSR + 9,25 ml faz mobil (0,0930 mg/ml)
SR3: 0,50 ml SSR + 9,50 ml faz mobil (0,0620 mg/ml). SR4: 0,25 ml SSR + 9,75 ml faz mobil (0,0310
mg/ml). SR5: 0,10 ml SSR + 9,90 ml faz mobil (0,0124 mg/ml). SR6: 0,05 ml SSR + 9,95 ml faz mobil
(0,0062 mg/m).
Rezultate. Concentraiile teoretice i rezultatele sub forma ariilor obinute pe trei determinri consecutive ale
probelor anterior prezentate, mpreun cu media determinrilor sunt prezentate n tabelul IX.18.
Tabel IX.18. Date privind parametrii determinrilor cromatografice efectuate
Concentraia mg/ml
Aria picului 0.00416 0.0104 0.0208 0.0312 0.0416 0.0624 0.0832

1 320 641 1100 1532 1910.4 2965 3902
2 321.4 643.4 1105 1538 1920 2967 3925
3 320.5 639.7 1110 1534.5 1915 2966 3910
Media determinrilor 320.63 641.37 1105.00 1534.83 1915.13 2966.00 3912.33
Regresie liniar Y = a + bX
Panta 17686
Intercept 19.35
Interval de confiden pentru 17138.6-
intercept 18142.12
Deviaia standard rezidual 170.71
Coeficient de corelaie 0.9999
Concluzie: - metoda este liniar pe domeniul studiat, iar ntre concentraia probei i aria picului exist o legtur
direct, semnificativ statistic, gradul de dependen dintre cele dou variabile fiind de 99.99%.
ACURATEEA METODEI ANALITICE
Acurateea metodei analitice pentru determinarea probei P8 s-a realizat prin determinarea a trei soluii
placebo reconstituite. Componenta excipienilor are rolul de a simula condiiile existente n cadrul produsului
analizat. Matricile analizate corespund procentelor de 80% i 120% fa de concentraia maxim a domeniului de
liniaritate considerat (Tabelul IX.22.).
Tabel IX.22. Matricea farmaceutic cu compusul C8 (P8).
P1 P2 P3
P8 8.1 9.7 11.8
celuloza microcristalin 29.7 29.2 29.9
carbonat de calciu 41.2 40.3 40.1
30

amidon 45.2 43.8 44.4
Tabletoza 80 51.6 49.4 50.2
talc 53.7 52.4 54
TOTAL 229.5 224.8 230.4
Tabel IX.23. Date privind analiza probelor P(1-3)

P8
% din concentraia
82 97 118
int
Arie Timp de retenie Arie Timp de retenie Arie Timp de retenie
Seria 1 498.2 2,417 575.3 2,417 695 2,452
Seria 2 501 4,438 585 2,425 693 2,417
Seria 3 497 2,455 579 2,433 700 2,440
Tabel IX.24. Interpretarea valorilor experimentale:
82%
Concentraii teoretice Concentraii regsite Regsirea procentual Abaterea procentual
0.0248 0.025338 102.1675 2.167453
0.0248 0.025496 102.8075 2.807494
0.0248 0.02527 101.8931 1.89315
97%
Concentraii teoretice Concentraii regasite Regsirea procentual Abaterea procentual
0.0291 0.029708 102.0903 2.090298
0.0291 0.030258 103.9799 3.979942
0.0291 0.029918 102.8111 2.81109
118%
Concentraii teoretice Concentraii regsite Regsirea procentual Abaterea procentual
0.0354 0.036494 103.0904 3.09037
0.0354 0.036381 102.7701 2.770091
0.0354 0.036777 103.8911 3.891067
regsirii s fie mai mici de 5. Valoarea medie a factorilor de recuperare este de 102,83%, deviaia standard a
prezentat valori de 0,74, iar deviaia standard relativ a fost de 0.71%. Considernd un interval de ncredere de
95%, domeniul de confiden este cuprins ntre 104,48% i 101,17%, fr a considera valoarea de 100%. Cu toate
acestea, deviaia de la valorile teoretice este mic, sub 5%, deci valoarea medie a recuperrii este corespunztoare
scopului considerat.
PRECIZIE - REPETABILITATE
Rezultatele determinrilor sunt prezentate n tabelul IX.26.
Tabel IX.26. Valori experimentale
Nr. det. Aria semnalului Abateri individuale Abateri procentuale
1 641 1.87 0.290883071

2 645 2.13 0.331326707
3 643 0.13 0.020221818
4 642.5 0.37 0.057554404
5 644.1 1.23 0.191329507
6 640.9 1.97 0.306438316
7 642.7 0.17 0.026443916
8 642.6 0.27 0.04199916
9 642.9 0.03 0.004666573
10 644 1.13 0.175774262
Medie 644.405 Domeniu 8.3
Eroare standard 0.563283373 Minimum 640.9
31

Mediana 643.85 Maximum 649.2
Deviaia standard 2.519079824 Suma 12888.1
Variana probelor 6.345763158 Nr- determinri 20
Distribuie -0.85345184 Domeniu de confiden (95%) 645.58-643.22
Oblicitate 0.547925671
Repetabilitatea a fost investigat prin analizarea a zece probe la concentraia 100%. Rezultatele au fost
sumarizate n tabelul anterior. Deviaia standard relativ a fost de 0,20% iar domeniul de confiden a fost de 0,45
relativ la valoarea medie. Deci, toate valorile s-au nscris n acest domeniu.
LIMITA DE DETECIE (LOD) I DE CUANTIFICARE (LOQ)
Tabel IX.27. Limitele de detecie si cuantificare pentru C8
P8
coeficient de regresie-R 0.999817496
R2 0.999635026
coeficient ajustat 0.999543782
eroare standard 17.92554111
Panta 17868.3
LOQ (mg/ml) 0.010031984
LOD (mg/ml) 0.003009595
DEPISTAREA VALORILOR ABERANTE - TESTUL DIXON Q
S-au obinut urmtoarele date: Qcalculat 0.03 pentru aria picului pentru P8. Q teoretic, cu pragul de semnificaie =
0,001, este 0,568. Avnd n vedere c Qcalculat < Q teoretic, n toate cazurile, rezult c nu sunt valori aberante.
Picul corespunztor compului C8 nu coelueaz cu picurile corespunztoare altor substane, nu este extins, nu are alt
aspect. Nu se observ picuri parazite la acelai timp de retenie cu picul corespunztor substanei de analizat.
CAPITOLUL X: DETERMINAREA COMPUSULUI C4 DIN MATRICE FARMACEUTIC

Material i metod
Metoda s-a dezvoltat pe un cromatograf de lichide de inalta performan de tip Agilent, 1100 series, cu o
pomp cu presiune maxim 400 barri, injector manual, detector DAD i degazor. Faza staionar a constat dintr-o
coloan cu suport din oel inoxidabil cu lungimea de 150 mm, diametru intern de 4.0 mm, iar faza staionar din
silice modificat pe suprafaa creia s-au grefat grupri octadecilsilil, mrimea particulelor fiind de 3 m. Faza
mobil a constat dintr-un amestec format din solutie acid formic 0,2%, acetonitril i metanol n proporiile
65:20:15, iar elutia de tip izocratic la un debit de 0.9 ml/min. Temperatura de lucru a fost de 40oC, iar detecia s-a
efectuat la 254 nm. Volumul injectat a fost de 20 l, iar timpul de analiz de 6 minute.
PARAMETRI STUDIAI. - compatibilitatea sistemului, - specificitate, - linearitate, - interval, - exactitate, -
precizie, - limita de detecie i de cuantificare.
COMPATIBILITATEA SISTEMULUI
Rezultatele sunt nscrise n tabelul X.1
Tabel X.1. Parametrii coloanei pentru compusul C4
Parametru C4
Timp de retenie 2.83
Factorul de capacitate, k 2.256
Rezoluie (Rs) -
Puritatea picului 0.996
Raport semnal/zgomot de fond (S/N) 24.943
Similaritatea (n raport cu spectrul de referrin) 1.000
Specificitatea metodei a fost demonstrat prin intermediul unor determinri cromatografice complete ale
substanei de analizat n raport cu eventuale semnale secundare determinate n timpul analizei. S-a demonstrat c
semnalul caracteristic componentului principal, compusul C4, nu interefer cu semnale secundare prezente pe
cromatogramele prezentate. S-au analizat cromatogramele corespunztoare solutiilor standard, soluiilor prob,
blanc-faza mobil i soluiilor placebo-reconstituite.
Rezultate:
n figurile X.(1-3) sunt redate cromatogramele obinute din analiza HPLC a soluiilor standard i placebo.
32

Fig.X.1 Cromatograma soluiei blanc - placebo. Fig.X.2. Cromatograma soluiei standard 0,1
mg/ml.
Fig.X.3. Cromatograma soluiei placebo-reconstituite.
ACURATEEA METODEI
Rezultatele sunt nscrise n tabelul X.1.
Tabel X.3. Date privind analizele compusului C4

Compusul C4
Nr det Aria picului Abateri individuale absolute Timp de retenie (min) Abateri individuale absolute
1 556.00 -0.12 2.842 -0.07
2 558.30 0.30 2.842 -0.07
3 557.26 0.11 2.843 -0.03
4 557.25 0.11 2.842 -0.07
5 554.36 -0.41 2.839 -0.17
6 555.60 -0.19 2.837 -0.24
7 557.20 0.10 2.849 0.18
8 558.65 0.36 2.849 0.18
9 557.30 0.12 2.851 0.25
10 554.63 -0.36 2.845 0.04
11 MEDIE 556.655 MEDIE 2.8439
12 STDEV 1.454069 STDEV 0.004557

13 RSD 0.261215 RSD 0.160239
Concluzie: n cadrul determinrilor, deviaia standard relativ pentru arii este de 0,26%, valoarea medie a
ariilor fiind de 556,65, iar deviaia standard relativ a determinrilor pentru monitorizarea timpilor de 0.16%,
valoarea medie fiind 2.84 minute. n aceste condiii, se respect condiia privind repetabilitatea determinrilor
pentru care valoare RSD<2%.
33

LINIARITATEA METODEI
Pentru studiul linearitii s-au utilizat soluii obinute din compusul C4. Soluie stoc de referin (SSR):
10.0 mg compus C4 s-a dizolvat n 2 ml ap cu ultrasonare i s-a diluat la 10 ml cu acelai solvent. SR1: 1 ml SSR
+ 9 ml faz mobil. SR3: 0,8 ml SSR + 9,2 ml faz mobil. SR5: 0,6 ml SSR + 9,4 ml faz mobil. SR6: 0,5 ml
SSR + 9,5 ml faz mobil. SR7: 0,4 ml SSR + 9,6 ml faz mobil. SR8: 0,2 ml SSR + 9,8 ml faz mobil. SR9: 0,1
ml SSR + 9,9 ml faz mobil.
Rezultate. Concentraiile teoretice i rezultatele sub forma ariilor obinute pe 3 determinri consecutive ale
probelor anterior prezentate, mpreun cu media determinrilor sunt prezentate n tabelul X.2.
Tabel X.4. Parametrii determinrilor efectuate
Concentraia
mg/ml
Aria picului 0,1 0,08 0,06 0,05 0,04 0,02 0,01

1 5701 4580 3419.00 2618.00 2212.00 1113.20 566.90
2 5639 4578 3352.00 2789.50 2211.00 1108.70 553.00
3 5700 4510 3410.00 2786.00 2215.00 1097.70 550.00
Media determinrilor 5680 4556 3393.67 2731.17 2212.67 1106.53 556.63
Interval de confiden pentru
Regresie liniar
Y = a + bX intercept -135.15 - 34.25
Panta 57204,91 Deviaie standard rezidual 43,36
Intercept -51,20 Coeficient de corelaie 0.999
Concluzie. Metoda este liniar pe domeniul studiat, iar ntre concentraia probei i aria picului exist o
legtur direct, semnificativ statistic, gradul de dependen dintre cele dou variabile fiind de 100,1%.
ACURATEEA METODEI ANALITICE

Acurateea metodei analitice pentru determinarea compusului C4 s-a realizat prin determinarea a 2 soluii
placebo reconstituite. Componenta excipienilor are rolul de a simula condiiile existente n cadrul produsului
analizat. Matricile analizate corespund procentelor de 50% i 100% fa de concentraia maxim a domeniului de
liniaritate considerat.
Valori experimentale.
Tabel X.8. Valori experimentale
Compusul C4
% din concentraia int 100 50
Arie Timp de retentie Arie Timp de retentie
Seria 1 5981 2.845 2892 2.840
Seria 2 5985 2.865 2911 2.785
Seria 3 5978 2.825 2895 2.860
Interpretarea valorilor experimentale:
Tabel X.9. Interpretarea valorilor experimentale
80% 100%
Conc. Conc. Regsire % Abatere % Conc. teoretice Conc. regsite Regsire % Abatere %
teoretice regsite
0.051 0.0515 100.90 0.903078 0.1065 0.1057 99.27 0.725954
0.051 0.0518 101.56 1.557556 0.1065 0.1055 99.08 0.922823
0.051 0.0515 101.01 1.006416 0.1065 0.1054 98.96 1.037726

regsirii sa fie mai mici dect 5. Valoarea medie a factorilor de recuperare este de 100,13%, deviaia standard sau
variana a prezentat valori de 1.14, iar deviaia standard relativ a fost de 1,14%. Considernd un interval de
ncredere de 95%, domeniul de confidena este cuprins ntre 99,2% i 101,5%, fr a considera valoarea de 100%.
Cu toate acestea deviaia de la valorile teoretice este mic, sub 5% deci valoarea medie a recuperrii este
corespunztoare scopului considerat.
PRECIZIE- REPETABILITATE
Tabel X.11. Valori experimentale :
Nr. det. Aria semnalului compusului C4 Abateri individuale Abateri procentuale
1 556.00 -0.12 0.021138
2 558.30 0.30 0.053088
34

3 557.26 0.11 0.019525
4 557.25 0.11 0.019202
5 554.36 -0.41 0.074065
6 555.60 -0.19 0.034047
7 557.20 0.10 0.017588
8 558.65 0.36 0.064383
9 557.30 0.12 0.020816
10 554.63 -0.36 0.065351
Media determinrilor 556.655
Dev. standard 1.454069
RSD 0.261215
Repetabilitatea a fost investigat prin analizarea a 10 probe la concentraia 100%. Deviaia standard relativ
a fost de 1,454% iar domeniul de confiden a fost de 1,040 relativ la valoarea medie. Deci, toate valorile s-au
nscris n acest domeniu.

n aceste condiii datele obinute sunt redate n tabelul X.8.
Tabel X.13. Valorile limitei de detecie i cuantificare ale compusului C4
Compusul C4
Coeficient de regresie-R 0.999
R2 0.99952193
Coeficient ajustat 0.99941
Eroare standard 32.95
Panta 57197.65
LOD (mg/ml) 0.0017
LOQ (mg/ml) 0.0057
DEPISTAREA VALORILOR ABERANTE - TEST DIXON Q
S-au obinut urmtoarele date: Qcalculat este de 0.49 pentru raportul ariilor, Qteoretic, cu pragul de semnificaie =
0,001. Avnd n vedere c Qcalculat < Q teoretic, n toate cazurile, rezult c nu sunt valori aberante.
CAPITOLUL XI
METOD SPECTROMETRIC UV-VIS PENTRU DETERMINAREA COMPUSULUI C3
COMPUSUL C3 (P3)
Material i metod. Compusul C3 a fost analizat spectrometric n UV i s-a determinat c absoarbe la 204. 237 i
278 nm (capitolul V). Determinrile au fost efectuate pe un spectrofotometru Agilent 8453. Soluie stoc compus
C3 (SSC): 100 mg compus C3 se dizolv n 100 ml ap. Soluie stoc prob (SSP): 100 mg compus C3 n 100 ml
ap. Blanc: ap(R).
PARAMETRI DETERMINAI: - specificitate, - linearitate, - exactitate, - precizie, - limita de detecie i de
cuantificare.
Specificitatea metodei a fost demonstrat prin intermediul unor determinri spectrometric n UV complete
ale substanei de analizat n raport cu eventuale semnale secundare determinate n timpul analizei. S-a demonstrat
c semnalul caracteristic componentului principal, compusul C3, nu interefer cu semnale secundare prezente pe
spectrele prezentate. S-au analizat spectrele corespunztoare solutiilor blanc, standard i reconstituit. Spectrele
sunt prezentate n figurile XI.(1-3).
35

Fig.XI.1. Spectrul probei blanc. Fig.XI.2. Spectrul probei standard.
Fig.XI.3. Spectrul probei reconstituit.
ROBUSTEEA
Studiul robusteei metodei analitice a fost extins la nivelul analizei variaiei semnalului caracteristic compusului
C3 la aciunea diverselor medii de degradare. Spectrele suprapuse i determintate prin msurarea absorbanei i
procesarea semnalelor prin aplicarea unei derivate de ordin unu sunt prezentate n figura XI.4.
Fig.XI.4. Spectrele de ordinul unu al compuilor

rezultatai prin degradarea compusului C3.
Degradrile duc la schimbri nesemnficiative

ale maximelor de absorbie la probele n
mediu acid i mediu fotodegradativ.
Mediul bazic a produs o scdere a intensitii
semnalului caracteristic, n condiiile
expunerii n acelai interval de timp.
Expunerea la mediul oxidant a produs o
intensificare a semnalului caracteristic
compusului C3, care prezint aceeai
concentraie, asociat i cu prezena altor
posibile interferene.
ACURATEEA METODEI
Rezultate sunt nscrise n tabelul XI.3.
Tabel XI.3. Acurateea metodei analitice pentru compusul C3
Absorbana Absorbana
A1-1 0.492 A2-1 0.492
D1 A1-2 0.495 A2-2 0.495
A1-3 0.498 A2-3 0.496
A1-4 0.499 A2-4 0.496
D2 A1-5 0.492 A2-5 0.497
A1-6 0.495 A2-6 0.490
36

Media 0.49475
Deviaia standard 0.002734
RSD 0.552695
n cadrul determinrilor efectuate, deviaia standard relativ pentru absorbana probelor este de 0,556%,
valoarea medie fiind de 0,494. n aceste condiii, se respect condiia privind repetabilitatea determinrilor pentru
care valoarea RSD < 2%.
Tabel XI.4. Studiul variabilitii semnalului compusului C3 n evaluarea acurateei metodei analitice.
Zi Nr. det. Media SD SEM Variana
A1 6 0.49467 0.00234 9.555-04 5.475-06
A2 6 0.49483 0.00331 0.00135 1.105-05
Analist Nr det. Medie SD SEM Variana
D1 6 0.49517 0.00293 0.00119 8.575-06
D2 6 0.49433 0.00273 0.00112 7.475-06
Total Nr det. Medie SD SEM Variana
12 0.49475 0.00273 7.895-04 7.485-06
Interaciune DF Suma patratelor Media patratic F P

Analist 1 8.33E-08 8.335-08 0.00937 0.92503
Zi 1 2.08E-06 2.085-06 0.23413 0.64003
Model 2 2.17E-06 1.085-06 0.12175 0.8868
Eroare 9 8.01E-05 8.905-06 - -
Corectare total 11 8.23E-05 - - -
Analiza varianei celor doi factori inclui n studiul reproductibilitii metodei a demonstrat c n cazul
factorului analist n evaluarea variabilitii zi nu exist o diferen stastistic semnificativ (p < 0.05). n cazul
analizei factorului zi la evaluarea n cadrul evalurii diferenelor produse de variabila analist nu se produc
diferene semnficative privind variabilitatea parametrului n condiiile metodei analitice (p < 0.05). (Tabel XI.4)
LINIARITATEA METODEI
Concentraiile analizate i rezultatele sub forma ariilor obinute pe trei determinri consecutive ale probelor anterior
prezentate, mpreun cu media determinrilor, sunt prezentate n tabelul XI.5.
Tabel XI.5. Distribuia absorbanelor n funcie de domeniul de concentratie

C1 C2 C3 C3 C5 C6 C7 C8
Conc. (mg/ml) 0.025 0.02 0.015 0.0125 0.01 0.0075 0.005 0.0025
S1 1.162 0.952 0.746 0.609 0.492 0.352 0.239 0.105
S2 1.148 0.946 0.755 0.627 0.492 0.352 0.238 0.1
S3 1.155 0.957 0.743 0.622 0.495 0.352 0.239 0.103
Media 1.155 0.951 0.748 0.619 0.493 0.352 0.238 0.103
STDEV 0.007 0.00551 0.00624 0.00933 0.00173 6.8E-17 0.00052 0.00278
RSD 0.606 0.5794 0.834 1.505 0.351 0.225 0.221 2.703
Distribuia ariilor de absorbie sunt prezentate n tabelul XI.6.

Tabel XI.6. Evaluarea valorilor experimentale
Compusul C3
Numr prob Concentraie declarat% mg/ml Abs [mAu] RSD (%)
S1 0.025 100 1.155 0.606
S2 0.02 80 0.951733 0.579
S3 0.015 60 0.748 0.835
S4 0.0125 50 0.619867 1.506
S5 0.01 40 0.493 0.351
S6 0.0075 30 0.352 0.000
37

S7 0.005 20 0.2388 0.222
S8 0.0025 10 0.1031 2.704
Regresia liniar neponderat Y = ax + b
Panta 47.075
Interval de confiden pentru pant (95%) 44.181 49.969
Intercept 0.008953
Interval de confiden pentru intercept (95%) -0.031-0.049
Eroare standard rezidual 0.000329
Se confirm domeniul de liniaritate ales cu coeficientul de regresie de minim 0.99.
PRECIZIA METODEI
Precizia metodei reprezint gradul de corelaie a datelor dintr-o serie de date de la mai multe probe. Probele
provin din acelai eation.
Precizia este obinut pentru determinrile care sunt efectuate n aceleai condiii i este o msur a gradului de
mprtiere intr-un interval de ncredere a rezultatelor obinute n urma msurrrilor executate n aceleai condiii.
Reproductibilitatea se determin prin analiza de probe identice prin aceleai metode n condiii diferite
(tab.XI.10).
Tabel XI.10. Statistica descriptiv pentru evaluarea preciziei metodei analitice

Nr. Crt. Valori Statistica descriptiv
1 0.492 Media 0.4947
2 0.492 Eroare standard 0.000667499
3 0.495 Mediana 0.495
4 0.493 Deviaie standard 0.002110819
5 0.493 Variana probelor 4.455565-06
6 0.498 Oblicitate -1.312651751
7 0.495 Distribuie de probabilitate 0.049619683
8 0.496 Minimum 0.492
9 0.497 Maximum 0.498
10 0.496 Interval de confidenta a mediei(95.0%) 0.49319-0.49621
Se observ valoarea medie a probelor de 0.494, intervalul de confiden a mediei (95.0%) - 0.49319-
0.49621 i o deviaie standard de 0.00211. n aceste condiii deviaia standard relativ pentru 10 determinri
efectuate a fost de 0.427.
EXACTITATEA METODEI
S-au analizat probe reconstituite cu concentraii cuprinse ntre 0.015 i 0.005 mg/ml. Rezultatele sunt
prezentate n tabelul XI.13.
Tabel XI.13.Compoziia probelor reconstituite
33%
Concentraii teoretice Absorbane Concentraii regsite Regsirea procentual
0.015 0.740 0.015532 103.5479
0.015 0.749 0.015723 104.8226
0.015 0.745 0.015638 104.2561
66%
0.010 0.493 0.010285 102.8468
0.010 0.498 0.010391 103.9091
0.010 0.496 0.010348 103.4842
100%
0.005 0.2388 0.004884 97.6843
0.005 0.245 0.005016 100.3187
0.005 0.246 0.005037 100.7436
38

Valoarea medie a factorilor de recuperare este de 102,40%, deviaia standard a prezentat valori de 2,33, iar
deviaia standard relativ este de 2,27%. Considernd un interval de ncredere de 95%, domeniul de confiden este
cuprins ntre 104,30% i 100,2%, fr a considera valoarea de 100%. Cu toate acestea deviaia de la valorile
teoretice este mic, sub 5% deci valoarea medie a recuperrii este corespunztoare scopului considerat.
TESTUL COCHRAN Q
Are rolul de a verifica dac seriile de date sunt omogene. n aceste condiii se formuleaz ipoteza nula H0: conform
creia seriile difer semnificativ i ipoteza alternativ conform creia seriile nu difer semnificativ. Ccalc este 0,335,
cu o valoare mai mic dect 0,797, deci se respinde ipoteza nul, n aceste condiii nefiind diferene semnficative
ntre serii.

Valoarea limitelor de detecie i a limitei de cuantificare pentru compusul C3 sunt nscrise n tabelul XI.15.
Tabel XI.15. Limitele de detecie i limitele de cuantificare

Compusul C3
Coeficient de corelaie 0.999465
Coefficient de regresie 0.99893
2
R ajustat 0.998128
Eroarea standard 0.000329
Nr. deteminri 8
Panta 47.07
LOQ 0.0050
LOD 0.0015
39

CONCLUZII GENERALE
1. Am elaborat un set de analize cromatografice pe strat subire pentru cei opt compui xantinici i o metod
cromatografic densitometric pe strat subire pentru doi dintre compui.
2. Identificarea derivailor metilxantinici s-a realizat pe baza capacitii de absorbie n UV datorit prezenei
gruprilor cromofore.
3. Spectrele de absorbie au prezentat similariti datorit structurii apropiate, derivaii fiind doar difereniai prin
prezena anumitor grupri n poziia 7 la inelul purinic.
4. Derivata spectral de ordinul unu a determinat descreterea maximelor de asborbie, i a permis evidenierea mai
clar a maximelor de absorbie, reuindu-se prin aceast tehnic creterea specificitii spectrale a metodelor de
identificare.
5. Datele spectrale obinute pot fi folosite la elaborarea i validarea unei metode de analiz calitativ i cantitativ a
substanelor sintetizate i din matrici farmaceutice i probe biologice.
CAP VI
6. Gradul ridicat de puritate al derivailor sintetizai a permis determinarea caracteristicilor IR.
7. Compusul de baz, 1, P1 prezint maxime de absorbie bine definite, care se vor regsi n toi cei derivaii.
8. Compusul bromurat, 2, P2 are maximele de absorbie ale compusului 1 cu influenele atomului de brom
substituent, pentru legtura alifatic C-Br la 700 - 600 cm-1 i pentru legtura aromatic C - Br de intindere de la
1500 - 1000 cm-1.
9. Compusul 3, cu o grupare nitro pe nucleu, prezint o band de absorbie cu un pic ascuit la 1181 cm-1, atribuit,
n general pentru legtura simetric a gruprii NO2 din compuii organici. Alte benzi de vibraii caracteristice
gruprii NO2 sunt imposibil de distins, deoarece aceste oxiabsorbii apar ntr-o regiunea aglomerat i foarte
suprapus a spectrului, n special ntre 1300 i 1350 cm-1.
10. Compusul 4 prezint benzi de absorbie caracteristice legturii C = N de ntindere care apar de obicei n
regiunea IR 1655 - 1640 cm-1.
11. Compusul 5, prezint n structura sa un radical piperidinic care i las amprenta prin vibraiile de la 3263 (s),
2790 (s), 2730 (s), 2675 (m), 2635 (w); 1600-1575 (w), 817 (m), 735 (s) cm -1.
12. Compusul 6 prezint o banda de absorbie nou la 1110 cm-1, atribuit legturii O - C de ntindere din radicalul
cu oxigen n molecul (morfofolinic). Se observ benzi IR n regiunea 3200 -2800 cm-1 care sunt caracteristice
radicalului morfolinic. Spectrul mai prezint dou benzi slabe de absorbie la 901 cm-1 i 1220 cm-1.
13. Compusul 7 prin radicalul metilpirazolonic i las amprenta prin maximele caracteristice acestui nucleu i
determinate a fi la 3127, 1597, 1525, 1498, 1454 cm-1.
14. Compusul 8, cu un substituent de dimetilpirazol prezint vibraii caracteristice la 3500, 2200, 1610 1575, 1550,
1520, 1400, 1040 cm-1.
CAP. VII
15. Variaia pH-ului n aceleai condiii cromatografice, folosind aceeai proporie n soluie apoas i modificatorii
organici, produce o cretere semnificativ a timpului de retenie, dar nu cu o mbuntire relativ a selectivitii.
16. Avnd n vedere eficiena relativ a pH-ului mediului din cele trei valori, randamentul cel mai bun s-a obinut la
pH 7,2, o valoare apropiat de pH-ul la care are loc disocierea compusului metil-xantinic. Acest lucru se datoreaz
valorilor semnificative mbuntite ale talerelor teoretice implicate n procesul de absorbie-desorbie a tehnicii de
cromatografie solid/lichid. Exist, de asemenea, o mbuntire semnificativ a asimetriei i a selectivitii
componentei principale de impuritile provenite din procesul de sintez.
17. Utilizarea preconizat a metodei cromatografice este adecvat pentru determinarea compuilor din matrici
farmaceutice cu derivai xantinici, cu eliberare imediat, modificat sau prelungit a cror structur este
condiionat de prezena excipienilor, cu rol de diluani, liani, ageni de dezintegrare, lubrifiani sau substane care
sunt capabile de a modifica comportamentul n tractul digestiv.
CAP. VIII
18. Am efectuat un studiu 1H-RMN i 13C-RMN asupra celor opt compui metilxantinici, posesori ai unor atomi de
hidrogen i carbon capabili de rezonana electromagnetic.
19. Compusul C1, 7-[2-hidroxy)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-1,3-dimetil-xantina, analizat prin spectrometrie
1
H-RMN a evideniat prezena atomilor de hidrogen singlei, dublei i multiplei ataai unor atomi de carbon
(primar, secundar) i atomilor de oxigen. Apare n structur o grup izopropanol. Deplasrile chimice () constatate
se ntind pe gama 2.09-9.7 ppm. Spectrele 13C-RMN efectuate ntre 23.8 i 167.75 ppm evideniaz rezonana
atomilor de carbon din poziiile: C1, C2, C4, C8, C19, C20, C23, C22, C14, C10, C12, C17, C13 i C28.
Dispunerea semnalelor 1H-RMN identificate i asociate anterior sunt reprezentate i analizate COSY prin
40

distribuia acestora n funcie de distribuia pe fiecare ax. Corelaii semnificative se produc n domeniul 4-5 ppm i
6,5-8,5 ppm.
20. Compusul C2, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-bromo-1,3-dimetilxantina, prezint n spectrul
1
H-RMN deplasrile chimice caracteristice atomilor de hidrogen. n structura compusului apare o grup
izopropanol ce adaug atomi de hidrogen, carbon i oxigen. Atomul de brom influeneaz i el spectrul RMN.
Acetia au valori cuprinse ntre 2.01 ppm i 9.77 ppm i caracterizeaz atomii de hidrogen din poziiile 19, 28, 10,
12, 18, 14, 15, 16, 21, 22, 24 i 25. n spectrul COSY (9-4.5 ppm) se observ corelaii bidimensionale n domeniul
3-5 ppm i 68 ppm. Determinrile 13C-RMN efectuate ntre 23.8ppm i 167.75 ppm pun n eviden semnalul
atomilor de C28, C12, C10, C13, C14, C17, C22,C21, C23, C19, C6, C4, C8, C26, C2 i C9.
21. Compusul C3, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-nitro-1,3-dimetilxantina, este caracterizat prin
prezena unei grupri nitro. Spectrul 1H-RMN prezint deplasri chimice ale atomilor de hidrogen ce aparin
gruprilor metil i metilenice, atomului de azot i altor grupri structurale situate ntre 1,1 i 9.775 ppm. Atomii de
hidrogen aparin atomilor din poziiile 31, 10, 12, 20, 15, 16, 17, 24, 26, 23, 27 (n ordinea aparieie lor n spectru).
Acestea apar ca singlei, dublei i multiplei. n spectrul 2D-RMN se observ corelaii bidimensionale n domeniul
3-5 i 6-8 ppm (identice cu cele ale compusului C2). Spectrul DEPT al compusului C3 efectuat ntre 23.81 ppm i
167.75 ppm arat rezonana pentru carbonii: 31, 12, 10, 15, 16, 20, 24, 26, 23, 27, 6, 4, 8, 29, 2 i 9 (n ordinea
apariiei lor n spectru).
22. Compusul C4, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3-dimetilxantina, ce prezint
n structur un inel imidazolic, prezint caracteristici spectrale 1H-RMN. Inelul imidazolic adaug doi protoni n
poziiile 16 i 17. Deplasarea chimic () a atomilor de hidrogen determinat n gama 2.01 i 9.917 ppm se
caracterizeaz prin singlei, dublei, triplet, quartet, multiplei i triplet pentru atomii de hidrogen din poziiile 33,
18, 22, 10, 12, 19, 16, 17, 14, 25, 29, 20 (OH, 26 i 28. Semnalele COSY indic urmtoarele corelaii: C19 (4.23
ppm) care se asociaz cu gruparea OH (20), C19 se asociaz vicinal cu C18 i C22 (4.40 ppm). n domeniul
deplasrii , 6-8 ppm, se remarc prezena asocierii gruprilor C25 cu C29 i respectiv a gruprilor C26 cu C28.
Caracteristicile spectrale 13C-RMN au fost determinate ntre 23,8 i 174.45 ppm. Semnalele din spectru
caracterizeaz atomii de carbon din poziiile: 33, 17, 12, 10, 16, 18, 22, 24, 25, 29, 26, 28, 6, 4, 8, 2, 31, i 9.
Spectrul DEPT prezint informaii despre gruprile metilice, metilenice i metinice. Astfel se remarc la 44,87 ppm
i 68,05 ppm gruprile metilenice C22 i C18, iar la 114,73 ppm i 120,39 atomii de carbon echivaleni: C25, C29
i C26, C28.
23. Compusul C5, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(piperidin-1-il)-1,3-dimetilxantina, are n
structur un ciclu piperidinici ce aduce opt atomi de H i cinci de C. Caracteristicile spectrale 1H-RMN pentru
compusul C5 s-au analizat n gama 2.0009 i 9.771 ppm. Spectrul se caracterizeaz prin singlei i dublei ai
hidrogenului din poziiile: 34, 20, 2, 23, 31(NH), 10, 26, 30, 27, 29, 21 (OH). Din analiza COSY rezult corelaii
directe ntre semnalele de la 4.2 ppm dublet cu 4.5 ppm. Similaritatea este determinat de hibridizarea sp3 a
atomului de carbon C20. Legtura covalent ntre C20 este realizat cu atomul de carbon C23 adiacent, prezent n
gruparea metoxi (OCH3). Din punctul de vedere al celui de-al doilea domeniu identificat, legturi directe se
realizeaz ntre grupul de atomi de carbon asociat inelului benzenic identificat (C26, C30: 6.75 ppm) i (C27, C29:
7.58 ppm). Spectrul 13C-RMN efectuat ntre 23.81 i 167.75 ppm arat prin semnalele determinate atomii de carbon
din poziiile: 34, 12, 10, 14, 19, 20, 23, 25, 26-30, 27-29, 6, 4, 8, 2, 32 i 9.
24. Compusul C6, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(morfolin-4-il)-1,3-dimetilxantina ce conine
un inel morfolinic, analizat spectrometric 1H-RMN ntre 2.5 i 3.68 ppm arat singlei i triplei caracteristici
hidrogenilor din poziiile 31 (NH), 34, 22, 20, 16, 6, 3 i 23. Din analiza COSY rezult corelaii directe ntre
semnalele de la 3.47 ppm i 3,68 ppm. Corelaia se produce prin protonii adiaceni gruprilor metilenice C3 i C6.
Din punct de vedere al analizei 13C-RMN deplasrile chimice () constatate sunt ntre 27.48 i 174.45 ppm. ntre
aceste valori sunt caracterizai atomii de carboni 16, 4, 7, 32, 22, 20, 25, 14, 9, 12, 34 i 10.
25. Compusul C7, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3-metil-5-oxo-pirazol-1-il)-1,3-
dimetilxantina, cu un inel oxo-pirazolic arat n spectrul 1H-RMN efectuat ntre 0 ppm i 15.0 ppm protonii din
gruparea CH3 (0.7-1.3 ppm), R-N-H (0,5 -4.0 ppm), R-N-C-H (2. 2.9 ppm), N=C-C-H (2.1-3.0 ppm), R-CO-CH3
(3.5-4.8 ppm) i OH-C-H (3.2-3.8 ppm). Acetia sunt sub form de singlei i dublei. Analiza COSY indic
corelaii ntre semnalele caracteristice gruprii C24 i C18 (corelaie ntre atomii de hidrogen adiaceni (4.25 i
3.958 ppm) i respectiv o corelaie mai slab cu protonul din gruparea OH (19) de 5.46 ppm. Se constat corelaii
ntre atomii de hidrogen adiaceni din cadrul gruprii aromatice prezente (6,81 i 7.45 ppm). n spectrul 13C-RMN
efectuat n gama de 23.8 i 174.46 ppm apar numai semnale ale atomilor de carbon 35, 15, 23, 17, 18, 24, 3, 26, 27-
31, 28-30, 29, 6, 13, 5, 8, 9, 33 i 11.
26. Compusul C8, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(3,5-dimetil-pirazol-1-il)-1,3-dimetilxantina
conine n structura sa un inel dimetil-pirazolic. n spectrul 1H-RMN efectuat ntre 2.01 i 9.78 ppm s-au identificat
singlei, dublei i multiplei ce sunt atribuii atomilor de hidrogen din poziiile: 35, 17, 14, 24, 18, 19, 27, 31, 28,
30 i 5. Analiza COSY indic corelaii ntre semnalele caracteristice gruprilor C24 i C18 (corelaie ntre atomii
41

de hidrogen adiaceni (4.30 i 3.91 ppm)) i o corelaie mai slab cu protonul din gruparea OH (19) la 5.46 ppm. De
asemenea, se constat corelaii ntre atomii de hidrogen adiaceni din cadrul gruprii fenolice prezente (6,89 i 7.45
ppm). Spectrele 13C-RMN ale compusului C8 nregistrate n intervalul 18.53 i 174.45 ppm arat numai semnale
ale atomilor de carbon din poziiile 16, 35, 15, 23, 17, 18, 24, 3, 26, 27-31, 28-30, 29, 6, 13, 5, 8, 9, 33 i 11. Natura
atomilor de carbon este redat prin determinrile DEPT (120.3 i 114.9 ppm).
CAP. IX
27. S-au stabilit i validat doua metode HPLC pentru doi compui metilxantinci, C5 i C8.
28. Metodele au fost efectuate n coniile determinrilor HPLC aplicate celor dou substane.
29. Metodele au fost aplicate i validate prin aplicarea lor la dou forme farmaceutice.
30. S-au stabilit toi parametrii cerui de normele de validare.
31. S-a determinat limita de detecie i limita de cuantificare din cele dou forme farmaceutice analizate.
32. Metodele vor putea fi aplicate i altor formulri farmaceutice cu aceti compui.
CAP. X
33. Compusul C4, 7-[2-hidroxi)-3-(4-acetilamino)-fenoxi]-propil-8-(imidazol-1-il)-1,3-dimeil-xantina a fost
nglobat ntr-o matrice de tip pulbere farmaceutic pentru a stabili i valida o metod de cuantificare.
34. S-au determinat i confirmat toi parametrii cerui de normele de validare pentru un compus nglobat ntr-o
matrice.
35. S-a determinat limita de detecie i de cuantificare, acestea avnd valorile LOD de 0.0017 mg/ml i LOQ de
0.0057 mg/ml cu r2 de 0.99952193.
36. Pentru a constata exactitatea determinrilor s-a efectuat verificarea cu ajutorul testului Dixon prin care s-au
eliminat posibilitatea unor valori aberante.
37. Substanele auxiliare din amestecul farmaceutic nu influeneaz determinrile efectuate.
CAP. XI
38.Metoda de determinare a compusului C3 prezint specificitatea necesar pentru ca semnalele corespunztoare sa
nu interfere.
39. Se confirm domeniul de liniaritate ales cu coeficientul de regresie de minim 0.99.
40. S-au identificat trei posibile surse de perturbare a semnalelor caracteristice absorbiei UV+VIS prin includerea
n medii de degradare accelerat.
41. Mediul de degradare oxidativ a prezentat cea mai ridicat influien asupra stabilitii compuaului C3.
42. Nu s-au nregistrat diferene semnificative ntre seriile de date obinute n cazul probelor standard i a probelor
reconstituite.
FINALE
43. Analizele cromatografice pe strat subire, HPLC i cele spectrale n UV, IR i RMN au demonstrat structura
dimetilxantinelor sintetizate.
44. S-au elaborat metode HPLC i spectrometrice n UV pentru analiza compuilor C5 i C8, respectiv C4 i C3.
Metodele analitice au fost validate conform normativelor internaionale.
42

BIBLIOGRAFIE SELECTIV
1. Hurst J, Tarka SM. Introduction to the chemistry, isolation, and biosynthesis of methylxanthines, Prog Clin Biol
Res.; 1984; 158:9-16.
2. Fredholm BB. Methylxanthines. 1st Ed. Heidelberg: Springer Verlag, 2011
3. Mohrig JR, Noring Hammond C, Schatz PF. Techniques in Organic Chemistry. New York: W. H. Freeman and
Company, 2010.
4. Schnitzler E, Kobelnik M, Sotelo GFC et al. Thermoanalytical study of purine derivatives copounds, Eclet.
Qum., 2001; Vol. 29: 71-78.
5. TA No. 15, Thermal Analysiss of Caffeine, Hitachi High-Tech. http://www.hitachi-hitec-
science.com/en/documents/technology/thermal_analysis/application_TA_015e.pdf, 1984.
6. Bergen HR, Benson LM, Naylor S. Determination of Aspartame and Caffeine in Carbonated Beverages Utilizing
Electrospray Ionization-Mass Spectrometry, J. Chem. Educ 2000; 77 (10) : 1325-1328.
7. Evstigneev MP, Veselkov DA, Djimant LN et al. 1H-NMR Analysis of Heteroassociation of Caffeine with
Mitoxanthrone in Aqueous Solution J Struct Chem 2001; 42 (5): 777-783.
8. Lehmann CW, Stowasser F. The crystal structure of anhydrous beta-caffeine as determined from X-ray powder-
diffraction data. Chem Eur J 2007; 13 (10): 2908-2911.
9. Ashihara H, Monteiro AM, Gillies FM, Crozier A. Biosynthesis of Caffeine in Leaves of Coffee. Plant Physiol
1996; 11 (1): 747-753.
10. Klebanov GS, Mednikova LN, Ovcharova AD. Extraction of caffeine from aqueous solutions, Pharmaceut
Chem J 1967; 1 (4): 221-223.
20. Verbeeck RK. Pharmacokinetics and dosage adjustment in patients with hepatic dysfunction. Eur J Clin
Pharmacol, 2008; 64 (12): 1147-1161.
21. Arnaud MJ. Pharmacokinetics and metabolism of natural methylxanthines in animal and man, Handb Exp
Pharmacol 2011; 200: 33-91.
22. Thorn CF, Aklillu E, McDonagh EM et al. Caffeine Pathway, Pharmacokinetics, Pharmacogenet, Genomics
2012; 22 (5): 389-395.
23. Denaro CP, Benowitz NL. Caffeine Metabolism. Drug Alc. Review 1991; 2: 513-539.
24. Johnson IM, Prakash H, Prathiba J, Raghunathan R, Malathi R. Spectral Analysis of Naturally Occurring
Methylxanthines (Theophylline, Theobromine and Caffeine) Binding with DNA. PLoS ONE. 2012; 7(12): e50019.
doi:10.1371/journal.pone.0050019
25. Moffat AC, Osselton M D, Widdop B, Watts J. Clarke's Analysis of Drugs and Poisons. Fourth Edition.
London, UK: Royal Pharmaceutical Society of Great Britain, 2011.
26. Sitkowski J, Stefaniak L, Nicol L et al. Complete assignments of the 1H, 13C and 15N NMR spectra of caffeine.
Spectrochim. Acta Mol. Biomol. 1995; 51 (5): 839-841.
27. MassBank Record: KOX00876.
http://www.massbank.jp/jsp/Dispatcher.jsp?type=disp&id=KOX00876&site=0
28. Zhang S. Physical Properties and Crystallization of Theophylline Co-crystals http://www.diva-
portal.org/smash/get/diva2:322893/FULLTEXT01.pdf, 2010.
91. Chung J, Kim IW. Oriented crystallization of xanthine derivatives sublimated on self-assembled monolayers,
Korean J. Chem. Eng. 2011; 28 (1): 232-238.
92. Belcak A, Komes D, Horzic D et al. Comparative study of commercially available cocoa products in terms of
their bioactive composition, Food Res Int 2009; 42: 707-716.
93. Misra H, M, Mehta BK et al. Study of extraction and HPTLC-UV method for estimation of caffeine in
marketed tea ( Camellia sinensis ) granules, Int J Green Pharm., 2009; 3, (1): 47-51.
94. Mirfazaelian A, Goudarzi M, Tabatabaiefar M, Mahmoudian M. A quantitative thin layer chromatography
method for determination of theophylline in plasma, J Pharm Pharmaceut Sci. 2012; 5 (2):131-134.
95. Kasabe AJ, Badhe GB. Extraction and estimation of theobromine in marketed tea by HPTLC and UV method,
Int J Appl Biol Pharmaceut Tech, 2010; 1 (2): 365-373.
96. Mirfazaelian A, Gourdazi M, Mahmoudian M. A Quantitittive Thin Layer Cromatograpgy Method for
Determination of Theophylline in Plasma. J. Pharm. Parmaceut. Sci., 2002; 5 (2): 131-134.
ALTE INDICAII BIBLIOGRAFICE

NMR Spectroscopy
http://www.chem.wisc.edu/areas/reich/handouts/chem343-345/345-nmr-handout.pdf
N.Murali, NMR Spectroscopy: Principles and Applications.Basic Concepts.

http://chem.rutgers.edu/~nmurali/nmr_course/Chem_542_Spring2010_Lecture_1.pdf
43

LIST DE ARTICOLE PUBLICATE DIN TEMATICA TEZEI DE DOCTORAT
1. Tamba A, Cioroiu B, Profire L, Lazr M.I. HPLC method for the evaluation of the chromatographic conditions
for the separation of new xanthine derivatives, Cellulose Chemistry and Technology, 2014; 48 (1-2): 61-68,
Impact Factor 0.825
2. Tamba A, Cioroiu B, Profire L, Lazr M.I. Spectral UV and IR determinations of new xanthine derivatives,
Revista Farmacia, 2012; 60: 939-946, Impact Factor 0.669
3. Palade B, Lazr, D. Corciov A., Tamba A., Lazr M.I. Determinarea spectrometric a ceftazidimei i
cefiximei, materii prime pentru obinerea de forme farmaceutice, Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, 2009,
vol. V, nr.2, Supliment nr.4, 307-311
4. Lazr M.I., Lazr D., Croci, A.N., Corciova A., Tamba A., Comparative dates about phenolic acids and
flavonoids content of some propolis sorts from Moldavia and Israel, Ziua medicamentului, mai 12-15, 2008
5. Lazr M.I., Lazr D., Cioroiu B., Corciov A., Tamba A., Profire L., Analiza HPLC a unor derivai xantinici,
Rev. Med. Chir. Soc. Med. Nat., Iai, 2007, vol. III, nr. 2, Supliment nr. 2, 108-111
44

Compusi de Sinteza Din Clasa Dimetilxantinelor

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Compusi de Sinteza Din Clasa Dimetilxantinelor

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Universitatea de Medicin i Farmacie Grigore T.

EVALUAREA ANALITIC A UNOR COMPUI

Cuvinte cheie: metilxantine, cromatografie, analiz spectral, spectrometrie, rezonan magnetic

n acest scop au fost urmrite o serie de obiective:

4. Elucidarea structurii metilxantinelor printr-un studiu de tip 1H-RMN i 13C-RMN.

6. Determinarea unui compus metilxantinic dintr-o matrice farmaceutic.

CAPITOLUL IV: ANALIZA CROMATOGRAFIC A COMPUILOR XANTINICI

Metilxantinele analizate au fost:

COMPUSUL C1, P1 CH3

COMPUSUL C2, P2 CH3

COMPUSUL C3, P3 CH3

COMPUSUL C4, P4 CH3

COMPUSUL C5, P5 CH3

COMPUSUL C6, P6 CH3

COMPUSUL C7, P7 CH3

IV.1. Analiza pe strat subire

Rezultate. Spectrele de absorbie n UV ale compuilor C1(P1) - C8 (P8):

Fig. V.1.b Spectrele de absorbie n UV ale compuilor C1(P1) - C8 (P8).

Fig.VI.2. Spectrul IR al compusului 1.

Legtura C-O de ntindere a gruprii de alcool teriar

cm-1, n timp ce benzile de absorbie observate n

regiunea 1410-1310 cm-1, aparin legturii O - H.

Gruparea funcional eteric este evideniat n toate

Banda larg, observat n toi compuii, cu excepia

3500 3000 2500 2000 1500 1000

Prezena atomului de brom n molecula compusului 2

(P2) d natere diverse tipuri de vibraii (700-600 cm-1

pentru legtura alifatic C-Br de ntindere sau 1500-

1000 cm-1 pentru legtura aromatic C-Br de intindere).

3500 3000 2500 2000 1500 1000

G:\BOGDAN\xantine\proba 2.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010

Proba P3 prezint o band de absorbie la 1181 cm-1,

atribuit, n general pentru legtura de ntinde simetric a

dou benzi de absorbie de la 1566 i 1315 cm-1,

atribuite vibraiilor de ntindere asimetrice i simetrice =

3500 3000 2500 2000 1500 1000

G:\BOGDAN\xantine\proba 3.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010

Fig.VI.5. Spectrul IR al compusului 4.

Proba P4 ar trebui s afieze benzile de absorbie

caracteristice legturii C = N de ntindere care apar de

obicei n regiunea IR 1655-1640 cm-1.

Din moment ce aceast vibraie se produce deja pentru

amidice din molecula-mam, benzi de absorbie noi nu

se observ n spectrul IR nregistrat la proba P4. Totui,

Fig.VI.6. Spectrul IR al compusului 5.

Compusul 5 prezint n structura sa un nucleu

piperidinic care i las amprenta prin vibraiile de la

1575 (w); IV, 817 (m), 735 (s) cm -1.

3500 3000 2500 2000 1500 1000

G:\BOGDAN\xantine\proba 5.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010

legturii O-C de ntindere din compuii cu oxigen n

molecul (altele dect acizii carboxilici, esteri, cetone

anhidridele, etc), cum ar fi nucleul morfolinic. De

asemenea, benzile IR observate n regiunea 3200-2800

Mai mult dect att acest spectru prezinta doua benzi

Fig.VI.8. Spectrul IR al compusului 7.

absorbie caracteristice compusului, care a constituit

baza sintezelor celolali derivai metilxantinici.

las amprenta prin maximele caracteristice acestui

nucleu i apreciate a fi la 3127, 1597, 1525, 1498, 1454

3500 3000 2500 2000 1500 1000

G:\BOGDAN\xantine\proba 7.SPC C:\SmithsDetection\ChemID\ChemIdent\Methods\Bog 27/11/2010

Fig.VI.9. Spectrul IR al compusului 8.

Ca i n cazul compusului 7, derivatul P8 nscrie n