Sunteți pe pagina 1din 199

CUPRINS

CAPITOLUL I
COMPONENTELE STRUCTURALE ALE ACIZILOR NUCLEICI ................................ 11
1. INTRODUCERE ...................................................................................................................... 11
2. BAZELE AZOTATE ................................................................................................................ 12
2.1. Tipuri de baze azotate ................................................................................................. 12
2.1.1. Baze majore ........................................................................................................................ 12
2.1.2. Baze modificate .................................................................................................................. 13
2.2. Proprietile bazelor azotate ...................................................................................... 15
2.2.1. Conjugarea dublelor legturi .............................................................................................. 15
2.2.2. Ionizarea heterociclurilor azotate ....................................................................................... 17
2.2.3. Nuclee i grupri funcionale .............................................................................................. 17
2.2.4. Transformarea chimic a bazelor........................................................................................ 20
3. NUCLEOZIDE ........................................................................................................................ 22
3.1. Pentoza nucleozidelor ................................................................................................. 22
3.1.1. Natur i configuraie ......................................................................................................... 22
3.1.2. Legtura cu baza azotat ..................................................................................................... 22
3.2. Conformaia nucleozidelor ......................................................................................... 23
3.2.1. Conformerii pentozei .......................................................................................................... 23
3.2.2. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice ................................................................. 24
3.3. Nucleozide naturale i de sintez ................................................................................ 26
3.3.1. Nucleozidele: metabolii i constitueni ai cofactorilor enzimatici .................................... 26
3.3.2. Nucleozide atipice naturale................................................................................................. 27
3.3.3. Nucleozide de sintez ......................................................................................................... 28
4. NUCLEOTIDE ........................................................................................................................ 30
4.1. Tipuri de nucleotide .................................................................................................... 30
4.1.1. Mono- i difosfat nucleozide .............................................................................................. 30
4.1.1.1. Monofosfat nucleozide ............................................................................................... 30
4.1.1.2. Difosfat nucleozide..................................................................................................... 31
4.1.2. Polifosfat nucleozide .......................................................................................................... 31
4.1.3. Nucleotide ciclice ............................................................................................................... 34
4.2. Proprietile nucleotidelor ......................................................................................... 36
4.3. Funcii metabolice ale nucleotidelor .......................................................................... 38
CAPITOLUL II
STRUCTURA PRIMARA A ACIZILOR NUCLEICI .......................................................... 41
1. CARACTERISTICILE DE COMPOZIIE A STRUCTURII PRIMARE ............................................... 41
1.1. Nucleotidele ................................................................................................................ 41
1.2. Mrimea polimerilor nucleici ..................................................................................... 42
1.2.1. Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici ............................................................ 43
1.3. Polimerizarea nucleotidic ......................................................................................... 46
1.3.1. Legtura fosfodiester .......................................................................................................... 46
1.4. Hidroliza acizilor nucleici .......................................................................................... 48
1.4.1. Hidroliza chimic a acizilor nucleici .................................................................................. 48
1.4.2. Scindarea enzimatic .......................................................................................................... 50
1.5. Purificarea acizilor nucleici i evaluarea cantitativ a acizilor nucleici ......... 54
1.5.1. Metode spectrofotometrice ................................................................................................. 54
1.5.2. Utilizarea de mini-gelulri .................................................................................................... 55
2. DETERMINAREA SECVENEI PRIMARE A ACIZILOR NUCLEICI ............................................... 56
2.1. Strategie i modaliti ................................................................................................. 56
2.2. Metoda chimic Maxam W. Gilbert ............................................................................ 57
2.3. Metoda dideoxi a lui F. Sanger .............................................................................. 58
2.3.1. Principiu .............................................................................................................................. 59
3. SINTEZA CHIMIC A POLIMERILOR NUCLEICI ....................................................................... 61
3.1. Etapele sintezei n faz solid ..................................................................................... 61
CAPITOLUL III
STRUCTURA SECUNDARA SI TERTIARA A ADN .......................................................... 65
1. CONSECINELE SCHELETULUI OZ-FOSFODIESTER .............................................................. 65
1.1. Posibilitile de rotaie ............................................................................................... 65
1.2. Natura polianionic a acizilor nucleici ...................................................................... 66
2. LEGTURA DE HIDROGEN .................................................................................................... 67
2.1. mperecherea specific a bazelor ............................................................................... 67
2.1.1. Regula lui Chargaff............................................................................................................. 67
2.1.2. mperecherile Watson i Crick ........................................................................................... 67
2.1.3. Studiul mperecherilor ........................................................................................................ 68
3. IERARHIA PLIERII ADN ........................................................................................................ 70
3.1. Structura spaial a ADN ........................................................................................... 70
3.1.1. Dublul helix - Modelul Watson i Crick................................................................................... 71
3.1.1.1. Rsucirea n dubl elice .................................................................................................. 71
3.1.1.2. Caracteristicile geometrice ale structurii 2-D de tip B........................................................ 71
3.1.2. Conformaia A ................................................................................................................... 72
3.1.3. Conformaia Z ..................................................................................................................... 74
3.1.3.1. Evidenierea ADN-Z .................................................................................................. 76
3.1.3.2. Caracteristicile ADN-Z .............................................................................................. 76
3.1.3.3. Interesul pentru ADN-Z ............................................................................................. 77
3.2. Conformaia de tripl elice (triplu helix) ................................................................... 78
3.2.1. Secvenele repetitive ........................................................................................................... 78
3.2.2. Secvenele polipirimidinice ................................................................................................ 78
3.2.3. Secvenele palindromice ..................................................................................................... 80
4. TOPOIZOMERI I TOPOIZOMERAZE ....................................................................................... 81
4.1. Caracterizare general ............................................................................................... 81
4.1.1. Super-helixurile 3-D ale ADN ............................................................................................ 81
4.1.1.1. Supra-rsucirile dublului helix ................................................................................... 81
4.1.1.2. Parametrii pentru caracterizarea formrii super-elicelor ............................................ 82
4.2. Structura topoizomerilor i topoizomerazelor ............................................................ 84
4.2.1. Diferitele stri ale topoizomerilor ....................................................................................... 84
4.2.1.1. Starea relaxat: ........................................................................................................... 84
4.2.1.2. Starea supra-rsucit................................................................................................... 85
4.2.2. Topoizomerazele................................................................................................................. 89
4.2.2.1. Topoizomerazele de tip I ............................................................................................ 89
4.2.2.2. Topoizomerazele de tip II........................................................................................... 91
4.2.2.3. Interesul biochimic al topoizomerazelor .................................................................... 92
4.2.2.4. Aplicaii medicale: inhibitorii topoizomerazelor ....................................................... 94
4.3. Consecinele supra-rsucirii teriare.......................................................................... 95
4.3.1. Structurale ........................................................................................................................... 95
4.3.2. Funcionale ......................................................................................................................... 95
4.3.3. Tehnice ............................................................................................................................... 96
5. PROPRIETILE FIZICO-CHIMICE ALE ADN ......................................................................... 97
5.1. Consecinele naturii fibroase i mrimii .................................................................... 97
5.2. Consecinele compoziiei ............................................................................................ 97
5.3. Proprietile oferite ADN de ctre mperecherea i stivuirea bazelor ....................... 98
6
5.3.1. Proprieti mecanice ........................................................................................................... 98
5.3.2. Denaturarea acizilor nucleici .............................................................................................. 98
5.3.2.1. Denaturarea i renaturarea termic ............................................................................. 98
5.3.2.2. Alte tipuri de denaturri ........................................................................................... 102
6. BILAN .............................................................................................................................. 103
CAPITOLUL IV
STRUCTURA SECUNDARA SI TERTIARA A ARN ........................................................ 106
1. STRUCTURA SECUNDAR A ARN ...................................................................................... 106
1.1. Elicele ARN ............................................................................................................... 106
1.2. Motivele elementare 2-D .......................................................................................... 108
2. STRUCTURA TERIAR A ARN .......................................................................................... 108
2.1. Interacii ntre structurile secundare ........................................................................ 108
2.2. Caracteristicile structurilor 3-D ............................................................................... 108
2.3. Organizarea n domenii ............................................................................................ 112
3. TIPURI DE ARN ................................................................................................................. 113
3.1. ARN mesager ............................................................................................................ 114
3.2. ARN de transfer ........................................................................................................ 116
3.2.1. Structura secundar sub form de frunz de trefl ........................................................ 118
3.2.2. Structura teriar n L a moleculelor ARNt ...................................................................... 119
3.3. ARN ribozomal .......................................................................................................... 119
3.3.1. Ribozomi........................................................................................................................... 119
3.3.2. Structura ARN ribozomal ................................................................................................. 123
3.3.3. Rolul moleculelor ARNr................................................................................................... 125
3.4. ARN cu rol catalitic .................................................................................................. 125
CAPITOLUL V
STRUCTURA MOLECULARA A
CROMOZOMILOR SI GENELOR ...................................................................................... 129
1. ORGANIZAREA GENOMULUI LA PROCARIOTE ..................................................................... 129
1.1. Punctul de vedere tradiional asupra cromozomului bacterian ............................... 131
1.2. Comentarii pe tema structurii nucleoidului procariot .............................................. 133
1.3. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor procariote .......................................... 134
1.3.1. Coninutul minim de gene i identitatea genelor specifice ............................................... 136
2. STRUCTURA MATERIALULUI GENETIC LA EUCARIOTE........................................................ 137
2.1. Nucleul celulei eucariote .......................................................................................... 138
2.1.1. nveliul nuclear................................................................................................................ 138
2.1.1.1. Structura i funcia complexului porilor nucleari ..................................................... 139
2.1.2. Nucleul este un organit organizat ..................................................................................... 144
2.1.3. Matricea nuclear.............................................................................................................. 145
2.2. Cromozomii ............................................................................................................... 147
2.2.1. Structura cromozomului mitotic ....................................................................................... 147
2.2.1.1. Centromeri ................................................................................................................ 150
2.2.1.2. Telomerii .................................................................................................................. 152
2.2.2. Tipuri neobinuite de cromozomi ..................................................................................... 153
2.3. mpachetarea genomului eucariot ............................................................................ 154
2.3.1. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului ............................................. 155
2.3.2. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei. .............................................................. 161
2.4. Heterocromatina i eucromatina .............................................................................. 164
2.4.1. Heterocromatina ............................................................................................................... 165
2.4.1.1. Inactivarea cromozomului X .................................................................................... 166

7
2.4.2. Sensibilitatea la nucleaze .................................................................................................. 167
2.4.3. Hipersensibilitatea la nucleaze ......................................................................................... 168
2.5. Aberaiile cromozomiale ........................................................................................... 169
2.6. Mrimea genoamelor nucleare eucariote ................................................................. 173
2.7. Genoamele organitelor din celulele eucariote ......................................................... 181
BIBLIOGRAFIE SELECTIVA ............................................................................................. 186
LISTA FIGURILOR ............................................................................................................... 192
LISTA TABELELOR ............................................................................................................. 202

8
Cuvnt nainte
Cunotinele n acest domeniu al biochimiei, acizii nucleici, structur i
organizare, s-au dezvoltat n ultimii ani ntr-o manier exploziv. Dup geniala
descoperirea a lui Watson i Crick care au deschis calea dezvoltrii fr precedent a
biologiei, foarte muli cercettori au urmat aceast direcie. n fiecare an un numr din
ce n ce mai mare de articole este publicat. Premiile Nobel obinute pentru cercetri n
acest domeniu se succedDirecii noi apar iar cele deja consacrate se dezvolt.
Acest volum prezint cunotinele de baz indispensabile unui student din
primul ciclu universitar de la specializrile biochimie, biologie, ecologie,
biotehnologie, medicin i farmacie, pentru nelegerea rolului acizilor nucleici n
transferul informaiei genetice i n funcionarea celular.

Obiective
Prezent n toate celule vii, ADN sau acidul deoxiribonucleic este suportul
chimic major al ereditii. n volum sunt:
prezentate unitile sale de baz ale structurii primare, nucleotidele, insistnd
asupra structurii componentelor i a modului de asamblare a acestora;
analizate structura secundar i teriar cu accent pe: i) mperecherile specifice
ntre bazele A-T i G-T situate pe cele dou catene complementare; ii) diferenele
structurale i funcionale ale celor dou tipuri de acizi nucleici;
trecute n revist caracteristicile diferitelor tipuri de conformaii ale dublului
helix, proprietile fizico-chimice ale acizilor nucleici i aplicaiile lor;
succint prezentate tipurile de ARN (acid ribonucleic) n corelaie cu
implicaiile lor funcionale;
descris modul de organizare al genelor i cromozomilor la procariote i
eucariote cu accent pe interaciile ADN-proteine prezente la nivelul cromatinei
eucariotelor;
Autoarele

9
10
CAPITOLUL I

COMPONENTELE STRUCTURALE ALE ACIZILOR


NUCLEICI

1. Introducere

Acizii nucleici sunt substane, care aa cum o indic numele lor, au fost pentru
prima dat izolate din nucleii celulelor. De fapt, mai trziu s-a evideniat, existena
acizilor nucleici att n nucleu ct i n citoplasma celulelor. Dei denumirea general
nu este cea mai adecvat a fost totui pstrat din considerente istorice.
Exist dou tipuri de acizi nucleici:
a) ADN (acid deoxiribonucleic) localizat n principal n nucleul celulelor dac
acesta este individualizat, cum este cazul eucariotelor;
b) ARN (acid ribonucleic), prezent n principal n citoplasma celulelor dar i n
nucleu.
Interesul studierii acizilor nucleici: acizii nucleici ADN i ARN au rol esenial
n sinteza proteinelor, compui fundamentali ai celulei, suportul marii majoriti a
activitilor biologice.
ADN conine informaia genetic necesar funcionrii celulare i deci i
programul sintezei proteinelor. El este responsabil de dictarea ordinii n care
aminoacizii se leag ntre ei pentru a da natere unei proteine adecvate. ADN este un
element permanent al celulei, informaiile coninute n structura sa fiind transmise
descendenilor. Din acest motiv se afirm c ADN este suportul ereditii. Majoritatea
tipurilor de acizii ribonucleici, ARNr, ARNt i ARNm, sunt moleculele implicate n
realizarea sintezei proteice.
Molecula de ADN este cea mai mare din organism, masa sa molecular variind
de la 10 -105 pb, la virusuri, la 108-109 pb, la mamifere. Din punct de vedere structural,
3

acizii nucleici sunt molecule polinucleotidice foarte mari formate din repetiia unor
subuniti numite nucleotide (Figura 1.1).
Unitile nucleotidice sunt formate din acid fosforic, un monozaharid cu cinci
atomi de carbon i o baz purinic sau pirimidinic.

11
Figura 1.1. Structura polimer a acizilor nucleici

2. Bazele azotate

n structura nucleotidelor i a polimerilor lor intr cinci baze azotate majore


care le confer proprieti eseniale pe care le vom trece n revist n continuare.
Acestui grup i se adaug bazele modificate enzimatic n structura acizilor nucleici,
dup sinteza acestora, i care reprezint adesea, semnale chimice de protecie i
control.
Diferitele baze din structur au origini diverse: intermediari metabolici,
produi de transformare chimic n condiii celulare, analogi de sintez, etc.

2.1. Tipuri de baze azotate

2.1.1. Baze majore

Sunt derivai oxi- sau amino- ai pirimidinei i ai purinei (imidazolpirimidin)


care formeaz cele dou familii de baze care intr n constituia nucleotidelor naturale.
n figura 1.2 sunt prezentate cele dou tipuri, n conformitate cu numerotarea
convenional normal, iar n tabelul 1 sunt trecute simbolurile acestora.
Numele utilizate curent nu sunt corelate cu denumirile sistemice folosite n
chimia organic. Anumite denumiri evoc sursa unde bazele azotate au fost
descoperite: guanina de la guano (excremente de pasre), timin de la evidenierea sa
n timus de vac. Pe de alt parte prin terminaia sa -ozin, citozina ntreine o
anumit confuzie interfernd cu denumirea unor nucleozide.
Baze pirimidinice: pirimidina; citozina (2-oxi-4-aminopirimidina); uracilul
(2,4-dioxipirimidina); timina (5-metil-2,4-dioxipirimidina);
Baze purinice: purina (imidazolpirimidin); adenina (6-aminopurina); guanina
(2-amino-6-oxipurina).

12
Figura 1.2. Bazele majore din structura acizilor nucleici

Nucleotidele din structura ADN i ARN nu conin dect patru baze azotate: trei
dintre acestea sunt comune celor dou tipuri de acizi nucleici - cele dou purine i
citozina i cte una este specific pentru fiecare tip: baza pirimidinic timina este
specific pentru ADN i derivatul su metilat, uracilul pentru ARN.

2.1.2. Baze modificate

n structura acizilor nucleici sunt prezente o serie de forme modificate sau


substituite ale bazelor azotate. Situsurile de modificare sunt prezente la nivelul ciclului
sau sunt exociclice. Pentru nomenclatur, n primul caz, este suficient indicarea
numrului atomului, n timp ce n al doilea caz sunt necesare indicaii privind natura
gruprii modificatoare i poziia n ciclu a atomului pe care aceasta se grefeaz (Figura
1.3).
ADN reprezint un bun substrat pentru metilarea bazelor purinice n anumite
regiuni ale moleculei (Figura 1.3). Rolul unora dintre aceste modificri este cunoscut.
De exemplu, 5-metil-citozina din structura ADN de la plante i animale este un semnal
negativ de reglare a expresiei genelor. Gruparea metil favorizeaz conformaia inactiv
a ADN n form condensat i mpiedic fixarea factorilor de transcripie, deci
copierea informaiei n structura ARN;
13
Figura 1.3. Baze modificate: N6-metil adenina (bacterii) 5-metil- citozina (plante,
animale); hipoxantina.

Moleculele de citozin metilate din structura ADN bacterian au cel puin dou
roluri:
i) constituie un sistem de distincie i de protecie a ADN bacterian fa de
ADN strin. Celula activeaz de fapt enzime de restricie (endonucleaze) pentru a
distruge ADN viral nemetilat, cel puin n cazul primei infectri. Acest sistem de
aprare este cunoscut sub numele de restricie-modificare;
ii) sunt elemente ale sistemului de corectare a eventualelor greeli de replicare.
Moleculele de ARN, i mai ales ARNt conin un numr variat de baze
modificate derivate de la purin (hipoxantina derivat de la guanin) sau de la
pirimidin.
Degradarea bazelor purinice implic reacii de deaminare: dac nu sunt
reciclate, bazele purinice sunt degradate la acid uric trecnd prin formele deaminate
hipoxantin i xantin. Acidul uric, foarte puin solubil, este produsul de excreie al
acestor baze la primate (Figura 1.4).
n aceeai categorie cu produii amintii mai sus putem introduce alcaloizii
vegetali, cu structur de metil-xantine, care au i utilizri farmacologice: cafeina
(stimulant), teobromina i teofilina (stimulatori cardiaci, relaxani ai musculaturii
netede i vasodilatatorii)
Analogii sintetici sunt molecule utile, care intr n structura acizilor nucleici i
pot avea utilizri diferite:
- a) n biologia molecular: 5-bromo-uracilul este mutagen; de asemenea exist
derivai fluoresceni care servesc drept reactivi de marcare pentru polinucleotide;
- b) n medicin ca ageni terapeutici: intr n competiie cu bazele naturale; se
comport ca antimetabolii ai sintezei acizilor nucleici i pot avea astfel rol
bacteriostatic; ageni antivirali; antimitotici. n figura 1.5 sunt prezentate cteva
exemple: i) derivaii fluorurai, tiol i aza care sunt substane cu aciune antitumoral;
14
ii) derivat ester al N9-metilguanin care este un agent antiviral eficace fa de herpesul
genital (comercial aciclovir).

Figura 1.4. Produii de


degradare i alcaloizii
vegetali derivai ai baze-
lor purinice. (Xantina;
acidul uric; 1,3-dimetil-
xantina = teofilina; 3,7-
dimetilxantina = teo-
bromina; 1,3,7-trimetil
xantina = cafeina)

2.2. Proprietile bazelor azotate

n urma examinrii structurilor din figura 1.2 se constat urmtoarele:


a) dublele legturi creeaz sisteme conjugate cu consecine structurale i fizice;
b) heterociclurile azotate sunt susceptibile de ionizare, caracterul lor de baze
slabe variind n funcie de substituenii ciclurilor;
c) moleculele prezint dualitate: gruprile funcionale sunt purtate de nuclee
heterociclice. Caracterul dual este la originea principalelor interacii principale din
structura polinucleotidelor i determin funciile acestora.
d) reactivitatea acestor structuri faciliteaz diferite transformri chimice, n
anumite condiii celulare.

2.2.1. Conjugarea dublelor legturi

n structura heterociclurilor purinice i pirimidinice starea de rezonan, care


apare ntre atomi, delocalizeaz electronii ai dublelor legturi. Consecinele sunt cele
ale caracterului aromatic: i) stabilizarea puternic a moleculei; ii) structurile sunt
aproape plane (pirimidinele sunt plane i purinele uor pliate); iii) moleculele exist
sub diferite forme tautomere.

15
Tautomeria care apare la nivelul gruprilor ceto/enol i amino/imino i
deplasrile de electroni din structura ciclurilor au drept consecin existena mai multor
posibiliti structurale. Figura 1.6 prezint cteva dintre formele tautomere ale
diferitelor baze azotate. Prin tehnici de cristalografie i prin spectroscopie n infra-rou
s-a demonstrat c la pH 7,0 sunt predominante formele ceto-amino.
Heterociclii cu azot i derivaii lor nucleozidici i nucleotidici prezint spectre
de absorbie molecular caracteristice n ultraviolet (UV). Absorbana derivailor
purinici este mai important dect a celor pirimidinici. Existena celor dou cicluri
determin o condensare mai dens a sarcinilor deoarece acestea sunt mai dens
conjugate. Aceste proprieti optice permit dozarea i controlul puritii nucleotidelor
i a acizilor nucleici. Raportul absorbanelor la lungimi de und de 260 i 280 nm ne
ofer informaii importante privind puritatea compuilor nucleotidici i eventuala lor
contaminare cu proteinele. Aminoacizii triptofan, tirozin, fenilalanin, prezeni n
proteine, confer acestora absorban la 280 nm.
Fluorescena bazelor este o caracteristic care nu poate fi utilizat n aceste
scopuri. Emisia fluorescent se situeaz n regiunea spectrului UV ntre 300 i 320 nm
i este foarte sczut: pentru purine sensibilitatea este de 400 de ori mai mic dect cea
a triptofanului, i pentru pirimidine de 2500 de ori mai mic.

Figura 1.5. Civa analogi sintetici ai bazelor din structura acizilor nucleici:
5-bromouracil, aciclovir (2-hidroxi-etoxometil guanin), 5-fluoro-
uracilul; 6tiopurina; 8-azaguanina;

16
Figura 1.6. Echilibre tautomere posibile la pH 7,0 ntre formele lactam (la
stnga) i lactim (la dreapta) ale bazelor pirimidinice i purinice
(prezente sunt form nucleozidic sau nucleotidic).

2.2.2. Ionizarea heterociclurilor azotate

Purinele, pirimidinele i nucleotidele derivate de la acestea sunt baze slabe ale


cror molecule nu au sarcin ionic la pH 7,0. Pentru cele mai multe structuri
comportamentul la titrare este complex deoarece posed multiple situsuri poteniale
donoare sau acceptoare de protoni cu localizare diferit n funcie de forma tautomer
implicat (ea nsi dependent de pH).

2.2.3. Nuclee i grupri funcionale

Faptul c heterociclii substituii sunt relativ hidrofobi are urmtoarele


consecine:
i) solubilitatea sczut n ap a bazelor acizilor nucleici (contrar structurilor
pirimidinice i purinice din care deriv). La pH i temperatur fiziologic bazele
purinice sunt aproape insolubile. La valori de pH acide sau bazice dizolvarea lor n
mediu apos este favorizat de ionizare;

17
ii) un efect de respingere al apei de ctre bazele ale cror planuri tind s se
suprapun. Aceast tendin reprezint fenomenul de stivuire sau stacking care este
foarte mult studiat. n figura 1.7 este prezentat modelul de stivuire a inelelor din
cristalul de 9-metil-adenin. Suprapunerea parial a inelelor reprezint o asociere
tipic a bazelor n structuri
cristaline i n dubla elice a acizilor
nucleici.

Figura 1.7. Stivuirea bazelor n cristalul de


9-metil-adenin (dup Biochemistry, Voet
& Voet, 1995)

De mai bine de treizeci de ani s-au realizat studii numeroase de difracie cu


raze X pe cristale ale diferiilor derivai ai bazelor i asupra comportamentului acestora
n soluie (vscozitate, presiune osmotic, absorban, spectre RMN i IR). Acestea au
dovedit c heterociclurile au o puternic tendin de a se suprapune plan peste plan, cu
un decalaj caracteristic ntre planuri.
n soluie, condiia cea mai interesant pentru extrapolarea interaciilor
celulare, apa are rolul determinant n formarea i stabilizarea acestor stivuiri. Repulsia
apei prin efectul hidrofob al nucleelor reprezint unul din motivele pentru care apare
acest tip de organizare. Legturile de hidrogen sunt total excluse. Stabilizarea se
realizeaz prin fore Van der Waals i interacii dipol-dipol ntre planuri. Apropierea
dintre nuclee modific distribuia lor electronic i determin apariia dipolilor n
fiecare ciclu.
Cu toate acestea, trebuie s remarcm c originea forelor care dirijeaz
asocierea spontan, remarcabil, rmne nc subiect de controverse. Reinem c
fenomenul nu este asimilabil cu cel de repliere hidrofob a proteinelor deoarece are un
caracter contrar. Datele termodinamice demonstreaz c acesta este controlat de

18
entalpie n timp ce fenomenul caracteristic resturilor aromatice din proteine este
controlat de entropie.
Faptul c bazele se stivuiesc ntr-o ordine preferenial: pur-pur>pur-pir>pir-
pir a fost demonstrat de valorile constantelor de disociere ale diferitelor combinaii de
baze, n soluie, i de frecvena dimerizrii timinei prin fotoreactivare.
Aceast prim modalitate de interaciune ntre baze este un factor primordial
de stabilizare a structurii spaiale a acizilor nucleici, responsabil de efectul hipocrom
al acizilor nucleici. Stivuirea bazelor are drept consecin scderea absorbiei n UV a
unui acid nucleic fa de o soluie echivalent de nucleotide libere, urmat n acelai
timp de deplasarea spectrului cu civa nm. Temperatura care, prin efectul su de
cretere a agitaiei moleculare este un factor de dezorganizare, nltur
hipocromicitatea (Figura 1.8). Efectul temperaturii asupra forelor de stivuire poate fi
urmrit comparativ n cazul unui polinucleotid i a unui dinucleotid (Figura 1.9)

Figura 1.9. Variaia absorbiei relative la 258 nm cu


creterea temperaturii:a) polimerul poli (A); b)
dinucleotidul ApA (dup Biochemistry,Voet&Voet,1995)
Figura 1.8. Absorbia diferit n UV a
moleculelor de ADN mono- i
dublucatenare nsoit de deplasarea
spectrului de absorie

Capacitatea de a forma legturi de hidrogen: grupele polare fixe, carbonil i


amino, i atomii de azot ai ciclurilor sunt adecvate pentru stabilirea legturilor de
hidrogen ntre baze, de tip O---H i N---H. Aceast a doua modalitate de interaciune,
19
coordonat de mperecherea necovalent dintre baze, este un fenomen cheie pentru
formarea structurii secundare a acizilor nucleici i pentru duplicarea, copierea i
exprimarea materialului genetic. Formele tautomere, n care se gsesc partenerii
bazelor, au o importan foarte mare deoarece condiioneaz posibilitatea formrii
acestor legturi.

2.2.4. Transformarea chimic a bazelor

n celule, bazele din structura acizilor nucleici suport alterri spontane sau sub
efectul diferiilor ageni fizici sau chimici. Dac aceste modificri nu sunt reparate
(ADN este singura molecul supravegheat i reparat de ctre un sistem specific), ele
pot sta la originea mutaiilor care determin apariia diferitelor maladii (de ex. cancer).
Deaminare spontan lent, cu oxidarea grupelor amino exociclice, modific
natura bazei. innd cont de structurile bazelor azotate din compoziia nucleotidelor
putem evidenia urmtoarele transformri (Figura 1.10):

citozina uracil; 5-metilcitozin timin;


adenin hipoxantin; guanin xantin.

ntr-o celul de mamifer, frecvena deaminrilor spontane este de ordinul


100/zi pentru citozin, i de numai 1/zi pentru bazele purinice.
Radiaiile energetice altereaz mai mult sau mai puin profund bazele din
structura acizilor nucleici: i) iradierea UV deschide dublele legturi din structura a
dou baze suprapuse i determin formarea de legturi covalente C-C ntre acestea.
Dimerizarea pirimidinelor (timinelor), este un factor care estimeaz capacitatea de
carcinogenez a acestor radiaii; ii) radiaiile ionizante (X, , etc.) deschid ciclurile i le
rup;
Numeroi ageni chimici reacioneaz cu bazele: i) acidul azotos (HNO2) i
compui organici i minerali derivai de la acesta: nitrozamine, nitrii i nitrai ca i
acidul sulfuros (HSO3-) au aciune de deaminare (Figura 1.11). n industria alimentar
regsim aceti compui n categoria conservanilor utilizai pentru a mpiedica
dezvoltarea bacteriilor. ii) mediul industrial este surs de substane toxice alchilante
care determin metilarea diferitelor baze (guanina este cea mai uor de metilat); iii)
speciile reactive de oxigen - peroxizii, radicalii liberi, oxigenul singlet - sunt
favorizate prin expunere la lumin i determin modificri oxidative la nivelul bazelor
care oblig sistemele de reparare s reacioneze.

20
Figura 1.10. Reacii de dezaminare ale bazelor: a) citozin la uracil; b) 5-metil-citozin la timin

Figura 1.11. Dezaminri


provocate de acidul azotos i
consecinele acestora

21
3. Nucleozide

3.1. Pentoza nucleozidelor

3.1.1. Natur i configuraie

n structura acizilor nucleici glucidele implicate sunt riboza (Rib) n acizi


ribonucleici i derivatul su 2-deoxiriboza (dRib) - n acizii deoxiribonucleici. Acestea
au urmtoarele caracteristici de configuraie (Figura 1.12):
Serie steric D
Ciclizare hemiacetalic furanoz
Anomerie (beta)

3.1.2. Legtura cu baza azotat

Legtura cu baza este de tip N-glicozidic. Aceasta se stabilete ntre


carbonul 1 al pentozei i azotul N1 al pirimidinelor i N9 al purinelor (se realizeaz
numerotarea bazei i apoi se rencepe prin numerotarea ribozei, dnd numerelor
apelativul prim) (Figura 1.13). Astfel se obin ribo- i deoxiribonucleotidele a cror
nomenclatur o prezentm n tabelul 1.1. Ca regul general trebuie s reinem sufixul
-idin pentru nucleozidele pirimidinice i -ozin pentru nucleozidele purinice.

Figura 1.12. Structurile


furanozice ciclice cu
anomerie ale ribozei i
deoxiribozei

Legtura N-glicozidic, asemenea legturii O-glicozidice, rezist la tratament


alcalin. Reacia sa cu acizii depinde de baza azotat: nucleozidele purinice se
hidrolizeaz uor, n timp ce pentru a degrada nucleozidele pirimidinice este necesar
aciunea prelungit a unui acid concentrat. Se estimeaz c ntr-o zi, ntr-o celul de
mamifere, numai unul din 105 nucleotidele purinice i pierde baza.

22
Tabel 1.1 Denumire i simbol cu trei litere i cu o liter pentru baze i nucleozidele lor

Baze azotate Ribonucleozide Deoxiribonucleozide


Nume S Nume Simbol Nume Simbol
3L 3L 1L 3L 1L
Baze nucleozide 2deoxiribonucleozide
pirimidinice Pyr pirimidinice Pyd Y pirimidinice dPyd dY/Yd
Citozin Cyt citidin cyd C 2-deoxicitidin dCyd dC/Cd
Uracil Ura Uridin Urd U 2-deoxiuridin dUrd dU/Ud
Timin Thy Ribozil-timin Thd T (2-deoxi) timidin dThd dT/Td
Baze nucleozide 2deoxiribonucleozide
purinice Pur purinice Puo R purinice dPuo dR/Rd
Adenina Ade Adenozin Ado A 2-deoxiadenozin dAdo dA/Ad
Guanina Gua Guanozin Guo G 2-deoxiguanozin dGuo dG/Gd
Xantina Xan Xantozin Xao X 2-deoxixantozin dXao dX/Xd
Hipoxantina Hyp Inozin Ino I

Figura 1.13. Legtur -N glicozidic


ntre o baz purinic i riboz

3.2. Conformaia nucleozidelor

Deoarece heterociclul plan al bazelor nu este deformabil, izomeria de


conformaie este dat de glucid i de legtura glicozidic.

3.2.1. Conformerii pentozei

Ciclul furanozic al pentozelor nu este plan ci prezint o structur spaial


caracteristic. Aceast structur este rezultatul flexibilitii legturilor prezente n
heterocicluri. Sunt recunoscute dou tipuri de conformaii: E sau anvelope i T sau
twist ale cror niveluri de energie sunt apropiate. Conformaia T reprezint o form
intermediar puin stabil care apare prin deformarea conformaiei E. Conformaia T
23
(twist), prezint numai trei atomi coplanari: atomul de oxigen i cei doi atomi de
carbon adiaceni. Ceilali doi atomi de carbon se deprteaz lejer de o parte i de alta.
n cazul conformaiei E (anvelope), sunt patru atomi adiaceni-oxigenul i
trei atomi de carbon-care pot fi considerai mpreun ca formnd un plan. Deviaiile
dintre acetia sunt foarte mici, de ordinul picometrilor. n urma studiilor realizate
pentru structura cristalin a peste 50 de nucleozide i nucleotide, s-a demonstrat c cel
de al cincilea atom se deprteaz la cteva zecimi de nanometri (mai puin de 0,05 nm;
distana ntre cele dou nuclee ale atomilor implicai ntr-o legtur covalent C-C fiind
de ordinul 0,15 nm) (Figura 1.14).
Aceste conformaii sunt desemnate ca endo dac C care deviaz din plan este
de aceeai parte a planului cu carbonul C5, i exo dac acesta se afl orientat n
direcie opus. Nomenclatura adoptat este cea de E i T cu referire la atomii de carbon
exoplanari.
La marea majoritate a nucleozidelor, atomii de C exteriori sunt C2 i C3. Dou
dintre cele mai probabile conformaii pentru D-riboz i pentru derivatul su 2-deoxi-
riboz din structura nucleotidelor, sunt prezentate n figura 1.15. Conformaia ribozelor
impune polinucleotidelor structuri spaiale diferite.

3.2.2. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice

n cazul legturii peptidice rigide i n cazul legturilor C-C din structura


acizilor grai, este asigurat o anumit libertate de rotaie substituenilor caracteristici
care stau la originea conformaiilor structurale multiple. n cazul nucleozidelor,
nucleotidelor i acizilor nucleici legtura glicozidic C1-N permite rotaia bazei
azotate n jurul legturii i situarea sa n dou poziii diametral opuse n raport cu
pentoza (Figura 1.16).
Pentru conformaia syn (mpreun), planul bazelor este orientat de aceeai
parte cu riboza, n timp ce pentru conformaia anti (contrar), orientarea este contrar. n
cazul nucleozidelor pirimidinice singur conformaie natural admis este anti
deoarece carbonul din poziia 2 purttor de grupare carbonilic determin apariia unor
fore de respingere cu oxigenul ciclului ribozic.
n figura 1.16 este prezentat modul convenional de definire a regiunilor syn i
anti n funcie de unghiul de torsiune : i) considerm rotaia dreapt a lui N1 ctre C1
n jurul legturii considerate; ii) axa de referin (00) este reprezentat de legtura C1-
O4 din pentoz; iii) legturile bazelor considerate pentru calcularea unghiului sunt
N1-C2 pentru pirimidine i N9-C4 pentru purine.
24
Figura 1.15. Cele mai probabile conformaii ale
ciclului furanozic (riboz i deoxiriboz) din structura
Figura 1.14. Cele dou conformaii pe care le
nucleotidelor. a) perspectiv; b) vedere din fa (planul
adopt pentoz n structur acizilor nucleici:a) E
atomilor coplanari perpendiculari pe planul paginii)
(anvelope) i b) T (twist) (dup Biochemistry,
(dup Biochemistry, Voet&Voet,1995)
Voet&Voet, 1995)

Figura 1.16. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice i definirea unghiului de torsiune (n raport
cu legtura N9-C1 i N1-C1).

Constrngerile sterice i interaciunile limiteaz posibilitile de rotaie: i)


purinele pot s adopte dou conformaii n timp ce pentru pirimidine, interferena
dintre gruparea hidroximetil a ozei (ribozei, deoxiribozei) i oxigenul gruprii carbonil,
defavorizeaz puternic conformaia syn i avantajeaz conformaia anti; ii)
probabilitatea existenei unuia sau a altuia dintre rotameri (izomeri de rotaie sau
conformeri de rotaie) depinde i de conformaia adoptat de pentoz.
Mai trziu se va discuta incidena acestei rotaii asupra conformaiei finale a
polinucleotidelor.

3.3. Nucleozide naturale i de sintez

3.3.1. Nucleozidele: metabolii i constitueni ai cofactorilor enzimatici

Ca i bazele lor, nucleozidele se regsesc ca intermediari n metabolismul


nucleotidelor: inozitol fosfatul este precursorul comun al nucleotidelor care conin n
structur adenozin i guanozin.
Alte nucleozide se regsesc sub form de cofactori sau coenzime. De exemplu,
adenozina este prezent: i) legat de gruparea sulfhidril a metioninei (Figura 1.17)
formnd S-adenozilmetionina, cofactor care asigur transferul unei grupri metil; ii) n
molecula coenzimei B12, sub forma 5-deoxiadenozil cobalamin (Figura 1.18); iii) n
fosfoadenozil fosfosulfatul (PAPS, Figura 1.17) care este implicat n reaciile de
sulfatare a glicanilor i a lipidelor; adenozin 3, 5 -difosfat fixeaz o grupare sulfat
printr-o legtur anhidridic, format ntre acid sulfuric i fosfatul din poziia 5 (Tabel
1.2).

Tabel 1.2. Coenzime i molecule intermediari metabolici n structura crora intr adenozina
Compusul funcia nucleotidul sau legtura cu restul
nucleozidul din structur moleculei
Coenzima A (CoA) acilare adenozin 3-fosfat ester: 5 diP-alcool
5-difosfat (Ado3P,5PP)
Flavin adenin dinucleotid Oxido-red adenozin 5-difosfat ester: 5 diP-alcool
(Ado 5 PP, ADP)
Nicotinamid adenin Oxido-red adenozin 5-difosfat ester: diP-oz
dinucleotid (NAD i NADP) (Ado 5 PP, ADP)
Coenzima B12 (Co B12) depl. grup. 5-deoxiadenozin C5-Co din nucleu
(5 dAdo)
Fosfoadenozin fosfosulfat trans.sulfat adenozin 3,5-bisfosfat andidrid:5P-sulfat
(Ado3P5PS, PAPS) (Ado3,5diP)
S-adenozilmetionin transf. metil Adenozin (Ado) sulfhidril: C5-
(AdoMet) S(Met)
.

26
Figura 1.17. Exemple de nucleozide care intr n structura unor metabolii sau/i cofactori: a) S-
adenozilmetionina (SAM); b) inozina (hipoxantin riboz); c) fosfoadenozilosfosulfat
(PAPS)

3.3.2. Nucleozide atipice naturale

Sunt cunoscute i analizate o serie de nucleozide atipice natural:


a) prezente alturi de alte baze minore n structura ARNt: pseudouridina, uracil
legat de riboz prin intermediul carbonului C5 i nu prin intermediul azotului, formnd
o legtur C-glicozidic (ozidic) excepional. Acest nucleozid i derivatul obinut
prin reducere, 5, 6 dihidrouridina, sunt prezente n majoritatea moleculelor de ARNt i
reprezint cele mai abundente nucleozide minore. Derivaii 2-O-metilai ai ribozei
constituie puncte de rezisten la hidroliza enzimatic sau alcalin a ARNt.
b) microorganismele produc nucleozide libere n structura crora riboza este
nlocuit cu arabinoz (Ara), cu aceeai configuraie. Deoarece au fost pentru prima
dat izolate din spongieri, aceste substane au fost denumite spongiozide i
spongionucleotide. Arabinozilcitozina i arabinoziladenozina sunt folosite n terapia
antiviral (Ara-Ade contra virusului Herpex) i anticanceroas (Ara-Cyt n tratamentul
leucemiilor). Inactivarea lor enzimatic este ntrziat prin transformarea n derivai
carbociclici (Figura 1.19);
c). Puromicina este un antibiotic, inhibitor al sintezei proteice, secretat de
Streptomyces. n acest nucleozid, foarte substituit, baza este reprezentat de adenozin
N-dimetilat iar pentoza este o ribozamin dimetilat ataat printr-o legtur amidic
la O-metiltirozin (Figura 1.19). Antibioticul intervine la nivelul sintezei proteice att la
procariote ct i la eucariote, pe care o blocheaz.

27
Figura 1.18. Structura moleculei B12 conine nucleozidul 5deoxiadenozil

Figura 1.19. Nucleozide atipice naturale: pseudouridina, arabinozil-citozina, arabinozil-adenozina, puromicina

3.3.3. Nucleozide de sintez

Nucleozidele de sintez completeaz arsenalul de analogi antagoniti. Dintre


structurile existente exemplificm: a) formele deoxi-, halogenate sau nu ale
nucleozidelor purinice i pirimidinice cu proprieti bacteriostatice: 3-deoxiadenozina
foarte eficace mpotriva Bacillus subtilis;
b) 6-azauridina este de un mare interes n tratamentul maladiilor proliferative
ale epidermei, iar derivatul su triacetat n psoriazis (Figura 1.20).

28
Figura 1. 20. Nucleozide de sintez: 3deoxiadenozina, 6-azauridina

Figura 1.21. Adenozin 5-monofosfat (adenilat, AMP)

29
4. Nucleotide

4.1. Tipuri de nucleotide

Sunt esteri fosfat ai nucleozidelor. Primele lor denumiri bazate pe numrul de


grupri fosfat prezente n molecul (mono-, di-, trifosfai) au fost nlocuite printr-o
nomenclatur care nltur ambiguitile. De fapt, n nucleotidele naturale:
a) fosforilarea privete gruparea hidroxil legat la unul sau mai muli atomi de
carbon din ciclul pentozei: nucleotidul este un nucleozid mono-, di- sau trifosfat;
b) gruparea fosfat poate ea nsi s fie angajat: i) cu alte molecule de acid
fosforic n condensri anhidridice; ii) cu un nucleotid cu structur de nucleozid di- sau
trifosfat, deoarece aceast combinaie i cea de mai nainte nu se exclud;
c) o alt grupare hidroxil, printr-o a doua legtur ester poate nchide molecula
i determina formarea de nucleotide ciclice.
Acizii nucleici sunt polimeri de nucleozide monofosfat. Celelalte nucleotide
intervin n biosinteza acestora i n alte tipuri de interaciuni de tipul acelora evocate
mai sus. Nomenclatura i tipurile de nucleotide este prezentat n tabelul 1.3.

4.1.1. Mono- i difosfat nucleozide

4.1.1.1. M onofosfat n ucleozide

Polifosforilarea C5 nu este o reacie foarte curent. Acizii nucleici sunt


polimeri de nucleozide 5-fosfat. Existena legturii internucleotidice 3OH-5P poate
fi dovedit prin eliberarea de nucleozide 3-fosfat, n anumite etape ale hidrolizei lor.
n figura 1.21. este prezentat mononucleotidul derivat de la adenozin, care are i o
serie de alte implicaii metabolice.
Constantele de disociere acide (pKa) ale gruprilor fosforice fixe fac ca la
temperatur i pH fiziologic gruprile s conin dou sarcini negative: molecula este
un acid (valoarea pKa a primei etape de ionizare este apropiat de 1,0) de unde i
denumirea de acid pe care l atribuim acestor esteri-fosfai (Tabel 1.3).
Solubilitatea lor n ap este variabil dar rmne redus. Proprietile optice de
absorbie sunt datorate bazelor prezente n structur i au fost trecute n revist n
paragrafele anterioare.

30
4.1.1.2. Difosfat nucleozide

Aceste structuri sunt rare. Cele mai bine reprezentate sunt nucleotidele derivate
de la adenin care sunt prezente n structura moleculelor de activare sau a coenzimelor
(Tabel 1. 2). De exemplu adenozin 3, 5 -difosfat fixeaz o grupare sulfat printr-o
legtur anhidridic, format ntre acidul sulfuric i fosfatul din poziia 5.
Fosfoadenozil fosfosulfatul (PAPS) este implicat n reaciile de sulfatare a glicanilor i
lipidelor (Figura 1.17); De asemenea, adenozin 3-fosfat 5-difosfat (exemplu de
nucleotid diester mixt i anhidrid) formeaz o parte a moleculei coenzimei A,
implicat n procesul de acetilare.

4.1.2. Polifosfat nucleozide

Difosfat nucleozidele rezult din fixarea, prin legtur anhidridic acid, a


celei de a doua molecule de acid fosforic, la nivelul esterului fosforic al carbonului
C5. Reluarea reaciei la nivelul acestui nucleozid difosfat (la nivelul celei de a doua
molecule fosfat) conduce la obinerea nucleozid trifosfailor. Pentru exemplificare
lum n discuie nucleotidul care conine adenin (Figura 1.22).
Consecina imediat a structurii este marea densitate de sarcini negative n
condiii fiziologice: trei pentru difosfat i patru pentru trifosfat. Acestea ridic
probleme pentru: i) echilibrul electric al celulei, concentraia de nucleotide libere fiind
obligatoriu limitat; ii) fixarea acestor molecule la nivelul structurilor vii. Cationii
divaleni de magneziu i mangan temporizeaz repulsiile electrostatice care pot s
apar (Figura 1.23).
Aceti compui au un nalt potenial energetic. n condiii celulare, legturile
de tip anhidrid acid au o entalpie liber de hidroliz superioar legturilor ester-
fosfat (de ordinul a 30 kJ/mol). ATP este molecula selecionat evolutiv de ctre
organisme pentru a constitui rezerva temporar i sursa de energie utilizabil de ctre
materia vie (Figura 1.24), cu toate c n cteva reacii metabolice intervin i CTP, GTP i
TTP.
De hidroliza ATP depind: i) realizarea unor aciuni fizice cum sunt contracia
muscular i transportul activ al ionilor i moleculelor; ii) reaciile chimice care sunt
termodinamic imposibile fr cuplare energetic.
O diversitate mai mare de nucleotide sunt utilizate in vivo ca suport molecular
de activare a grupelor sau moleculelor indispensabile intrrii acestora n reaciile

31
metabolice. Activarea-fixarea se realizeaz prin consumarea unei legturi anhidrid
acid prezent n structura unei molecule de nucleotid trifosfat:
a) etanolamina i colina sunt activate de ctre CDP (Figura 1.25);
b) glucidele sunt activate fie prin intervenia: i) UTP i mai rar de GTP i CTP,
pentru biosinteza glicanilor i a lanurilor glicozilate ale proteinelor; ii) ATP care
reprezint donorul de energie i de grupri fosfat pentru fosforilare.
Biosinteza polimerilor nucleozidici 5-monofosfat (acizii nucleici) se
realizeaz prin condensarea precursorilor trifosfat energia necesar formrii legturii
covalente fiind furnizat de hidroliza legturii anhidridice. Este foarte clar c celula
trebuie s ntrein permanent o rezerv i s echilibreze necesarul de NTP, aa cum
procedeaz n cazul aminoacizilor necesari sintezei proteice.

Tabel 1.3. Nomenclatura i simbolurile diferitelor tipuri de nucleotide (sunt figurate numai
ribonucleotidele, n afar de timin care servete ca exemplu pentru deoxiribonucleotide).

Nucleotide* fosfat la nivelul a diferii atomi de carbon (x, y: nr. atomilor de C ai pentozei)
Nume Simboluri
Formul general Nucleozid x, y-bifosfat Nuc x, y P2
Exemple adenozin 3-5-bifosfat Ado3, 5 P2
Nucleotide mono- i polifosfat (cu gruparea fosfat la nivelul aceluiai atom de carbon)
Nume Simboluri
Formul general Nucleozid x-fosfat* Nuc5P NMP
x-difosfat Nuc5PP NDP
x-trifosfat Nuc5PPP NTP
Aplicaii citidin 5-fosfat Cyd5P CMP
5-difosfat Cyd5PP CDP
5-trifosfat Cyd5PPP CTP
uridin 5-fosfat Urd5P UP
5-difosfat Urd5PP UDP
5-trifosfat Urd5PPP UTP
dtimina 5-fosfat dThd5P dTMP
5-difosfat dThd5PP dTDP
5-trifosfat dThd5PPP dTTP
adenozina 5-fosfat* Ado5P AMP
5-difosfat Ado5PP ADP
5-trifosfat Ado5PPP ATP
guanozin 5-fosfat Guo5P GMP
5-difosfat Guo5PP GDP
5-trifosfat Guo5PPP GTP
Nucleotide ciclice (puni fosfodiester ntre Cx i y din pentoz)
Nume Simboluri
Formul general nucleozid x:y fosfat Nucx:yP NMPc
Aplicaii adenozin 3:5-fosfat Ado3 :5P AMPc
guanozin 3:5-fosfat Guo3:5P GMPc
*- caracterul acid al nucleozid monofosfailor face ca ele s fie denumite i:
acid 5-citidilic (forma acid) sau 5-citidilat (forma ionizat);
acid 5-uridilic (5-uridilat); acid 5-timidilic (5-dtimidilat);
acid 5-adenilic (5-adenilat); acid 5-guanilic (5-guanilat).

32
Figura 1.22. Structura nucleozid
polifosfatului derivat de la adenin
(ATP)

Figura 1.23. Complexe ATP Mg2+

Figura 1.24. Structurile AMP, ADP i


ATP cu marcarea legturilor fosfoester i
fosfoanhidrid

33
O serie de nucleotide sunt constituenii ai coenzimelor. Adenozin 5-difosfatul
intr n structura a dou coenzime implicate n reacii de oxido-reducere: nicotinamid
adenin dinucleotid (NAD i omologul su fosforilat NADP) i a flavin adenin
dinucleotid (FAD) (Figura 1.26). Denumirea acestora are mai mult caracter istoric
deoarece partea a doua a moleculei are structur ciclic dar nu reprezint un nucleotid
n adevratul sens al cuvntului. Nucleotidul se leag la restul moleculei prin
intermediarul difosfatului su. Cofactorii nu intervin n procesul catalitic ca n cazurile
coenzimei A (Figura 1.27) i coenzimei B12 (Figura 1.18).
Mediatori extracelulari: nucleotidele extracelulare au fost recent recunoscute ca
mediatori. Eliberate prin liz celular sau prin exocitoza veziculelor membranare,
acestea se fixeaz pe receptorii celulelor int, avnd, n general, aciune activatoare.
Familia ATP (ADP i AMP) este cea mai bine reprezentat pentru aceast funcie de
comunicare celular.
n tabelul 1.2 sunt prezentate coenzime i a intermediari metabolici care conin
n molecul adenozin.

4.1.3. Nucleotide ciclice

n structura acestor derivai, un fosfat formeaz o punte fosfodiester


intramolecular care ciclizeaz molecula. Aceti compui au fost selecionai pentru
funciile lor n comunicare i semnalizare celular fiind repartizai n compartimentul
intracelular.
Mesagerii secundari: conceptul de mesager secundar a fost impus odat cu
descoperirea AMP ciclic (AMPc) n 1950 de ctre Sutherland. Un mesager secundar
este o molecul care asigur aciunea intracelular a unui semnal extracelular. Acest
semnal poate s fie un hormon sau un alt mediator i constituie primul mesager care se
fixeaz la suprafaa celular.
AMPc (Figura 1.28) este produs plecnd de la ATP la nivelul feei intracelulare
a membranei plasmatice n urma fixrii moleculei semnal. Producerea AMPc este
oprit, n momentul n care aciunea extern nceteaz, prin hidroliza uneia dintre
legturile ester, produsul 5-AMP fiind reciclabil.

34
Figura 1.25. Exemple de intermediari metabolici activai: CDP-diacil glicerol, CDP-etanolamin, UDP-glucoz

Figura 1.26. Structurile NAD(P)+ i FAD(H2)

35
Figura 1.27. Structura Coenzimei A forma activ SH.

Analiza reaciilor la care particip AMPc ne face s nelegem de ce aceast


molecul a fost aleas evolutiv drept mesager secundar universal. GMP ciclic (GMPc) are o
funcie similar dar pentru un numr foarte sczut de ci de semnalizare (Figura 1.28).

Figura 1.28. Nucleotide ciclice: AMPc i GMPc

4.2. Proprietile nucleotidelor

Componentele celulare care conin fie baze purinice, fie pirimidinice pot fi
uor detectate datorit absorbiei puternice a luminii ultraviolete. Bazele purinice,
nucleozidele i nucleotidele au absorbii mai puternice dect pirimidinele i derivaii
lor. Coeficienii de extincie molar (o msur a absorbiei luminii la lungimi de und
specifice) i lungimile de und (max.) corespunztoare acestora sunt prezentate n
tabelul 1. 4. Lungimea de und la care se nregistreaz absorbie maxim variaz, n
particular, cu baza din compoziia moleculei, dar n majoritatea cazurilor este apropiat

36
de 260 nm. Spectrul UV pentru fiecare dintre aceste nucleozide sau derivai
nucleotidici poate fi diferit n funcie de pH. Absorbiile UV puternice i diferenele
datorate structurii specifice a bazelor, din structur, furnizeaz metode sensibile de
dozare a acestor compui att din punct de vedere calitativ ct i cantitativ. De
exemplu, deaminarea citozinei din structura nucleozidului sau nucleotidului la derivaii
uracil corespunztori determin a deplasare a max. de la 271 nm la 262 nm, care este
uor de determinat. Datorit coeficienilor molari de extincie mari ai bazelor purinice
i pirimidinice n acizii nucleici, o soluie de ARN sau ADN de concentraie 1 mg/ml
va avea o absorban la 260 nm de aproximativ 20 uniti, n timp ce o soluie proteic
obinuit cu concentraia de 1 mg/ml va avea la 280 nm o absorban de aproximativ o
unitatea. n consecin, acizii nucleici pot fi uor detectai i n concentraii foarte mici.
Legtura N-glicozidic, din structura nucleozidelor purinice i pirimidinice,
este stabil n prezen de baze. Totui, stabilitatea acestei legturi la hidroliz acid
difer marcant. Legtura N-glicozidic din structura nucleozidelor i nucleotidelor
purinice se hidrolizeaz uor n prezen de acizi diluai i prin creterea temperaturii
(600C) conducnd la purine libere i glucide sau glucide-fosforilate. Pe de alt parte,
legtura N-glicozidic din nucleozidele derivate de la uracil, citozin i timin i din
nucleotidele derivate de la acestea este foarte stabil la tratament acid. Pentru
eliberarea pirimidinelor libere i completa distrugere a restului glucidic sunt necesare
condiii drastice de hidroliz, cum ar fi acid percloric (60%) i temperatur de 1000C.
Legtura N-glicozidic din structura nucleozidului derivat de la dihidrouracil este
sensibil la tratament acid moderat.
Datorit gruprilor fosfat foarte polare, nucleotidele purinice i pirimidinice
sunt mult mai stabile n soluii apoase dect nucleozidele i bazele libere din care
deriv. In general, nucleozidele sunt mult mai solubile dect bazele purinice i
pirimidinice libere.
Bazele purinice i pirimidinice, nucleozidele i nucleotidele derivate din
acestea pot fi uor separate printr-o serie de tehnici. Aceste metode sunt: cromatografie
pe hrtie, cromatografie n strat subire (Thin Layer Chromatography TLC),
cromatografie de schimb ionic, electroforez. Cele mai bune separri ale compuilor
purinici i pirimidinici s-au realizat prin cromatografie lichid de nalt presiune n faz
invers (High Presure Liquid Chromatography HPLC). Prin aceast tehnic pot fi
separate cantiti de ordinul nano-molilor din aceste componente ntr-o scurt perioad
de timp. n figura 1.29 este prezentat profilul de separare prin HPLC al unui amestec
format din baze, nucleozide i nucleotide. Dezvoltarea acestei tehnici prin introducerea

37
coloanelor de nalt rezoluie permite o determinare rapid a nucleozidelor i
nucleotidelor dintr-o numr mare i variat de celule n diferite stadii.

Tabel 1.4. Constante spectrofotometrice ale nucleozidelor purinice i pirimidinice

Nucleozidul Coeficientul molar de extincie max la pH 7,0


Adenozin 15,4 259
Guanozin 13,7 253
Citidin 8,9 271
Uridin 10,0 262
Timidin 10,0 262

Figura 1.29. Separarea bazelor, nucleozidelor i nucleotidelor prin cromatografie lichid de


nalt rezoluie (HPLC) n faz invers: Coloan Alltina C18-NUC, 5 m, 250 x
4,6 mm; faz mobil: gradient cresctor de fosfat i descresctor de metanol; debit
1,5 ml/min; detector UV 267 nm

4.3. Funcii metabolice ale nucleotidelor

Toate tipurile de celule (mamifere, bacterii, plante) conin o varietate foarte


mare de nucleotide i de derivai ai acestora. Unele dintre aceste nucleotide se gsesc
n cantiti importante n celule (de ordin mili-molar). Raiunea existenei unui numr
mare de nucleotide i de derivai ai acestora, n celul, este faptul c acestea sunt

38
implicate ntr-un numr foarte mare de procese metabolice care asigur creterea i
funcionarea normal.
Rol n metabolismul energetic: dup cum am prezentat mai sus ATP reprezint
principala form sub care energia este disponibil n celul. Cantitativ, ATP este
generat n celule prin fosforilare oxidativ i fosforilare la nivel de substrat. ATP este
folosit pentru a coordona reaciile metabolice, ca agent de fosforilare, fiind implicat i
n procesele de contracie muscular, transport activ i meninerea integritii
membranare. Ca agent de fosforilare, ATP servete drept donor de fosfat pentru
generarea altor nucleozide 5-trifosfat (GTP, UTP i CTP).
Uniti monomere ale acizilor nucleici: acizii nucleici, ADN i ARN, sunt
compui din uniti monomere, nucleotide. n reaciile de sintez ale acizilor nucleici,
nucleozidele 5-trifosfat sunt substrate care particip la formarea legturilor 3, 5-
fosfodiester cu eliberarea unei molecule de pirofosfat la fiecare condensare.
Mediatori fiziologici: una dintre cele mai recent recunoscute funcii ale
nucleotidelor i ale derivailor acestora este implicarea n procesul de mediere a unor
procese metabolice cheie. n primul rnd, trebuie luat n considerare rolul AMPc ca
mesager secundar n controlul glicogenolizei i glicogenezei mediat de epinefrin i
glucagon i n semnalizarea transmembranar prin intermediul proteinelor G. De
asemenea a fost recunoscut i importana GMPc ca mediator celular. O serie de studii
confirm rolul critic al concentraiei ADP n agregarea plachetelor n timpul coagulrii
sngelui. Adenozina provoac dilatarea vaselor de snge coronariene i poate avea un
rol important n reglarea fluxului de snge la nivelul coronarelor. GTP este necesar
unor reacii cum este prelucrarea post-transcripional a ARNm (adugarea capului),
transmiterea semnalului ctre proteinele G (GTP binding protein), i formarea
microtubulilor.
Componente ale coenzimelor: intr n structura NAD+, NADP+, FAD i CoA
care sunt constitueni celulari foarte importani cu rol critic n multe reacii metabolice.
Intermediari activai: nucleotidele au i rolul de transportori (carriers) ai
intermediarilor activai ntr-o serie de reacii metabolice. Compusul UDP-glucoz
este un intermediar cheie n sinteza glicogenului i glicoproteinelor. Compuii GDP-
manoz, GDP-fucoz, UDP-galactoz, i CMP-acid sialic sunt cu toii intermediari
cheie n reaciile n care monomerii glucidici sunt transferai pentru sinteza
glicoproteinelor. CTP este folosit pentru generarea CDP-colinei, CDP-etanolaminei i
CDP-diacilglicerolilor, care sunt implicai n metabolismul fosfolipidelor. De
asemenea, ali intermediari activai sunt S-adenozilmetionina (SAM) i 3-

39
fosfoadenozin 5-fosfosulfat (PAPS). S-adenozilmetionina este un donor de grupri
metil n reaciile responsabile de metilarea glucidelor i a bazelor din structura ARN i
ADN i n formarea unor compui cum sunt fosfatidilcolina, fosfatidiletanolamina,
carnitina din lizin, etc. S-adenozilmetionina furnizeaz i grupri aminopropil pentru
sinteza sperminei din ornitin. Intermediarul PAPS este folosit ca donor de grupri
sulfat pentru sulfatarea biomoleculelor de tipul proteoglicanilor i sulfatidelor.
Efectori alosterici: o serie din etapele metabolice reglatoare sunt controlate
prin intermediul concentraiilor intracelulare ale nucleotidelor.
n celule nucleotidele sunt distribuite diferit: principalele forme ale compuilor
purinici i pirimidinici din celul sunt derivaii 5-nucleotidici. n celulele normale
ATP reprezint nucleotidul cu concentraia cea mai mare. De reinut c, n funcie de
tipul celular, concentraia nucleotidelor variaz foarte mult. De exemplu, n eritrocite
adenin nucleotidele depesc mult concentraia altor nucleotide, care sunt n
concentraii abia detectabile. n celulele hepatice i n alte esuturi se regsete un
spectru complex al mono-, di- i trifosfailor care se regsesc cuplai n structurile
UDP-glucoz, UDP-acid glucuronic, NAD+, NADH, etc. Prezena bazelor libere,
nucleozidelor sau nucleotidelor 2- i 3-fosfat, n fracia acid solubil din celule, este
datorat reaciilor de degradare normal a nucleotidelor exogene i endogene. n
acelai mod se explic i prezena bazelor minore rezultate din degradarea acizilor
nucleici.
Concentraia ribonucleotidelor n celul este de ordin milimolar n timp ce
concentraia deoxiribonucleotidelor este de ordin micromolar. De exemplu,
concentraia ATP n celulele tumorii Erlich este de 3600 pmol/106 celule, n timp ce
dATP este n concentraie de numai 4 pmol/106 celule. Totui, nivelurile
concentraiilor deoxiribonucleotidelor sunt subiectul unor fluctuaii majore n timpul
ciclului celular, n contrast cu nivelul concentraiei ribonucleotidelor care rmne
relativ constant.
n celulele normale, concentraia total a nucleotidelor variaz ntr-un domeniu
ngust dei concentraia componentelor individuale poate s varieze. De exemplu,
concentraia total a adenin-nucleotidelor (AMP, ADP i ATP) este constant, dei pot
exista variaii ale raportului ATP/AMP+ADP, dependente de starea energetic a
celulelor. La baza concentraiilor fixe ale nucleotidelor st faptul c reaciile de
biosintez ale acestora reprezint ci metabolice care presupun o reglare celular foarte
fin.

40
CAPITOLUL II

STRUCTURA PRIMAR A ACIZILOR NUCLEICI

Asemenea poliglucidelor i proteinelor, aceti polimeri se caracterizeaz


printr-o structur covalent primar i prin aranjarea spaial a acesteia ntr-o ierarhie
pe care o vom discuta n capitolele urmtoare.
Structura primar a acizilor nucleici (AN) se refer la secvena nlnuirii
monomerilor nucleozid 5-fosfat (NMP), legturile dintre acetia i mrimea
polimerilor obinui.

1. Caracteristicile de compoziie a structurii primare

1.1. Nucleotidele

Cele dou tipuri de acizi nucleici se deosebesc prin dou caracteristici


calitative fundamentale (Tabelul 2.1):
1) prezena unei pentoze diferite (riboz sau deoxiriboz); tipul de glucid d
numele celor dou tipuri de acizi nucleici deoarece nu exist structuri naturale mixte
ADN/ARN n afar de hibrizii care apar tranzitoriu n timpul replicrii i transcripiei;
2) diferene privind cele patru baze care intr n constituia ADN i ARN, una
dintre pirimidine fiind diferit. O distincie mai nuanat este dat de bazele i
nucleotidele minore discutate n capitolul anterior.

Tabel 2.1. Constituenii ARN i ADN


Acidul Pentoza NMP majore NMP minore
nucleic
Pyr Pur
ARN D-riboza U A foarte diverse ARNt
C G
ADN 2-deoxi-D-riboza dT dA derivai metilai ai A i C
dC dG

Cu toate c aceste diferene par minime ele au consecine spectaculoase i sunt


suficiente pentru a mpri acizii nucleici n dou categorii majore de molecule destul

41
de asemntoare pentru a se recunoate dar care au funcii diferite. Astfel, prezena
hidroxilului n poziia 2 a ribozei determin:
a) imposibilitatea catenelor de ARN de a forma structuri dublu catenare pe
distane mari;
b) o reactivitate particular a ARN;
c) centre suplimentare de interaciune prin legturi de hidrogen.
O alt diferen de compoziie const n faptul c ADN se caracterizeaz prin
egaliti i raporturi purine/pirimidine specifice pe care nu le regsim n ARN.

1.2. Mrimea polimerilor nucleici

n privina lungimii polimerilor nucleici gama acoperit este foarte mare. De


fapt, trebuie s subliniem c este luat n discuie grupul care cuprinde macromoleculele
naturale cele mai mari. Mrimea acizilor nucleici se exprim prin trei caracteristici
(tipuri de uniti): i) lungime; ii) mas molecular n Daltoni (Da); iii) numr de
nucleotide sau de baze ale acestora pentru monocatene (b) i n perechi de baze (pb)
dac molecula este constituit din dou catene asociate. Multiplul cel mai folosit este
cel de kilobaze sau kilo-perechi de baze ( 1000 b sau 1000 pb).
Numrul nucleotidelor din structura ARN variaz de la mai multe zeci de baze
la mai multe mii de baze.

ARN ribozomal (ARNr) de la 100 la 5 000 b


ARN de transfer (ARNt) 75 - 90 b
ARN mesager (ARNm) numrul de baze este n funcie de gena copiat

Mrimea ADN variaz n funcie de regn i specie. Aceasta acoper toat gama
de la 5 000 la mai mult de un milion de perechi de baze. Masa molecular medie a unei
perechi de baze este de 660 Da, iar distana ntre platourile a dou baze este de 0, 34
nm n conformitate cu caracteristicile geometrice ale dublei catene de ADN. Aceste
caracteristici dau o echivalen foarte util n practic: 2x106 Da se pot aproxima cu
3 000 pb i cu 1 m.

n tabelul 2.2. sunt prezentate tipuri de ADN de provenien diferit. Mrimea


acestora este comparat cu colagenul care este o molecul proteic gigant.

42
1.2.1. Metode de determinare a mrimii acizilor nucleici

Metodele de determinare a dimensiunilor acestor macromolecule se bazeaz pe


diferite caracteristici. Mrimea poate fi determinat prin mai multe metode:
Microscopie electronic: datorit dimensiunilor lor acizii nucleici pot
vizualizai prin aceast tehnic. Metoda se
potrivete foarte bine moleculelor de ADN de
mrime medie (cteva mii la 200 000 pb) (Figura
2.1)

Figura 2.1. Imagine electrono-microscopic a unei


molecule de ADN dublu catenar circular nchis
(plasmid)

Electroforeza n gel: este o tehnic de separare a moleculelor n funcie de


masa lor molecular. Condiiile de densitate de sarcin asemntoare sunt realizate n
mod natural, de ctre scheletul oz-fosfat. De asemenea, dependena logaritmic,
distan de migrare n funcie de mrime, este bine respectat. Pentru separarea
moleculelor de acizi nucleici de diferite dimensiuni sunt folosite geluri de agaroz cu
poroziti variate (Figura 2.2). Pentru facilitarea estimrilor cantitative exist colecii de
polimeri marcheri de mas molecular utilizai pentru etalonarea separrilor. De
altfel, aceast metod de separare este omniprezent n manipulrile de biologie
molecular. Electroforeza se poate realiza i n geluri de poliacrilamid pentru situaiile
n care este necesar separarea moleculelor polinucleotidice mici sau
oligonucleotidelor. Prin electroforeza n gel de poliacrilamid este posibil
identificarea unor fragmente care difer numai printr-un singur nucleotid. Din acest
motiv tehnica este foarte util n secvenializarea acizilor nucleici i n determinarea
regiunilor de polimorfism normal sau patologic determinat de existena unor mutaii.

43
Tabel 2.2. Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat cu cea a unei proteine fibroase,
colagenul, i celulele procariote i eucariote.

ADN/ particule/ n de baze Mas Lungime numr de


organisme (kb) (MDa) (nm) (nm) cromozomi
Virusuri ADN
SV40 5,2 3,2 1,7x10-3 (1,7m) 2
fag X174 5,4 3,6 1,8x10-3 (1,8 m) 2
fag 48 32 17x10-3 (17 m) 2
Procariote 4000 2600 1,36 2 1
E. coli
Eucariote
Drosofila 62 000 41000 21 2 2x4
Om 125 000 80 000 41 2 2x23
Colagen 3x1000 0,33 0,3x10-3 (0,3 m) 1,5
aminoacizi
Celule
Bacteria E. coli 2x10-3 (0,5x2 m)
Mamifere aprox 10x10-3 (10 m)
SV40: virus simian; mrimea exact a ADN este de 5243 pb. Bacteriofagii folosii ca exemplu au drept
gazd Escherichia coli. ADN al fagului X174 este monocatenar, dar n celulele infectate se
mperecheaz sub form de dubl caten. n tabel sunt date dimensiunile celei de a doua forme. La
drosofila este dat mrimea celui mai mare ADN, este vorba de cromozomul gigant. La om este dat
mrimea ADN/cromozom.

Figura 2.2 Imagine de separare electroforetic a ADN


n gel de agaroz: M, marcheri de mas molecular; 1,
2, 3, 4 i 5, ADN plasmidial scindat cu enzime de
restricie

Moleculele ADN de mrime mare


sunt analizate i prin:
a) metoda clasic de
ultracentrifugare cu toate c forele de
frecare existente ntre aceste molecule
limiteaz cmpul aplicaiilor (molecule de
pn la 1,5 x 106 pb); Prin aceast tehnic
pot fi separate, n gradient de densitate de
clorur de cesiu, urmtoarele: i) fragmente
de ADN care au un coninut diferit n
guanin i citozin (Figura 2.3a); ii) ADN
genomic bacterian; iii) ADN plasmidial; iv)
ARN total, etc. Diferitele tipuri de ARN

44
ribozomal de la eucariote i procariote poate fi separat foarte simplu prin
ultracentrifugare n gradient de zaharoz (Figura 2.3b).

Figura 2.3. Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN prin
ultracentrifugare n gradient de CsCl; b) separare ARN prin
ultracentrifugare n gradient de zaharoz

45
Figura 2.4. Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b) electroforegram
obinut n urma separrii unor fragmente mari de ADN. Vizualizarea a fost
realizat n urma colorrii cu bromur de etidium.

b) proprietile hidrodinamice ale soluiilor de ADN: i) birefringena de


curgere, ii) vscozitate, etc.
c) electroforeza n cmp pulsatoriu (sau alternant). Prin aceast tehnic care a
fost imaginat la nceputul anilor 1980, dou cmpuri electrice se aplic alternativ pe
dou direcii diferite. Principul de separare se bazeaz pe viteza diferit de reorientare a
moleculelor n momentul alternrii celor dou cmpuri electrice. Ele impun
moleculelor de ADN etape de reorientare diferite nainte de migrarea lor efectiv.
Aceste etape de reorientare sunt dependente de mrimea moleculelor. Separarea este
eficace i utilizabil pentru molecule de ADN mai mari de 10 000 kb (Figura 2.4).

1.3. Polimerizarea nucleotidic

Acizii nucleici sunt, asemeni proteinelor, polimeri neramificai care pot fi


liniari sau circulari. Demonstrat de Levene n 1925 i confirmat dup 1950 de ctre
Todd, nlnuirea covalent a nucleotidelor este de tip ester. Depolimerizarea se poate
realiza prin hidroliz de diferite tipuri (acid, bazic, enzimatic) i este destul de
folosit n tehnicile de biologie molecular.

1.3.1. Legtura fosfodiester

Indiferent de tipul de acid nucleic (ribonucleic sau deoxiribonucleic), reacia


de asamblare polinucleotidic este aceeai: hidroxilul din poziia 3 al unui nucleozid
monofosfat este esterificat de ctre 5-fosfatul din structura nucleozid trifosfatului care
particip la formarea legturii (Figura 2.5). Faptul c acizii nucleici sunt polimeri
fosfodiesterici ai NMP are urmtoarele consecine directe:
a) asemeni polipeptidelor, catena este orientat (vectorizat). Sensul
convenional 5-3 a fost adoptat pentru lectura i scrierea (de la stnga la dreapta)
polinucleotidelor ca i pentru reprezentrile prescurtate i simbolice (Figura 2.6).
b) bazele fixate regulat n funcie de o secven specific speciei moleculare,
sunt purtate de un schelet covalent pentoz-fosfat. Cu toate c imaginea este
asemntoare cu cea a scheletului polipeptidic purttor al catenelor laterale ale
aminoacizilor, exist o serie de diferene fa de acesta: i) scheletul acizilor nucleici
este un polianion cu o sarcin pe unitate care are o densitate total de sarcin negativ
foarte mare; ii) varietatea bazelor este redus. Analizm alternana a patru baze fa de
46
alternana a 20 de aminoacizi. Consecinele acestor diferene sunt foarte importante
pentru sistemele de informaie genetic. nelegem astfel, de ce pentru codificarea
aminoacizilor de ctre secvenele nucleotidice nu este nevoie numai de o simpl
echivalen baz/aminoacid. Este necesar un limbaj ternar, format din ansambluri de
trei baze adiacente a cror asociere determin existena a 64 de combinaii posibile,
care stau la baza codului genetic.

Figura 2. 5. Sinteza unei monocatene de ADN: a) formarea legturii fosfodiester ntre un dinucleotid i
deoxiadenozin citidin trifosfat; b) reprezentarea schematic a reaciei de sintez cu marcarea
orientrii 5-3 a catenei n formare
47
Figura 2.6. Structura unei molecule ARN: a) evidenierea nlnuirii nucleotidelor i vectorizarea catenei;
b) reprezentrile prescurtat i simbolic.

1.4. Hidroliza acizilor nucleici

Degradarea unui polinucleotid poate s se refere la: i) legtura fosfodiester


atunci cnd se produce o depolimerizare; ii) unitile nucleotidice dac se rupe legtura
glicozidic i se degradeaz componentele. n ambele cazuri hidroliza poate fi de
natur chimic sau enzimatic.

1.4.1. Hidroliza chimic a acizilor nucleici

Dei sunt printre cele mai stabile molecule, n condiii fiziologice celulare,
acizii nucleici prezint totui, rezistene diferite la condiiile de pH i de temperatur la
care se realizeaz diferitele tipuri de hidroliz, in vitro (Tabel 2.3).
Tratamentul acid afecteaz la fel ARN i ADN:

48
i) sunt necesare condiii drastice pentru a degrada scheletul pentozo-fosfat
(nclzire, acizi concentrai). n aceste condiii celelalte legturi din structur nu rezist
i obinem un amestec de fosfai, oze i baze. Acest protocol, urmat de o fracionare
cromatografic, a fost una dintre tehnicile care au permis analiza compoziiei acizilor
nucleici;
i) n condiii relativ blnde (pH 4,0), se vor rupe numai legturile N-glicozidice
cu purinele care sunt cele mai fragile. n acest caz, se obine un derivat de acid nucleic
apurinic care prezint interes pentru anumite analize.
Comportamentul ARN i ADN la hidroliz bazic este foarte diferit:
i) ADN rezist la valori extreme de pH bazic. La pH 13,0 i 370C se
nregistreaz aproximativ zece scindri pe or i pentru milion de puni fosfo-diester.
Cu toate acestea, punile fosfodiester din ADN devin sensibile la hidroliz alcalin
dac bazele sunt nlturate sau degradate. Este cazul ADN apurinic. Aceast
proprietate este utilizat n tehnica de secvenializare chimic.
ii) ARN este total hidrolizat n ribonucleotidele componente n cteva minute,
0
la 37 C i pH 11,0. nc de la pH 8,0, se constat nceperea unei degradri
semnificative. Comportamentul ARN la hidroliz alcalin explic obinerea unui
amestec de nucleozide 2 i 3 fosfat n loc de 5 fosfat, aa cum era de ateptat.

Tabel 2.3. Produii de degradare chimic a acizilor nucleici

Condiii Produi de hidroliz


ARN ADN
Acide
pH 1,0 + nclzire pentoze + fosfai + baze
pH 4,0 baze purinice + AN apurinici
Alcaline NMP (2 sau 3) -

Diferena dintre reactivitatea ARN i ineria ADN este dat de existena


gruprii hidroxil din poziia 2. De fapt, aceast grupare autorizeaz o cataliz bazic
hidrolizei punilor fosfodiester schematizat n figura 2.7. Deprotonarea sa n condiii
alcaline produce un anion alcoxid, puternic nucleofil care atac gruparea fosfo-diester
adiacent. Absena hidroxilului n 2 din scheletul ADN este un factor determinant al
stabilitii sale chimice n condiii celulare, normale sau agresive. Astfel nelegem
esena selecionrii evolutive a ADN, ca suport al informaiei genetice, datorit
rezistenei sale. Aceast molecul trebuie s suporte operaii de duplicare i de copiere
care se desfoar pe toat durat de via a organismului i s asigure transmiterea
informaiilor la descendeni.
49
Figura 2.7. Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1. Hidroxilul din 2
este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul, nucleofil, atac gruparea
fosfodiester cu formarea unui diester ciclic 2: 3; 3. Un al doilea hidroxid provoac
hidroliza uneia sau alteia dintre legturile ester: se obin izomeri 2 i 3 fosfat.

1.4.2. Scindarea enzimatic

Enzimele care catalizeaz hidroliza legturii fosfodiester din structura acizilor


nucleici, fosfodiesterazele, sunt numite i nucleaze. Acestea sunt prezente n toate
celulele i sunt foarte utile n metabolismul acizilor nucleici i proteinelor. O parte
dintre a ceste nucleaze sunt secretate de ctre pancreasul exocrin, n intestin, i
particip direct la digestie hranei. Aceste enzime prezint niveluri de specificitate
comparabile cu cele ale peptidazelor i proteazelor. Ele se pot clasifica n funcie de:
a) modul lor de atac al catenei: i) exonucleaze, enzimele care acioneaz la
nivelul extremitii catenelor; ii) endonucleaze, enzimele care atac n interiorul
catenelor;
b) specificitatea lor fa de substrat: i) pentru tipul de acid nucleic:
ribonucleaze pentru ARN, deoxiribonucleaze pentru ADN i nucleaze pentru ambele;
ii) pentru tipul de structur: mono- sau dublu catenar;
c) specificitatea lor de recunoatere a situsurilor: i) specificitate pentru baze; ii)
specificitate pentru secvene;

50
d) tipul de rupere a legturii fosfodiester: i) exonucleazele i endonucleazele de
tip d scindeaz extremitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; ii) exonucleazele i
endonucleazele de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (Figura
2.8);
n tabelul 2.4 sunt prezentate principale nucleaze i caracteristicile acestora. O
serie de endonucleaze cu specificitate mare nu sunt trecute n acest tabel. Acestea fac
parte din categoria enzimelor de restricie, endonucleaze capabile s scindeze ntr-un
mod, bine definit i reproductibil, moleculele de ADN dublu catenar indiferent de
originea lor.

Figura 2.8. Tipuri de tieturi la nivelul legturilor: exonuclea-zele i endonucleazele de tip d


scindeaz extre-mitatea 5 i duc la formarea de 3NMP; exonucleazele i endo-
nucleazele de tip p scindeaz extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (vezi
tabelul 2.4)

51
Tabel 2.4. Exemple de nucleaze reprezentative i diferitele lor caracteristici.

Nucleaze Substrate1 Tietur Produi


tip2; specificitate
Exonucleaze
fosfodiesteraza (venin de arpe) ARN, ADN s p 5-NMP
extremitatea 3
fosfodiesteraza (splin) ARN, ADN s d 3-NMP
extremitatea 5
exonucleaza I (E. coli) AND p 5-NMP
extremitatea 3
exonucleaza III (E. coli) AND p 5NMP+ADNs
extremitatea 3
Endonucleaze
endonucleaza S1 (Aspergillus oryzae) ARN,ADN s,d p 5-NMP +ON n 5 P
aleatoare
ribonucleaz T1 (Aspergillus oryzae) ARN s p 5-NMP +ON n 3 P
G/N
ribonucleaza A (pancreas) ARN s d-Pyr/N 3-NMP +ON n 3 P
Deoxiribonucleaza II (timus) ADN s d sPyr/dPur ON n 3 P
1
s: monocatenar (single strand); ON: oligonucleotide. 2 tip de tietur p sau d: vezi figura 2.8.

Descoperirea enzimelor de restricie, n 1970, de ctre W. Harber, H. Smith i


D. Nathans, a nsemnat un pas gigantic pentru evoluia tehnicilor de biologie
molecular. Acestea au permis nlturarea principalului obstacol tehnologic privind
manipularea ADN, deoarece pot reduce ntr-o manier reproductibil, un genom ntreg
la o serie de fragmente caracteristice pentru o specie dat. Astfel, genele sau pri ale
genelor devin entiti fizice izolabile. Aceste enzime sunt responsabile pentru
fenomenul de restricie de unde i numele lor. n figura 2.9 sunt prezentate cteva
dintre enzimele de restricie cele mai uzuale mpreun cu motivele recunoscute de ele.
Enzimele recunosc i taie secvene de baze cu structuri caracteristice de pe catena
ADN, numite palindroame, a cror lungime variaz ntre 4 i 10 pb. Se remarc axa de
simetrie de ordinul 2 pe care o prezint secvenele ADN pe care aceste enzime le
recunosc i scindeaz. Se observ c secvena de pe una din catene reprezint
palindromul secvenei celeilalte catene. Pe cele dou catene exist acelai mesaj care
poate fi citit la fel n cele dou sensuri (de tip RADAR sau ROTOR). Deci, situsul de
clivare are o poziie simetric n raport cu axa. n urma aciunii enzimelor de restricie,
se pot obine capete coezive sau capete drepte pentru fragmentele eliberate, n funcie
de poziia situsurilor de scindare. (Figura 2.10).

52
Au fost izolate i purificate mii de
enzime de restricie. Din fericire foarte
curnd dup descoperirea lor s-a utilizat o
nomenclatura adecvat. Prima liter este
majuscul i reprezint iniiala speciei
bacteriene din care a fost extras
endonucleaza. Urmtoarele dou litere sunt
minuscule i corespund genului bacteriei de
unde enzima este extras. Aceste trei litere
sunt urmate de o cifr roman care
reprezint numrul de ordine al descoperirii
enzimei n acelai tip de bacterie. Dac este
necesar se mai adaug o litera majuscul
reprezentnd identificarea suei bacteriene.

Figura 2.9. Exemple de enzime de restricie i


situsurile recunoscute de acestea

Figura 2.10. Exemple de enzime de restricie i palindroamele recunoscute de acestea cu


marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a) obinerea de capete
coezive; b) obinerea de capete drepte (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

53
Enzimele de restricie sunt clasificate n trei categorii, dar numai cele de tip II
sunt utile n cercetrile de biologie molecular deoarece scindeaz catenele de ADN
chiar la nivelul situsurilor specifice pe care le recunosc. Dou enzime de restricie care
recunosc aceeai secven sunt numite izoschizomere.
Numrul de situsuri recunoscute i tiate de anumite enzime este evident
corelat cu structura ADN. n tabelul 2.5 este prezentat un exemplu de aciune
difereniat a enzimelor de restricie asupra ADN viral din diferite surse. Scindarea
difereniat reprezint o modalitate important de a obine marcheri de mas
molecular utilizai n tehnicile de biologie molecular.

Tabel 2.5. Numrul situsurilor de tiere prezente la nivelul ADN din trei virusuri pentru trei endonucleaze comune.
Endonucleaza (sursa) Numr de situsuri de tiere
Virus SV40 fag X174 fag
EcoRI (E. coli RY13) 1 0 5
BamHI (Bacillus amyloliquefaciens H) 1 0 5
HaeIII (Haemophilus aegypticus) 19 11 >50

1.5. Purificarea acizilor nucleici i evaluarea

cantitativ a acizilor nucleici

Un procedeu clasic de purificare const n tratarea soluiei apoase de acid


nucleic cu soluie fenolic care denatureaz proteinele. De obicei este folosit amestecul
fenol-cloroform care este destul de eficient. Dup separarea fazelor prin centrifugare,
este recuperat faza apoas care constituie supernatantul i care conine acizii nucleici.
Urmele de fenol (care ar putea s inhibe activitatea enzimelor din etapele urmtoare)
sunt eliminate printr-un nou tratament cu cloroform/alcool izoamilic. Dac acizii
nucleici provin din extracte celulare, proteinele sunt n prealabil hidrolizate cu ajutorul
unei enzime proteolitice numit proteinaza K.
n ultimii ani au fost puse la punct procedee de purificare pe baz de rini.
Reactivii sunt livrai sub form de kituri gata de ntrebuinare simplificnd mult
procesul de purificare i crescnd adesea randamentul acestuia.

1.5.1. Metode spectrofotometrice

Determinarea absorbiei n ultraviolet cu ajutorul unui spectrofotometru


permite verificarea puritii unei soluii de ADN sau ARN. n urma determinrii
densitii optice se va obine un pic la 260 nm. Pentru estimarea puritii este necesar

54
calcularea raportului densitilor optice la 260 nm/280 nm care, n mod normal, trebuie
s fie apropiat de valoarea 1,8-2,0. n cazul ADN, un raport mai ridicat indic o
contaminare cu ARN. Dac exist o contaminare cu proteine (280 nm) sau fenol (270
nm), raportul va fi net inferior valorii de 1,8. Dac ADN i ARN sunt puri, cantitatea
poate fi apreciat astfel:

unitatea DO (260 nm) = 50 ng/l pentru ADN dublu-catenar


unitatea DO (260 nm) = 33 ng/l pentru ADN monocatenar
unitatea DO (260 nm) = 40 ng/l pentru ARN

1.5.2. Utilizarea de mini-gelulri

Dac nu dispunem de ADN n cantitate suficient sau de sisteme miniaturizate


care s permit msurarea densitii optice la 260 nm, se poate realiza o estimare semi-
cantitativ utiliznd mini-geluri de agaroz. Dup realizarea separrii electroforetice,
se realizeaz colorarea cu bromur de etidium urmat de evaluarea intensitii benzilor
obinute dup expunerea la UV. Estimarea semi-cantitativ se realizeaz prin
compararea rezultatelor obinute cu migrarea unor cantiti cunoscute de ADN standard
folosite pentru etalonare.

Figura 2.11. Separare electroforetic pe mini-geluri utilizat pentru


estimarea semi-cantitativ a fragmentelor de acizi nucleici separate:
a) principiu de separare; b) vizualizarea mini-gelului dup tratament cu bromur de etidium

55
2. Determinarea secvenei primare a acizilor nucleici

2.1. Strategie i modaliti

Strategia curent de secvenializare a acizilor nucleici este format din trei


etape, conforme cu principiile comune de analiz a polimerilor:
a) acidul nucleic este ntotdeauna prea lung pentru a fi secvenializat direct i
trebuie fracionat n fragmente de mrime adecvat. Acestea sunt separate, fiecare fiind
apoi supus secvenializrii;
b) prin scindarea diferit a fragmentului de secvenializat, se produc
amestecuri de segmente de oligonucleotide, de diferite lungimi (pentru fiecare tip de
scindare) care se suprapun;
c) separarea i identificarea componentelor fiecruia dintre aceste amestecuri i
apoi compararea lor n scopul reconstituirii secvenei iniiale a fragmentului.
n raport cu secvenializarea proteinelor, secvenializarea iniial a acizilor
nucleici a fost mai complicat deoarece: i) structura ADN este dublu catenar; ii)
macromoleculele sunt mult mai lungi; iii) prezena a numai a patru baze, face ca
varietatea monomerilor s fie redus i eventuala identificare a produilor de hidroliz
s constituie o operaie delicat.
n concluzie, nceputurile n secvenializarea acizilor nucleici au fost tributare
modalitilor de scindare i de fracionare a oligonucleotidelor. n rezolvarea acestei
probleme, deceniul 1970-1980 a fost decisiv.
nainte de 1970 cercettorii nu dispuneau nici de endonucleaze specifice i nici
de modaliti de scindare echivalente degradrii Edman. Secvenializarea realizat
pentru ARNt pentru alanin a constat n: i) scindarea parial cu ajutorul
ribonucleazelor T1 i A (Tabel 2.4); ii) suprapunerea fragmentelor obinute n urma
aciunii secveniale a unei exonucleaze (una din fosfodiesterazele din Tabelul 2.4); iii)
analiza produilor prin cromatografie.
n aceste situaii, pentru a stabili secvena celor 72 de nucleotide ale ARNt
pentru alanin, i-au fost necesari mai muli ani lui R. Holley. Abia n 1965, la mai mult
de 10 ani de la secvenializarea insulinei de ctre E. Sanger, a fost posibil elucidarea
structurii materialului genetic din structura unor fagi de aproximativ 4 000 nucleotide.
Anii 1970 marcheaz descoperirea endonucleazelor de restricie i primele
realizri ale tehnicilor de biologie molecular, printre care i clonarea care permitea
multiplicarea moleculelor de ADN disponibile.

56
La baza evoluiei ulterioare a secvenializrii ADN au stat dou metode care se
bazeaz pe un principiu comun:
i) ADN era decupat n fragmente cu enzime de restricie i catenele sunt
separate;
ii) utilnd modaliti specifice de tratare pentru fiecare baz, se obin patru
ansambluri de fragmente de mrimi diferite (prin intermediul unui semnal care
identific nceputul sau sfritul catenei);
iii) separarea fragmentelor n funcie de mrime rezolv problema
secvenializrii.
Diferena dintre cele dou metode const n modul de obinere a ansamblurilor
de fragmente: una din metode se bazeaz pe scindarea chimic (metoda introdus de A.
Maxam i W. Gilbert), cealalt se inspir din procesul de replicare i se bazeaz pe
tehnologia sintezei enzimatice (metoda Sanger).
Cu toate c metoda Maxam i Gilbert a cedat de mult locul metodei Sanger,
pentru care la ora actual exist numeroase variante, confruntarea dintre cele dou
concepii rmne interesant. n continuare vom descrie principiul i numai cteva
aspecte tehnice pentru fiecare metod.

2.2. Metoda chimic Maxam W. Gilbert

Metoda de secvenializare chimic este formt din mai multe etape.


Fragmentul de ADN care urmeaz a fi secvenializat este marcat la una dintre
extremiti printr-un semnal care va permite detectarea sa. Cea mai frecvent tehnic
este marcarea cu fosfor radioactiv (32P). Aceasta se realizeaz n doi timpi: i)
modificare-eliminare baz; ii) hidroliza alcalin a grupelor fosfodiester, posibil prin
pierderea sau deschiderea ciclului bazelor. Scindarea este dubl fiind realizat att la
captul 3 ct i la cel 5.

Specificitatea tieturii este dat de reactivii utilizai i de condiiile de reacie:


a) pirimidinele: hidrazinoliz; n condiii controlate de trie ionic este
realizat degradarea preferenial a citozinei sau a ambelor pirimidine (C i T);
b) purinele: metilare cu protonare; alegerea pH este decisiv pentru orientarea
reaciei ctre guanin sau ctre ambele purine (G i A).
Separarea produilor se realizeaz prin electroforeza n gel de poliacrilamid
urmat de autoradiaografia fragmentelor pentru reconstituirea secvenei (Figura 2.12).

57
Figura 2. 12. Principiul i prezentarea schematic secvenializrii prin metoda Maxam i Gilbert.

2.3. Metoda di d eoxi a lui F. Sanger

F. Sanger, pionierul secvenializrii insulinei, a conceput o metod genial de


secvenializare care se bazeaz pe principiul replicrii. Analiza structurii ADN i a
rolului su n exprimarea genelor a fost uurat enorm de punerea la punct a acestei
tehnici de secvenializare. Esena tehnicii de secvenializare a ADN, propus F. Sanger
i colaboratorii, a constituit-o generarea de fragmente a cror lungime era dependent
de ultima baz din structura secvenei. Colecii de astfel de fragmente au fost generate
prin ntreruperea controlat a sintezei enzimatice. Aceast tehnic s-a impus n faa
celorlalte tehnici de secvenializare datorit simplitii sale.
Pentru nelegerea principiului sunt necesare informaii privind mperecherea
specific a bazelor n structura ADN i sinteza catenelor complementare ct i asupra
modului de aciune al polimerazei. Sanger a utilizat ADN polimeraza I bacterian care

58
realizeaz o copie complementar a catenei matri ADN utiliznd nucleotid trifosfai
(dNTP).

2.3.1. Principiu

Acelai procedeu este aplicat pentru patru amestecuri de reacie, n acelai


timp. n toate, ADN polimeraza este folosit pentru a sintetiza catena complementar
unei secvene matri pornind de la un fragment oligonucleotidic (primer)
complementar cu captul 5-3 al matriei.
a) Fragmentul care urmeaz a fi secvenializat (matri), este denaturat, pentru
obinerea de monocatene, i adus n contact cu un primer. Hibridizarea primerului cu
matria monocatenar permite iniierea aciunii ADN polimerazei, n prezena
substratelor nucleotidice dNTP;
b) n fiecare dintre cele n patru loturi se adug o mic cantitate dintr-un 2-
3dideoxiribonucleotid trifosfat (ddNTP) diferit, analog cu una dintre nucleotide.
Incorporarea acestui analog, n locul unei nucleotide normale, blocheaz alungirea
datorit lipsei hidroxilului din poziia 3 terminal. Din acest considerent ddNTP au
fost denumite molecule terminatoare de caten. Concentraia lor este destul de mic
pentru a opri sinteza numai ocazional;
c) Prin electroforez n gel de poliacrilamid se realizeaz separarea
fragmentelor din cele patru loturi. Mrimea diferit a fragmentelor este datorat opririi
copierii catenei matri la un anumit nivel, corespunztor fiecruia dintre cele patru
tipuri de ddNTP (ddATP, ddCTP, ddGTP i ddTTP). n figura 2.13 este prezentat
simplificat schema principiului reaciei i modalitatea prin care se deduce direct, din
lectura gelului, secvena catenei complementare, deci cea a matricei de secvenializat.
De remarcat c rezoluia gelului trebuie s fie de o nucleotid;
d) Determinarea secvenei a fost realizat de Sanger prin autoradiografia
gelului deoarece unul dintre dNTP introduse n reacie era marcat radioactiv cu 32P sau
35
S, izotopi capabili s impresioneze un film fotografic.
Aceast metod ingenioas i-a permis lui F. Sanger, n 1977, s stabileasc
prima secvena complet de 5386 baze a bacteriofagului X174. Total automatizat
ulterior, tehnica a permis descifrarea complet a genoamelor multor organisme
procariote i eucariote i a fost folosit cu succes n amplul proiect de secvenializare a
genomului uman. Secvenializarea clasic a acizilor nucleici inventat de Sanger are la
ora actual o serie de variante care au fcut-o s se impun ca singura alternativ
viabil de determinare a secvenei acizilor nucleici. Toate aceste variante se bazeaz pe

59
principiul iniial de sintez de fragmente complementare cu matria de analizat.
Diferenele constau n evoluia spectaculoas a modalitilor de separare i identificare
a acestor fragmente. Detectarea fluorescent reprezint o alternativ viabil pentru
tehnica autoradiografic. Acum, se folosesc primeri sau nucleotid trifosfai marcai
fluorescent a cror separare se realizeaz prin electroforez n gel de acrilamid sau
prin electroforez capilar. Marcarea fluorescent ofer posibilitatea combinrii
amestecurilor de reaciei urmat de separarea electroforetic a ansamblului. Benzile
obinute pot fi detectate independent n funcie de reactivul cu care au fost marcate. O
alternativ a metodei folosete analogi dideoxi marcai fluorescent diferit care permit
realizarea tuturor reaciilor ntr-o singur etap (tub). Folosirea marcrii fluorescente i
evoluia interesant a sistemelor de detectare i a programelor de interpretare a
rezultatelor a permis automatizarea tehnicii i extinderea aplicaiilor acesteia. (Figura
2.14). Astzi, pe lng secvenializare, tehnica permite analiz de fragmente
(genotipare) i identificare de mutaii punctiforme la nivelul moleculelor ADN.

Figura 2.13. Metoda Sanger: a) Principiul de sinteza a catenei complementare i modul de intervenie al
ddNTP; b) Prezentare schematizat a realizrii practice a secvenializrii. n urma
electroforezei celor patru loturi se obine secvena catenei complementare.

60
3. Sinteza chimic a polimerilor nucleici

Polinucleotidele au devenit repede unelte i materiale de experien, astfel


nct sinteza acestora s-a impus din ce n ce mai acut. Sinteza polimerilor nucleotidici
ridic aceleai probleme ca i cea a polipeptidelor. Este necesar: i) activarea gruprii
care este implicat n legtur, mpiedicndu-le, n acelai timp, pe celelalte s
reacioneze; ii) fixarea nucleotidelor secveniale n ordinea determinat.
Strategia este asemntoare cu cea de la polipeptide fiind preferat sintez prin
elongare n faz solid, care nltur obstacolele eliminrii reactivilor neutilizai i
produilor fiecrei etape. Catena ADN poate fi sintetizat secvenial prin adugarea de
monomeri activai la un lan n formare care este cuplat pe un suport solid. n cazul
metodei fosforoamidiilor monomerii activai sunt deoxiribonucleozide
3fosforamidii (Figura 2.15).

3.1. Etapele sintezei n faz solid

Sinteza n faz solid este una dintre cele mai utilizate tehnologii pentru
obinerea oligonucleotidelor i polinucleotidelor de diferite dimensiuni folosite ca
primeri n reaciile de amplificare sau ca sonde n reaciile de hibridizare.
Etapele sintezei sunt urmtoarele:
a) Nucleozidul n, care va constitui extremitatea 3, este fixat prin intermediul
unui bra de bilele unui suport solid (silice, rin). Hidroxilul su 5 este liber;
b) Nucleotidul n-1, activat i protejat, este legat n doi timpi: i) condensarea 3-
5 n mediu anhidru, prin aciunea unui agent de cuplare (nucleu tetrazoliu). n aceast
etap atomul de fosfor din poziia 3 a unitii monomere se cupleaz cu atomul de
oxigen din poziia 5 a lanului n cretere pentru a forma un fosfit triester. Gruparea 5
OH a monomerului activat nu reacioneaz deoarece este cuplat cu gruparea
protectoare dimetoxitritil (DMT). De asemenea, gruparea 3 fosforil este inactivat de
gruparea protectoare -cianoetil. n acelai mod sunt blocate gruprile amino ale
bazelor purinice i pirimidinice. Reacia se realizeaz n mediu anhidru deoarece apa
reacioneaz cu fosforamidiii; ii) oxidare cu iod a gruprii fosfit triester (P (III)) n
fosfat triester P (V). n aceast etap fosfit triesterul n care fosforul este trivalent este
oxidat cu iod pentru a trece n fosfotriester n care fosforul este pentavalent.

61
Figura 2.14. Utilizarea principiului reaciei Sanger n secvenializarea automat: a) sinteza
fragmentelor complementare i marcarea acestora folosind molecule ddNTP cuplate cu
fluorocromi; b) principiul de separare a fragmentelor pe gel sau prin electroforez
capilar; c) modalitate de prezentare a rezultatelor.

Figura 2.15. Protecia i activarea


nucleotidelor. n acest procedeu fosforul
trivalent poart: i) o grupare protonat
reactiv (fosforamidita) obinut printr-o
legtur de tip amid; ii) o grupare ester
care blocheaz gruparea OH (gruparea
CE); iii) hidroxilul din poziia 5 este
protejat cu o grupare (metoxitritril)
aleas datorit capacitii sale de clivare
uoar n mediu acid (grup DMT);
Gruprile amino ale bazelor, susceptibile
s reacioneze, sunt i ele protejate.

62
c) Hidroxilul din 5 este eliberat prin acidifiere: catena este gata pentru
urmtorul ciclu. n aceast etap gruparea protectoare DMT este eliberat n mediu de
acid dicloracetic care elibereaz 5OH i las celelalte grupri protectoare intacte. n
acest moment catena are o unitate monomer n plus i este gata pentru o nou reacie
(Figura 2. 16).
Procedeul este automatizat i poate produce lanuri de 150 baze necesitnd 10
minute pentru fiecare ciclu. Sinteza ribopolinucleotidelor este mult mai delicat
datorit reactivitii hidroxilului din poziia 2: este dificil protecia eficient fr a
altera posibilitile de reacii ale gruprii 3.
La sfritul sintezei se realizeaz un tratament cu amoniac pentru a elimina
toate gruprile protectoare i detaaz nucleotidele curate de pe suport. Sinteza n
faz solid reprezint abordarea ideal att pentru sinteza polipeptidelor ct i pentru a
polinucleotidelor. Toate reaciile au loc n acelai recipient i reacia poate fi
coordonat n funcie de cantitile de reactivi introdui. Produii de reacie pot fi
purificai prin electroforez n gel de poliacrilamid sau prin cromatografie lichid de
nalt rezoluie (HPLC High Performance Liquid Chromatography).

Figura 2.16. Sinteza n faz solid a catenelor unui polinucleotid prin metoda fosforamidiilor.

63
64
Capitolul III

STRUCTURA SECUNDAR I TERIAR A ADN

Legturile prezente n structura secundar i teriar a acizilor nucleici sunt


comune cu cele din alte tipuri de polimeri biologici. Acestea sunt legturi cu energie
sczut, a cror multiplicitate determin apariia unor fore destul de puternice pentru a
stabili i menine coeziunea de ansamblu, n spaiu, i pentru a autoriza modificrile
plastice.
Cu toate acestea secvena covalent a lanurilor polinucleotidice demonstreaz
diferene fundamentale fa de proteine. Acestea se traduc prin interacii particulare
ntre compui i cu mediul i stau la originea conformaiilor permise. Aceste diferene
vin: i) din structura scheletului polimer; ii) prin prezena substituenilor laterali, bazele
azotate, care aduc n structur proprietile lor originale: planuri apolare susceptibile de
stivuire (de suprapunere) i capabile s realizeze mperecheri specifice prin intermediul
gruprilor lor polare.

1. Consecinele scheletului oz-fosfodiester

1.1. Posibilitile de rotaie

Geometria i conformaia scheletului sunt dictate de posibilitile de rotaie ale


componentelor n jurul legturilor covalente succesive. Cel puin din punct de vedere
teoretic, acestea sunt mult mai numeroase ca cele care pot s apar n nlnuirea
catenelor proteice n care legtura peptidic este plan i rigid i nu i gsesc
echivalent n structura acizilor nucleici. n consecin, conformaiile posibile ale unui
polinucleotid, n ansamblul su, sunt mult mai complexe dect cele din proteine.
Aceast afirmaie este susinut de informaiile structurale privind unghiurile de
legtur i posibilitile de rotaie (torsiune) ct i de interaciile sterice ntre grupri i
cu moleculele din lanurile vecine.
Se poate realiza o analiz simplificat a fiecrei uniti mononucleotidice
(Figura 3.1), independent de vecinii si, pentru a determina conformaiile probabile,
nainte de includerea acesteia n lanul polinucleotidic. n acest mod se realizeaz

65
evaluarea tuturor interaciilor posibile. n cadrul unitii mononucleotidice, ase dintre
legturile scheletului (, , , , , ) ofer posibiliti de rotaie substituenilor lor
(Figura 3.1). Prin cea de a aptea legtur (), baza particip la formarea legturi
glicozidice. La aceti factori de conformaie se adaug izomeria conformaional a
ciclului furanozic al pentozei discutat n capitolul 1.
n realitate, aceste posibiliti multiple de rotaie sunt supuse unor constrngeri
interne care limiteaz gradele de libertate de micare. n unitatea mononucleotidic i
mai ales n polinucleotid, scheletul riboz-fosfat are o conformaie restrictiv, n urma
nsumrii interferenelor sterice i funcionale. Aceast structur nu este foarte rigid.
De asemenea, catenele separate de acizi nucleici sunt destul de flexibile pentru a trece
n conformaii dezordonate de tip ghem statistic

Figura 3. 1. Tipurile de rotaii posibile n


structura unei mononucleotide
(dup Biochemistry,Voet&Voet,1995)

1.2. Natura polianionic a acizilor nucleici

Contrar scheletului proteic, polar dar cu sarcin total neutr, cel al acizilor
nucleici este polianionic. Densitatea sa de sarcin negativ, foarte crescut la pH
celular, are urmtoarele consecine:
i) repulsii ntre segmentele lanului care se opun compactrii acestuia. Din
aceast cauz nu ne putem atepta la forme globulare, compacte.

66
ii) o afinitate electrostatic crescut pentru cationi minerali i organici. Ionul
2+
Mg este un factor important pentru achiziionarea structurilor spaiale i stabilizarea
acestora (Figura 1.23). Ca urmare a acestei afiniti, peptidele i proteinele ncrcate
pozitiv la pH fiziologic, se pot fixa pe scheletul acizilor nucleici.

2. Legtura de hidrogen

Pentru acizi nucleici, modul de formare a structurilor sub form de elice (helix)
este diferit de cel cunoscut pentru proteine datorit forelor de repulsie i afinitii
electrostatice crescute precum i a interaciilor dintre baze (pe care le vom discuta n
continuare). De fapt, n cazul acizilor nucleici, legturile de hidrogen nu se stabilesc
ntre polii scheletului, ci ntre echivalenii lanurilor laterale, bazele.

2.1. mperecherea specific a bazelor

2.1.1. Regula lui Chargaff

Compoziia ADN a fost stabilit abia n anii 1940, la 70 de ani de la


descoperirea sa. Chargaff a stabilit compoziia ADN prin hidroliz i cromatografie i a
remarcat urmtoarele:
a) coninutul n purine (A+G) este egal cu cel n pirimidine (C+T), indiferent
de originea celular a speciilor de ADN;
b) fraciile molare ale bazelor sunt astfel distribuite nct A=T i G=C.
La acea epoc nu a fost neleas greutatea acestor observaii care au fost
numite mai trziu regula lui Chargaff. ARN nu prezint aceste dou caracteristici.
De reinut c, valorile sumelor A+T i G+C nu sunt egale. Acestea sunt
specifice tipului i provenienei moleculei de ADN. Astfel, coninutul G+C poate
reprezenta ntre 35 i 75% din coninutul total al bazelor.

2.1.2. mperecherile Watson i Crick

La nceputul anilor 1950, James Watson a propus o explicaie pentru


stoechiometria Chargaff a bazelor, n urma realizrii unor machete moleculare:
cuplurile Pur-Pyr se stabilesc prin legturi de hidrogen care apar ntre bazele care
prezint o anumit complementaritate. n acelai context, specialistul n cristalografie
Francis Crick a neles c hrile ADN, obinute prin difracie cu raze X, pot fi

67
interpretate printr-un complex de duble helixuri mperecheate prin intermediul acestor
cupluri.
Cei doi cercettori au definit aceste mperecheri ca fiind de tip Watson i
Crick (Figura 3.2). Ele reprezint asocierea specific dintre: i) A i T (sau U) prin dou
legturi de H; ii) G i C prin trei legturi de H (o asociere mult mai solid).
n structura ADN, ansamblul celor dou baze mperecheate este plan, iar
lungimea total a acestor cupluri este identic (Figura 3.2).

2.1.3. Studiul mperecherilor

Datorit importanei lor cruciale n formarea structurilor n dublu helix i n


copierea fidel a informaiei n cazul replicrii sau transcripiei, caracterul specific al
acestor mperecheri a determinat i mai determin un numr mare de studii. Principale
metode folosite sunt:
a) cristalizarea bazelor i derivailor lor i co-cristalizarea diferitelor perechi
urmat de analize prin difracie cu raze X a geometriilor de asociere;
b) msurarea energiei de legtur;
c) determinri prin spectroscopie IR i RMN - care difereniaz speciile libere
de formele mperecheate. Se realizeaz determinarea constantelor de asociere a bazelor
identice, diferite sau modificate prin folosirea unor solveni neutri fa de legturile de
hidrogen;
d) msurarea direct a forelor i a importanei atraciilor. Se confecioneaz
dou suprafee acoperite cu bazele de studiat. Una dintre acestea este legat la un resort
iar cealalt este apropiat controlnd distana prin interferometrie optic (precizie de
1/10 din raza atomic). Msura forelor care se exercit ntre baze este dat de
deformarea resortului respectiv.

Figura 3.2. mperecheri pirimidin-purin conform Watson i Crick (formarea legturilor de hidrogen).

68
Bilanul tipurilor de investigaii, trecute n revist mai sus, este rezumat n
urmtoarele concluzii:
a) Existena mai multor tipuri de mperecheri diferite: n structura ADN
perechile A-T i C-G se mperecheaz dup modelul Watson i Crick. Cu toate acestea,
perechea A-T co-cristalizeaz i n geometria denumit a lui Hoogsteen (Figura 3.3),
care este diferit. Modalitatea de mperechere Hoogsten, descris n figura 3.3., se
ntlnete n fragmentele de triplu helix ADN sau n structura ARNt, constituind factori
de stabilizare a structurii teriare.

Figura 3.3. mperecheri diferite de tipul Watson-Crick: a) mperecherea de tip Hoogsten a derivailor
cuplurilor T-A (gruparea metil nlocuiete pentoza); b) mperechere ipotetic ntre C i T; c)
mperechere de adenine n structura cristalului de 9-metil-adenin

b) Evaluarea selectivitii atraciei bazelor: ncepnd din anii 1970,


msurtorile energiilor de legtur i ale constantelor de asociere au demonstrat
preferina energetic a bazelor pentru stabilirea de cupluri. Datele prezentate n tabelul
2. 6 sunt elocvente n acest sens. n raport cu autoasocierea, mperecherile Watson-
Crick au o energie de legtur mult mai puternic i o constant de asociere de 15 la 1
000 ori mai mare. Msura direct a forelor de atracie confirm valorile energiei de
legtur i evideniaz c atracia A-T domin pe distan scurt (10-20 nm) n timp ce
la distane mai mari bazele par s se atrag indiferent de natura lor.
De reinut c in situ, n structura polinucleotidelor, aceste caracteristici de
legtur nu sunt constante fiind dependente de bazele vecine, deci de secvena primar.
c) Explicaia selectivitii: este evident c asocierea specific, n funcie de
regulile lui Watson i Crick, depinde de posibilitatea stabilirii numrului de legturi de
hidrogen necesare. Astfel, apare obligativitatea ca gruprile implicate s prezinte o
geometrie complementar adecvat care este dependent de formele tautomere pe care
le adopt bazele (Figura 1.6). Totui, aceste consideraii nu sunt suficiente pentru a
explica total specificitatea de mperechere. n aceste condiii, s-a avansat ipoteza
69
existenei unei complementariti electronice ntre A - T, i C - G, care pentru moment
nu este complet elucidat.

3. Ierarhia plierii ADN

Interaciile i conformaiile elementare pe care le-am descris sunt, asemeni


cazului proteinelor, dictate de structura primar specific a acizilor nucleici.
Compoziia i secvena bazelor vor determina replieri ale polimerului ntr-o structur
spaial global. Att pentru ADN ct i pentru ARN putem defini mai multe nivele de
organizare structural.
Nivelul structurii secundare
Acest nivel este cel al mperecherii locale a bazelor provenind din dou
fragmente antiparalele (de zeci la mii de nucleotide), cu consecinele de rsucire n
diverse tipuri de elice, pe care le vom descrie n continuare. Fragmentele care se
mperecheaz aparin la dou catene diferite sau pot s fac parte din aceeai caten.
Aceste elice (helixuri), formate prin stivuirea planurilor bazelor fa de o ax,
le considerm structuri n dou dimensiuni (2-D). Ele pot fi uneori separate de fragmente
ne-mperecheate sau mperecheate diferit.
Nivelul teriar
Nivelul teriar este constituit din rsuciri, plieri sau suprarsuciri ale elicelor.
Se formeaz structuri arhitecturale n trei dimensiuni (structuri 3-D) care confer
macromoleculei conformaia sa global. Aceste structuri vor fi analizate, pentru ADN,
n paragrafele urmtoare i pentru ARN n capitolul patru.
Nivelurile superioare de organizare, asocieri excepionale de subuniti, pentru
a forma structuri cuaternare cu grade complexe de compactare la nivelul cromozomilor
vor fi descrise succint n capitolul cinci.

3.1. Str uctura spaial a ADN

Organizarea acestor polimeri, a cror mrime deosebit a fost evideniat, este


dominat de celebra dubl-elice (dublu helix sau duplex). Sunt deja cunoscute
structura, deosebit de repetitiv i uniform, dar i variaiile i deformrile modelului
de rsucire la nivel secundar i teriar.

70
3.1.1. Dublul helix - Modelul Watson i Crick

Anul 1953 are o importan deosebit pentru biologie: descoperirea structurii spaiale
a ADN urma s deschid calea cunoaterii mecanismelor ereditii i ale biosintezei proteice,
primele mari realizri ale domeniului biologiei moleculare. Utiliznd i asamblnd toate
cunotinele anterioare privind compoziia ADN, tautomeria bazelor, modelele moleculare
anterioare, spectrele de difracie cu raze X (furnizate de M. Wilkins i R. Franklin), Watson i
Crick au reuit, n acest an de graie, s deduc modelul de organizare n dubl elice i s
demonstreze existena structurii denumit de atunci ADN B.

3.1.1.1. Rsucirea n dubl elice

Conformaia ADN B este cea mai rspndit n natur i are urmtoarele


caracteristici responsabile de rsucirea n dubl elice:
1) Este format din dou catene polideoxiribonucleotidice cu secvene simetrice
asociate prin mperecherea bazelor complementare. Sensul celor dou catene este obligatoriu
opus: acestea sunt antiparalele (Figura 3.4.).
2) Asocierea celor dou catene determin apariia de constrngeri care se traduc prin
rsucirea obligatorie, n elice, a unei catene n jurul celeilalte. Catenele nu pot fi separate
dect dac pierd structura elicoidal regulat. Dubla elice (Figura 3.5) are cteva caracteristici
bine definite:
a) bazele sunt mperecheate i stivuite prin intermediul planurilor lor, care au
lungime egal, i constituie un cilindru central;
b) nlnuirile pentoz-fosfat polianionice formeaz scheletele elicoidale paralele
exterioare, planurile bazelor fiind aproape perpendiculare pe cele ale bazelor;
c) marea ax a ansamblului este perpendicular pe planul de stivuire a bazelor.
Aceast structur monoton, de o remarcabil regularitate, se stabilete pe toat
lungimea unei molecule i i confer un caracter fibros. Ea este meninut prin dou
ansambluri de fore, discutate n capitolul precedent: legturile de hidrogen care se formeaz
ntre bazele celor dou catene i forele de stivuire.

3.1.1.2. Caracteristicile geometrice ale structurii 2-


2- D de tip B

Structura n dou dimensiuni a acizilor nucleici prezint urmtoarele caracteristici: i)


din cele dou sensuri de rsucire, posibile teoretic - drept/stng, care determin obinerea unor
structuri care constituie fiecare imaginea rsturnat a celeilalte n oglind, pentru ADN se
impune modelul considerat convenional drept. Acesta este dictat de geometria scheletului
71
pentoz-fosfat ii) dimensiunile elicei (helixului) sunt indicate n tabelul 2.7. Elicea conine, n
medie, 10 perechi de baze pe tur, care au un pas de 3,4 nm i un diametru de 2 nm. Distana
dintre planurile bazelor este corespunztoare grosimii nucleelor n contact; iii) datorit
poziiei axei n centrul fiecrei perechi de baze i de ataarea lor covalent di-simetric pe
schelet, se formeaz dou fose (mare i mic) care au deschidere i profunzime diferit i care
alterneaz la nivelul flancurilor elicei, pe toat lungimea acesteia (Figura 3.5). Morfologia
acestor fose sufer variaii locale, n funcie de secvena de baze. De exemplu, ntr-o regiune
bogat n A-T, fosa mic este mult mai ngust dect n cazul unei regiuni bogate n G-C.
d) conformaiile pentozei i legturii glicozidice n structura unitilor nucleotidice
sunt caracteristice acestui tip de structur (Tabel 3.1).
Conformaia B, cea descris de Watson i Crick, este cea mai stabil n condiii
fiziologice i deci considerat drept forma nativ de referin pentru ADN. Totui,
flexibilitatea relativ a structurii i permite acesteia s adopte i alte conformaii duplex, dintre
care dou sunt bine caracterizate prin cristalografie. n tabelul 3.1 sunt grupate caracteristicile
diferitelor conformaii iar n figura 3.5. este prezentat modelul conformaiei B.

3.1.2. Conformaia A

Dac se concentraz o soluie de ADN n ap, moleculele ncep s treac


reversibil ntr-o conformaie diferit, care a fost numit A. ADN-A este tot o dubl
elice dreapt dar cu o geometrie particular:
i) aceasta este mult mai compact; pentru acelai numr de perechi de baze
lungimea sa total este mai redus iar diametrul este mai mare dect n cazul ADN-
B. Ca urmare acestei structuri bazele sunt mai puin accesibile;
ii) planurile bazelor sunt rsucite cu 1800 n raport poziia celor din forma B
i sunt mult nclinate fa de ax, ceea ce strivete i adncete fosa mare i
aplatizeaz pe cea mic. n acest caz, calificativele de fos mare i mic i pierd
sensul;
iii) conformaia furanozei trece n 3E (C3 endo) (Figura 1.15).
In vivo, conformaia A este adoptat de: i) ADN din anumii spori bacterieni
formai ca rspuns la uscarea mediului. Aceast trecere poate explica rezistena la
condiii extreme i efectul de dimerizare al radiaiilor UV; ii) mperecherile locale
sub form de dubl elice ale ARN, care prezint o preferin net pentru conformaia
C3 endo a pentozei (3E); iii) hibrizi ARN-ADN care se formeaz tranzitoriu n
timpul procesului de amorsare a replicrii i n timpul transcripiei.

72
Figura 3. 4. Legturi de hidrogen ntre bazele complementare din structura catenelor elicei ADN: a) reprezentare n
plan a legturilor de hidrogen; b) prezentare schematic plan a vectorizrii catenelor.

Figura 3.5. Structura ADN B: a) imagine schematic a dublei elice cu evidenierea dimensiunilor, b)
vedere schematic de sus; c) imagini ADN B cu evidenierea scheletului riboz-fosfat i a
planului bazelor; d) vederi de sus cu evidenierea cilindrului central (adaptat dup
Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

73
Tabel 3.1. Caracteristicile diferitelor conformaii ale elicelor ADN
Caracteristici conformaie B conformaie A conformaie Z
sens de rsucire Drept drept Stng
numr de pb/tur 10,4 (10,0-10,7) 11 12 (6 di-nucleotide)
nlimea pe ax
pe tur (pas) 3,4 nm 2,8 nm 4,5 nm
pe plan de baze 0,34 nm 0,26 nm 0,37 nm
nclinarea bazelor fa de 10 200 90
ax 360 330 -600/dinucleotid
rotaia planului bazelor
Diametru 2 nm 2,3 nm 1,8 nm
Conformaii
2 3 2
dPyd: pentoz E E E
legtur glicozidic Anti anti Anti
2 3 3
dPuo: pentoz E E E
legtur glicozidic Anti anti Syn
fos: mare mare i profund ngust i profund* -
Mic ngust i profund mare i profund* ngust i profund
n text este explicat aceast aparent contradicie

3.1.3. Conformaia Z

Este o structur radical diferit de precedentele deoarece se formeaz prin


rsucirea elicei spre stnga. Pentru prima dat, a fost evideniat, in vitro, prin
cristalografie cu raze X, la 25 de ani de la descoperirea conformaiei B de ctre Watson
i Crick. Aceast conformaie este prezent n segmentele de secven alternante Pur-
Pyr (-G-C-G-C-). Unitatea de structural de baz este dinucleotidic. Componenta
purinic prezint o conformaie care prezint modificri la nivelul formei anvelope a
pentozei i a poziiei bazei.
Aceast conformaie Z a fost detectat la procariote i la eucariote, la nivelul
secvenelor bogate n metil-citozine, ale cror grupri hidrofobe favorizeaz formarea
structurii. Analiza structurii primare evideniaz c anumite regiuni scurte de ADN
prezint alternana necesar pentru adopta conformaii Z. Acestea ar putea avea rol de
comutator al expresiei genelor ca urmare a trecerii reversibile din conformaie B n Z.
Cu siguran c acest proces este foarte costisitor care din punct de vedere energetic.
Este general admis c, n condiii fiziologice (trie ionic i pH celular), apare
necesitatea unei etape indispensabile de pregtire prealabil a dublei catene, de
exemplu printr-o supra-rsucire. Cu ajutorul spectroscopiei prin dicroism circular a fost
identificat net existena conformaiilor B i Z i posibilitile de tranziie ale acestora
(Figura 3.7).

74
Figura 3.6. Alte conformaii ADN: a) conformaia ADN A - vedere normal i de sus; b) conformaia Z
vedere normal i de sus (adaptat dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

Figura 3.7. Model


privind posibilitatea de
trecere din conformaia
B n Z (dup
Biochemistry, Voet &
Voet, 1995)

75
3.1.3.1. Evidenierea ADN - Z

Pn la sfritul anilor 1970 nu a fost contestat dubla elice dreapt prin


evidenierea altor conformaii. n 1979, n SUA, Rich a obinut ADN de stnga sau
ADN-Z. Rezultatul a fost obinut folosind un oligonucleotid artificial dublu-catenar cu
secvena: d(CGCGCG).
Aceast alegere, n care alterneaz o baz pirimidinic i una purinic, poate fi
considerat a priori arbitrar. Astfel de secvene exist in vivo, chiar dac sunt rare.
Experimentul prin care s-a demonstrat c un polimer artificial, cu o anumit structur,
poate adoptata conformaie Z a fost realizat n condiii de concentraii n sruri ale
mediului foarte ridicate. Dup 1982, a fost posibil obinerea ADN-Z n condiii mult
mai apropiate de cele fiziologice. S-a constatat c este suficient metilarea secvenelor
de ADN la nivelul citozinei sau realizarea experimentului n prezena anumitor
poliamine de tipul sperminei. De asemenea, la sfritul anului 1982, a fost posibil
prima evideniere a prezenei ADN-Z n structura materialului genetic viu (cromozomi
de insecte i de rztoare) prin folosirea de anticorpi specifici direcionai ctre ADN-
Z. Din acest moment ADN-Z nu a mai constituit numai o curiozitate de laborator. Un
an mai trziu, prezenta acestei forme a fost evideniat i la nivelul cromozomilor de la
om.

3.1.3.2. Caracteristicile ADN - Z

ADN de stnga nu este imaginea n oglind a ADN de dreapta. Acesta are


o conformaie care difer prin:
a) scheletul pentoz-fosfat este n zig-zag n loc s formeze o spiral regulat
cum este cazul ADN-B, de unde i numele de ADN-Z pe care l-a primit structura;
b) ADN-Z formeaz un helix mai zvelt i mult mai puin rsucit dect ADN-B.
El posed un numr mai mare de perechi de baze pe fiecare tur de elice: 12 pb n loc
de 10/10,5 pb n ADN-B. Pasul elicei este de 4,6 nm (n loc de 3,4 nm pentru ADN-B)
i diametrul de 1,8 nm fa de 2,4 pentru ADN-B;
c) bazele sunt, asemeni structurii ADN-B, orientate n interiorul helixului. n
structura ADN-Z acestea sunt mult mai accesibile (conformaie anti pentru citozin sau
timin i sin pentru guanin sau adenin) dect n structura ADN-B (conformaie anti
pentru toate tipurile de nucleotide) unde sunt aproape inaccesibile. Aceast alternan
anti-sin produce aspectul de zig-zag al scheletului helixului. Spre deosebire de ADN-
B, ADN-Z are oxigenul ciclului pentagonal, de pe aceeai caten, orientat alternativ n
76
sus i n jos. Astfel, n ADN-Z nucleul imidazol al guaninei (n particular N7 i C8)
este mult mai accesibil.
Deci, conformaia ADN-Z este favorizat de o alternan pirimidin i purin.
Tendina dinucleotidelor pirimidinice-purinice de a forma secvene ADN-Z descrete
n ordinea: m5CG > CG > TG = CA > TA (m5C este citozin metilat n poziia 5)
Se pare c ADN Z apare mai frecvent la procariote dect la eucariote. Aceast
tendin poate fi corelat cu faptul c secvenele CG sunt net mai numeroase n
structura ADN la procariote dect la eucariote.
n soluii fiziologice, ADN-Z este mai puin stabil dect ADN-B. Acest fapt
este datorat n mare parte repulsiilor electrostatice care apar ntre gruprile fosfat
ncrcate negativ. Aceste grupri fosfat sunt mai apropiate n ADN-Z (elice mai zvelt)
dect n ADN-B unde cele dou catene sunt mult mai deprtate. Astfel se explic de ce
evidenierea iniial a structurilor a putut fi fcut numai pentru soluii ADN bogate n
sruri, care reduc forele de repulsie dintre gruprile fosfat.

3.1.3.3. Interesul pentr u ADN - Z

Nu se cunoate nc exact funcia ADN-Z. Totui, se pare c acesta joac un


rol biologic important. Este unanim acceptat c, secvenele CG par sunt implicate n
controlul expresiei genelor. Astfel, cel mai adesea, aceste secvene sunt metilate (la
nivelul citozinei) n genele inactive i invers, nemetilate n genele frecvent exprimate.
De asemenea, se tie c metilarea secvenelor CG favorizeaz foarte mult formarea
ADN-Z. Se consider c unul dintre mecanismele posibile implicate n reglarea
expresiei genelor o reprezint capacitatea, in vivo, a anumitor secvene CG de a adopta
o conformaie ADN-Z (dublu helix de stnga) n mijlocul unei zone de dublu helix
de dreapta.
Pe de alt parte, anumite proteine cu un rol reglator important (Z-DNA
binding protein), sunt capabile s se lege specific la ADN-Z i nu la ADN-B.
n concluzie
Datele prezentate mai sus ne confirm c ADN nu conine numai informaia
codant care dirijeaz sinteza ARN, prin secvena sa nucleotidic, ci i o informaie
conformaional determinat de prezena anumitor secvene nucleotidice (ex.
succesiunile CG). Aceste informaii conformaionale ar putea permite ca segmente din
structura ADN s adopte conformaii diferite (ex. ADN-Z) care ar putea astfel juca un
rol important n anumite mecanisme de reglare biologic, n particular la nivelul
transcripiei.
77
ADN nu este considerat o molecul static. Aceasta trebuie privit mai mult
ca o structur dinamic, flexibil, la nivelul creia unele conformaii sunt n echilibru
cu altele.

3.2. Conformaia de tripl elice (triplu helix)

Pentru diferite regiuni de ADN a fost identificat o conformaie de tripl elice


(triplu-helix H). Aceast conformaie poate fi adoptat de unele dintre secvenele
particulare despre care vom discuta n continuare.
Un numr secvene particulare prezente n structura primar sau fixarea
anumitor proteine produc modificri conformaionale locale n structura 2-D a acizilor
nucleici.

3.2.1. Secvenele repetitive

Unele regiuni din structura ADN se ndeprteaz de geometria standard de


dublu helix prin apariia unei curburi la nivelul axei mari. Aceast modificare este
adesea rezultatul fixrii unei proteine dar poate fi, la fel de bine, rezultatul repetrii
anumitor secvene n regiuni ale structurii ADN la nivelul crora nu s-au legat proteine.
O scurt repetiie a aceleiai baze pe o caten, format de exemplu din 4 la 6 A sau T
una dup alta, produc local, prin nclinarea planurilor, o conformaie B mai rigid.
Aceasta se caracterizeaz printr-o fos mic mai ngust i un pas mai mare dect n
conformaia B normal. Repetarea periodic a acestei suite, separat prin serii aleatoare
de aceeai lungime, cumuleaz efectul. Aceste molecule vor migra mai repede
deoarece forele de friciune la nivelul lor sunt mai reduse n raport cu forma baton. Se
consider c aceste deformri sunt implicate direct n interaciile dintre diferitele
regiuni de ADN i proteinele globulare.

3.2.2. Secvenele polipirimidinice

O alt structur foarte particular rezult dintr-o asimetrie Pur/Pyr ntre cele dou
catene. Dac regiunea luat n discuie este destul de lung, dubla caten se desface pe
o poriune, catena eliberat, bogat n pirimidine se repliaz i se dispune n fosa mare
la nivelul restului catenei rmas sub form de duplex. Poziionarea se realizeaz prin
stabilirea de mperecheri de tip Hoogsteen cu purinele care la rndul lor fac parte
integrant din dubla caten. Astfel, se formeaz o elice tripl (denumit H de la

78
Hoogsteen), ale crei planuri sunt triade de tip T-A x T i C-G x C (unde x marcheaz
mperecherea Hoogsteen) (Figura 3.9.).
n mod analog, o tripl elice eterogen se poate forma ntre un ADN bicatenar
i o caten de la o alt specie (ADN sau ARN). Astfel de structuri ar putea responsabile
de iniierea schimburilor de secvene implicate n recombinarea genoamelor.

Figura 3.8. Curbura impus


dublului helix de ctre repetarea
secvenial a bazelor.

79
Figura 3.9. mperecherea i schema triplei elice H a ADN

3.2.3. Secvenele palindromice

Se cunoate c palindroamele prezint pe aceeai caten o secven i


complementul su (secvena sa complementar). Aceste regiuni manifest preferina de
mperechere ntre ele prin auto-complementaritate dect tendina de mperechere
complementar cu cealalt caten a elicei (Figura 3.10). Aceast situaie este frecvent n
cazul monocatenelor ARN, structura n ac de pr fiind un motiv secundar important
al structurii lor. n cazul ADN, apariia unor astfel de structuri cruciforme pare s fie
rezervat secvenelor mai puin stabile din structura dublei elice i anume celor bogate
n baze A i T care alterneaz.

Figura 3.10. Consecinele prezenei secvenelor


repetitive pentru structura secundar a ADN.
Existena unor secvene repetitive inversate poate

80
provoca mperecheri ale regiunilor de pe aceeai caten. Cum cele dou catene sunt complementare o
mperechere poate determina o mperechere simetric pe cea de a doua caten. Rezultatul l reprezint
formarea unei structuri cruciforme.

4. Topoizomeri i topoizomeraze

Majoritatea cromozomilor bacterieni sunt suprarsucii n celule. De asemenea,


chiar moleculele de ADN lineare lungi conin regiuni suprarsucite local. n mod
normal, cromozomii bacterieni posed aproximativ cinci suprarsuciri pentru fiecare
1000 perechi de baze ADN. De asemenea, ADN din nucleii celulelor eucariote este
suprarsucit. Toate organismele posed enzime care pot scinda ADN pentru a de-rsuci
sau suprarsuci moleculele de ADN n scopul modificrii topologiei acestuia n funcie
de necesitile fiziologice ale celulei.

4.1. Caracterizare general

4.1.1. Super-helixurile 3-D ale ADN

In vivo, ADN nu rmne linear. El se gsete n cea mai mare parte a


genoamelor sub form nchis:
a) molecula este nchis prin formarea de legturi 3-5 ester ntre extremitile
sale, deci, este forma de forma ADN circular nchis. Este cazul unor virusuri, plasmide,
ADN mitocondrial i ADN din cloroplaste.
b) extremitile sunt ancorate la nivelul unor puncte fixe pe o matri: i) cazul
cromozomului nucleoid de la procariote; ii) matricea nuclear de la eucariote, unde
ADN este sub form de bucle care intr n contact strns cu proteinele.
n aceast topologie, cele dou catene sunt indispensabile, chiar dac sunt
desfcute. Starea duplexului n momentul nchiderii sale poate s l supun la fore
suplimentare de constrngere la care acesta trebuie s rspund.

4.1.1.1. Supra - rsucirile dublului helix

Conceptul de supra-rsucire a fost introdus ca urmarea a observaiilor fcute de


J. Vinograd (1963) asupra comportamentului anormal la ultracentrifugare al
moleculelor de ADN circular ale virusului animal SV40. Cu toate c se afla n stare
pur, acesta se repartiza n funcie de condiii sau de pre-tratament n trei zone de
densiti diferite: 14, 16 i 20S. Existen unei alte benzi cu densitate foarte mare, 53S,
81
a fost explicat ca fiind rezultatul unei posibile denaturri pe care o vom analiza mai
trziu. Autorul a interpretat apariia celor trei benzi prin existena a trei forme mai mult
sau mai puin compacte ale aceleiai molecule: i) 14S, molecule lineare; ii) 16S,
molecule circulare relaxate care reprezentau eventuale forme modificate; iii) 20S,
singura form nativ care conine ADN circular compactat printr-o suprarsucire a
dublului helix.
Demonstrat c fiind starea fiziologic a moleculelor de ADN, aceast
suprarsucire este indus printr-o rsucire a moleculei prealabil nchiderii sale. Pentru
facilitarea explicaiei considerm o molecul ipotetic de 374 pb care va fi utilizat
drept exemplu (lungimea reprezint 1/14 din mrimea virusului SV40). Modelul
utilizat se consider a fi un duplex linear n conformaie B cu 36 ture (374/10,4).
Molecula poate fi analizat sub diferite forme i condiii (Figura 3.11.):
a) ca o structur fr tensiuni suplimentare numit relaxat;
b) fixm o extremitate i derulm dublul helix cu un anumit numr de ture, de
exemplu 3, nainte de a nchide molecula. Molecula nchis trebuie s compenseze
aceast constrngere (modificare). Ea poate realiza acest lucru n dou moduri care
corespund la dou conformaii 3-D limitate: i) rsucirea se realizeaz pe cele 33 de ture
ale helixului B rmas, deficitul de 3 ture dnd natere unei regiuni de ne-mperechere,
sub forma unei bule de ADN denaturat; ii) dubla elice se poate reface sub forma a 36
de ture i tensiunea aprut poate fi compensat de formarea unei torsade a duplexului
sub propria sa ax de 3 super-ture n sensul n care elicea ADN se deruleaz. Aceast
suprarsucire, care este de pas drept ca i elicea, este numit, prin convenie, negativ.
Forma (b.i) este energetic defavorabil. n condiii normale moleculele de
ADN adopt o conformaie supra-rsucit negativ (b.ii). n experienele lui Vinograd,
aceasta este forma cu densitatea cea mai mare 20S. 16S corespunde moleculei circulare
relaxate obinut prin ruperea unei catene iar 14S este forma linear rezultat prin
scindarea celor dou catene.
n vitro, este posibil supra-rsucirea unui duplex prin introducerea de ture
suplimentare n sensul elicei. Aceast supra-rsucire pozitiv este practic absent n
structurile biologice. Situaia ar putea fi explicat prin faptul c presiunea de rsucire
impus dublului helix este mai greu de disociat opunnd o rezisten care mpiedic
molecula de ADN s-i realizeze funciile vitale (replicarea i transcripia).

4.1.1.2. Parametrii pentru caracterizarea formrii super -


elicelor

82
Pentru a nelege mai bine formarea super-helixurilor ADN i caracteristicile
acestora au fost definii o serie de parametrii. Nomenclatura convenional curent,
folosit pentru definirea parametrilor topologici este urmtoarea:
Densitatea de supra-rsucire (superhelical density) notat convenional cu
este numrul de super-ture pentru o tur de dubl elice. Pentru forma b.ii din exemplul
nostru, are valoarea -3/36 = -0,08. Marea majoritate a moleculelor de ADN naturale
au o densitate de supra-rsucire aproximativ asemntoare, cuprins ntre -0,05 i -0,06
(sau de la -5 la -6%).
Numrul de nlnuiri L (linking number) care se definete ca numrul de
ture ale unei catene n jurul axei dublei elice ntr-o molecul circular dispus ipotetic
pe o suprafa plat. Acest numr este considerat convenional pozitiv pentru dubla
elice de dreapta, i este un numr ntreg i constat pentru o molecul nchis.
Moleculele care nu difer dect prin indicele L sunt denumite topoizomeri
(formele 2a i 2b din figura 3.11). Interconversia lor este posibil numai prin tierea i
re-sudarea obligatorie a uneia dintre cele dou catene.
Pentru a nelege mai bine exemplificm pentru ADN circular al virusului
SV40 (aprox 5 300 pb) care are urmtoarele caracteristici:

forma relaxat: L = 500 (5 300/10,6)


forma nativ: L = 475
= - 0,05 (-25/500)

Pentru a aduce precizri asupra formelor supra-rsucite ale dublelor elice i a


putea diferenia formele cu acelai numr L (de exemplu a i b) apare necesitatea
definirii altor doi parametri topologici: T i W.
Numrul de rsuciri T (twisting number) care este o caracteristic intrinsec
a dublei elice i reprezint numrul su total de ture (nr. total de baze/nr. baze pe tur
pentru a da natere structurii ipotetice dispus n plan);
Numrul de supra-rsuciri, W (writhing number) care este un indiciu
veritabil asupra supra-rsucirii moleculei. Acesta descrie modul de rotire al axei
duplexului n spaiu. W este 0 pentru molecula relaxat, i aproximativ, numrul de
super-ture cu semnul su corespunztor, pentru forma supra-rsucit. De reinut c
ntotdeauna L= W + T
Spre deosebire de L, care are o valoare fix asociat entitii globale nchise, T
i W reprezint nsumarea caracteristicilor locale ale secvenelor i nu sunt neaprat
numere ntregi. Valoarea relativ a celor dou componente este determinat energetic.
Pentru un anumit tip de ADN, starea energetic minim este aceea pentru care variaia
83
L, provocat de trecerea la conformaia suprarsucit, se traduce aproximativ 70% n
parametrul W. n cazul exemplului utilizat dac L trece de la 36 la 33, forma rsucit
stabil va avea W egal cu -2,1 (-3 x 0,70) (Figura 3.11)

4.2. Structura topoizomerilor i topoizomerazelor

Aa cum am constata n prezentarea general, dou molecule de ADN


circulare, care au aceeai secven de baze, pot s difere ntre ele prin parametrul L,
numit numr de nlnuiri, adic numrul de ture pe care o caten o face n jurul
celeilalte. Aceste dou forme moleculare, a cror singur diferen este numrul de
rsuciri, se numesc topoizomeri.
Noiunile care vor fi utilizate n continuare (tensiune, constrngere) nu sunt
aplicabile teoretic dect inelelor de ADN (moleculelor circulare cu capete nchise), i
nu moleculelor de ADN lineare, ale cror extremiti sunt libere. Totui, o molecul de
ADN linear se poate comporta ca o molecul de ADN circular dac fiecare dintre cele
dou extremiti este legat ntr-un punct de ancorare, situaie absolut normal n
celule.
Tot n prezentarea general am constatat c numrul de rsuciri reprezint o
constant topologic. Indiferent de deformrile pe care le sufer o molecul de ADN,
ale crei extremiti sunt fixe, nu vom schimba numrul de rsuciri. Deci, modificarea
numrului de perechi de baze pe tur de elice, n dreptul unei bucle a ADN, va fi n mod
necesar compensat de o supra-rsucire de sens opus (pozitiv sau negativ) n amonte
sau n aval de acest loc (Figura 3.11).

4.2.1. Diferitele stri ale topoizomerilor

4.2.1.1. Starea relaxat:


n starea numit relaxat, constrngerea sau tensiunea existent la nivelul
dublei elice este minim. Analizele fizico-chimice efectuate pe fibre cristaline de
ADN-B au indicat c aceast stare exist pentru 10 perechi de baze pe tur. n celule,
ADN are o conformaie apropiat de cea a ADN-B. Totui, n aceast stare
netensionat ADN are 10,5 perechi de baze pentru fiecare tur a spirei, n loc de 10
(Klug, Premiul Nobel pentru chimie 1982). Aceast valoare este de fapt o medie, ea
putnd varia pe distane scurte n molecula de ADN, deoarece acesta este asociat cu
proteine.

84
4.2.1.2. Starea supra - rsucit
Axa dublului helix se poate rsuci sub ea nsi formnd o super-elice.
Teoretic, sunt posibile dou forme de supra-rsucire (supercoiling):
a) supra-rsucire pozitiv: numrul de rsuciri a fost crescut; tensiunea care
apare determin formarea unui super-elice pozitiv sau stng;
b) supra-rsucire negativ: numrul de rsuciri a fost diminuat; axa dublei elice
se rsucete formnd o elice negativ sau dreapt.
Supra-rsucirea negativ = de-rsucire
Cea mai mare parte a moleculelor de ADN, din natur, formeaz suprarsuciri
negative (super-elice de dreapta), prin derularea a aproximativ unui tur pentru fiecare
200 perechi de baze. n figura 3.12 este prezentat schematic o modalitate de
introducere a unei supra-rsuciri folosind modelul unei brri elastice. Un exemplu
casnic de apariie a unor structuri supra-rsucite l constituie rsucirea firului de
telefon.

85
Figura 3.11. Reprezentarea schematic a
diferitelor forme de ADN circular.
numerele reprezint turele dublului helix,
iar sgeile punctate regiunile de sudur
ale extremitilor.

86
Figura 3.12. Modelul unei brri elastice: cele dou laturi pot reprezenta cele dou catene ale dublului
helix.

Supra-rsucirea exercit o constrngere asupra moleculei. Aceast


constrngere provoac o ncolcire, att n cazul ADN supra-rsucit pozitiv ct i a
celui supra-rsucit negativ. Obinerea unui molecule de ADN supra-rsucite (pozitiv
sau negativ) necesit aport energetic, situaie logic deoarece se realizeaz trecerea
dintr-o stare netensionat ntr-o stare tensionat.
Formele de ADN supra-rsucite negativ prezint un dublu avantaj: i) sunt mai
compacte (cum sunt de altfel i formele supra-rsucite pozitiv); ii) sunt mult mai
accesibile enzimelor implicate n replicare i transcripie deoarece se formeaz n urma
unei de-rsuciri lejere a dublei elice.
La eucariote, ADN formeaz o super-elice dreapt n urma rsucirii n jurul
moleculelor de proteine histonice.
Trebuie s menionm c ADN mitocondrial nu este complexat cu histone.
Acesta se afl pur i simplu sub form de inele supra-rsucite, asemeni ADN bacterian
Concluzie: n celule ADN exist sub dou forme: a) stare relaxat (fr
constrngeri); b) stare ncolcit, rezultatul unei suprarsuciri negative: de obicei -1
tur/200 pb.

87
Figura 3.13. Micrografii electronice ale topoizomerilor unei molecule de ADN dublu-catenar circular nchis:
1) forma relaxat; 2, 3, 4, 5 forme supra-rsucite. (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

Existena structurilor supra-rsucite ale ADN a fost demonstrat i prin


microscopie electronic. n figura 3.13 sunt prezentate micrografii electronice att
pentru forma relaxat ct i pentru diferitele forme suprarsucite.
Topoizomerii pot fi separai prin gel electroforez. n general, cu ct un inel de
ADN este de-rsucit (supra-rsucit negativ), cu att el este mai ncolcit i mai
compact. Teoretic, cu ct un inel este mai compact cu att el va migra mai repede, dar
mobilitatea electroforetic este dependent i de o serie de ali factori. Moleculele de
ADN pot fi vizualizate prin iradierea gelului cu radiaii UV, dup ce acesta a fost tratat
cu bromur de etidium (BET), substan care se intercaleaz ntre bazele stivuite ale
acizilor nucleici, i determin apariia unei fluorescene oranj determinat de efectul
excitaiei UV (Figura 3.14). Reacia se produce att n cazul acizilor nucleici
monocatenari ct i dublu-catenari. Afinitatea
pentru acizii nucleici monocatenari este mai
mic i deci fluorescena este mai sczut. n
figura 3.14 este prezentat separarea
electroforetic a topoizomerilor SV40 nainte
si dup tratamentul cu topoizomeraz.

Figura 3.14. Separarea electroforetic a topoizomerilor


SV40: linia 1) migrarea ADN nativ; linia 2) migrarea
ADN supus 3 minute tratamentului cu topoizomeraz;
linia 3) migrarea ADN supus 30 minute tratamentului cu
topoizomeraz.

88
4.2.2. Topoizomerazele

Sunt enzime care modific numrul de rsuciri . Deci, ele sunt capabile s
induc sau s elimine super-turele ntr-un dublu helix ADN. Pentru a modifica numrul
de nlnuiri este necesar tierea uneia dintre cele dou catene sau a ambelor.
Pn n prezent se cunosc dou tipuri de topoizomeraze: topoizomeraza de tip I
i topoizomeraza de tip II.

4.2.2.1. Topoizomerazele de tip I

Sunt enzime care realizeaz tierea tranzitorie i re-sudarea unei singure catene
din structura ADN dublu-catenar relaxnd-o prin suprimarea super-turelor negative.
Ele aduc ADN supra-rsucit sau tensionat la conformaia sa iniial. Enzimele
relaxante de tip I acioneaz dup urmtorul protocol:
a) Tierea unei catene ADN este realizat la nivelul legturii fosfodiester. Este
eliberat momentan gruparea 3 OH, iar gruparea fosfat din 5 este esterificat cu o
tirozin prezent n situsul activ al topoizomerazei (Figura 3.15). Aceast reacie de
trans-esterificare creeaz un complex tranzitoriu ADN-topoizomeraz. Astfel, energia
legturii fosfodiester scindat la nivelul ADN este conservat temporar sub forma
legturii fosfotirozin.
b) Rotaia catenei tiate: catena eliberat se poate roti liber n jurul catenei
intacte.
c) Re-sudarea catenei ADN: legtura fosfodiester este restabilit utiliznd
energia conservat de legtura fosfotirozin; n general, aceste topoizomeraze nu
necesit aport de ATP.
ADN i topoizomerazele sunt regenerate n final, molecula de ADN avnd
acum o conformaie ne-tensionat.
Topoizomeraze de tip I au fost descrise, pentru prima dat la bacterii, dar se
gsesc i la om. Structura acestora din urm este diferit de cea de la bacterii, ele
putnd relaxa nu numai super-turele negative ct i pe cele pozitive (Figura 3.16).

89
Figura 3.15. Tirozina prezent n situsul
catalitic activ al topoizimerazei esterific
gruparea 5 fosfat eliberat

Figura 3.16 Modul de aciune al topoizomerazelor de tip I

Figura 3.17. Modul de aciune al girazelor bacteriene: a) introducerea de super-ture negative; b) replicarea
ADN dublu catenar circular nchis cu formarea de regiuni supra-rsucite (catenate); c)
intervenia girazelor n procesul de catenare decatenare;

90
4.2.2.2. Topoizomerazele de tip II

Sunt enzime care taie temporar ambele catene de ADN i apoi le re-sudeaz.
Topoizomerazele de tip II sunt structuri dimere fiecare caten ADN fiind tiat de ctre
o subunitate.
Din aceast categorie fac parte i girazele bacteriene. Acestea sunt enzime
remarcabile care deruleaz ADN, deci permit introducerea de super-ture negative la
nivelul dublei elice (Figura 3.17) . Aceast reacie este cuplat cu hidroliza cel puin a
unei molecule de ATP.
La eucariote nu se cunoate foarte bine mecanismul introducerii de supra-
rsucirii negative.
n figura 3.18. este prezentat un model al mecanismului de aciune al
topoizomerazei II de la E. Coli. Enzima este un dimer constituit din dou subuniti
identice. Iniial, aceasta leag o parte a catenei ADN, segmentul G (albastru nchis),
inducnd o modificare conformaional la nivelul domeniilor B, B, A i A ale
enzimei (2). Dup legarea ATP (indicat prin asterisc) i a altei pri a catenei ADN,
segmentul T (albastru deschis), se produc o serie de reacii n care segmentul G este
scindat de ctre domeniile A i A (portocaliu deschis) ale enzimei. Capetele
segmentului G se leag covalent la un rest de tirozin cu trei domenii (3 i 3a).
Simultan domeniile de legare a ATP (verde) se deplaseaz unele ctre altele,
transportnd segmentul T ctre i n deschiderea central (4). Segmentul G tiat este
apoi resudat i segmentul T este eliberat ca urmare a unei modificri conformaionale
care separ domeniile A i A la captul enzimei (5). Refacerea interfeei dintre
domeniile A i A se realizeaz printr-o reacie care necesit utilizarea unei molecule
de ATP (2). n acest punct, segmentul G poate disocia de pe enzim prin conversia 2 n
1. Alternativ, enzima poate trece ctre un alt ciclu, trecnd segmentul T peste
segmentul G i nlturnd nc dou super-ture.
n 1984 au fost descoperite la unele archeobacterii, care triesc la mai mult de
0
80 C, i apoi la eucariote termofile, topoizomeraze capabile s induc supra-rsuciri
pozitive. Acestea determin formarea unor molecule de ADN suprarsucite pozitiv cu
consum de ATP. Enzimele a fost denumite iniial gireze inverse deoarece au rolul de
a proteja ADN de denaturare, fenomen altfel inevitabil la temperaturi ridicate. Se pare
c acestea sunt topoizomeraze este de tip I i nu de tip II cu toate c necesit ATP
pentru funcionare.

91
4.2.2.3. Interesul biochimic al topoizomerazelor

Virusuri i procariote

Rolul conjugat al celor dou tipuri de izomeraze este foarte important:


a) n primul rnd, ADN supra-rsucit negativ este mai compact dect
echivalentul su circular relaxat. Astfel, n vivo, ADN conine numeroase ncolciri,
prezena acestora fiind indispensabil mpachetrii moleculelor de ADN circular foarte
lungi ntr-un volum mic.
b) Pe de alt parte, topoizomerazele faciliteaz replicarea, transcripia i
repararea ADN prin recombinare cu alte segmente ADN. De fapt, numeroase proteine,
indispensabile, nc de la iniierea acestor procese, nu se vor lega la ADN dect dac
acesta este supra-rsucit negativ. Deplasarea furcilor de replicare i de transcripie
induce automat formarea de supra-rsuciri pozitive la nivelul duplexului ADN,
ngreunnd deplasarea acestora. Pentru ca sinteza ADN s se continue, supra-rsucirile
pozitive trebuiesc nlturate de ctre ADN giraza (Figura 3.19)
nelegem foarte bine care este interesul topoizomerazelor capabile s
introduc super-ture negative. Rolul enzimelor care produc relaxarea super-turelor
negative este mai enigmatic. Este posibil ca acestea s fie implicate n asigurarea unui
grad normal de supra-rsucire. Acesta se poate obine printr-un echilibru ntre
topoizomerazele care asigur supra-rsucirea negativ i topoizomerazele relaxante.
n figura 3.19. este prezentat un model interesant de aciunea al
topoizomerazelor de tip II. La bacterii i virusuri denaturarea capetelor ne-replicate
urmat de supra-rsuciri conduce la instalarea unor constrngeri topologice care
determin ncetarea replicrii. n cazul ADN de la SV40, cele dou etape finale
(sintez i decatenare) pot s apar n orice ordine n funcie de condiiile
experimentale. Procesul a fost confirmat prin studii de microscopie electronic care
demonstreaz catenarea moleculelor de SV40 complet replicate. In vitro, intervenia
topoizomerazei II catalizeaz de-catenarea unor astfel de cercuri mpletite.

92
Figura 3.18. Model molecular al activitii catalitice a topoizomerazei II de la E. Coli (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Figura 3.19. Intervenia topoizomerazei


II n procesul de decatenare la SV40. a)
Imagine electronomicroscopic; b)
Model de decatenare; catenele parentale
sunt reprezentate n culori nchise iar
catenele fiice n culori deschise.(dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000)

93
Eucariote

nelegem foarte bine necesitatea topoizomerazelor de tip I pentru relaxarea


super-turelor negative i pozitive. n ceea ce privete topoizomerazele de tip II, acestea
se pare c au mai ales capacitatea de a desface nodurile (constrngerile) care apar n
structura ADN. Asemeni situaiei de la procariote, acestea taie dubla elice ADN, las
s treac un alt segment dublu catenar prin aceast bre i apoi o nchid. Se cunosc
izoformele alfa i beta, forma beta avnd o extremitate COOH terminal mai lung
dect forma alfa.
In concluzie, topoiomerazele sunt foarte utile, fie pentru a schimba supra-
rsucirea unei molecule de ADN, fie pentru a desface nodurile care apar n structura
ADN n urma diferitelor procese de transcripie i replicare. Aceste enzime sunt
extraordinari prestidigitatori, capabili s realizeze traversarea unei molecule de ADN
de ctre o alt molecul monocatenar sau dublu-catenar fr a las semne.
Deci, fr topoizomeraze nu ar putea fi rezolvate suprarsucirile inevitabile
care se produc n structura ADN n urma naintrii ARN i ADN polimerazelor.

4.2.2.4. Aplicaii medicale: inhibitorii topoizomerazelor

Inhibitorii girazei bacteriene, anti-bacterieni: lum drept exemplu modul de


aciune al anumitor medicamente din familia quinolonelor, deja utilizate de mult timp,
cum sunt Negram (acid nalidixic) i Urotrat sau a unora mai noi, cum este
Novobiocina. Aceste medicamente sunt utilizate la om pentru tratamentul infeciilor
urinare determinate de colibacili. Ele reacioneaz parial prin inhibarea girazei. Astfel,
este mpiedicat supra-rsucirea negativ, produs normal de giraz i necesar unei
bune replicri bacteriene. n acest fel este mpiedicat replicarea E. coli i deci stopat
multiplicarea colibacililor. Aciunea selectiv asupra enzimei bacteriene se explic prin
diferena structural dintre topoizomerazele bacteriene i umane. Aceste medicamente
au fost utilizate empiric nainte de cunoaterea modului lor de aciune.
Inhibitorii topoizomerazelor umane anticancerigeni: topoizomerazele sunt
inta a numeroase medicamente anticanceroase. Aceti produi acioneaz stabiliznd
tieturile tranzitorii din structura ADN induse n stare normal de topoizomeraze. n
aceste situaii, nu se poate realiza relegarea i acumularea unor astfel de complexe de
clivare determin moartea celulelor. Se manifest o selectivitate relativ fa de
celulele tumorale deoarece cantitatea de topoizomeraze la nivelul acestora este mult

94
mai mare. Dintre medicamentele din aceast categorie amintim: etopozidul (VP16),
inhibitor al topoizomerazei II i taxolul (extras din Taxus baccata), inhibitor al
topoizomerazei I.
Din pcate, exist numeroase cazuri de rezisten la inhibitorii
topoizomerazelor. Unele dintre aceste mecanisme se explic prin modificarea structurii
topoizomerazelor.

4.3. Consecinele supra - rsucirii teriare

4.3.1. Structurale

Supra-rsucirea moleculelor de ADN circulare, sau nchise sub form de bucl,


reprezint o modalitate major de compactare mecanic a acestor molecule de mrime
mare. Forma linear opune fore electrostatice replierilor dublei elice. Raporturile
dintre compactarea i densitatea moleculei se dispun n ordinea formei astfel: circular
supra-rsucit > circular relaxat > linear.
Aceste forme se pot diferenia prin microscopie electronic, ultracentrifugare i
electroforez. Electroforetic este posibil separarea topoizomerilor a cror valoare L
difer numai cu o singur unitate. n figura 3.14. este prezentat separarea
electroforetic a diferiilor topoizomeri ai ADN de la SV40. Materialul genetic a fost
extras din virioni SV40 n condiii care s asigure obinerea unui ADN cu un numr
maxim de supra-rsuciri (linia 1).
Cteva probe au fost tratate cu topoizomeraza de tip I din E. coli timp de 3 la
30 minute (liniile 2 i 3). Se observ identificarea a aproximativ 25 de benzi, egale cu
numrul aproximativ de topoizomeri, dup tratamentul cu topoizomeraza I. n figur
este prezentat i forma deplin relaxat, care nu prezint supra-rsuciri. ADN care
prezint un numr redus de supra-rsuciri tinde s se extind i migreaz mult mai
ncet dect moleculele compacte care posed un numr mai mare de supra-rsuciri.

4.3.2. Funcionale

Moleculele supra-rsucite sunt tensionate. Este vorba de o tensiune de torsiune


care crete, ca n cazul elasticului, o dat cu creterea numrului de super-ture. Energia
latent a acestei structuri 3-D poate fi:
a) parial absorbit de rsucirea ADN n jurul proteinelor (histonele de la
eucariote). Aceast situaie este mult mai probabil dect rsucirea sub propria

95
structur. n aceste cazuri spunem c supra-rsucirea este contrabalansat de ctre un
suport;
b) repartizat asupra ansamblului moleculei. n cazul unei conformaii ne-
contrabalansate, efectul negativ al supra-rsucirii se poate repartiza asupra pasului
mediu al dublei elice care este mrit, de la 10,4 la 10,6 sau din contr se concentreaz
local asupra uneia dintre regiuni fiind probabil ruperea mperecherilor. Supra-
rsucirea, prin dinamica sa, este o condiie prealabil pentru apariia deformrilor i
tranziiilor de la dublul helix B ctre alte conformaii. De asemenea, aceasta reprezint
o necesitate pentru amorsarea tuturor operaiilor fundamentale care necesit o
deschidere local a duplexului cu sunt: replicarea, transcripia, recombinarea.

4.3.3. Tehnice

Cristalizarea moleculei antreneaz modificri ale structurii 3-D. Suprarsucirea


duplexului flexibil poate fi evaluat prin utilizarea de molecule cu capacitate de
intercalare.
Ageni intercalai: modific helixul i conformaia sa supra-rsucit.
Demonstraia a fost realizat de ctre J. Vinograd cu bromur de etidium. Adugarea
de reactiv, al crui efect asupra moleculei este urmrit prin ultracentrifugare sau
electroforez, face ca ADN nativ s ating o densitate minim: prin inserarea bromurii
de etidium determin trecerea ADN din conformaia sa supra-rsucit negativ n
form relaxat. O molecul de BET deruleaz helixul cu un unghi constant de
aproximativ -260C, metoda putnd fi utilizat pentru msurarea supra-rsucirilor
(Figura 3.20.). Adugarea suplimentar de reactiv foreaz trecerea moleculei de ADN n
conformaie supra-rsucit pozitiv.

96
Figura 3.20. Aciunea bromurii de etidium asupra structurii ADN: a) structura bromurii de etidium; b)
intercalarea bromurii de etidium ntre planurile bazelor (adaptat dup Biochemistry,
Voet&Voet, 1995)

Tratamentul denaturant al ADN circular: cldura, tratamentul cu baze,


determin modificarea mperecherii celor dou catene care formeaz Helixul,
determinnd formarea unei structuri compacte cu densitate mare. Dac se realizeaz
tierea prealabil a celor dou catene cu ajutorul enzimelor, acestea se separ i
structurile lor aleatoare singure au densiti mai mici. n figura 3.14 sunt prezentate
astfel de situaii pentru molecula de ADN SV40 n urma tratamentului cu
topoizomeraze.

5. Proprietile fizico-chimice ale ADN

5.1. Consecinele naturii fibroase i mrimii

Pentru a extrage acizii nucleici i a le evalua masa molecular, sunt utilizate


anumite proprieti determinate de natura fibroas i de mrimea ADN, pe care le-am
anticipat deja n paragrafele precedente, i anume:
a) srurile de sodiu ale ADN sunt solubile n ap i dau soluii cu vscozitate
ridicat caracterizate prin fenomenul de birefringen de curgere;
b) alcoolii, dintre acetia cel mai folosit este etanolul, sunt utilizai pentru
precipitarea acizilor nucleici din soluie, sub forma unor aglomerate formate din fibre
foarte lungi;
c) densitatea acestor macromolecule este destul de mare pentru a permite
separarea lor prin ultracentrifugare. Centrifugarea n gradient de densitate la echilibru
permite determinarea masei moleculare i evaluarea coninutului n G+C*. n aceast
tehnic, numit i izopicnic (densitate egal), gradientul este realizat cu soluii de
clorur de cesiu (CsCl) (Figura 2.3).
Diferena de o unitate ntre masele moleculare ale cuplurilor GC i AT este
suficient pentru ca densitatea ADN s fie o funcie linear a coninutului n G+C.

5.2. Consecinele compoziiei

Dintre proprietile datorate compoziiei reinem:

97
a) Caracterizarea i dozarea ADN pentru coninutul n deoxiriboz. Coloraia
Feulgen a fost utilizat mult timp n histologie i citologie pentru localizarea nucleelor
i cromozomilor pe diferite preparate i se bazeaz pe reacie aldehidic a
deoxipentozei. Hidroliza acid parial, la cald, nltur purinele demascnd resturile
de 2-deoxiriboz. O fraciune suficient dintre deoxiribozele ataate pe schelet, sub
forma lor furanozic, sunt convertite n forma aldehidic care poate reaciona cu
reactivul Schiff (fuxin decolorat cu acid sulfuros) pe care l recoloreaz. Produsul
obinut precipit pe scheletul macromoleculei.
b) Absorbia n UV a ADN la 260 nm datorit coninutului lui n baze. Aceast
absorbie este de aproximativ 30 de ori mai important dect a proteinelor cu o
concentraie egal, dar totui inferioar bazelor libere. Proprietile de absorbie ale
acizilor nucleici stau la baza metodelor de dozare i de caracterizare a strii lor
moleculare (efectul hipocrom al ADN).

5.3. Proprietile oferite ADN de ctre mperecherea i

stivuirea bazelor

5.3.1. Proprieti mecanice

Spre deosebire de elicea alfa a proteinelor, scheletul acizilor nucleici nu este


stabilizat prin legturi de hidrogen. Helixul este deci flexibil i extensibil ca un resort
mai mult sau mai puin ntins. Astfel, se explic rezistena chimic i fragilitatea
mecanic a ADN n afara celulelor. Cnd molecula este ancorat la nivelul
extremitilor, ea este obiectul supra-rsucirilor despre care am discutat n paragraful
anterior. Aceste caliti sunt eseniale pentru evoluia proceselor de replicare i de
transcripie n cursul crora diferitele regiuni trebuie s se adapteze pentru contactul cu
diferitele complexe proteice, s se expun pentru a fi accesibile, etc.

5.3.2. Denaturarea acizilor nucleici

Procesul de denaturare reprezint o alterare a structurii spaiale a unei


macromolecule fr ruperea legturilor covalente. Comportamentul la denaturare al
acizilor nucleici este esenial diferit de al proteinelor.

5.3.2.1. Denaturarea i renaturarea termic

98
Denaturarea i renaturarea termic a ADN sunt pe de o parte modaliti de
studiu ale acestor molecule dar i unelte necesare n manipularea acestora. n
continuare vom ncerca s examinm aspectele eseniale.
Denaturarea: nclzirea unei soluii de ADN este nsoit de modificri
spectaculoase ale proprietilor fizice: pierderea vscozitii i amplificarea absorbiei
n UV. Efectul de hipercromicitate este o modificare foarte important i informativ
pentru studiul fenomenului de denaturare (Figura 3.21). Din stare nativ, dublu catenar,
molecula trece n stare denaturat: se rup legturile de hidrogen ale mperecherilor i
contactele Van der Waals care asigur stivuire, temperatura separ mai mult sau mai
puin complet cele dou catene care i pierd forma elicoidal i adopt o conformaie
statistic aleatoare (Figura 3.22.a; 3.23a). n aceste condiii crete absorbia n UV a
bazelor care pn n acel moment erau mascate.

Figura 3.21. Efectul temperaturi asupra ADN dublu catenar: a) creterea valorilor DO260 nm n urma
procesului de denaturare termic; b) efectul hipercrom al procesului de denaturare i
modalitatea de estimare a temperaturii de melting

Aceast modificare provocat de creterea temperaturii a fost denumit fuziune


prin comparaie cu procesul care se produce la nivelul membranelor. Aa cum se poate
observa n figura 3. 22b, moleculele de ADN de origini diferite prezint caracteristici
de fuziune diferite prin:
a) curba de fuziune: amplitudinea i etalarea efectului hipercrom;
b) valoarea temperaturii de fuziune Tm (m pentru melting), reprezint valoarea
la care jumtate din cantitatea de ADN dublu catenar se regsete n form
99
monocatenar. Grafic, reprezint 50% din valoarea maxim a absorbanei, i
corespunde punctului de inflexiune al curbei de variaie a acesteia cu temperatura.
La originea acestor diferene stau caracteristici intrinseci ale ADN: lungimea i
compoziia n baze. Rezistena la fuziune este n relaie direct cu coninutul n G+C,
deoarece mperecherile GC se realizeaz prin intermediul a trei legturi de hidrogen i
sunt mai stabile n timp ce perechile AT se disociaz primele. Astfel curba din figura 3.
2(b) demonstreaz existena unei relaii lineare ntre Tm i (G+C). n tabelul 3.2 sunt
furnizate cteva informaii privind coninutul G+C i valoarea Tm la cteva tipuri de
organisme. Pentru comparaie sunt introduse i valorile pentru poli(AT) i poli(CG).

Figura 3.22 a) Efectul hipercrom al denaturrii termice i determinarea temperaturii de melting; b)


Efectul coninutului G+C al ADN din diferite surse asupra temperaturii de fuziune.

Tabel 3.2. Exemple de valori Tm n funcie de coninutul n (G+C)


polinucleotide sau ADN G+G (% din coninutul total) Tm (0C)
poli(AT) 0 65
Mamifere 40 87
Escherichia coli 50 92
Micrococcus phlei 70 >98
poli (CG) 100 105

Un factor important este concentraia n sruri a mediului. Acesta reprezint un


factor extrinsec care are efect protector spectacular. Ionii minerali neutralizeaz
sarcinile scheletului fosfat i anuleaz repulsiile electrostatice care destabilizeaz
dublul helix (Figura 3.23). De reinut c n ap pur ADN se poate denatura la
temperatura ambiant.

Renaturarea: restaurarea strii iniiale de dubl caten, plecnd de la ADN


denaturat, este posibil. Succesul acestei renaturri depinde de: i) condiiile de mediu:

100
pH, trie ionic; ii) starea mai mult sau mai puin avansat a denaturrii; iii) protocolul
adoptat pentru revenirea la temperatura ne-denaturant (Figura 3.24).
Procesul de renaturare face obiectul a numeroase studii n intenia nelegerii
cineticii i a modelrii etapelor. Procesul de denaturare/renaturare parcurge diferite
etape n funcie de protocolul utilizat:
a) dac soluia este rcit prea repede, timpul de cutare al catenelor
complementare este prea scurt: moleculele sunt ngheate n starea imperfect de
cupluri inter- i intramoleculare;
b) dac soluia este meninut timp ndelungat la o temperatur inferioar Tm
(Tm-20 sau la temperatura optim Tm-250C) s-a observat, din contr, o revenire
gradat la proprietile caracteristice structurii bicatenare. Trebuie asigurat durata
necesar pentru explorarea bazelor prezente pe cele dou catene, reconstituirea
mperecherilor complementare i formarea dublei elice. Aceste condiii au fost
denumite de anelare, annealing sau trempe, expresii mprumutate din activitatea
de turnare a sticlei sau a metalelor.
Dac se pornete de la o soluie complet denaturat, re-mperecherea se
realizeaz n dou etape de cinetic diferite:
i) catenele separate se ntlnesc la ntmplare (hazard). Catenele
complementare se pot mperechea la nivelul unei scurte regiuni i pot forma nceputul
unei duble elice. Aceast etap este lent i este limitant de vitez pentru procesul
total de renaturare;
ii) mperecherile se vor efectua foarte rapid, plecnd de la punctele de iniiere a
procesului, dup modelul nchiderii unui fermoar, impunnd structura 2-D elicoidal pe
toat lungimea moleculei.
n afar de determinarea vscozitii i absorbiei, starea ADN mai poate fi
controlat prin microscopie electronic i prin tehnici de biologie molecular. Prin
microscopie electronic se vizualizeaz direct moleculele n timp ce biologia
molecular furnizeaz metodele indirecte: i) studiul activitii de transformare a ADN
pentru un anumit tip celular; ii) degradarea preferenial a duplexului de ctre enzime
cum sunt nucleaza S1 i ExoII (Tabel 2.4). Cromatografia de absorbie pe hidroxiapatit
ofer o alt modalitate de separare a duplexului, prin reinerea pe suprafaa suport a
monocatenelor.
Denaturrile i renaturrile sunt etape cheie pentru numeroase tehnici de
biologie molecular. Hibridizarea, etap tehnic foarte important, presupune formarea
de duplexuri artificiale ntre ADN din diferite surse sau ntre ADN i ARN.

101
Regiunile de ARN al cror lan monocatenar se repliaz pentru a forma o
structur elicoidal 2-D pot prezint acelai fenomen de denaturare. Aceste duplexuri
ARN sunt mult mai stabile. Valorile temperaturilor lor de melting sunt mai mari cu
aproximativ 200C dect cele ale secvenelor de ADN echivalente.

Figura 3.23 Fenomenul de denaturare i renaturare termic a acizilor nucleici:denaturare; b)


renaturare

Figura 3.24. Procesul de denaturare prin nclzire i tratament alcalin (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

5.3.2.2. Alte tipuri de denaturri

Exist o serie de ali factori care au aciune denaturant asupra ADN:


Valorile extreme de pH dezorganizeaz mperecherile modificnd ionizarea
grupelor de baze.

102
Tratamentul alcalin este o metod important care este folosit n tehnicile de
biologie molecular pentru denaturarea ADN. Prin aceasta se separ rapid catenele fr
a se produce degradare. Este o modalitate reversibil de a obine molecule de ADN
monocatenare care sunt foarte utile etapelor de hibridizare din tehnicile Southern i
northern blot (Figura 3.24). i moleculele de ARN se denatureaz foarte bine n condiii
blnde de tratament alcalin.
Corpii organici: compuii organici ca aldehida formic, formamida, ureea, au
capacitatea de a stabili legturi de hidrogen i sunt utilizai ca ageni denaturani n
tehnicile de separare a ADN (Figura 3.25). Faptul c aciunea lor necesit accesibilitatea
grupelor de baze implicate n mperecheri a condus la concepia unei structuri dinamice
pentru ADN, la nivelul cruia exist regiuni care se desfac tranzitoriu i monocatene
care se re-mperecheaz. Aceasta ne face s considerm c molecula se comport ca i
cum ar respira. n ADN linear, desfacerea spontan a bazelor este totui rar la
temperaturi fiziologice: durata de via a mperecherilor/desfacerii acestora este ordinul
10-2 i 10-7 secunde respectiv.

Figura 3.25. Ageni denaturani pentru


dubla elice ADN. Sunt molecule capabile s
formeze legturi de hidrogen i s induc
denaturarea ADN

Trebuie s reinem c in vivo: i) probabilitatea de denaturare a ADN n condiii


de pH, for ionic i temperatur celular este minim. Cu toate acestea existena
procesului activ de mperechere parial este obligatoriu pentru replicare i transcripie;
ii) proteinele care se leag la ADN inhib, pentru cea mai mare parte, denaturarea. Cu
toate acestea, n funcie de starea fiziologic a celulei, numeroase proteine
destabilizeaz dubla elice.

6. Bilan

Principalii factori care determin structura spaial a acizilor nucleici:


1) conformaia scheletului i sarcina electrostatic;
2) dublele interacii ale bazelor cu solventul: hidrofobe prin intermediul
nucleelor i hidrofile prin intermediul substituenilor polari;
3) stivuirea bazelor prin contacte Van der Waals;
4) mperecherea specific a bazelor prin legturi de hidrogen.

103
Totui, n raport cu proteinele diversitatea combinaiilor este limitat de
utilizarea a numai patru monomeri constitutivi:
a) ADN este macromolecul format din dou catene polinucleotidice ale cror
grade de libertate i varietate de organizare sunt reduse;
b) moleculele de ARN prezint un repertoriu structural care amintete de cel al
proteinelor, motive i domenii, care le permit, de altfel, s exprime anumite funcii cum
ar fi cea catalitic.

De ce T n ADN i U n ARN?
Dezaminrile accidentale (oxidative) fac ca citozina (C) s poat pierde
spontan gruparea sa amino (nlocuit de OH) i s se transforme n uracil, deci s stea
la originea unei mutaii. Din fericire, exist enzime de reparare care recunosc U,
deoarece U nu este prezent n mod normal n structura ADN. Acestea nltur U prin
excizie i o pot nlocui cu C.
n ADN, baza T poate fi deci considerat ca un semnal care indic
normalitatea, i c orice apariie a lui U trebuie considerat o greeal. Dac ADN ar fi
avut U n stare normal, enzimele de reparare nu ar fi putut distinge ntre U normal i
U provenind din dezaminarea citozinei.
n ceea ce privete ARN, acesta posed U fie n stare normal sau dup
dezaminarea accidental a citozinei. Este deci imposibil diferenierea celor dou tipuri
de U. n acelai timp sinteza T (compus metilat) este mai scump din punct de vedere
energetic dect U. Deoarece integritatea ADN este esenial pentru organism, ARN nu
a beneficiat de acest sistem de protecie specifica ADN.

De ce deoxiriboz n ADN i riboz n ARN?


Helixurile care conin riboz sunt mai puin stabile dect cele care conin
deoxiriboz, datorit prezenei gruprii OH din poziia 2. Deci, deoxiriboza confer un
element de stabilitate ADN, gardianul informaiei genetice a organismelor.
Pe de alt parte, n structura ARN prezena OH n poziia 2 este esenial i
util n excizia intronilor din pre-ARNm.

De ce 2 catene n ADN i una n ARN?


n molecula de ADN existena a dou catene complementare reprezint o
modalitate de asigurare a pstrrii informaiei genetice. Aa cum vom vedea n
capitolul despre mutaii, n cazul deteriorrii unei catene, informaia este conservat de
cealalt. Ct privete ARN, se pare c acesta nu reprezint dect o copie printre alte
mii.

104
105
CAPITOLUL IV

STRUCTURA SECUNDAR I TERIAR A ARN

Moleculele de ARN, care conin dou catene mperechiate, reprezint o


excepie care este ntlnit la cteva virusuri. Diferitele tipuri de ARN sunt, de fapt,
produi ai reaciilor de transcripie a unei singure catene. n acest caz structura primar,
reprezentat de compoziia i secvena nucleotidic constituie:
a) suportul copiei codificate de gene destinat traducerii n proteine;
b) obiectul unei serii de modificri importante i variate care determin
obinerea unor baze atipice (dihidro-uridina, pseudo-uracilul, etc.);
c) structura care individualizeaz situsuri specifice de legare a proteinelor;
d) structura care determin orientarea spaial a polimerului la nivel secundar
i teriar.

1. Structura secundar a ARN

Forele de stivuire i de mperechere a bazelor determin i n cazul ARN,


structuri sub form de elice. Acestea nu au perfeciunea dublului helix de referin
prezent n structura ADN, dar mpreun cu regiunile existente ntre ele se organizeaz
n structuri definite prin noiunea de motive.

1.1. Elicele ARN

Numai sub aciunea forelor de stivuire, scheletul monocatenei tinde s ia o


form de elice dreapt simpl i neregulat. Tendina de apropiere dintre dou purine
este mai puternic, astfel nct dac dou purine sunt separate de o pirimidin ele pot
determina ndeprtarea acesteia pentru a se stivui. Cu toate acestea, conformaia
dominant este cea de dubl elice care se poate obine din: i) dou catene de ARN de
tipul celor descrise mai sus; ii) dintr-o caten ADN i una ARN n cazul hibrizilor
tranzitorii care apar n celul n timpul transcripiei; iii) dou segmente de ARN
distante care prezint o complementaritate destul de important pentru a se mperechea.

106
Dac comparm aceast structur cu dublul helix ADN constatm urmtoarele:
a) catenele sau segmentele sunt de asemenea antiparale (antisens);
b) mperecherile standard (A-U i G-C) sunt mbogite n cazul ARN cu alte
mperecheri Watson-Crick (cuplul G-U) dar i de mperecheri ne-standard de tip A-I,
U-I i C-I foarte frecvente n cazul moleculelor ARNt. De reinut c afinitatea relativ
a perechilor G-C, A-U i G-U este 1 000, 100, 1(Figura 4.1).

Figura 4.1. Tipuri de legturi de hidrogen care sunt specifice structurii secundare a ARN (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

c) apar baze modificate derivate att de la bazele purinice ct i pirimidinice


(Figura 4. 2);
d) radicalii hidroxil din poziia 2 a ribozei se opun, prin interferen lor
puternic cu baza, rsucirii pentru a forma o conformaie B. nclinarea pe care acestea
o impun planului bazei (de aproximativ 200 fa de ax) are drept rezultat apariia unei
conformaii asemntoare cu conformaia A (numit adesea ARN 11 pentru a accentua
faptul c sunt necesare 11 pb/tur).
ntr-o molecul de ARN monocatenar, mperecherea bazelor se face pe
lungimi foarte variabile: de la una la mai multe sau la mai multe zeci de perechi de
baze. Diferitele elice, formate mpreun cu segmentele aleatoare ne-mperecheate care
le separ, desemneaz cteva structuri bine definite i reproductibile care reprezint
gradul secundar de organizare. Aceste motive pot fi reprezentate printr-un grafic
bidimensional.

107
1.2. Motivele elementare 2 - D

n figura 4.3 a este prezentat structura secundar a uneia dintre cele mai
cunoscute molecule de ARN. Sunt evideniate motivele identice care se regsesc n
structura tuturor moleculelor de ARN de transport. Se observ prezena unor
proeminene i pliuri care determin orientarea segmentelor. Structura reprezint o
alternan interesant de tije, la nivelul crora bazele se mperecheaz pe baz de
complementaritate, i bucle.
Buclele difer prin: i) poziia lor intern sau extern n organizarea general a
moleculei; ii) mrimea elementelor lor, tij i bucl; aceasta variaz de la mai multe
sute pentru cele mai mari la cteva uniti pentru buclele cu motive n agraf, mai puin
perfecte dect cele descrise n cazul ADN.
Aceste motive sub form de agraf sunt importante n structura i funcionarea
ARN. Buclele acestora sunt constituite din secvene particulare: i) secvene stabilizante
cum sunt UNCG care determin formarea unor bucle solitare; ii) secvene dotate cu
potenial de interaciune cu alte secvene, cum este cazul buclelor GNRA i a buclelor
de apte baze care sunt caracteristice ARNt.

2. Structura teriar a ARN

2.1. Interacii ntre structurile secundare

Diferite regiuni secundare, mai mult sau mai puin distanate n reprezentarea
plan, determin prin interacie apariia de replieri spaiale. Legturile implicate sunt
legturi de hidrogen:
a) formate ntre bazele din regiunile ne-mperecheate care determin perechi
Watson-Crick sau alte tipuri;
b) determinate prin participarea bazelor modificate (Figura 4.2);
c) foarte originale care implic grupri ale scheletului care formeaz asocieri
cu trei sau chiar patru parteneri. n aceste cazuri pot participa gruprile hidroxil din
poziia 2 a ribozei sau un atom de oxigen al gruprii fosfat.

2.2. Caracteristicile structurilor 3 - D

108
n urma interaciunilor descrise mai sus iau natere structurile 3-D. Un numr
restrns de asocieri simple, prezente n motivele arhitecturale 3-D, au fost deja
identificate iar altele sunt n curs.

109
Figura 4.2. Tipuri de baze modificate prezente n structura acizilor nucleici

110
Figura 4.3. Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de structur 2-D; b) Structura
teriar n form de L (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000).

Figura 4.4. Tipuri de structuri


secundare i teriare
caracteristice moleculelor de
ARN: a) structuri secundare; b)
structuri teriare i pseudo-
teriare (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)

111
Pn n prezent au fost caracterizate cteva motive arhitecturale:
a) dou elice care se altur sau se suprapun parial (mbuc) prin intermediul
fosei lor aplatizate;
b) o elice fixat ntr-o fos: i) un segment ne-mperecheat se fixeaz prin
mperecheri de tip Hoogsteen la nivelul fosei profunde i prin intermediul ribozei la
nivelul altui fragment: se formeaz astfel o tripl elice; ii) sau prin prinderea unei bucle
GNRA n fosa sa aplatizat;
c) asocieri ntre regiuni ne-mperecheate ale unei bucle cu un segment aleator
determinnd producerea unor pseudo-noduri (noduri false) (Figura 4.4).

2.3. Organizarea n domenii

Conformaia global a moleculelor de ARN mari prezint domenii


independente care determin apariia unei structuri specifice i compacte pentru unele
din aceste motive. Acestea sunt separate de fragmente flexibile. Cel mai bun exemplu,
n acest sens, l constituie structura secundar a ARNr 16 S, de 1542 nucleotide, de la
E. coli (Figura 4.5). Aceasta a fost obinut prin compararea secvenelor de la mai multe
tulpini i se consider a fi conservat evolutiv. n figura 4.5 sunt prezentate cele patru
domenii i localizarea principalelor subdomenii la nivelul subunitii ribozomale 30 S.
Fiecare domeniu este alctuit din structuri de tip tij bucl specifice.
Motive secundare i teriare, domenii..... Poate fi asemnat organizarea
structural a ARN cu a proteinelor?
Asemeni proteinelor, secvena nucleotidic a polimerului conine ntreaga
informaie a conformaiei sale. n acelai mod, achiziionarea structurii spaiale este o
tem nc actual de cercetare, care vede confruntndu-se dou concepii opuse: fie
motivele se formeaz secvenial i paralel cu biosinteza catenei fie, din contr,
molecula complet suport o pliere aleatoare provizorie la nivelul creia se realizeaz
ajustarea motivelor.
Indiferent de cronologie, important este c o molecul de ARN poate exista
sub diferite forme conformaionale reversibile, dependente de ioni magneziu sau de
liganzi de tipul polipeptidelor sau proteinelor.
n cazul ARN, cristalografia cu raze X este adesea un eec deoarece densitatea
lor de sarcin reprezint un impediment pentru determinrile cristalografice sau
determin rupturi. Utilizarea tehnicii RNM este limitat la moleculele de mrime mic.
Pentru moleculele ARN de mrime mare, metoda cea mai bun pentru identificarea

112
replierilor 2-D i 3-D, plecnd de la secvena primar, o constituie modelarea
molecular.
Mult timp, modelele de studiu ale conformaiei 3-D au fost constituite din
moleculele de ARN de transfer (ARNt). n prezent, ribozimele de tipul celei
descoperit la Tetrahymena reprezint un material de studiu foarte interesant.

Figura 4.5. Structura secundar a ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542 nucleotide bazat pe compararea
secvenelor de la diferite tulpini (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

3. Tipuri de ARN

Studiul aprofundat al structurii diferitelor molecule de ARN nu prezint interes


real dect n corelaie cu funciile acestora n mecanismul transcripiei sau n cadrul
biosintezei proteice. n aceste condiii ne vom limita numai la cteva aspecte ilustrative
privind structurile elementare descrise anterior.

113
3.1. ARN mesager

Reprezint copii ale genelor ADN. Aceste amprente n limbaj genetic ternar
(aminoacizii sunt codificai de triplete de baze numite codoni) conin secvena
proteinei care va trebui sintetizat, flancat de secvene adiionale necesare funcionrii
i reglrii mainriei de translaie. Conceptul de mesager a fost formulat pentru prima
dat de F. Jacob i J. Monod n 1961. Acetia au primit mpreun cu A. Lwoff premiul
Nobel pentru fiziologie i medicin n 1965.
La procariote informaia este adesea copiat de pe operonii bacterieni, ARNm
fiind o molecul policistronic (Figura 4.6a).
La eucariote ARNm este monocistronic i conine exoni i introni. Utilizarea
ARN mesager permite celulei s separe stocarea i utilizarea informaiei. n nucleul
eucariotelor, n urma procesului de transcripie, moleculele de ARN nuclear heterogen
(ARNnh) formeaz o colecie de transcripi pentru numeroase gene nucleare: i)
transcripi primari, mrimea lor este identic cu cea a genei; ii) molecule parial
maturate care sunt lipsite de un numr variabil de introni. Moleculele de ARNm
citoplasmatic sunt produsul unei astfel de colecii complexe de precursori care au
suferit un complex proces de maturare (Figura 4.6b). Precursorii ARNm de la eucariote
sunt procesai nainte de transportul ARNm n citoplasm unde urmeaz a fi tradus de
ctre ribozomi. Acest proces const n: i) adugarea structurii cap; ii) scindare i
poliadenilare n poziia 3; iii) nlturarea intronilor i sudarea exonilor (splicing).
n timp ce genele rmn izolate n nucleu, unde sunt pari integrante ale
moleculelor enorme de ADN, informaia acestora poate fi comunicat unei molecule de
ARN mobil, mult mai mic i capabil s treac n citoplasm. La acest nivel,
molecula servete drept model pentru a dirija incorporarea aminoacizilor ntr-o ordine
specific, codificat de secvena nucleotidelor n ADN i ARNm. De asemenea,
folosirea ARNm permite celulei s i amplifice puternic activitatea. O molecul de
ADN poate servi de model pentru producerea unui numr mare de molecule de ARN
care, toate vor reprezenta matrie pentru producerea unui numr i mai mare de catene
polipeptidice.
Durata de via a moleculelor de ARN mesager este scurt. Din acest punct de
vedere, ARNm este opusul ARNt a crui durat de via este mult mai mare. Aceeai
molecul de ARNt este folosit de mai multe ori pentru a asigura transportul
aminoacidului corespunztor la nivelul ribozomilor. La bacterii durata de via a unui

114
ARNm este de numai cteva minute. La eucariote aceste molecule sunt mai stabile
durata de via variind de la cteva minute la cteva zile.
ARNm se rennoiete foarte repede, aceste molecule fiind permanent produse
i degradate. Ele au, asemeni trandafirilor, viaa unui mesaj. Cu toate acestea, aceeai
molecul de ARNm poate fi citit de mai multe ori la nivelul ribozomilor.
Din punct de vedere cantitativ ARNm nu reprezint dect cteva procente din
totalul moleculelor de ARN din celul.
n timpul transcripiei unui fragment de ADN, n molecula de ARN
corespunztoare, se formeaz tranzitoriu hibrizi scuri ARN-ADN cu conformaie A, la
nivelul buclei unde catenele de ADN sunt local desfcute.

Figura 4.6. Sinteza


moleculelor de ARNm: a)
transcripia ARNm
policistronic la procariote; A,
B; C, D i E sunt genele
operonului triptofan (trp)
b) transcripia i maturarea
ARNm la eucariote (gena
globinei); ARN transcris de
la nivelul unei uniti
complexe (albastru) conine
exoni (c) i introni (d); poate
fi procesat pe mai multe ci
pentru a conduce la unul sau
la mai multe uniti ARNm
monocistronice funcionale;
liniile punctate marcheaz
nlturarea intronilor (dup
Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

Etapa de descifrare, pas cu pas, a mesajului purtat de ARNm de ctre ribozomi,


pentru traducerea acestuia n caten polipeptidic, este reglat de motive n form de
agraf (ac de pr) sau, n anumite cazuri, de pseudo-noduri teriare (Figura 4.4).
Informaia genetic copiat n structura ARNm, n urma procesului de transcripie, este
tradus n structura proteinelor prin intermediul codului genetic care realizeaz
115
traducerea mesajului dintr-un cod format din nlnuirea repetitiv i aleatoare a patru
nucleotide n altul, reprezentat de alternana a 20 de aminoacizi. Fiecare aminoacid este
codificat de una sau mai multe secvene de trei baze, numite codoni, din structura
ARNm. Codul genetic aste format din 64 de combinaii posibile (codoni) dintre care 61
specific amino acizi i trei (AAA, AAG i AGA) semnalizeaz ncheierea traducerii
(STOP). Codonul de iniiere, AUG codific formil-metionin la procariote i metionin
la eucariote. Codul genetic este degenerat deoarece majoritatea aminoacizilor sunt
codificai de mai muli codoni (Figura 4. 8). Codul genetic standard este comun pentru
procariote i eucariote. Mici diferene au fost evideniate n cazul codului genetic
utilizat de ctre mitocondrii.

3.2. ARN de transfer

Aceste molecule au rolul de a adapta fiecrui codon, prezent n structura


ARNm, aminoacidul corespunztor. Sunt molecule polinucleotidice mici de 75-90 de
resturi a cror funcionalitate se bazeaz pe existena a dou situsuri strict specifice: i)
captul 3 care asigur fixarea unuia din cei 20 de aminoacizi, ntr-o form activat; ii)
captul anticodon, structur complementar codonului care se potrivete foarte bine pe
structura ARNm prin mperechere complementar. O molecul de ARN de transfer,
ncrcat cu un aminoacid, poate fi reprezentat conform schemei elementare din
figura 4.7.
O molecul de ARNt are o serie de caracteristici datorate structurii sale
primare:
a) conine nucleotide atipice, neobinuite, prin natura bazelor pe care le conin.
Astfel, n structura ARNt gsim hipoxantina al crei nucleotid corespunztor este IMP
(Figura 4.9).
b) prezena timinei, o baz specific ADN i a altor baze metilate.
Deoarece aceste baze nu sunt incorporate n momentul sintezei ARN, ele sunt
obinute prin modificarea secundar a uneia dintre cele patru baze, A, U, C, G, ntlnite
n mod normal n structura primar a ARN. Astfel, IMP provine din deaminarea
adeninei din AMP i TMP provine prin metilarea UMP. Aceste modificri se numesc
post-transcripionale.

116
Figura 4.7. Schema
unei molecule de ARNt
ncrcat: a) schema
general a structurii
secundare a moleculei;
b) modul de formare a
legturii ntre ARNt i
aminoacil (dup
Biochemistry, Voe t&
Voet, 1995)

Figura 4.8. Codul genetic


standard. Codonul AUG care
codific pentru metionin este cel
mai comun codon start. Trei dintre
codoni AAA, AAG i AGA
funcioneaz drept codoni STOP.
Se poate observa degenerescena
codului genetic deoarece numai
metionina i triptofanul sunt
codificai de un singur codon,
restul aminoacizilor fiind
codificai de doi la ase codoni.

117
Prima molecul de ARNt, secvenializat n 1965, a fost cea pentru alanin de
la drojdii (ARNtAla, 76 nucleotide). De atunci alte mii de molecule de la peste 500 de
organisme sau din organite diferite au fost secvenializate. Compoziia lor se
caracterizeaz printr-o varietate i un procentaj mare de baze modificate (Figura 4.3).
Analiza tridimensional, prin difracie cu raze X, a ARNt pentru fenilalanin
cristalizat, nu a fost realizat dect 10 ani mai trziu. Din pcate, de atunci numai un
numr destul de mic de molecule ARNt au fost analizate prin aceast tehnic.
Rezultatele diferitelor metode de analiz sau a modelelor conformaionale sunt
uimitoare: n ciuda diferenelor existente ntre secvenele nucleotidice primare, din
punct de vedere al structurii secundare i teriare, moleculele de ARNt se prezint sub
forma aceluiai model structural.

3.2.1. Structura secundar sub form de frunz de trefl

Imaginea vine de la reprezentarea n plan a moleculei (Figura 4.7a): o tij cu trei


foi de trefl, a patra putnd fi adesea numai ntrezrit.
Structura n care reperm motivele descrise mai sus, se compune din patru
brae elicoidale pe care le difereniem prin funcia i caracteristicile lor structurale:
1) extremitatea 3 CCA (constituit din trei nucleotide CMP, CMP i AMP)
reprezint tija care constituie braul acceptor al aminoacidului. Acesta se leag covalent
la hidroxilul extremitii 3 hidroxil (Figura 4.7b);
2) braul purttor al anticodonului: este o structur sub form de agraf a crei
bucl format din apte nucleotide poart anticodonul. Numim anticodon grupul de trei
nucleotide care este situat la nivelul unei bucle a ARNt i are capacitatea de a se
mperechea prin legturi slabe cu codonul ntr-o manier antiparalel i
complementar. n cazul codonului i anticodonului este absolut necesar precizarea
sensului de scriere a secvenei. Astfel, anticodonul 3 UAC 5 corespunde codonului
5 CAU 3 (Figura 4.8)
3) braele D i TC i datoreaz denumirile i simbolurile faptului c buclele
lor conin baze modificate rare: pentru braul D este dehidrouridina iar pentru TC,
este prezent pseudouridina poziionat ntre timin i citozin i notat (Figura 4.7a).
Sistemul de numerotare de la 5 la 3 (de la stnga la dreapta) a fost utilizat
pentru prima dat n cazul structurii ARNt de 76 nucleotide i a fost adoptat prin
convenie pentru reprezentarea normal a unei molecule ARNt.
Diferene ntre structurile secundare ale diferitelor molecule pot s apar la
nivelul buclei braului D dar acestea nu depesc ns 4 baze. De asemenea, unele
118
molecule posed o bucl suplimentar, care reprezint regiunea cea mai variabil a
moleculelor de ARNt. n funcie de structura, la acest nivel distingem: i) moleculele de
ARNt de clas 1, cele mai bine reprezentate i care prezint un bra suplimentar scurt
de 3 la 5 nucleotide; ii) moleculele ARNt de clas 2 care posed un bra suplimentar
lung de 13 la 21 nucleotide dintre care 5 sunt complementare (Figura 4.10).
mperecherea secundar a bazelor determin formarea de elice constante. Dac
parcurgem structura din direcia 5 ctre 3 numrul de perechi de baze din care acestea
sunt formate este 7, 3 (sau 4), 5 i 5. mperecherile bazelor sunt de tip Watson-Crick
ct i de alte tipuri.
Compararea secvenelor moleculelor de ARNt evideniaz conservarea n
poziii invariabile a unor baze pirimidinice sau purinice.

3.2.2. Structura teriar n L a moleculelor ARNt

n figura 4.3b este prezentat structura teriar a unei molecule de ARNt.


Numrul mare de puni de hidrogen, care se formeaz ntre baze situate la distan,
realizeaz replierea moleculei i apariia unei conformaii cu dou regiuni elicoidale ale
cror axe sunt situate n planuri perpendiculare.
Una dintre aceste elice lungi se formeaz ntre braul D i anticodon iar
cealalt ntre braul acceptor i TC. Cu toate c molecula n aceast conformaie 3-D
este compactat, constatm c doi poli sunt particular accesibili: extremitatea 3 i
bucla anticodon.
n ciuda numrului mic de cristalizri reuite pentru moleculele de ARNt,
datele obinute sunt suficiente pentru a admite existena unei structuri identice sau
foarte apropiate pentru toate tipurile de ARNt.

3.3. ARN ribozomal

3.3.1. Ribozomi

Ribozomii reprezint sediul sintezei proteice i sunt agregate multi-moleculare


necovalente, mari i compacte de proteine i ARN. Ei sunt formai din dou subuniti
diferite, ca mrime i compoziie, care n cazul micorrii concentraiei de ioni de Mg2+
se separ reversibil. La baza nelegerii structurii i funciei ribozomilor stau studiile
biochimice realizate de Nomura ct i utilizarea tehnicilor imunologice i de
microscopie electronic.

119
Figura 4.9.
Recunoaterea codon
anticodon (dup
Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

Figura 4.10. Tipuri de molecule de ARNt


difereniate n funcie de mrimea braului
suplimentar: structurile 1, 2 i 3 aparin categoriei
clasei 1 n timp ce 4 aparine clasei 2. Sunt marcate
elementele de identitate majore n cele patru tipuri.
Fiecare baz din structura ARNt este reprezentat
de cercuri pline. Cercurile roii indic poziiile
identice pentru recunoaterea ARNt de ctre
aminoacil-ARNt sintetaz. Bazele din structura
anticodonului care reprezint elemente de
identificare sunt subliniate.(dup Biochemistry,
Voet&Voet, 1995)

120
Tratarea subunitilor cu ageni denaturani (fenol, uree, sulfat de amoniu)
disociaz legturile slabe i precipit proteinele determinnd separarea constituenilor
ARN, n trei specii diferite, i proteici, n mai multe zeci de proteine diferite.
Particulele ribozomale din citoplasma eucariotelor superioare sunt mai mari
dect cele prezente la procariote. Celula ai crei ribozomi au fost cel mai mult studiai
este E. coli. Compoziia i caracteristicile acestor ribozomi sunt date n figura 4.11.
Ribozomii 70S ai E. coli sunt formai din dou componente: o subunitate mare (50S) i
o subunitate mic (30S). S este prescurtarea pentru unitatea Svedberg care reprezint
msura vitezei de sedimentare prin ultracentrifugare. Coeficientul de sedimentare
depinde nu numai de masa dar i de rigiditatea particulei. Astfel, se explic de ce
asamblarea subunitilor 50S i 30S poate da particule caracterizate printr-o constant
de sedimentare de 70S. Fiecare dintre aceste subuniti sunt formate dintr-un amestec
de proteine, denumite proteine ribozomale i ARN ribozomal (ARNr).
Subunitatea 30S conine: i) o molecul ARNr 16S de 1 542 nucleotide; ii) 21
de proteine diferite, prezente ntr-un singur exemplar. Proteinele au fost denumite de la
S1, S2 la .......S21. n cazul proteinelor ribozomale S are semnificaia small i
desemneaz proteinele care intr n constituia subunitii mici. Ansamblul ARNr
mpreun cu proteinele ribozomale are o mas de aproximativ 900 kDa.
Subunitatea 50S conine: i) o molecul ARNr 5S de 120 nucleotide; ii) o
molecul ARNr 23S de 2 904 nucleotide; iii) 34 proteine ribozomale denumite L1, L2,
...L31. L este folosit pentru large i semnific prezena acestor proteine n constituia
subunitii mari. Treizeci dintre aceste proteine se gsesc ntr-un singur exemplar iar
una dintre proteine n patru exemplare. Ansamblul proteine-ARN al subunitii mari
are aproximativ 1,6 milioane daltoni.
n momentul asamblrii subunitii mici cu cea mare se formeaz ntre cele
dou o fos la nivelul creia va trece ARNm n timpul traducerii sale n proteine.
La eucariote ribozomii sunt mai mari, 80S, cele dup subuniti fiind de 40S i
respectiv 60S. Compoziia acestora este diferit n ceea ce privete tipurile de ARNr i
numrul proteinelor din care acetia sunt constituii. Subunitatea mic conine o
molecul de ARNr 18S i 33 de proteine ribozomale iar subunitatea mare trei molecule
ARNr (5S, 5,8S i 28S) i 45 proteine ribozomale.
Aceste diferene ale constituiei ribozomilor prezint un interes foarte mare
deoarece anumite antibiotice, care acioneaz la nivelul ribozomilor, pot s aib o
aciune specific asupra ribozomilor bacterieni fr a afecta ribozomii proprii
organismului gazd (Figura 4.13).

121
Figura 4.11. Principalele caracteristici ale ribozomilor de la procariote i eucariote (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)

Figura 4.12. Structura puromicinei analog cu tirozil ARNt

122
Alte antibiotice de tipul puromicinei intervin n procesul de sintez proteic
att la eucariote ct i la procariote determinnd terminarea prematur a sintezei
catenei proteice datorit analogiei structurale. Aceast molecul este asemntoare cu
extremitatea 3 a unui ARNt ncrcat (Figura 4.12) i poate ocupa situsul aminoacil de
pe structura ribozomului. Poziionarea sa permite transferul catenei n formare pe
puromicin prin formarea unei legturi covalente. Fixarea moleculei de antibiotic la
captul carboxi-terminal al polipeptidului stopeaz continuarea sintezei proteice.

3.3.2. Structura ARN ribozomal

Moleculele de ARNr sunt constitueni majori ai ribozomilor reprezentnd


aproximativ 65% din structura acestora.
Moleculele ARNr se caracterizeaz prin cteva aspecte structurale importante
care le difereniaz de celelalte tipuri de ARN. Acestea sunt molecule care sufer
metilare dup sinteza polinucleotidului la nivelul adeninei (N-dimetil adenin) sau prin
formarea de O-metilriboze. Metilarea hidroxilului din poziia 2 a ribozei protejeaz
polimerul de hidroliza ponilor fosfodiester i prelungete durata de via a acestuia.
A fost determinat structura primar a moleculelor de ARNt de diferite origini.
Analiza secvenelor i studiile realizate asupra structurilor secundare an relevat acelai
paradox ca i n cazul ARNt, i anume evidenierea unor structuri secundare tip care
sunt conservate remarcabil cu toate diferenele importante de secven constate.
Regiunile de secven conservate sunt ntotdeauna localizate la nivelul secvenelor ne-
mperecheate ale moleculei (Figura 4.14) .
Aceste molecule de ARN au conformaii globale teriare complexe care iau
natere prin stivuiri multiple (asemntoare celor din cazul ARNt) care compacteaz
molecula n diferite domenii identificabile. De exemplu, moleculele de ARNr 16S
cuprind patru domenii formate din motive secundare care posed regiuni mperechiate
scurte de mai puin de 10 nucleotide (Figura 4.14).

123
Figura 4.13 Diferite tipuri de antibiotice, majoritatea cu aciune selectiv asupra sintezei proteice la
nivelul ribozomilor celulelor procariote

124
3.3.3. Rolul moleculelor ARNr

Dei nu putem afirma cu precizie c se cunosc toate implicaiile funcionale i


structurale ale moleculelor de ARNr, se poate constata c acestea: i) au rol structural
intrnd n compoziia ribozomilor; ii) faciliteaz fixarea celorlalte specii de ARN
(ARNt i ARNm) la nivelul ribozomilor; iii) la procariote au rol de recunoatere, pe
structura ARNm, a situsului de iniiere a traducerii (AUG) prin hibridizarea unei
secvene situat la captul 3 al ARNr 16 S cu o secven scurt, numit Shine-
Dalgarno, aflat la cteva nucleotide n amonte de AUG; iv) la eucariote nu se
cunoate nc cu precizie dac una dintre moleculele de ARNr recunoate o secven
situat n apropierea AUG dar, se tie c este absolut necesar recunoaterea
extremitii 5cap a ARNm nainte de nceperea citirii informaiei acesteia.

3.4. ARN cu rol catalitic

Certitudinea c numai proteinele au activitate enzimatic a fost total infirmat.


Mult vreme identificarea enzimelor cu proteinele a condus la convingerea c, numai
proteinele, cu variatele lor structuri tridimensionale i grupri laterale, posed
flexibilitatea s creeze situsuri active care s catalizeze reaciile biochimice.
Caracterizarea sistemelor implicate n procesarea ARN a demonstrat c acest punct de
vedere era deosebit de simplist.
T. Cech, n 1981 a fcut o descoperire uimitoare studiind molecula ARNr 26S
de la protozoarul termofil Tetrahymena. Acest ARN este derivat dintr-un precursor
(ARN brut obinut n urma transcrierii) care sufer un proces de maturare (splicing)
prin nlturarea unui intron de 400 baze. Descoperirea important a constat n faptul c
reacia de maturare (nlturarea intronului) este catalizat de nsi molecula de ARN.
De altfel, intronul eliberat devine un catalizator activ n procesul de maturare a altor
molecule de ARN.
n 1983, a fost descoperit un al doilea exemplu de cataliz realizat de o
molecul de ARN. Sidney Altman i Norman Pace studiau n colaborare ribonucleaz
P, enzim implicat n maturarea unui precursor ARNt la bacterii. Aceast enzim are
o structur neobinuit fiind compus dintr-o protein i o molecul de ARN. De fapt,
cercetrile efectuate au demonstrat c activitatea enzimatic era datorat moleculei de
ARN, partea proteic avnd numai rol de structurare conformaional a ribonucleazei

125
P. Spre deosebire de exemplul studiat de Cech, ARN din ribonucleaza P aciona asupra
unei alte molecule substrat i nu asupra propriei structuri.
Numeroase tipuri de reacii catalitice sunt acum cunoscute ca fiind catalizate
de ARN. Au fost denumite ribozime acele molecule de ARN dotate cu capacitate
enzimatic despre care, pn la un anumit moment, se considera c este rezervat
numai proteinelor. Activiti catalitice ale ARN sunt direcionate ctre: i) substrate
separate; ii) propria molecul i sunt descrise ca auto-maturare sau auto-splicing, n
funcie de tipul de reacie.
Cteva din cele mai cunoscute exemple de activitate catalitic a ARN sunt:
a) Enzima ribonucleaza P, ribonucleoprotein care conine o singur molecul
de ARN legat la o protein. ARN posed capacitatea de a cataliza clivarea substratului
ARNt, n timp ce componenta proteic are un rol indirect, probabil n meninerea
structurii conformaionale a ARN catalitic.
b) Intronii din grupa I posed capacitatea de a-i realiza propria maturare din
pre-ARNm n care sunt coninui. Reacia poate fi realizat in vitro numai de ctre
ARN, dar in vivo ea este asistat de proteine. Aciunea intronilor din grupa I genereaz
molecule ARN care posed multe alte activiti catalitice corelate cu activitatea de
origine.
c) Anumii introni, att din grupul I ct i din II, conin faze de lectur care pot
fi traduse n proteine. Unii introni din grupa I codific pentru maturaze i pentru
endonucleaze.
d) Moleculele mici de ARN din clasa viroizilor i virusoizilor au capacitatea de
a realiza reacii de auto-clivare. Cu toate c aceste reacii sunt intramoleculare,
molecula poate fi mprit ntr-o parte enzimatic i o parte substrat ale cror
funcii sunt independente. S-a demonstrat c majoritatea viroizilor i virusoizilor care
sufer auto-clivare au, n principiu, o structur secundar sub form de cap de ciocan
n figura 4.15 este prezentat aceast structur obinut prin analize cu craze X. La
nivelul structurii secundarea a complexului ARN-ADN sunt reprezentate prin linii
punctate interaciile de tip Watson-Crick iar cele diferite prin linii continue.

126
Figura 4.14. Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a) la archeobacterii; b) eucariote,
drojdii; c) mitocondrie de mamifer (bovine). Se observ conservarea filogenetic a domeniilor
i subdomeniilor din structur (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)

Figura 4.15. Structura secundar cap de ciocan a unei ribozime (Lewin B., Genes VII,2000)

Reaciile de nlturarea a intronilor i sudare a exonilor (splicing) sunt


asistate de o serie de molecule de ARN mici snRNA - small nuclear RNA. n
procesul de splicing sunt implicate cinci molecule mici bogate n uracil (U1, U2, U4,
U5, i U6) cu dimensiuni cuprinse ntre 107 la 210 nucleotide. Asocierea secvenial a
acestora cu un numr de ase la zece proteine formeaz snRNP (small nuclear
ribonucleoprotein particles) care mpreun cu pre-ARNm constituie complexul
ribonucleoproteic numit spliceozom (Figura 4.16 i 4.17).

127
Figura 4.16. Asamblarea moleculelor de
ARN U pentru formarea spliceozomului
implicat n nlturarea intronilor i sudarea
exonilor din structura pre-ARNm (dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000)

Figura 4.17. Molecule ARNsn implicate n recunoaterea pre-ARNm i n realizarea procesului de


splicing (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

128
CAPITOLUL V

STRUCTURA MOLECULAR A

CROMOZOMILOR I GENELOR

Unul dintre criteriile care stau la baza clasificrii organismelor este absena sau
prezena nucleului individualizat. Celulele procariote lipsite de un veritabil nucleu,
includ eubacteriile i archeobacteriile. De cealalt parte se afl celulele eucariote care
posed o membran nuclear care separ cromozomii de restul celulei. Cromozomul
unic al celulelor procariote este format dintr-o molecul de ADN dublu catenar
circular care conine cteva milioane de perechi de baze (Tabel 5.1). n general,
genoamele eucariotelor au o mrime i o complexitate variabil i conin mai muli
cromozomi.
Att celulele procariote ct i cele eucariote posed mecanisme, pe de o parte
comune i pe de alt parte distincte, pentru reglarea expresiei genelor i a fluxului de
informaie de la ADN la proteine. Transcripia ADN realizat de ARN polimeraze
constituie prima etap, comun la toate organismele. La celulele procariote, ribozomii
se fixeaz pe molecula de ARNm, n curs de sintez, i realizeaz traducerea imediat a
informaiei n proteine, n citoplasm. Din contr, la eucariote membrana celular
separ locul n care se realizeaz transcripia de cel n care are loc traducerea.
Transcriptul primar, ARNm imatur, conine o succesiune de secvene netraduse,
numite introni, care vor fi eliminate prin procedeul de scindare a intronilor i sudare a
exonilor (splicing) n procesul de maturare a ARNm. n urma acestei etape,
localizat n nucleu, ARNm trece n citoplasm unde este tradus. Maturarea ARNm
prin splicing confer celulei eucariote posibilitatea diversificrii informaiei prin
combinarea alternativ a exonilor, o alt etap foarte important n dezvoltarea
organismelor.

1. Organizarea genomului la procariote

Bacteriile, organismele procariote cele mai simple ntlnite n toate mediile


naturale, prezint caracteristici comune. Adesea, un perete celular, format din

129
peptidoglicani, nconjoar membrana plasmatic i confer celulei form rigid. De
asemenea, este prezent o membran extern care posed un numr de flageli i pili
variabil (Figura 5.1). Bacteriile au un compartiment citoplasmatic unic care conine un
nucleoid format dintr-o molecul simpl circular de ADN, ARN i proteine. Pe lng
ADN prezent n nucleoid, citoplasma majoritii bacteriilor conine mici molecule
circulare de ADN, numite plasmide. Cel mai adesea acestea confer celulei rezisten
la antibiotice i la alte toxine. n condiii favorabile, bacteriile se multiplic rapid prin
diviziune. Capacitatea lor de adaptare la condiiile de mediu i de diviziune rapid fac
ca aceste celule s constituie suporturi excelente pentru numeroase analize biochimice
i de biologie molecular, in vitro.

Figura 5. 1. Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell, et al., Biology, 2002).

Dei cea mai mare parte a genoamelor procariote sunt mai mici de 5 Mpb
lungime, exist i cteva mai mari (Tabel 5.1). n prezentarea tradiional, genomul tipic
procariotelor conine o singur molecul circular de ADN, localizat la nivelul
nucleoidului.
Aceast abordare este adevrat pentru E. coli i pentru multe alte bacterii
foarte studiate dar, specificm c evoluia cunoaterii, n sfera genomului procariotelor,
pune n discuie anumite concepte dezvoltate n era pre-genomic a microbiologiei.
Aceste aspecte se refer att la structura fizic a genomului procariotelor ct i la
organizarea genetic.
130
1.1. Punctul de vedere tradiional asupra cromozomului

bacterian

Asemeni eucariotelor, genomul procariotelor trebuie s se ncadreze ntr-un


spaiu foarte restrns. Cromozomul circular de la E. coli are o circumferin de 1,6 mm
n timp ce dimensiunile celulei sunt de 1,0 x 2,0 m. Structurarea necesar este
realizat, ca i la eucariote, cu ajutorul proteinelor de legare la ADN (DNA binding
proteins) care compacteaz genomul ntr-o form organizat. Structura obinut nu
prezint similitudini substaniale cu cromozomul de la eucariote cu toate c din punct
de vedere didactic este folosit exprimarea de cromozom bacterian.
Majoritatea cunotinelor pe care le avem despre organizarea ADN n nucleoid
sunt rezultatul studiilor pe E. coli. Genomul circular al E. coli este suprarsucit.
Suprarsucirile apar cnd ture suplimentare sunt introduse sau ndeprtate din structura
dublei elice (suprarsucire pozitiv/negativ. Suprarsucirea este modalitatea ideal de
mpachetare a unei molecule ntr-un spaiu redus. Primele dovezi c suprarsucirile
sunt implicate n mpachetarea genomului circular de la E. coli au fost obinute n 1970
n urma examinrii unor nucleoizi izolai, fiind confirmate definitiv ca o trstur a
celulelor vii n 1981. Se consider c, la E. coli supra-rsucirile sunt generate i
controlate de dou enzime, ADN giraza i ADN topoizomeraza I.
Cea mai plauzibil explicaie privind compactarea nucleoidului este aceea c
ADN este ataat la proteine care restrng capacitatea de relaxare, astfel nct rotaia la
nivelul unui situs de scindare are ca rezultat pierderea unei suprarsuciri dintr-un mic
segment al moleculei. Modelul curent propune ataarea ADN de la E. coli pe structura
unei proteine miez de la care radiaz 40-50 bucle n interiorul celulei. Fiecare bucl
radiaz n interiorul celulei i conine aproximativ 100 kpb de ADN suprarsucit
(Figura 5.2). Componentele proteice ale nucleoidului includ ADN giraza i ADN
topoizomeraza I, cele dou enzime care sunt principale responsabile pentru meninerea
strii de suprarsucire, ca i un set de aproximativ patru proteine considerate a avea un
rol mai specific n mpachetarea ADN bacterian. Cea mai abundent protein este HU,
care este foarte diferit structural de histonele eucariote dar acioneaz similar,
formnd un tetramer n jurul cruia se nfoar aproximativ 60 pb. n celula de E. coli
sunt prezente aproximativ 60 000 copii ale HU care acoper aproximativ 1/50 din

131
molecula de ADN, dar nu se cunoate dac tetramerii sunt distribuii de-a lungul ADN
sau sunt poziionai numai n regiunea central a nucleoidului.

Tabel 5. 1. Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i celule


Nume comun Mrimea genomului Mrimea relativ a
(pb) genomului (E. Coli=1)
Virusuri
SV40 5,2 x 103 1,3 x 10-3
Bacteriofagul 4,8 x 104 1,2 x 10-2
Virus herpes bovin 1,4 x 105 3,5 x 10-2

Celule Procariote Bacterii


Mycoplasma capricolum 0,7 x 106 1,7 x 10-1
Staphylococcus aureus 2,9 x 106 7,2 x 10-1
Escherichia coli 4,6 x 106 1
Myxococcus xanthus 9,7 x 106 2,6
Bacillus megaterium 30 x 106 6,5

Celule Eucariote
Ciuperci
Saccharomyces cerevisiae Drojdii 1,5 x 107 3,7
Aspergillius niger Ciuperci 1,5 x 107 3,7
Plante
Arabidopsis thaliana 7,0 x 107 1,7 x 101
Zea mays Porumb 3,9 x 109 9,7 x 102
Alium cepa Ceap 1,8 x 1010 4,5 x 103
Animale
Drosophila melanogaster Musc 1,8 x 108 4,5 x 101
Mus musculus oarece 2,7 x 109 6,7 x 102
Bos taurus Taur 3,2 x 109 8,0 x 102
Homo sapiens Om 3,4 x 109 8,5 x 102

132
Figura 5.2. Model pentru structura nucleoidului de E. coli

1.2. Comentarii pe tema structurii nucleoidului

procariot

n ultimii 10 ani a devenit foarte clar c anatomia genomului procariot


dezvoltat pe baza studiilor pe E. coli este foarte simplist. Dei marea majoritate a
genoamelor bacteriene sau a cromozomilor de la archeobacterii sunt circulari, a fost
descoperit un numr mare de forme lineare. Prima a fost descris pentru Borrelia
burgdorferi, n 1989 de ctre Ferdows i Barbour, urmtorii ani fiind realizate
descoperiri similare pentru genul Streptomyces i alte bacterii.
Un alt aspect l reprezint prezena plasmidelor care reprezint mici molecule
de ADN, adesea dar nu ntotdeauna circulare, care coexist cu cromozomul principal n
celula bacterian. Anumite tipuri de plasmide sunt capabile de integrare n genomul
principal, n timp ce altele pot avea o existen independent. Plasmidele conin gene
care, de obicei, nu se gsesc pe cromozomul principal, dar care sunt, n multe cazuri,
neeseniale pentru bacterie, deoarece codific pentru fenotipuri cum sunt rezistena la
antibiotice fr de care bacteriile pot tri n condiii de mediu normale (Tabel 5. 2).
Multe plasmide sunt capabile de transfer de la o celul la alta, i aceleai plasmide sunt
adesea regsite n bacterii care aparin la diferite specii. Trsturile diferite ale
plasmidelor sugereaz c ele reprezint entiti independente care, n majoritatea
cazurilor, nu sunt incluse n definiia genomului bacterian.
Pentru o bacterie de tipul E. coli, care are un cromozom de 4,6 Mpb i care
poate conine variate combinaii de plasmide, nici una mai mare de cteva kilobaze,
toate dispensabile, putem defini cromozomul principal ca genom. n cazul altor
procariote lucrurile nu stau la fel de simplu. De exemplu, cromozomul linear al
Borrellia burgdoferi care are 910 kpb i conine 853 gene, este nsoit de cel puin 17
plasmide circulare i lineare care mpreun contribuie cu alte 533 kpb i cu cel puin
430 gene. Dei, majoritatea acestor gene sunt orfane (fr funcie identificat), au fost
identificate i structuri indispensabile cum sunt genele pentru proteinele membranare i
biosinteza purinelor. Se consider c mcar unele din cele 17 plasmide de la Borrelia
sunt componente eseniale ale genomului. Astfel, este admis posibilitatea ca anumite
procariote s posede genoame constituite din mai multe componente care includ un
numr separat de molecule ADN. Aceast situaie este mult mai apropiat de ceea care
133
exist la eucariote dect la procariotele tipice. De fapt, interpretarea informaiilor
privind genomul de la Borrelia este nc controversat, i complicat datorit existenei
unei bacterii nrudite, Treponema pallidum, al crei genom este format dintr-o singur
molecul de ADN de 1138 kpb care conine 1041 gene, este lipsit de orice omologie cu
genele prezente n plasmidele de la Borrelia.

Tabel 5.2. Trsturile ctorva plasmide tipice


Tip de Funciile genelor Exemple plasmide
plasmid
Rezisten Rezisten antibiotice Rbk la E. coli i alte bacterii
Fertilitate Conjugare i transfer ADN ntre F de la E. coli
bacterii
Uciga Sinteza de toxine care ucid alte Col de la E. coli; produce colicin
(killer) bacterii
Degradativ Enzime pentru metabolismul TOL pentru Pseudomonas putida;
moleculelor neobinuite metabolism toluen
Virulen Patogenitate Ti de la Agrobacterium tumefaciens;
capacitatea de a determina formarea galelor
la dicotiledonate

O alt complicaie privind structura fizic a genoamelor procariote este legat


de diferenele dintre sistemele de mpachetare pentru moleculele de ADN de la bacterii
i archeobacterii. Una dintre motivaiile pentru care archeobacteriile sunt privite ca un
grup distinct de organisme, diferite de bacterii, este faptul c acestea nu posed
proteine de compactare de tipul HU, dar posed proteine mult mai asemntoare cu
histonele. Cu toate c, informaiile despre nucleoidul de la archeobacterii sunt destul de
incomplete, se presupune c proteinele asemntoare histonelor au un rol important n
mpachetare.
Cunoatem deja c genomul bacterian are o structur genetic compact cu
foarte puin spaiu ntre gene. Aceast organizare este foarte bine demonstrat i tipic
la genomul de la E. coli. La acest organism ADN care nu codific pentru diferite gene
reprezint numai 11% din total i este distribuit pe toat lungimea sub forma unor
segmente mici. O serie de teorii susin c organizarea compact este benefic pentru
replicarea rapid a genomului cu toate c ipotezele nu pot fi susinute de dovezi
experimentale.

1.3. Operonii sunt caracteristici ale genoamelor

procariote

134
Cea de a doua caracteristic a genomului de la procariote, ilustrat la E. coli,
este prezena operonilor. Operonii reprezint un grup de gene localizate una lng
cealalt. Toate genele din structura unui operon sunt exprimate ca o singur unitate.
Acest tip de aranjament este comun genoamelor procariote i poate fi ilustrat la E. coli
cu operonul lactozei care a fost descoperit n 1961 de ctre Jacob i Monod. Acesta
conine trei gene implicate n transformarea dizaharidului lactoz n unitile sale
componente (glucoz i galactoz). Genele operonului lactoz sunt implicate n
utilizarea lactozei ca surs de energie de ctre E. coli. Deoarece, lactoza nu este o
component comun a mediul nconjurtor pentru E. coli, majoritatea timpului
operonul nu este exprimat i enzimele pentru utilizarea lactozei nu sunt sintetizate de
bacterie. Cnd lactoza devine disponibil se realizeaz activarea operonului i cele trei
gene sunt exprimate mpreun. Operonul lactoz reprezint un exemplu clasic de
reglare a expresiei genelor la bacterii (Figura 5.3 a).
La E. coli i la Bacillus subtilis exist aproximativ 600 operoni. n majoritatea
cazurilor, genele unui operon sunt corelate funcional i codific pentru un set de
proteine implicate ntr-o anumit cale metabolic, cum ar fi utilizarea unui glucid ca
surs de energie sau sinteza unui aminoacid (operon triptofan, Figura 5.3 b). La alte
bacterii sau archeobacterii exist posibilitatea ca operonii s conin gene implicate n
diferite ci metabolice. Este cazul unuia dintre operonii de la Aquiflex aeolicus care
conine ase gene linkate care codific pentru: i) dou proteine implicate n
recombinare; ii) o enzim folosit n sinteza proteic; iii) o protein necesar pentru
mobilitate; iv) o enzim utilizat n sinteza nucleotidic; v) o enzim pentru sinteza
lipidic (Figura 5.3c). n concluzie, teoria c expresia unui operon conduce la sinteza
coordonat a mai multor enzime necesare pentru o singur cale metabolic nu este
valabil pentru toate speciile.

135
Figura 5.3. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b) operonul triptofan de la E. coli;
c) operonul mixt de la Aquifex aeolicus

1.3.1. Coninutul minim de gene i identitatea genelor specifice

Cu toate c numrul de genoame procariote secvenializate integral crete


continuu, nu este nc posibil realizarea unui catalog complet cu coninutul genelor
fiecrei specii, din simplul motiv c funciile anumitor gene rmn necunoscute. De
exemplu, genomul de la E. coli conine 4 288 gene care codific pentru proteine dar
peste 1 500 din acestea sunt orfane. Chiar dac informaia este adesea incomplet, este
interesant s examinm rolul genelor ale cror funcii sunt cunoscute, i s apreciem
numrul diferit al genelor implicate n diferite activiti biochimice la o bacterie de
tipul E. coli (Tabel 5.3).
Cataloagele de gene sunt mult mai interesante cnd comparaiile se realizeaz
ntre diferite specii. De exemplu, la E. coli 243 de gene sunt implicate n metabolismul
energetic, la Haemophylus influenzae numai 112 i la Mycoplasma genitalium numai
31. Aceste comparaii pot duce la speculaii privind numrul minim de gene necesar
pentru supravieuirea unei celule. Majoritatea demersurilor realizate n acest sens au
demarat cu studiul celor mai mici genoame, cel al Mycoplasma genitalium i cel a
Mycoplasma pneumoniae, care conin numai 470 i respectiv 679 gene. Consideraii
teoretice au dus la sugestia c 256 gene reprezint minimul necesar, dar experimentele
de inducere de mutaii sugereaz c pentru Mycoplasma sunt necesare minim 300.
Studii similare interesante au fost realizate pentru genele specifice care determin
distincia dintre o specie i alta.

136
Tabel 5.3. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M. genitalium

Categorie Numr de gene


E. coli H. influentzae M. genitalium
Total gene pentru proteine 4 288 1 727 470
Biosintez aminoacizi 131 68 1
Biosintez cofactori 103 54 5
Biosintez nucleotide 58 53 19
Protein anvelop celular 237 84 17
Metabolism energetic 243 112 31
Metabolism intermediar 188 30 6
Metabolism lipidic 48 25 6
Replicare ADN, recombinare, reparare 115 87 32
Pliere proteine 9 6 7
Proteine reglatoare 178 64 7
Transcripie 55 27 12
Translaie 182 141 101
Preluarea de molecule din mediu 427 123 34

Din cele 470 gene ale genomului de la M. genitalium, 350 sunt prezente i la
bacterii mai ndeprtate evolutiv, cum este Bacillus subtilis. Aceasta sugereaz c
trsturile biochimice i structurale care disting Mycoplasma de Bacillus sunt
codificate n aproximativ cele 120 gene care sunt unice la fiecare tip. Din nefericire,
astfel de comparaii privind genele particulare nu dau rspunsuri cheie privind
caracteristicile care individualizeaz fiecare tip de microorganism.

2. Structura materialului genetic la eucariote

n ciuda diferenelor evidente de form i de funcie, diferitele tipuri celulare care


compun un organism multicelular, fie c este vorba de o ciuperc sau de un mamifer,
conin un lot complet de gene. Vzut din exterior o celul din constituia unui cartilaj
i un neuron nu se aseamn deloc. Cu toate acestea cele dou tipuri celulare conin
acelai complement de gene.

Informaia genetic, prezent ntr-o celul eucariot specializat, se poate


compara cu o carte care conine toate informaiile necesare construciei unei cldiri cu
utiliti multiple. n cursul realizrii construciei, sunt probabil necesare toate planurile
dar numai o mic parte a informaiei va trebui consultat n timpul activitii de
construcie a unui etaj sau a unei singure camere. Aceast abordare este adevrat i
pentru un ovul fecundat, care conine ansamblul instruciunilor genetice, i care este
fidel replicat i informaia distribuit tuturor celulelor organismului n dezvoltare. n
consecin, celulele poart mult mai mult informaie genetic dect pot utiliza
137
vreodat. Acestea posed mecanisme care le permit s exprime informaia genetic, n
mod selectiv, urmnd numai instruciunile care privesc numai o singur celul ntr-un
moment particular al existenei acesteia. n acest subcapitol, o s analizm modalitile
care le permit celulelor eucariote s structureze totalitatea materialului genetic pe care
l conin, n condiiile controlului coordonat al expresiei genelor menite s asigure
numai sinteza anumitor proteine. Mai nti vom descrie structura i proprietile
nucleului celulei eucariote, care conine majoritatea informaiei genetice i
mecanismele de reglare a acesteia.

2.1. Nucleul celulei eucariote

n ciuda importanei sale pentru stocarea i utilizarea informaiei genetice,


nucleul celulei eucariote posed o morfologie destul de comun (Figura 5.4). Coninutul
nuclear reprezint o mas vscoas amorf de materie nchis ntr-un nveli nuclear
complex. n nucleul unei celule tipice, n interfaz, se evideniaz: i) cromozomii,
prezeni sub forma unor fibre nucleoproteice foarte alungite, cromatina; ii) matricea
nuclear care este format dintr-o reea fibrilar care conine proteine; iii) unul sau mai
muli nucleoli, structuri amorfe, opace la microscopie electronic care sunt sediul
sintezei ARN ribozomal i al asamblrii ribozomilor; iv) nucleoplasma, substan
lichid care conine toate componentele i elementele nucleului eucariot. n figura 5.4
sunt ilustrate schematic diferitele elemente ale nucleului eucariot.

2.1.1. nveliul nuclear

n opoziie cu termenul de membran nuclear, nveliul nuclear desemneaz


structura complex care se afl la frontiera dintre nucleul i citoplasma unei celule
eucariote. ntr-o celul, separarea materialului genetic i a citoplasmei care l
nconjoar este poate caracteristica cea mai important care distinge eucariotele de
procariote. Apariia nveliului nuclear este cu siguran un punct de reper n evoluia
biologic. nveliul nuclear const n mai multe elemente distincte (Figura 5.4).
Continuitatea nveliului care delimiteaz nucleul este asigurat de dou membrane
concentrice separate de un spaiu intermembranar de 10 la 50 nm. Cele dou membrane
sunt fuzionate din loc n loc i formeaz pori circulari care sunt compui dintr-un
ansamblu complex de proteine. Densitatea porilor nucleari variaz de la aproximativ 2
la 4 pe m2 n nveliul nuclear al eritrocitelor de pasre, relativ inactiv din punct de

138
vedere metabolic, la mai mult de 60 m2 n cel al ovocitelor care se pregtesc s
rspund nevoilor viitoare ale dezvoltrii embrionare.
O celul de mamifere, de mrime medie, posed aproximativ 3 000 de pori
nucleari. Membrana extern este n general presrat cu ribozomi i adesea n
continuitate cu membrana reticulului endoplasmatic (Figura 5.4).
Suprafaa intern a nveliului nuclear este bordat de o plas fibrilar dens,
numit lamina nuclear. n anumite celule, cum este ovocitul de amfibian, aceast
lamin formeaz un strat destul de continuu, n timp ce n altele pare mult mai
fragmentat. Considerm c lamina nuclear reprezint un suport structural pentru
nveliul nuclear i servete la fixarea fibrelor de cromatin la periferia nucleului
(Figura 5.4).
Fibrilele laminei nucleare au un diametru de aproximativ 10 nm i sunt
compuse din polipeptide numite lamine, care aparin aceleiai superfamilii de
polipeptide care compun filamentele intermediare ale citoscheletului. Ca i pentru
componentele intermediare ale citoplasmei, integritatea laminei nucleare este
controlat de ctre procesul de fosforilare/defosforilare. Dezasamblarea laminei
nucleare, nainte de mitoz, este indus de ctre fosforilarea laminelor de ctre o kinaz
specific.

2.1.1.1. Structura i funcia complexului porilor nucleari

nveliul nuclear este o barier care separ dou din cele mai importante
compartimente ale celulei, nucleul i citoplasma, porii fiind pori n aceast barier.
Contrar membranei plasmatice, care mpiedic trecerea macromoleculelor ntre
citoplasm i spaiul extracelular, anvelopa nuclear este un centru activ pentru ARN i
proteinele care se deplaseaz n cele dou sensuri, ntre compartimentele pe care
aceasta le separ. Replicarea i transcripia materialului genetic, n nucleu, necesit
participarea unui mare numr de proteine care se sintetizeaz n citoplasm i sunt
transportate prin nveliul nuclear. Invers, moleculele de ARNm, ARNt i subunitile
ribozomilor care sunt fabricate n nucleu trebuie s fie transportate prin membrana
nuclear, n sens invers.
Anumite elemente, cum sunt moleculele ARNsn (ARN small nuclear), se
deplaseaz n cele dou direcii. Acestea sunt sintetizate n nucleu, se asambleaz n
particule ribonucleoproteice (RNP), n citoplasm, i sunt reimportate n nucleu unde
intervin n maturarea ARNm. Acest trafic intens se realizeaz prin porii nucleari.

139
innd seama c particule materiale, de talia subunitilor ribozomale, pot s treac
prin porii nucleari, putem presupune c acetia sunt canale deschise dar, de fapt, este
exact contrar. Porii nucleari conin un aparat complex, n form de co, numit
Complexul Porului Nuclear (CPN) care obtureaz porul ca un dop i care se reliefeaz
n afar n citoplasm i n nucleoplasm. Structura CPN este prezentat n modelul
schematic din figura 5.5 i n micrografiile electronice din figura 5.6 .
CPN este un enorm complex molecular cu simetrie octogonal care se
estimeaz c are n structur 100 la 200 polipeptide. Masa CPN este cam de 30 ori mai
mare dect masa unui ribozom. Structura molecular a complexului CPN a fost
determinat de-a lungul timpului graie tehnicilor de microscopie electronic i de
analiz de imagini din ce n ce mai performante. Dac sunt injectate soluii, ale
moleculelor cu mas molecular mic, n citoplasma unei celule acestea pot penetra
rapid n porii nucleari prin simpl difuzie. Experimentul sugereaz c aceste substane
sunt capabile s treac printre fantele existente ntre razele coului.

Figura 5.4. Nucleul


celular i caracteristicile
sale (dup Campbell, et
al., Biology, 2002).

140
Figura 5.5. Complexul porului
nuclear, model schematic
(dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

Figura 5.6. Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin microscopie electronic: a) faa
citoplasmatic a complexului porului nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a anvelopei
nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub form de
co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup ndeprtarea membranei nucleare prin
tratament blnd cu detergent. Reeaua laminar, care se insereaz n inelul nuclear al NPC,
este expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Capacitatea moleculelor mai mari (proteine i nucleoproteine) de a trece din


citoplasm n nucleu depinde de sediul lor obinuit de rezidena, n nucleu sau n afara
acestuia. De exemplu, dac o protein citoplasmatic, cum este albumina seric bovin,
este marcat radioactiv i injectat n citoplasm, ea are tendina de a rmne acolo.
Din contr, dac injectarea este realizat cu o protein cu localizare nuclear,
nucleoplasmina, proteina marcat va fi regsit imediat n nucleu.
n 1982, Robert Laskey i colaboratorii si de la Medical Research Council,
Anglia, au descoperit c nucleoplasmina, una dintre cele mai abundente proteine
141
nucleare din ovocitele de amfibieni, conine o secven de aminoacizi n apropierea
extremitii C terminale care funcioneaz ca un Semnal de Localizare Nuclear (SLN),
care i permite s treac prin porii nucleari i s intre n nucleu. De atunci au fost
identificate o serie de alte SLN, cea mai mare parte a acestora fiind constituite din
scurte secvene de aminoacizi cu sarcin pozitiv. n principiu, orientarea (adresarea)
proteinelor ctre nucleu este asemntoare cu transportul altor proteine care sunt
distribuite n anumite organite, de tipul mitocondriei sau peroxizomilor. n toate
cazurile, proteinele posed o etichet specific care este recunoscut de ctre un
receptor particular de la suprafaa organitului int.
Importul proteinelor n nucleu trece prin mai multe etape: i) proteina care
trebuie importat se cupleaz cu un receptor pentru SLN care pare a fi localizat la
suprafaa filamentelor deprtate de inelul extern al porului ctre citoplasm (Figura 5.
7); ii) interacia ntre proteina nuclear i receptorul pentru SLN permite acostarea
proteinei pe faa citoplasmatic a complexului porului nuclear prin formarea unui
complex de transport; iii) deplasarea complexului de transport prin por necesit energie
eliberat din hidroliza ATP. Aceasta implic o modificare a conformaiei
transportorului, structur mare n form de dop (inel intern) situat n centrul
complexului porului nuclear (Figura 5.5). Modificarea de conformaie deschide un canal
n centrul transportorului i permite moleculelor situate n proximitatea acestuia s
ptrund n nucleoplasm. Dup acelai principiu, substanele care trec din nucleu n
citoplasm declaneaz, probabil, deschiderea transportorului n sens invers.
n figura 5.7 este prezentat un model schematic de import nuclear al unei
proteine (cargo) dup cuplarea acesteia cu semnalul de localizare nuclear (SLN). n
citoplasm, importinele i interacioneaz cooperativ cu proteina cargo care
urmeaz a fi transportat, prin legarea importinei la SLN. Subunitatea importinei ,
din complexul cargo trimeric rezultat, interacioneaz cu componentele CPN,
translocnd complexul n nucleoplasm prin mecanisme destul de puin cunoscute.
Aceast translocare necesit hidroliza ATP. n nucleoplasm, Ran-GTP interacioneaz
cu importina , determinnd disocierea complexului cargo i elibernd proteina
transportat n nucleoplasm. Pentru a susine un alt ciclu de import, importina
monomer i complexul importin -Ran-GTP sunt transportate napoi n citoplasm.
Proteina de activare RanGAP (Ran GTP activating protein), din citoplasm, stimuleaz
transformarea Ran-GTP la Ran-GDP avnd drept rezultat o transformare
conformaional la nivelul Ran care determin disocierea de importina . Importina
liber interacioneaz apoi cu importina i se formeaz un nou complex cargo
142
purttor al unui semnal bazic SLN, care iniiaz un alt ciclu de import nuclear. Se
presupune c Ran-GDP este i el translocat prin porii nucleari din citoplasm n
nucleoplasm, unde factorul nucleotidic de schimb, Ran (RCC1), determin eliberarea
GDP i relegarea GTP.
Un por nuclear individual este capabil s importe proteine i s exporte ARN i
ribonucleoproteine. Acest transport bidirecional poate fi vizualizat prin microscopie
electronic. De asemenea, tendina de acumulare n unul dintre cele dou
compartimente celulare a unor proteine purttoare de semnale de localizare n
citoplasm sau n nucleu poate fi vizualizat prin microscopie de fluorescen (Figura
5.8) sau confocal.

Figura 5.7. Mecanismul propus pentru transportul, din citoplasm n nucleu, a proteinelor
cargocare conin un semnal de localizare nuclear (SLN) (dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000).

143
Figura 5.8. Semnalul de Localizare Nuclear (SLN) al antigenului T (SV40) poate direciona o protein
citoplas-matic n nucleu: a)
Piruvat kinaza normal, localizat
n citoplasm, vizualizat prin
imunofluorescen dup tratarea
celulelor n cultur cu un anticorp
specific; b) piruvat kinaza himer,
care conine un semnal SNL al
SV40 la captul su N-terminal,
este direcionat ctre nucleu.
Proteina himer a fost exprimat
n urma transfeciei unei gene
modificate produs prin fuziunea
unui fragment al unei gene virale
care codific NLS al SV40 cu
gena piruvat kinazei (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000).

2.1.2. Nucleul este un organit organizat

Specialitii n biologie celular se bazeaz mult pe studiile biochimice pentru a


nelege activitile nucleului. Cu toate c acestea furnizeaz un numr mare de
informaii, distrug toate structurile moleculare organizate care pot exista n nucleu i
dau impresia c acesta nu este dect un sac de elemente repartizate la ntmplare. n
acelai timp, o serie de studii de microscopie ne fac s realizm c nucleul este n
realitate un compartiment foarte organizat. De exemplu, fibrele de cromatin, care
compun un cromozom interfazic, nu sunt dispersate n tot nucleul, cum am putea crede,
ele sunt concentrate ntr-un domeniu specific care nu se suprapune deloc cu domeniile
altor cromozomi.
Interaciunile ntre extremitile cromozomilor i anvelopa nuclear reprezint
un alt mod de organizare a cromozomilor n nucleu. Aceast asociere este evident mai
ales n meioz, cnd cromozomii pot s se ndeprteze de anvelopa nuclear i s
formeze un buchet.
De mai bine de treizeci de ani se tie c ARN ribozomal este sintetizat n
nucleol, dar se considera c celelalte molecule de ARN, i mai ales ARNm se asamblau
n tot nucleul. Cercetrile ultimilor zece ani au demonstrat clar c moleculele de
ARNm sunt sintetizate ntr-un numr limitat de situsuri discrete situate n ntregul
nucleu. Dac sunt identificate cu ajutorul unor sonde marcate fluorescent, situsurile de
sintez i de maturare a moleculelor de pre-ARNm apar sub forma unor pete
strlucitoare n nucleoplasma nemarcat (Figura 5.9 b,c). Fiecare din cele 20 la 50 de
144
pete observate ntr-un anumit nucleu reprezint situsul sintezei mai multor molecule de
ARNm diferite. Diferitele elemente ale nucleului sunt organizate n acest compartiment
printr-o reea interactiv complex de filamente care compun matricea nuclear.

2.1.3. Matricea nuclear

Cnd nucleele izolate sunt tratate cu detergeni anionici i o concentraie


crescut de sruri (NaCl 2M), pentru a extrage lipidele i aproape toate proteinele
histonice i nehistonice ale cromatinei, ADN apare ca un halou care nconjoar un
centru nuclear rezidual (Figura 5.10a). Dac fibrele de ADN sunt apoi digerate cu
nucleaz, rmne o structur care pstreaz forma nucleului de origine, dar ea este
compus din fibrile proteice subiri care se ncrucieaz pe suprafaa spaiului nuclear

(Figura 5.10b). Aceast reea fibrilar insolubil este matricea nuclear.


Figura 5.9. Localizarea situsurilor de sintez i de maturare a pre-ARN cu sonde fluorescente: a) vizualizarea
procesului de transcripie prin colorare cu DAPI pentru evidenierea genei i cu anticorpi fa de
heterogen nuclear ribonucleo proteine, marcai cu fluorescein; b) evidenierea procesului de
poliadenilare prin colorare cu poli-dT marcat cu rodamin i cu DAPI pentru evidenierea ADN;
c) evidenierea splicingului prin utilizarea de anticorpi monoclonali, fa de proteina de splicing
SC-35, marcai cu fluorescein (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Matricea nuclear nu este numai un schelet care menine forma nucleului sau
un eafodaj pe care se organizeaz buclele de cromatin; ea servete i de fixare pentru
mecanismele care intervin n diferite activiti ale nucleului, cum sunt transcripia,
maturarea ARN i replicarea. De exemplu, dac celulele sunt incubate n prezen de
precursori radioactivi ai ARN sau ADN n timpul unei scurte perioade, gsim c
aproape toi acizii nucleici sintetizai sunt asociai fibrilelor matricei nucleare.

145
Figura 5.10. Matricea nuclear: a) micrografie electronic a unui nucleu izolat n prezen de detergeni i
sruri 2M; b) micrografie electronic a unei regiuni de fibroblast de oarece n urma
tratamentului cu detergent i nlturare a cromatinei i ADN

Proba cea mai clar privind importana matricei nucleare a fost furnizat de o
serie de cercetri efectuate n laboratorul lui Jeanne Lawrence de la Universitatea din
Massachusetts. Utiliznd hibridizarea fluorescent, in situ, pentru a identifica
localizarea secvenelor specifice de ADN sau ARN. Lawrence i colaboratorii si au
constatat c moleculele de ARN transcrise, pornind de la o anumit gen, apar ca o
tren ntr-o serie limitat de nuclee. Trena fluorescent apare datorit prezenei mai
multor sute de molecule de pre-ARNm transcrise pornind de la o singur gen (Figura
5.9a). Concentrarea transcripilor ntr-un loc limitat ne sugereaz c acetia nu sunt
liberi s difuzeze plecnd de la ADN de pe care au fost transcrii. Se pare c acetia
sunt meninui locului de unele dintre elementele nucleului pe toat perioada maturrii
lor.
Dac nucleele sunt tratate cu detergeni i cu sruri concentrate, practic toate
moleculele de pre-ARNm care au fost transcrise rmn asociate matricei nucleare
reziduale. De fapt, urmele de ARNm fluorescente care au fost observate nainte de
extracia dintr-un anumit nucleu i pstreaz exact poziia i dup extracie, deoarece
moleculele de ARNm nou formate sunt asociate elementelor matricei celulare. De
asemenea, orientarea trenelor sugereaz c moleculele de ARN prsesc locurile de
sintez pentru a se localiza n situsuri mai apropiate de periferia nucleului. n cursul
deplasrii moleculelor de ARNm fa de gena de la care sunt sintetizate, intronii sunt
eliminai din structura transcripilor prin mecanismul de splicing. Orientarea trenei,
dinspre interiorul nucleului ctre periferia sa, este compatibil cu un model n care
matria nuclear ghideaz moleculele de ARN, n curs de maturare, de la locul n care
sunt transcrise ctre porii nucleari pentru a iei din nucleu.

146
2.2. Cromozomii

Cromozomii se individualizeaz structural la nceputul mitozei i par s


dispar din nou la sfritul acesteia. Acetia sunt constituii dintr-un complex de ADN
i proteine numit cromatin. Cromatina exist n diverse stri n diferite faze ale
ciclului celular. Cromozomii sunt mult mai scuri dect lungimea moleculelor de ADN
pe care le conin. n medie, un cromozom uman conine o molecul de ADN de
aproximativ 5 cm. Compactarea acestui material genetic, n structura cromozomului,
presupune existena unui sistem organizat de mpachetare care s permit totui
funcionarea genomului i exprimarea genelor. Observate la microscopul electronic,
cea mai mare parte a organitelor intracelulare prezint o structur care ne ofer
informaii interesante despre funcia lor. Totui, micrografiile electronice ale
preparatelor fine ale nucleului ofer destul de puine informaii privind natura
cromozomilor n interfaz. n aceast etap, cromozomii sunt mult mai puin vizibili
deoarece cromatina se afl ntr-o stare mai relaxat (Figura 5.11a).

2.2.1. Structura cromozomului mitotic

Dispersarea cromatinei n celulele n interfaz face mult mai uoar replicarea


i transcripia ADN. Din contr, cromatina celulelor mitotice este sub forma cea mai
condensat, care uureaz livrarea unui pachet intact de ADN fiecrei celule fiice.
Cromozomii mitotici sunt foarte utili, att pentru biologi ct i pentru medici, deoarece
ei conin un lot complet de material genetic celular i pot fi pui n eviden prin tehnici
simple (Figura 5.11b). Cnd un cromozom se condenseaz n timpul profazei mitotice, el
adopt o form distinct i constant determinat, n principal, de lungimea moleculei
de ADN i de poziia centromerului. Se pot evidenia cromozomii mitotici ai unei
celule n diviziune prin tehnica descris n figura 5. 12a. n aceast tehnic, celulele
sunt sparte dup oprirea diviziunii celulare n mitoz n urma folosirii colchicinei.
Cromozomii mitotici sunt fixai la suprafaa unei lame unde ocup o suprafa foarte
mic i colorai cu diferite tipuri de reactivi (Tabel 5. 3). De exemplu, tehnica n care se
realizeaz o proteoliz limitat i colorarea cu reactiv Giemsa poart numele de

147
bandare G. Prin aceasta se evideniaz prin benzi nchise la culoare regiunile bogate
n AT i prin benzi pale cele bogate n GC.

Figura 5.11. Comparaie ntre starea cromatinei n interfaz i a cromatinei compactate n mitoz: a)
micrografie electronic prezentnd starea dispersat a cromatinei n interfaz; b)
micrografie electronic a unui cromozom mitotic (dup Molecular Cell Biology Lodish
H., et. al., 2000)

Dup fotografiere cromozomii individuali sunt decupai i aranjai n perechi.


Se realizeaz un cariotip n care cromozomii omologi sunt dispui n ordinea
descresctoare a mrimii aa cum se prezint n figura 5.12b. Celulele somatice de la
om conin 46 cromozomi care pot fi grupai n 22 de perechi omologe i cromozomii
sexuali care sunt XX la femei i XY la brbai. Studiul cariotipului este o tehnic de
baz pentru citogeneticieni. Cu colorantul Giemsa se obin ntre 400 i 800 benzi
pentru un set haploid de cromozomi. Preparatele de cromozomi mitotici sunt curent
realizate pornind de la culturi de celule sanguine pentru a identifica indivizii purttori
de anomalii cromozomale. Exist posibilitatea determinrii cromozomilor
suplimentari, absena lor sau o serie de alte modificri vizibile la microscopul optic.
O alt modalitate de prelucrare o reprezint colorarea cu quinacrin (bandarea
Q) care evideniaz striuri transversale. Deoarece distribuia benzilor Q este
caracteristic, fiecrui cromozom de la fiecare specie, tehnica permite identificarea
rapid a cromozomilor i realizarea unor comparaii ntre specii. De asemenea, se pot
detecta anomalii minime din structura cromozomului prin identificarea modificrilor
148
care apar n repartiia benzilor. Benzile Q strlucitoare conin, de obicei, secvene de
ADN bogate n A-T i un numr redus de gene care codific pentru proteine.
Braul scurt al cromozomului este desemnat cu litera p (petit), iar braul lung
cu litera q (urmtoarea liter din alfabet). n tehnicile de bandare, fiecare bra al
cromozomului este mprit n dou sau mai multe regiuni prin benzi mari. Regiunile
sunt numerotate cu 1, 2, 3 pornind de la centromeri ctre capete. Fiecare regiune este
divizat n benzi i subdiviziuni ale benzilor. De exemplu, Xp21.2 se refer la
segmentul cromozomial localizat pe braul scurt al cromozomului X, n regiunea 2,
banda 1 i sub-banda 2.
O alt tehnic, mult mai recent, dar care a intrat n setul analizelor de
de rutin pentru stabilirea cariotipului, este hibridizarea fluorescent, in situ - FISH
(Fluorescence In Situ Hybridization). Metoda prezint o limitare tehnic pentru
stabilirea cariotipului deoarece nu poate fi aplicat dect celulelor n diviziune sau
celor la care diviziunea este indus, in vitro. Aceast problem poate fi depit dac
se folosesc sonde ADN care recunosc secvene specifice de pe cromozomi. Astfel de
sonde, marcate fluorescent, sunt folosite pentru tratarea nucleelor interfazici. Sondele
se leag la secvenele complementare de pe cromozomi i marcheaz specific
cromozomii care pot fi vizualizai prin microscopie de fluorescen. Astfel, FISH
poate fi folosit pentru identificarea cromozomilor din nucleii n interfaz. Aplicaiile
nu se limiteaz numai la acest aspect. Prin folosirea unor sonde specifice, pentru
regiuni bine definite de pe cromozom, FISH se folosete pentru identificarea
microdeleiilor fine i translocrilor complexe care nu pot fi detectate prin tehnici
clasice. De asemenea, FISH reprezint o metod de cartare a genelor, de interes clinic,
nou izolate. O variant extins a tehnicii FISH, numit Chromosome Painting,
permite identificarea tuturor cromozomilor unei celule prin folosirea unor seturi de
sonde marcate fluorescent care recunosc secvene particulare de-a lungul
cromozomilor. Numrul cromozomilor care pot fi detectai simultan poate fi limitat
numai de disponibilitatea coloranilor fluoresceni care pot fi excitai la diferite
lungimi de und. De exemplu, tehnica nu poate fi folosit pentru vizualizarea
simultan a tuturor celor 46 de cromozomi de la om. Aceast limit a fost depit
prin introducerea cariotipului spectral care presupune folosirea unor combinaii de
cinci fluorocromi i semnale adecvate controlate de computer. n acest fel este posibil
vizualizarea fluorescent a tuturor cromozomilor (Figura 5.13 b).

Tabel 5.4. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor


Tehnic Procedeu Tipul benzilor
Bandarea G Proteoliz limitat, colorare Giemsa Benzi ntunecate bogate n AT;
149
Benzi pale bogate n GC
Bandarea R Denaturare prin cldur, colorare Benzi ntunecate bogate n GC
Giemsa Benzi pale bogate n AT
Bandare Q Colorare cu quinacrin Benzi ntunecate bogate n AT
Benzi pale bogate n GC
Bandare C Denaturare cu hidroxid de bariu, Evidenierea de benzi ntunecate de
colorare Giemsa heterocromatin

2.2.1.1. Centromeri

Se poate remarca c toi cromozomii reprezentai n figurile 5.11 la


5.13 posed o regiune unde suprafaa lor exterioar este net rscroit. Aceast
scobitur care este vizibil foarte bine n figura 5.11b reprezint centromerul
cromozomului. Poziia centromerului este variabil, mprind cromozomul
(cromatida) n dou regiuni inegale. n general, centromerii conin heterocromatin
constitutiv. Centromerii cromozomilor umani conin secvene lungi de aproximativ
170 nucleotide (ADN satelit ) dispuse n tandem i repetate de la 2 000 la 30 000 ori
pentru fiecare centromer. ADN centromeric fixeaz proteine specifice, printre care i
cele care servesc drept situs de fixare a microtubulilor n procesul de separare a
cromozomilor n timpul diviziunii mitotice. Centromerii mpart fiecare cromatid n
dou cromatide inegale numite brae.

150
Figura 5.12. Cariotipul cromozomilor mitotici de la om: a) tehnic folosit pentru obinerea de preparate
de cromozomi mitotici din leucocitele sngelui periferic; b) dup obinerea unei fotografii a
cromozomilor eliberai din nucleu, acetia sunt aranjai perechi i dup mrime.

.
Figura 5. 13. Hibridizarea fluorescent n situ (FISH) i aplicaiile ei: a) utilizarea de sonde fluorescente
pentru marcarea regiunii centromerice a cromozomului 16; b) exemplu de cariotip spectral;
c) evidenierea prezenei telomerilor la cromozomi de oarece (adaptat dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)

151
2.2.1.2. Telomerii

Cele dou extremiti ale moleculei de ADN, de la nivelul fiecrui cromozom,


posed segmente particulare de secvene repetitive numite telomeri, care formeaz un
coif la fiecare capt. La om telomerii posed motivul repetitiv TTAGGG/AATCCC
care se repet de o mie de ori i permite replicarea normal a capetelor cromozomilor
(Figura 5.14).
Contrar celor mai multe tipuri de secvene repetitive, care variaz mult ntre
specii, chiar dac ele sunt nrudite i apropiate evolutiv, n cazul telomerilor de la om i
de la marea majoritatea a vertebratele studiate pn n prezent, gsim aceeai secven
telomeric. La alte organisme, cum sunt protozoarele i drojdiile, telomerii au secvene
diferite. Totui, asemeni situaiei de la vertebrate, una dintre catene este ntotdeauna
bogat n resturi de guanozin iar complementara sa n resturi de citozin. Catena
bogat n G este orientat n sensul 5-3 ctre extremitatea cromozomului i depete
cu 12 la 15 nucleotide extremitatea catenei bogat n C. Datorit existenei acestui
dezechilibru catena bogat n G formeaz o coad scurt, monocatenar, la cele dou
extremiti ale cromozomului. Aceast dispoziie persist de la o generaie celular la
alta datorit unei enzime speciale, telomeraza, care poate aduga noi uniti repetitive
la extremitatea 3 a catenei bogate n G (Figura 5.14b).
Telomeraza, ale crei proprieti au fost bine studiate de ctre Elisabeth
Blackburn i colegii si de la Universitatea din California, San Francisco, este o
transcriptaz invers care asambleaz fragmente de ADN folosind o caten ARN
matri. Este o enzim foarte neobinuit deoarece fragmentul de ARN care servete
drept model (matri) face parte din structur.
Telomerii au roluri importante: i) sunt necesari replicrii complete a
cromozomului; ii) protejeaz cromozomii de nucleaze i de alte influene
destabilizatoare; iii) mpiedic fuziunea dintre extremitile cromozomilor n procesele
de recombinare; iv) faciliteaz interaciile dintre extremitile cromozomilor i
anvelopa nuclear n anumite tipuri celulare. De asemenea, telomerii i activitatea
telomerazei par s fie unii dintre principalii actori implicai n procesul de mbtrnire.
Celulele normale, n cultur, nu sunt capabile s se divid dect de un numr limitat de
ori nainte de a da semne de mbtrnire i de a muri n final. Dintre ipotezele
propuse pentru a explica aceast observaie este i scurtarea progresiv a telomerilor.

152
Figura 5.14. Completarea capetelor ADN de ctre telomeraz: a) procesul de replicare i evidenierea
formrii capetelor incomplete ale cromozomilor pentru catena ntrziat; b) mecanismul de
aciune al telomerazei cu evidenierea motivelor repetitive de la capetele cromozomilor

Telomerii se scurteaz deoarece cea mai mare parte a celulelor umane par s
fie lipsite de telomeraze. Contrar celulelor normale, celulele canceroase nu nceteaz s
creasc n cultur i devin nemuritoare. Unul dintre factorii care ar putea contribui la
imortalizarea celulelor maligne este reactivarea telomerazei, care conserv lungimea
telomerilor de-a lungul generaiilor. De fapt, cercetrile realizate n acest sens au
demonstrat clar c celulele canceroase posed o activitate telomerazic care nu poate fi
evideniat n celulele normale. Aceast descoperire a declanat stimularea cercetrilor
privind inhibitorii specifici ai acestei enzime n sperana c acetia vor avea efect
benefic n tratamentul anumitor tipuri de cancer.

2.2.2. Tipuri neobinuite de cromozomi

Cariogramele de la anumite organisme evideniaz existena unor trsturi


neobinuite care nu sunt ntlnite la om. Acestea includ minicromozomii i cromozomii B.
Minicromozomii sunt structuri relativ mici n lungime dar bogate n gene. De
exemplu, genomul de la pui conine 39 cromozomi: i) 6 macrocromozomi care conin
66% din cantitatea de ADN i numai 25% dintre gene; ii) 33 minicromozomi care
153
conin 33% ADN i restul de 75% gene. Densitatea genic pe minicromozomi este de
ase ori mai mare dect pe macrocromozomi.
Cromozomii B sunt cromozomi adiionali existeni la unii indivizi din
populaii, dar nu la toi. Acetia sunt structuri comune la plante dar exist i la fungi,
insecte i animale. Cromozomii B par s fie versiuni fragmentare ale cromozomilor
normali care sunt rezultatul unor evenimente neobinuite aprute n timpul diviziunii
nucleare. Unii dintre acetia conin gene, care adesea codific pentru ARNr, dar nu se
cunoate starea de activare a acestora. Prezena cromozomilor B poate afecta fenotipul
organismului, mai ales la plante, unde sunt asociai cu viabilitatea redus. O serie de
studii au evideniat pierderea gradual a cromozomilor B n descenden datorit
anormalitilor evideniate n modul de motenire.

2.3. mpachetarea genom ului eucariot

Dup cum am evideniat mai sus, o celul uman normal conine aproximativ
6 miliarde de perechi de baze repartizate ntre 46 de cromozomi (cantitatea prezent n
numrul diploid de cromozomi ne-replicai). Fiecare cromozom conine o singur
molecul continu de ADN. Cu ct cromozomul este mai mare cu att este mai lung
molecula de ADN pe care o conine. Deoarece fiecare pereche de baze ocup
aproximativ 0,34 nm, 6 miliarde de perechi de baze corespund unei molecule lungi de
2 metri. De asemenea, n celul, ADN este hidratat cu cantiti importante de ap
(aproximativ 6 molecule de ap pentru fiecare pereche de baze), care i acestea duc la
creterea volumului. Problema cheie a fost identificarea modalitilor prin care este
posibil localizarea a 2m de ADN hidratat ntr-un nucleu al crui diametru nu
depete 10 m, asigurnd n acelai timp, accesul proteinelor i enzimelor implicate
n procesele de reglare. O alt problem, la fel de important, se refer la modul n care
molecula de ADN, dintr-un cromozom, este organizat pentru a nu se nnoda cu
moleculele altor cromozomi. Rspunsurile la toate aceste probleme l gsim n modul
remarcabil de mpachetare al moleculei de ADN. Se cunoate de mult timp c fibrele
care formeaz cromatina, i intr n structura cromozomilor, sunt formate din ADN n
asociere cu proteine. Proteinele din structura cromatinei sunt mprite n dou grupe
principale: histonele i proteinele cromozomiale nehistonice. Histonele reprezint o
colecie de mici proteine bazice bine definite, n timp ce proteinele nehistonice sunt
compuse dintr-un numr mare de proteine diferite cu rol structural, enzimatic i
reglator. Cromatina mai conine i un procentaj sczut de ARN compus, n principal,

154
din catene de ARNhn in diferite stadii de maturare i din ARNsn care intervine n
procesul de splicing al ARNm.
n celulele eucariote, unitatea de baz a organizrii cromatinei este
nucleozomul. Acesta reprezint o entitate n care 146 pb sunt rsucite n dou ture de
super-elice stng n jurul unui octamer de histone care conine cte dou exemplare
din moleculele H2A, H2B, H3 i H4. Nucleozomii sunt organizai n filamente de 10
nm n diametru prin interaciuni cu histona H1, care se leg la ADN care intr i iese
din nucleozom. Un al treilea nivel de organizare este obinut prin rsucirea unui
filament de 10 nm ntr-o elice care conine 6 nucleotide pe tur, cu formarea unui
solenoid cu un diametru de 30 nm. Structuri mai complexe ale cromatinei sunt realizate
prin condensarea filamentelor de 30 nm, dar detaliile privind aceste structuri sunt mai
puin cunoscute (Figura 5.15).
Microscopia electronic a furnizat dovezi decisive privind organizarea
cromatinei n regiuni, bucle i domenii distincte de 30 la 300 kpb, fixate fiecare pe o
matrice bogat n proteine. Fiecare bucl pare s aib doar o singur origine de
replicare i s se comporte ca o unitate de replicare. Buclele, sunt uniti de supra-
rsucire independente, structura topologic a fiecreia fiind independent de starea
celorlalte. Se pare c acest lucru este posibil datorit fixrii extremitilor buclelor n
matrice. Cu toate c fiecare bucl conine mai multe uniti de transcripie, activitatea
ntregii regiuni poate fi coordonat pentru a fi reprimat sau potenial activat (Figura
5.15).

2.3.1. Nucleozomii: primul nivel de organizare al cromozomului

mpachetarea precis a ADN de la eucariote depinde de histone, grup


remarcabil de proteine bazice care se mparte n cinci subgrupe, n principal n funcie
de coninutul lor n lizin i arginin care reprezint aproximativ din totalul
aminoacizilor (Tabel 5.5). La pH fiziologic, aceste proteine sunt ncrcate pozitiv i
posed o structur teriar cu un grad mare de elice alfa. Aminoacizii bazici din
structur sufer modificri post-traducionale (acetilare, metilare, fosforilare)
reversibile enzimatic. Studiile comparative de secven i de structur tridimensional
au condus la divizarea familiei histonelor n dou grupuri: H2A, H2B, H3 i H4 pe de o
parte i H1 pe de alt parte. Aceast eterogenitate este subliniat i de poziia lor n
nucleozom.
De fapt, histonele H4 i H3, i ntr-un grad mai mic H2A i H2B, sunt proteine
foarte conservate evolutiv. Exemplul cel mai frapant este al histonei H4 de la bovine i

155
de la mazre, care au acelai numr de aminoacizi (102) i ale cror secvene primare
nu difer dect prin doi aminoacizi: o lizin n locul unei arginine i o leucin n locul
unei valine. Aceste diferene minore sunt prezente n condiiile n care divergena
dintre animal i plant s-a produs acum un miliard de ani. Structura histonei H1 este
mult mai variabil de la o specie la alta. Aceast conservare extrem sugereaz c toi
aminoacizii au un rol bine definit n funcionarea proteinei.
Structura teriar a histonelor din primul grup demonstreaz existena a dou
domenii: un domeniu central globular, hidrofob i un domeniu N-terminal, hidrofil,
ncrcat pozitiv i flexibil. Histona H1, mai lung, posed un al treilea domeniu la
nivelul captului C-terminal, hidrofil i flexibil.
La nceputul anilor 1970, s-a putut observa c n urma tratamentului
cromatinei, cu nucleaze nespecifice, cea mai mare parte a ADN era transformat n
fragmente de aproximativ 200 perechi de baze sau n multipli ai acestora.
Din contr, acelai tratament aplicat moleculelor de ADN nud determin
obinerea unei populaii de fragmente de mrimi aleatoare. Aceast descoperire i-a
fcut pe cercettori s considere c fragmentele uniforme de ADN cromozomial erau
protejate de atac enzimatic probabil prin asocierea lor periodic cu o protein.

Tabel 5.5: Caracteristicile histonelor din timus de vac


Histone Nr. aminoacizi Masa % Arg % Lys PUE*
kDa (10-6 ani)
H1 215 23,0 1 29 8
H2A 129 14,0 9 11 60
H2B 125 13,8 6 16 60
H3 135 15,3 13 10 330
H4 102 11,3 14 11 600
* PUE = Perioad unitar de evoluie: durat de timp necesar pentru o schimbare cu 1%
a secvenei de aminoacizi a unei proteine dup separarea a dou specii

n 1974, Roger Kornberg, de la Universitatea Harvard, a propus un nou tip de


structur secundar pentru cromatin bazndu-se pe rezultatele digestiei cu nucleaze
asupra cromatinei din diferite surse. Astzi, se cunoate c nucleozomii conin o
particul care constituie nucleul nucleozomului, compus din 146 perechi de baze de
ADN suprarsucit, care face aproape dou spire n jurul unui miez proteic central care
conine 8 molecule din patru histone: H2A, H2B, H3 i H4 (Figura 5. 16d).

156
Figura 5.15. Schema general a organizrii cromatinei cu evidenierea principalelor nivele cunoscute
de organizare (Campbell, et al., Biology 2002).

157
Particulele de nucleozomi sunt unite unele de altele printr-un segment de ADN
de legtur, de lungime variabil, dar care are n general 60 de perechi de baze. ADN
din structura unui nucleozom i din braul de legtur reprezint aproximativ 200 de
perechi de baze, ceea ce corespunde valorii fragmentelor gsite n cursul primelor
experiene cu nucleaze (Figura 5.16a i b). Nucleele nucleozomilor, care au un diametru
de aproximativ 10 nm, i ADN de legtur, cu un diametru de 2 nm, apar pe
micrografiile electronice asemeni unui irag de mtnii (Figurile 5.16 i 5.17c). Pentru
fiecare nucleozom, o molecul de histon H1 este poziionat n exteriorul nucleului
fiind asociat la cele dou extremiti ale ADN care intr i ies de pe suprafaa
complexului proteic. (Figura 5.16d). Dac se realizeaz eliminarea selectiv a
moleculelor de histone H1, printr-un tratament al fibrelor cu soluii saline de
concentraie sczut, cromatina capt un aspect mult mai dezorganizat.
In general, resturile de aminoacizi bazici ale histonelor nucleului sunt grupate
la extremitile moleculei, restul structurii pstrnd un caracter relativ hidrofob.
Aceast separare convine perfect organizrii nucleozomului. Regiunile nencrcate i
hidrofobe ale histonelor ocup centrul particulei i favorizeaz agregarea ntr-un nucleu
strns. Poriunile polare, bazice, ale moleculelor din nucleu formeaz cozi flexibile
orientate ctre exteriorul particulei, unde resturile ncrcate pozitiv pot stabili interacii
ionice cu gruprile fosfat negative din structura scheletului ADN. Cu toate c,
molecula de ADN este strns asociat nucleului format din histone prin suprafaa
intern a fibrei elicoidale, suprafaa sa extern rmne expus i poate interaciona cu
moleculele de reglare.
Studii de cristalografie cu raze X au demonstrat c resturile ncrcate pozitiv
sunt reunite sub form de perechi la suprafaa octamerului histonic. Situsurile pereche
formeaz un fel de spiral pe drumul pe care se presupune c l urmeaz elicea ADN
care nconjoar nucleul nucleozomului. Acestea servesc drept puncte de fixare
pentru cele dou catene ale helixului. Deoarece toate moleculele ADN, indiferent de
origine i secvena nucleotidic, posed un schelet riboz-fosfat identic cu cel cu care
interacioneaz histonele, nu trebuie s ne surprind extrema conservare a moleculelor
aminoacizilor din structura histonelor.
Dac pentru spiralizarea a 200 de perechi de baze de ADN sunt necesare
aproximativ nou molecule de histone, o celul uman care conine 6 miliarde de
perechi de baze de ADN, poate conine aproximativ 300 milioane de histone necesare
mpachetrii primare a materialului genetic. Astfel se explic, necesitatea unui numr
mare de exemplare de gene care codific pentru histone n celulele care se divid rapid.

158
Figura 5.16: Structura i dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea nucleozomilor n gradient de
sucroz duce la obinerea unei serii de picuri care corespund formelor monomere,
dimere, trimere, etc., ale nucleozomilor; b) ADN extras din fraciile individuale este
supus electroforezei mpreun cu un martor ADN digerat cu nucleaze; c) micrografie
electronic a cromatinei eliberat dintr-un nucleu al unei celule de Drosophila. Se
observ c fibrele de cromatin sunt formate din nucleozomi conectai ntre ei prin
segmente scurte de ADN; d) schem care demonstreaz structura unei particule
nucleozomale cu o molecul de histon H1 asociat; e) electroforez n SDS a unui
amestec de histone H3 i H4 din timus de viel. Se observ toate benzile corespunztoare
componentelor tetramerului (H3)2(H4)2 (Lewin B., Genes VII,2000).

159
Interacia dintre histone i ADN este, n principal, de natur structural i
relativ independent de secvena nucleotidic. In vitro, un fragment de ADN care n
mod normal nu este asociat cu histone, cum este cazul bacteriofagilor sau a
polinucleotidelor bicatenare sintetice, formeaz subuniti nucleozomale dac este
incubat cu histone purificate care provin de la plante i animale. Experienele de acest
tip ilustreaz clar capacitatea de autoasamblare a nucleozomilor.
Chiar dac asamblarea histonelor cu ADN nu depinde de secven, aceasta nu
semnific neaprat c pentru o anumit gen, nucleele nucleozomilor sunt localizate la
situsuri aleatoare. De fapt, s-a demonstrat c anumite pri ale genelor manifest
interaciuni constante cu regiunile vecine. Exemplul prezentat n micrografia
electronic din figura 5.17 demonstreaz c pe cromozomul virusului SV40 particulele
nucleozomale sunt distribuite periodic, cu excepia unei regiuni care este lipsit de
asocierea cu histonele.
Absena particulelor nucleozomale, la nivelul acestui fragment, care conine i
originea de replicare a cromozomului viral, presupune legarea n acel loc, a unei
proteine nehistonice situs-specific care poate influena poziionarea particulelor
nucleozomale.
Poziionarea nucleozomilor poate fi influenat i de capacitatea ADN de a se
rsuci n jurul nucleului histonelor. Astfel, segmentele de ADN bogate n A-T sunt mai
flexibile i se curbeaz mult mai uor dect regiunile bogate n G-C. n consecin,
nucleozomii au tendina s se formeze n regiunile n care raportul A-T i G-C este
optim deoarece este diminuat energia necesar pentru rsucirea ADN n jurul
octamerilor de histone. S-a constatat c regiunile bogate n A-T se gsesc preferenial
n locurile unde fosa mic a dublei elice este orientat ctre nucleul histonic, n timp ce
regiunile bogate n G-C se gsesc, cu predilecie, n zonele n care fosa mic este
orientat ctre exterior. De fapt, poziionarea nucleozomilor poate fi foarte important
pentru exprimarea genelor.

Figura 5.17. Structura genomului SV40. Se


evideniaz regiunea lipsit de nucleozomi n
partea superioar a figurii

160
O alt problem este modul n care un nucleu cu un diametru de 10 m poate
conine o cantitate de ADN a crei lungime este de 200 000 de ori mai mare dect
aceast valoare. Formarea nucleozomilor reprezint prima etap important a
procesului de condensare. Dac ntinderea ar fi complet, cele 200 perechi de baze ale
unui nucleozom individual de 10 nm diametru ar ocupa aproximativ de 70 nm, pentru o
valoare a planului nucleotidelor de 0,34 nm. n consecin, raportul c de condensare a
ADN, din structura nucleozomilor este de aproximativ 7:1.

2.3.2. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei.

Deci, cel mai redus nivel de organizare al cromatinei este rsucirea moleculei
de ADN n jurul inimii nucleozomului i are un de diametru 10 nm. Totui, cromatina
nu se gsete n celul sub aceast form relativ rsucit de irag de mtnii.
Micrografiile electronice ale seciunilor de nucleu relev un umr de pete minuscule cu
un diametru de aproximativ 30 nm care reprezint seciuni transversale la nivelul
fibrelor de cromatin. Dac se separ cromatina din nucleu, n prezena ionilor
divaleni, se observ prezena unor filamente de aceeai grosime (Figura 5.18).
Structura acestui filament de 30 nm rmne nc un subiect discutabil. n
figura 5.18 este prezentat modelul solenoid de suprarsucire a filamentului subire al
nucleozomilor (10 nm) pentru a forma un filament de ordin superior, mai gros. Se
presupune c, fibrele condensate se formeaz prin mpachetarea nucleozomilor ntr-o
structur spiralat (aranjament solenoid) care conine ase nucleozomi pentru fiecare
tur de rsucire. Acest nivel suplimentar de organizare al cromatinei crete de ase ori
raportul de condensare. Filamentul de 30 nm este conservat prin interaciunea ntre
moleculele de histon H1 ale nucleozomilor vecini (Figura 5.18 b).
Dac sunt extrase selectiv moleculele H1, filamentele groase de cromatin se
deruleaz i se transform n mrgele (mtnii) mai subiri i mai nguste.
Readugarea histonei H1 restabilete structura de ordin superior. Studii recente de
microscopie electronic sugereaz c fibrele de 30 nm sunt mai puin uniforme dect
modelul solenoid imaginat. Cromatina condensat poate fi de fapt foarte dinamic fiind
format din structuri parial depliate care se pot replia rapid n structuri solenoide
ocazionale.
Cromatina din regiunile cromozomiale care nu sunt transcrise frecvent este
predominant n forma condensat de 30 nm, n timp ce regiunile transcrise activ se
consider c adopt forma relaxat de irag de mtnii (Figura 5.18 a)

161
Urmtoarea etap de condensare a ADN n nucleu l reprezint organizarea
filamentelor de 30 nm ntr-o serie de bucle mari suprarsucite. Se estimeaz c fiecare
bucl conine ntre 10 i 150 kilobaze ADN. Se pare c acestea sunt fixate la baza cu
proteine specifice printre care i o topoizomeraz de tip II care intervine pentru a
controla gradul de spiralizare al ADN la nivelul buclei. Topoizomeraza elibereaz
moleculele de ADN dac o bucl se ncurc. Buclele de ADN ar putea mpri genomul
n domenii, fiecare coninnd un lot mic de gene care sunt exprimate printr-un
mecanism comun de reglare. Normal, buclele de cromatin sunt etalate la interiorul
nucleului i nu sunt vizibile, dar prezena lor poate fi evideniat n anumite
circumstane. De exemplu, dac tratm cromozomii mitotici izolai cu reactivi care
extrag histonele, putem observa c ADN eliberat de histone se pliaz sub form de
bucle plecnd de la eafodaj proteic, format din proteine nehistonice (Figura 5.15).
Micrografia electronic din figura 5.19c evideniaz buclele lungi de ADN
ancorate la un schelet cromozomial compus din proteine nehistonice obinut prin
ndeprtarea histonelor din structura cromozomilor din celule HeLa, n metafaz. Acest
eafodaj flexibil are forma cromozomului metafazic i persist chiar i atunci cnd
ADN este digerat cu nucleaze (Figura 5.19c).
Acelai tip de bucle se pot evidenia n cromozomii politeni interfazici din
celulele insectelor i n cromozomii meiotici n perie (lamp-brush) din ovocitele de
amfibieni (Figura 5.19a), ceea ce demonstreaz c acestea nu sunt proprii cromozomilor
mitotici.
O serie de experimente de hibridizare in situ, realizate pe celule umane n
interfaz, utiliznd diferite sonde fluorescente, au dus la imaginarea modelului
prezentat n figura 5.19b. Astfel, s-a evideniat c o serie de sonde (A la H) care
recunoteau secvene situate la milioane de perechi de baze distan, n structura ADN
linear, erau poziionate foarte aproape unele de altele n structura cromozomului
interfazic. Se consider c apropierea dintre aceste situsuri, numite i regiuni asociate
scheletului (denumite SARs de la scaffold-associated regions sau MARs de la
matrix-attachment regions) este posibil datorit asocierii lor la scheletul
cromozomului. n general, regiunile asociate scheletului se gsesc ntre unitile de
transcripie. Deci, genele sunt localizate prioritar la nivelul buclelor de cromatin ale
cror baze sunt ataate scheletului cromozomului.

162
Figura 5.18. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat de 30 nm: a) micrografia
i modul de organizare a nucleozomilor din structur; b) micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i
modelul de mpachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

Figura 5.19. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) micrografie electronic prezentnd
domenii de cromatin, n bucle la cromozomii n perie izolai dintr-un ovocit de amfibian; b) model de
structurare a buclelor fibrelor de cromatin de 30 nm imaginat n urma experienelor de hibridare in situ
cu sonde (A la H) situate la distane variabile pe ADN liniar; c) micrografie electronic a unui cromozom
metafazic din celule HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergeni.
163
Cromozomul mitotic reprezint etap ultim de condensarea a cromatinei
(Figura 5.11 i 5.17). De obicei, un m de cromozom mitotic conine un cm de ADN.
Aceast condensare, realizat ca urmare a unui proces nc puin cunoscut, este nsoit
de fosforilarea practic a tuturor moleculelor de histone H1 la nivelul celor cinci resturi
de serin din molecul.
O imagine general a diferitelor niveluri de organizare ale cromatinei de la
filamentele nucleozomale pn la cromozomii mitotici este prezentat n figura 5.17.

2.4. Heterocromatina i eucroma tina

Dup terminarea mitozei, cea mai mare parte a cromatinei care compune
cromozomii mitotici foarte condensai se disperseaz i revine la starea sa interfazic
difuz. Totui, n cea mai mare parte a celulelor, aproximativ 10% din materialul
cromozomial i pstreaz forma condensat compact pe tot parcursul interfazei,
cromatina condensat putnd fi evideniat la periferia nucleului. Termenul de
heterocromatin desemneaz cromatina care rmne condensat n timpul interfazei
pentru a o distinge de eucromatina care desemneaz starea dispersat. Dac celulele
sunt puse n prezena unui precursor ARN radiomarcat, la nivelul uridinei (uridin 3H),
i apoi fixate, secionate i observate dup autoradiografie, se constat c regiunile de
heterocromatin rmn nemarcate deoarece acestea sunt puin transcrise sau chiar
netranscrise. Cercetrile din ultimii ani demonstreaz clar posibilitatea trecerii
reversibile dintr-o form n alta, aceast clasificare fiind mai degrab didactic.
Numeroase gene de la eucariotele multicelulare nu sunt exprimate dect n
anumite momente ale dezvoltrii i/sau n anumite esuturi. Deci, celulele trebuie s
posede modaliti eficace pentru a reprima expresia tuturor genelor care nu sunt
caracteristice unui anumit tip de celul ntr-o anumit etap a dezvoltrii sale. Represia
unor blocuri mari de gene, prin limitarea disponibilitii factoriilor de transcripie, este
un mecanism destul de puin probabil pentru o astfel de reglare. Ideea este susinut de
faptul c unele gene, care nu sunt exprimate n mod normal ntr-o celul, pot fi
transcrise dac sunt introduse prin transfecie n aceasta. De exemplu, genele globinei,
induse prin transfecie n fibroblaste, sunt exprimate de o mie de ori mai puternic dect
genele rezidente ale globinei. Aceast diferen persist n cursul diviziunilor succesive
dac genele transfectate sunt integrate la nivelul unor situsuri cromozomiale. De fapt,
posibilitatea ca genele transfectate s aib o activitate mai mare dect genele endogene
este un efect destul de obinuit dar nu universal. Este general admis c aceast represie

164
este rezultatul sechestrrii genelor silenioase n complexe de cromatin superior
structurate care le fac inaccesibile mainriei de transcripie.
n absena informaiei privind organizarea acestei structuri a cromatinei, este
imposibil de descris starea de tranziie care separ cromatinele reprimate i exprimate.
O indicaie este furnizat de corelaia care exist ntre momentul n care gena este
replicat i cel n care ea poate fi transcris. Genele de meninere, exprimate n
permanen n toate celulele (exemplu: dihidrofolat-reductaz, actin citoplasmatic,
glucozo-6-fosfat dehidrogenaza) sunt replicate n prima jumtate a fazei S. n acelai
context, genele neexprimate tind s fie replicate mai trziu. De asemenea, replicarea
genelor este precoce n esuturile n care ele sunt exprimate i trzie n esuturile n care
acestea sunt silenioase". DE exemplu, la mamifere cromozomul X inactiv este
replicat dup cromozomul X activ. Aceste corelaii sugereaz c replicarea precoce
creeaz o stare mai accesibil mainriei de transcripie crescnd eficiena fixrii
factorilor de transcripie.

2.4.1. Heterocromatina

Heterocromatina poate fi divizat n dou categorii: constitutiv i facultativ,


n funcie de permanena strii condensate. Heterocromatina constitutiv rmne
condensat tot timpul i reprezint regiunile din structura ADN care rmn silenioase
permanent. n celulele de mamifere, cea mai mare parte a heterocromatinei constitutive
se gsete n apropierea centromerului tuturor cromozomilor i n alte cteva regiuni
particulare, cum este braul distal al cromozomului Y la masculi. La multe plante,
extremitile cromozomului (telomerii) sunt i ele formate din heterocromatin
constitutiv. n principal, ADN din structura heterocromatinei constitutive este format
din secvene nalt repetitive i se presupune c este lipsit de gene care codific pentru
proteine. Se consider c, heterocromatina conine elemente a cror influen se face
simit la o anumit distan i poate afecta starea fiziologic a genelor nvecinate.
Astfel, dac unele gene active, care i-au schimbat poziia ca urmare a unei transpoziii
sau a unei translocri, se afl poziionate n apropierea heterocromatinei, ele prezint
tendina de a deveni inactive. Acest fenomen poart numele de efect de poziionare.
Contrar formei constitutive, heterocromatina facultativ este inactivat specific
n cursul anumitor stadii de via ale organismului. Un exemplu tipic de
heterocromatin facultativ este furnizat de inactivarea unui cromozom X n celulele
femele de la mamifere. Celulele masculine au un mic cromozom Y i un cromozom X
mult mai mare. Cromozomii X i Y au puine gene n comun astfel nct brbaii nu

165
posed dect un exemplar al genelor situate pe cromozomii sexuali. Dei, celulele de la
femele conin doi cromozomi X, unul singur este funcional n procesul de transcripie.
Cellalt cromozom rmne condensat sub forma unei mase de heterocromatin (Figura
5.20b) numit corpuscul Barr, dup numele cercettorului care l-a descoperit n anul
1949. Se consider c, producerea corpusculului Barr este un mecanism normal, graie
cruia celulele femele i mascule dispun de acelai numr de cromozomi X activi i
sintetizeaz cantiti echivalente de produi codificai de genele situate pe cromozomul
X.

Figura 5. 20. Evidenierea heterocromatinei: a) micrografie electronic a unei celule stem


din mduva spinrii. Regiunile nchise de la periferia nucleului i din afara
nucleolului reprezint heterocromatin; b) prezena cromozomului X
inactivat sub forma corpusculului Barr ntr-o celul de femeie.

2.4.1.1. Inactivarea cromozomului X

n 1961, Mary Lyon emite ipoteza c un cromozom X devine heterocromatic


n toate celulele femelelor de mamifere ntr-un stadiu precoce al dezvoltrii
embrionare. Acest mecanism a fost numit inactivarea cromozomului X i s-a
demonstrat ulterior c se produce n embrioni, n momentul gastrulaiei. Deoarece,
inactivarea n embrion este un proces aleator, att cromozomul X de origine matern
ct i cel de origine patern prezint aceeai probabilitate de inactivare n oricare dintre
celule. n consecin, cromozomul X patern poate fi inactivat ntr-o celul embrionar
n timp ce cromozomul X matern poate fi inactivat ntr-o celul vecin. Din acel
moment, acelai cromozom X este inactiv n toat descendena unei celule particulare.
Cel de al doilea cromozom X este reactivat, n celulele germinale, nainte de nceputul
meiozei. Deci, cei doi cromozomi X sunt activi n timpul ovogenezei i toi gameii
primesc un cromozom X activ.

166
Deoarece, cromozomii X care provin de la tat i de la mam pot purta alele
diferite pentru acelai caracter, femelele adulte sunt, ntr-un anumit sens, un mozaic
genetic, alele diferite putnd funciona n celule diferite. Mozaicismul cromozomului X
se traduce prin pete de culoare n blana anumitor mamifere, cum sunt pisicile calico.
Din fericire, la om, genele de pigmentare nu sunt localizate pe cromozomul X, de unde
absena femeilor calico. Existena mozaicismului datorat inactivrii cromozomului X
a fost demonstrat n cazul ochilor unor femei heterozigote pentru daltonism rou-
verde. Dac ochii sunt luminai de un fascicol de lumin roie sau verde, se pot detecta
n retin, regiuni de celule care prezint o proast percepie a culorilor, dispersate
printre celule unde vederea este normal.
Mecanismul responsabil de inactivarea cromozomului X a atras atenia dup ce
n 1992 o publicaie a sugerat c inactivarea este iniiat de o molecul de ARN
transcris plecnd de la gena Xist localizat pe cromozomul X inactiv i nu de proteina
codificat de aceasta. De asemenea, s-a evideniat c gena omolog situat pe
cromozomului X activ nu este transcris. Acesta reprezint un exemplu rar de expresie
genic dintr-o regiune cromozomial inactiv (heterocromatin). Aceast descoperire,
i multe altele, au stat la originea ipotezei conform creia moleculele de ARN pot
funciona ca reglatori direci ai genelor, ceea ce reprezenta o funcie nc necunoscut a
ARN.

2.4.2. Sensibilitatea la nucleaze

Judecnd dup sensibilitatea la nucleaze (deoxiribonucleaza I sau nucleaza din


Micrococus), regiunile cromatinei active transcripional sunt mai puin compacte dect
cele ale genelor silenioase (inactive). Aceast sensibilitate la nucleaze este adesea
caracteristic pentru regiuni care cuprind mai multe mii de perechi de baze de o parte i
de alta a unitii de transcripie. Nu au fost total identificate bazele moleculare ale
acestei sensibiliti diferite. Studiile biochimice sugereaz c nucleozomii genelor
active sunt sraci n histone H1 i bogai n histone acetilate, legate prin ubiquitin i
complexate cu mai multe tipuri de proteine HMG acide (HMG pentru High Mobility
Group). Aceste modificri altereaz asocierea histonelor cu ADN i ar putea favoriza
separarea neregulat a nucleozomilor, fcnd ADN mai sensibil la digestie. De
exemplu, periodicitatea normal a situsurilor nucleazice de clivare ale genelor
proteinelor de oc termic este modificat n timpul inducerii expresiei acestora prin
creterea temperaturii. Aceeai variaie a situsurilor de clivare se poate observa pentru

167
gena ovalbuminei, n oviduct i n ficat, i pentru genele IgL (k) din limfocite, dup
reorganizare ntr-o form transcripional activ.

2.4.3. Hipersensibilitatea la nucleaze

Genele transcrise activ prezint pe lng sensibilitatea normal la nucleaze,


situsuri de hipersensibilitate situate n jurul unitilor de transcripie. O astfel de hiper-
sensibilitate la deoxiribonucleaza I nu apare la nivelul unor fragmente de ADN nud.
n general, situsurile de hipersensibilitate sunt poziionate imediat n amonte de situsul
de iniiere a transcripiei, dar i la extremitatea 3 a unitii de transcripie. Acestea pot
s conin secvene de amplificare sau de terminare. n cea mai mare parte a cazurilor,
hipersensibilitatea este restrns la esuturile sau celulele n care genele sunt exprimate
sau programate s fie exprimate. De exemplu, situsul de hipersensibilitate situat n 5
de gena pre-proinsulinei, este prezent n insulele ale celulelor pancreatice dar nu a
fost identificat n celulele hepatice. La fel, au fost evideniate situsuri de
hipersensibilitate asociate genelor reorganizate ale imunoglobulinelor n celulele B, dar
nu i n esuturile hematopoietice.
Probabil, situsurile de hipersensibilitate la nucleaze apar acolo unde exist o
discontinuitate n aranjarea nucleozomilor. Pentru prima dat, acest fapt a fost
demonstrat de corelaiile evideniate ntre situsurile de hipersensibilitate i zona lipsit
de nucleozomi din genomul SV40 (Figura 5.17). Aceast regiune se ntinde de la situsul
de iniiere a transcripiei genei precoce pn la extremitatea din amonte a elementului
activator. Dac acest segment de 400 pb este transferat ntr-o alt regiune a genomului
SV40 sau este integrat ntr-o plasmid, se formeaz n aceste locuri, o zon liber de
nucleozomi, hipersensibil la deoxiribonucleaza I. Deci, cele dou proprieti sunt
probabil consecina secvenei nucleotidice a acestui segment de ADN. Totui, este
posibil ca sensibilitatea la nucleaz s fie modulat i de proteine nehistonice care
recunosc aceast regiune.
De asemenea, situsuri de hipersensibilitate la nucleaze i lipsite de nucleozomi
au fost identificate n structura elementelor activatoare ale genelor pentru IgH i IgL(k)
i n secvenele activatoare din amonte asociate extremitii 5 a genelor
metalotioneinei. Alte situsuri de hipersensibilitate la deoxiribonucleaza I au fost
asociate cu activarea transcripiei ADNr. Ele au fost identificate n amonte de situsul de
iniiere i n apropierea regiunilor separatorilor intergenici. Astfel, hipersensibilitatea la
nucleaze a devenit un indicator al regiunilor de reglare a transcripiei genelor eucariote.

168
Deoarece localizarea secvenelor care regleaz transcripia coincide cu
situsurile de hipersensibilitate la nucleaze i cu situsurile lipsite de nucleozomi, se
consider c aceste caracteristici sunt corelate. Este probabil, ca fixarea factorilor de
transcripie s deplaseze nucleozomii sau s altereze mpachetarea lor avnd drept
consecin crearea unui vid identificabil n aranjarea cromatinei sau chiar perturbri
mai subtile care s permit aciunea nucleazelor. Dac mpachetarea dens a
nucleozomilor este stabilizat de ctre histona H1, sau prin replierea sub forma unei
structuri mai elaborate, accesul la secvenele semnal al proteinelor eseniale
transcripiei poate fi restrns, mpiedicnd astfel iniierea transcripiei.
n acest domeniu al cercetrilor privind diferenele dintre cromatina exprimat
i cea reprimat, precum i a trecerii de la o stare la alt se ridic o serie ntreag de
ntrebri care, pentru moment, nu i-au gsit rspuns. Pn n prezent tim c exist
regiuni ale cromatinei care pot fi meninute n stare condensat i neexprimat timp de
mai multe cicluri de replicare dup care sunt disociate i devin active sub aciunea unor
stimuli exogeni sau endogeni adecvai. Pentru moment nu putem afirma c activarea
regiunilor specifice ale cromatinei implic intervenia unor factori (proteine) care
acioneaz pozitiv, sau eliminarea altora care au rol represor, sau ambele situaii.

2.5. Aberaiile cromozomiale

O serie de mutaii accidentale care modific informaia coninut n genele


individuale apar cel mai adesea n cursul replicrii ADN sau datorit aciunii unor
ageni de mediu. Fr a minimaliza importana acestora, pentru buna funcionare a
organismului, trebuie s artm c modificri mult mai importante pot suporta
cromozomii, cel mai adesea n timpul diviziunilor celulare. Astfel, buci de
cromozomi se pot pierde sau segmente importante se pot schimba ntre cromozomi
diferii. Aceste aberaii cromozomiale apar ca urmare a unor rupturi iar frecvena lor
este crescut n urma expunerii la ageni de mediu capabili s modifice ADN: infeciile
virale, radiaiile X, agenii chimici, etc. De asemenea, cromozomii unor indivizi
prezint zone fragile care au o susceptibilitate particular la rupere. Anumite maladii
ereditare rare, ca sindromul Bloom, anemia Fanconi, i ataxia telangiectazic induc o
instabilitate a cromozomilor care crete mult aceast instabilitate.
Consecina unei aberaii cromozomiale depinde de genele afectate i de tipul
de celul atins. Dac modificarea intervine ntr-o celul somatic ne-reproductoare,
consecinele sunt n general minore, deoarece numai cteva celule ale organismului vor

169
fi afectate. Totui, n cazuri rare, o celul purttoare de aberaii se poate transforma
ntr-o celul malign i poate dezvolta o tumor canceroas.
Pot fi transmise generaiei urmtoare, aberaiile cromozomiale care apar n
timpul meiozei, particular dup un crossing-over anormal. Dac un cromozom anormal
este transmis printr-un gamet, toate celulele descendenei sale vor avea aberaia i, n
general, individul nu depete stadiul dezvoltrii embrionare.
Exist mai multe tipuri de anomalii cromozomiale:
Inversiuni: un cromozom este adesea rupt n dou locuri i segmentul situat
ntre cele dou poziii este reataat n ordine invers. Pn la 1% din oameni sunt
purttori ai unei inversii care poate fi detectat n urma realizrii unui cariotip.
Inversiunile pot fi de dou tipuri: i) paracentric, dac implic numai un bra al
cromozomului; ii) pericentric, dac rupturile se produc de o parte i de alta
centromerului (Figura 5.21). Deoarece, de obicei, un cromozom care conine o inversie
posed toate genele cromozomului normal, individul nu este ntotdeauna afectat
defavorabil. Totui, dac o celul cu o inversie cromozomial intr n meioz,
cromozomul aberant nu se poate mperechea corect cu omologul su normal deoarece
ordinea genelor este diferit. n acest caz, mperecherea cromozomial este nsoit de
formarea unei bucle. Dac n bucl se produce un crossing-over, gameii rezultai din
meioz posed o copie suplimentar a anumitor gene i apare o duplicare. Dac un
gamet care conine un cromozom modificat fuzioneaz cu un gamet normal n
momentul fecundrii, zigotul rezultat poart un dezechilibru la nivelul numrului de
cromozomi, care de obicei este invariabil.
Translocri: ataarea unui cromozom sau a unui fragment de cromozom la un
altul (Figura 5.21). Ca i inversiunile, translocrile care survin ntr-o celul somatic pot
s nu aib deloc efect asupra funcionrii celulei i a descendenei sale. Totui, anumite
evenimente de acest tip cresc probabilitatea ca celulele s devin canceroase. Exemplul
cel mai bine cunoscut este cel al cromozomului Philadelphia, pe care l gsim n
celulele maligne (nu i n celulele normale) ale indivizilor care sufer de anumite
forme de leucemie. Cromozomul Philadelphia, denumit astfel deoarece a fost
descoperit n acest ora n 1960, reprezint o versiune scurtat a cromozomului 22 de la
om. De-a lungul anilor, s-a crezut c segmentul care lipsea reprezenta o simpl deleie
dar, odat cu ameliorarea tehnicilor de observare a cromozomilor, s-a demonstrat c
fragmentul care lipsea era transferat unui alt cromozom (nr. 9). Cromozomul 9 posed
o gen care codific pentru o protein-kinaz care intervine n proliferarea celular. Ca
urmare a translocrii, o mic parte a acestei proteine este nlocuit prin aproximativ

170
600 aminoacizi suplimentari codificai de ctre fragmentul translocat care provine de
pe cromozomul 22. Aceast nou protein, mult mai lung, conserv activitatea
catalitic a formei originale, dar nu mai este supus mecanismelor de reglare normal
ale celulei (Figura 5.22).

Figura 5.21. Tipuri de rearanjamente cromozomiale

Figura 5.22. Analiza translocrilor cromozomiale prin bandare (a) i prin marcarea fluorescent a
cromozomilor (b). Se observ formarea cromozomului Filadelfia datorit translocrii unei
regiuni din cromozomul 22 pe cromozomul 9.

171
Ca i inversiunile, translocrile sunt o surs de probleme n procesul de
meioz. Coninutul genetic al unui cromozom alterat prin translocare este diferit de cel
al omologului su. n consecin, gameii formai n urma meiozei posed copii
suplimentare ale anumitor gene sau sunt lipsite de acestea. n figura 5.21 sunt
prezentate dou tipuri de translocri: i) translocare reciproc balansat, n care se
produce cte o singur ruptur pe cei doi cromozomi, cu schimb de material genetic. O
astfel de translocare nu poate fi evideniat fr utilizarea unor tehnici de bandare
avansate; ii) fuziune centric sau translocare robertsonian, care presupune fuziunea
dintre doi cromozomi acrocentrici. De obicei, ruperile apar n apropierea centromerilor
fiecrui cromozom. Transferul de segmente duce la formarea unui cromozom foarte
mare i a unuia foarte mic care se pierde.
S-a demonstrat c translocrile joac un rol important n evoluie producnd
modificri de mare anvergur care pot fi la originea separrii liniilor evolutive distincte
provenite dintr-un strmo comun. Acest accident genetic s-a produs probabil n timpul
propriei noastre istorii evolutive recente. Comparaia celor 23 perechi de cromozomi
ale celulelor somatice de la om cu cele 24 perechi de cromozomi de la cimpanzeu,
goril i urangutan evideniaz asemnri frapante. Observarea precis a doi
cromozomi de maimu, care nu au echivalen la om, demonstreaz c n ansamblu
acetia corespund, band cu band, cromozomului 2 de la om. Se presupune c, ntr-un
anumit moment al evoluiei, un cromozom ntreg a fost translocat ctre altul i a dat
natere unui singur cromozom prin reducerea numrului haploid de la 24 la 23.
Deleiile: reprezint pierderea unui fragment de cromozom. n funcie de
localizare acestea pot fi: i) terminale care sunt rezultatul unei singure rupturi la nivelul
unui bra al cromozomului, producnd un fragment fr centromer care este nlturat;
ii) interstiiale care sunt rezultatul a dou ruperi i care se soldeaz cu pierderea
regiunii dintre acestea (Figura 5.21).
Adesea, zigoii cu o deleie cromozomial se formeaz dac un gamet provine
dintr-o meioz anormal. De obicei, lipsa unei poriuni cromozomiale antreneaz
pierderea de gene eseniale i are consecine severe, chiar dac cromozomul omolog
este normal. Cea mai mare parte din embrionii umani, purttori ai unei deleii
semnificative, nu ajung la termen iar cei care reuesc prezint adesea numeroase
malformaii. n 1963, Jerome Lejeune (descoperitorul sindromului Down) a fost primul
care a stabilit o relaie ntre o malformaie la om i o deleie cromozomial. Lejeune a
constatat c un copil cu diferite malformaii ale feei i o dezvoltare anormal a
laringelui era lipsit de o parte a cromozomului 5. Boala a fost denumit iptul pisicii

172
deoarece existena unei deficiene a laringelui fcea ca iptul copilului s seamene cu
cel al unei pisici care sufer.
Cromozomul sub form de inel reprezint o form special de deleie. Aceast
anomalie apare cnd la ambele capete ale cromozomului se produc rupturi urmate de
fuziunea regiunilor afectate (Figura 5.21). Dac se pierd fragmente importante apar
anomalii fenotipice. Din pcate, cromozomii sub form de inel nu se normalizeaz nici
n meioz i nici n mitoz, avnd drept rezultat consecine serioase asupra
organismului.
Duplicrile: presupun repetarea unei poriuni de cromozom. Se discut
problema rolului acestora n formarea familiilor multi-genice. Unele duplicri
cromozomiale, mai importante, sunt responsabile de prezena mai multor exemplare ale
anumitor gene (ex, trisomie parial). Cele mai cunoscute duplicri afecteaz genele
globinei. Deoarece echilibrul activitilor metabolice ale organismului este foarte
sensibil, existena unor exemplare suplimentare pentru anumite gene poate avea
consecine negative grave.
Izocromozomii: se obin cnd unul dintre braele cromozomului este pierdut i
braul care rmne este duplicat. Se obine un cromozom care conine dou brae scurte
sau dou lungi, identice (Figura 5.21). Cele mai frecvente cazuri se ntlnesc pentru
cromozomul X.

2.6. Mrimea genoamelor nucleare eucariote

Genoamele nucleare eucariote au mrimi variabile (Tabel 5. 1) care pot varia de


la 10 Mpb la peste 100 000 Mpb. Adesea, mrimea acestora coincide cu complexitatea
organismelor, genoamele organismelor eucariote fiind mai mari dect cele ale
eucariotelor inferioare. Totui, mrimea nu este determinat numai de numrul de gene
ci i de cantitatea de secvene de ADN repetitiv. Cele mai mari genoame au un numr
de copii de secvene repetitive este foarte mare.
Dup cum am constatat n paragrafele anterioare, la eucariote genomul nuclear
este mprit ntr-un set de molecule de ADN lineare, fiecare fiind mpachetat n
structura unui cromozom. Din acest punct de vedere nu au fost evideniate excepii n
lumea eucariotelor, toate organismele cunoscute avnd cel puin doi cromozomi n care
molecula de ADN este liniar. Variabilitatea la acest nivel se manifest numai n ceea
ce privete numrul de cromozomi, care pare s nu fie corelat cu trsturile biologice
ale organismului (Tabel 5.6)

173
Tabel 5.6. Numrul de cromozomi la diferite organisme (celula haploid)
Organism Mrime genom (Mpb) Numr.
cromozomi
Saccharomyces cerevisiae 12,1 16
Drosophila melanogaster 140 4
Om 3 000 23
Porumb 5 000 10
Salamandr 90 000 12

De exemplu, drojdia Saccharomyces cerevisiae, un eucariot relativ simplu are


de patru ori mai muli cromozomi dect musculia Drosophila melanogaster. De
asemenea, numrul cromozomilor nu pare s fie corelat cu mrimea genomului sau cu
poziia evolutiv a organismului. Anumite salamandre posed genoame de aproximativ
30 de ori mai mari dect omul dar au un numr de cromozomi redus la jumtate. O
situaie similar se poate consta i n cazul unor plante, cum este porumbul (Figura 5.23
i Tabelul 5.6). Aceste comparaii sunt foarte interesante, dar din pcate nu sunt destul
de informative pentru genoamele n sine. Adesea, ele reprezint numai o reflectare a
neuniformitii evenimentelor evolutive care au modificat arhitectura genomic la
diferite organisme.
Complexitatea morfologic a ADN se poate corela cu valoarea C, care
reprezint cantitatea de ADN din genomul haploid. Pe de alt parte complexitatea
morfologic a unui organism ar trebui s reflecte complexitatea genetic. Cu toate
acestea, corespondena dintre cei doi parametrii este cunoscut drept Paradoxul
Valorii C, deoarece unele organisme au valori C neateptat de mari. De exemplu
genomul petelui-plmn este de 10-15 ori mai mare dect cel de la mamifere. Adesea
paradoxul valorii C este aplicabil i unor specii nrudite (de exemplu valorile C de la
diferite specii de drosofile sunt uneori foarte diferite).

174
Figura 5.23. Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la diferite organisme. Complexitatea
morfologic a organismelor, estimat n funcie de numrul tipurilor celulare pe care le
prezint, crete de jos n sus (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
.
Analiza molecular ncearc s explice i paradoxul aparent pe care l
reprezint faptul c genoamele eucariotelor par s conin o cantitate nsemnat de
ADN care nu este necesar celulei. Acum mai bine de 30 de ani se considera c
eucariotele conin aproximativ 50 000 gene. Cum fiecare secven codant era
considerat ca avnd, n medie, 1 200 pb, genomul acestora ar fi trebuit s conin
numai aproximativ 6 x 107 pb. Acum se cunoate c genoamele unor ciuperci sunt mai
mici dect aceast valoare i c cea mai mare parte a genoamelor de mamifere i de
plante conin de 50 la 100 ori mai mult ADN (Tabel 5.1).

Iniial, pentru estimarea numrului de gene, o serie de cercettori au extrapolat


situaia cunoscut de la E. coli unde de 4,7 milioane pb codific pentru 3000 de gene.
Pstrnd proporionalitatea ei considerau c genomul haploid uman de 2,9 miliarde pb
trebuia s aib un numr mult mai mare de gene (de 600 ori mai mare). Odat cu
ncheierea secvenializrii genomului uman a fost posibil identificarea tuturor fazelor
de lectur i realizarea unei estimri ct mai corecte a numrului genelor de la om. n
prezent se discut de 30-40 000 n loc de 60-80 000 gene cum se considera n
momentul nceperii acestui program. De asemenea, evoluia tehnicilor de biologie
175
molecular i utilizarea unor aparate de secvenializare performante permite
definitivarea secvenializrii unui numr din ce n ce mai mare de organisme i
estimarea din ce n ce mai corect a numrului genelor coninute de acestea. n tabelul
5. 7 se realizeaz o prezentare mrimii unora dintre cele mai cunoscute genoame, a
numrului genelor precum i a distribuiei acestora/Mb.

Tabel 5.7. Mrimea genoamelor, numrul de gene i distribuia acestora


Organism Mrime genom Nr. de gene Nr. de
estimat gene/Mb
H. influenzae (bacterie) 1,8 Mb 1 700 950
S. cerevisiae (drojdie) 12 Mb 6 000 500
C. elegans (nematod) 97 Mb 19 000 200
A. thaliana (plant) 100 Mb 25 000 200
D. melanogaster (musculia oet) 180 MB 13 000 100
Homo sapiens (om) 3 200 Mb 30 000-40 000 10

Aceast variaie inexplicabil a mrimii genoamelor apare deoarece


cromozomii eucariotelor conin, pe lng informaia genetic din structura genelor,
cantiti variabile de ADN, plasate n: i) introni; ii) n regiunile intra-genice i inter-
genice; iii) regiuni repetitive n tandem sau dispersate pe toat lungimea genomului.
Acest ADN, a crui funcie nu a fost nc demonstrat, este adesea compus din repetiii
de secvene, unele dintre ele nefiind niciodat transcrise. El mai este denumit i ADN
nefuncional. n tabelul 5.8 sunt trecute n revist principalele tipuri de secvene
prezente n structura genomului eucariotelor.

Tabel 5.8. Clasificarea secvenelor ADN de la eucariote


Gene care codific pentru proteine
Gene solitare
Gene duplicate i divergente (familii de gene i pseudogene nefuncionale)
Gene repetitive n tandem care codific pentru ARNr, ARNr 5S, ARNt i histone
Repetiii ADN
Secvene simple ADN
ADN moderat repetitiv (elemente de ADN mobile)
Transpozomi
Retrotranspozomi virali
Secvene repetitive lungi dispersate (LINES de la Long Interspersed Elements;
retrotranspozomi nevirali)
Secvene repetitive scurte dispersate (SINES de la Short Interspersed Elements;
retrotranspozomi nevirali)
Alte tipuri de secvene separatoare intergenice

Mrimea, adesea excesiv a genoamelor eucariote se poate datora urmtoarelor


aspecte: i) cea mai mare parte a genelor care codific pentru polipeptide posed cel
puin un intron, un numr mare de gene avnd mai muli (Tabel 5.9). Totui, prezena

176
intronilor nu este obligatorie existnd i gene lipsite de acetia. Genele care codific
pentru moleculele de ARN funcionale cum sunt ARNt i ARNr pot s posede i ele
secvene intercalare, dar ntreruperile la nivelul acestora sunt mai puin frecvente. n
general, cantitatea de ADN prezent n introni depete cu mult pe cea din exoni.
ii) anumite gene apar de mai multe ori ntr-un genom eucariot i contribuie la
creterea taliei. Existena de copii multiple ale unei anumite gene nu este ns o
proprietate exclusiv a eucariotelor. De exemplu, E. coli posed apte gene pentru
ARNr, probabil pentru a satisface necesitile, n ribozomi, ale unei creteri rapide.
Eucariotele posed i ele gene n copiii multiple pentru a rezolva astfel de probleme.
La mamifere exist mai multe sute de gene care codific pentru ARNr. O alt
parte important din excesul de ADN este determinat de prezena copiilor
nefuncionale ale genelor. n general, aceste copii sunt numite pseudogene i sunt
inactive din cauza existenei unor deleii sau altor alterri ale secvenei ADN. Numrul
pseudogenelor pentru un anumit tip de gen variaz foarte mult. Astfel, n genoamele
eucariotelor, o gen poate fi prezent o singur dat, sau foarte bine, poate s fac parte
dintr-o familie de gene funcionale strns nrudite. Acestea pot fi exprimate n
momente diferite sau n esuturi i celule diferite. Astfel de familii pot include i
pseudogene. n figura 5.24 este prezentat clusterul -globinei care conine dou
pseudogene. De asemenea, se remarca cantitatea mare de ADN nefuncional prezent
la om comparativ cu drojdia Saccharomyces cerevisiae.
iii) o alt cauz a mrimii excesive a genoamelor eucariote este prezena unor
familii mari de secvene de ADN repetitiv a cror funcie este, pentru moment,
necunoscut. Astfel de familii reprezint adesea ntre 10% la 50% din genom (Tabel
5.10) . Aceste secvene au fost pentru prima dat identificate n urma analizei cineticii
de reaciei de renaturare a ADN. Astfel, s-a demonstrat c mari cantiti de ADN se
reasociaz mult mai rapid dect era prevzut pentru secvenele unice. Viteza mare de
reasociere indic faptul c genoamele conin segmente care se repet de sute de mii sau
de milioane de ori (Figura 5.25) Curbele de reasociere Cot sunt informative pentru
identificarea regiunilor care conin secvene repetitive sau satelii. Clonarea molecular
i secvenializarea au confirmat existena unor astfel de secvene nalt repetitive, care,
asemenea genelor repetitive, sunt aranjate n tandem sau sunt dispersate la nivelul a
numeroase locusuri necorelate.
ADN repetitiv const n secvene scurte repetitive sub forma unor copii
identice sau nrudite n genom. Componenta care se renatureaz cel mai rapid n
genomul eucariotelor este reprezentat de secvenele nalt repetitive, i const n

177
secvene foarte scurte care se repet de multe ori n tandem formnd clustere mari.
Datorit unitilor repetitive scurte, aceste secvene de ADN sunt adesea denumite
secvene ADN simple sau secvene satelit.

Tabel 5.9. Variabilitatea numrului de introni i exoni i mrimea acestorala diferite specii
Produsul genei Organism Exoni Introni
Pb total numr Pb total
Adenozin dezaminaza om 1 500 11 30 000
Apolipoproteina B om 14 000 28 29 000
Beta-globina oarece 432 2 762
Citocrom b drojdii 2 200 6 5 100
Dihidrofolat reductaza oarece 568 5 31 500
Eritropoetina om 582 4 1 562
Factorul VIII om 9 000 25 177 000
Hipoxantin fosforibozil oarece 1 307 8 32 000
transferaza
Interferon alfa om 600 0 0
Receptor LDL om 5 100 17 40 000
Fazeolin Fasole verde 1 263 5 515
Tiroglobulin om 8 500 >40 100 000
ARNtTyr drojdii 76 1 14
Ureaz (subunitate) soia 300 7 4 500
Vitelogenin broasc 6 300 33 20 000
Zein porumb 700 0 0

Tabel 5. 10. Tipuri de secvene ADN repetitive i distribuia acestora


Secvene repetitive n tandem (unitile repetitive la nivelul unui situs sunt de obicei identice)
Proporia n genomul mamiferelor 10-15%
Lungimea fiecrei uniti repetitive 1-10 pb
Lungimea total a repetiiilor ADN pentru un situs n perechi de baze:
Satelii ADN normali 100 000-10 milioane
Minisatelii 100-100 000
Microsatelii 10-100
Secvene repetitive dispersate (copiile sunt similare dar nu identice)
Proporia n genomul mamiferelor 25-40%
Lungimea fiecrei uniti repetitive 100-10 000 pb
Numr de repetiii n genom 1 la 1 milion

178
Figura 5.24. Prezentare comparativ a structurii genice a cromozomului III de la Saccharomyces
cerevisiae (a) i clusterului globinei de la om situat pe cromozomul 11(b).
Dreptunghiurile albastre marcheaz fazele de lectur. Se poate constata c genomul de S.
cerevisiae are un numr foarte mic de secvene nefuncionale. La om clusterul globinei
conine secvene intergenice necodante, pseudogene (1 i 2) i secvene repetitive
dispersate lungi (secvenele Alu care aparin tipului SINES) (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000)

Figura 5. 25. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din sursele indicate pe grafic. Se
observ procesul de renaturare rapid a secvenelor repetitive sau care conin satelii dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)

Acest tip de secvene sunt prezente n aproape toate genoamele eucariote, dar
cantitatea lor total este extrem de variabil. n genoamele mamiferelor acestea
reprezint, n mod normal, < 10% dar la Drosophila virilis, cantitatea este de 50%.

179
Secvenele repetitive n tandem pot fi corelate cu modificarea alinierilor care
apar n urma mperecherii cromozomilor. Astfel, mrimea clusterelor n tandem tinde
s fie foarte polimorf, cu variaii largi ntre indivizi. De fapt, clusterele mai mici,
formate din astfel de secvene, pot fi folosite pentru caracterizarea genoamelor
individuale folosind tehnica fingerprinting sau genotiparea automat. Compararea
secvenelor simple de ADN, de la diferite specii, ofer informaii interesante despre
mecanismele procesului de evoluie. Pentru moment nu putem spune cu precizie dac
aceste secvene au o funcie structural.
Mari familii de repetiii dispersate n genomul mamiferelor
Analiza clasic a profilelor de dispersie demonstreaz c genomul uman i
genoamele altor mamifere posed profile de dispersie apropiate. Aceste concluzii sunt
confirmate de detaliile moleculare furnizate prin analiz de restricie, clonare i
secvenializare. Cu toate c exist diferite familii i sub-familii de repetiii dispersate,
un numr mic dintre acestea prezint un numr foarte mare de copii i domin
genoamele. O familie dominant poate reprezenta mai mult de 5% din ADN total, iar
totalitatea familiilor pot reprezenta 20% din acesta. Unele familii sunt constituite din
secvene de 100 la 500 pb i sunt denumite secvene SINES (Short Interspersed
Repeats). Altele, ale cror membri pot avea 6 kpb sau mai mult, sunt denumite LINES
(Long Interspersed Repeats). Organisme cum sunt miomicetele, lcustele,
echinodermele, petii i amfibienii conin repetiii dispersate care se aseamn cu
SINES de la mamifere. La plante i la nevertebrate exist secvene comparabile cu
LINES de la mamifere.
Fiecare specie (ordin) posed un joc caracteristic de familii de secvene
SINES. Una dintre familiile SINES cele mai bine studiate este familia ALU de la
primatele lumii vechi, denumit aa datorit prezenei n aceast secven a unui situs
de restricie Alu I. Unitile Alu se gsesc n regiuni care flancheaz genele, n introni,
n ADN satelit i grupate cu alte secvene repetitive dispersate (Figura 5.24).
Pe lng multiplele familii SINES, genoamele mamiferelor posed toate o
abundent familie LINES, familia LINE-1, ale crei membri pot avea 6 la 7 kpb. n
unele dintre aceste genoame, exist i alte familii LINE dar ele nu sunt la fel de
frecvente. Familiile LINE-1 de la diferite mamifere sunt toate nrudite dar divergente:
cu ct speciile sunt mai apropiate cu att familiile sunt mai similare. Secvenele LINE-
1 sunt prezente n regiunile care flancheaz genele, n introni i inserate n repetiiile
ADN satelit.

180
2.7. Genoamele organitelor din celulele eucariote

Majoritatea celulelor eucariote posed genoame mitocondriale i toate


eucariotele capabile de fotosintez au genoame n structura cloroplastelor. Iniial, s-a
considerat c genoamele organitelor sunt molecule de ADN circulare. Aceasta
deoarece hrile genetice i fizice obinute, prin analiza de restricie a genoamelor din
mitocondrii i din cloroplaste, erau circulare. n anumite organite, studiile de
microscopie electronic au evideniat att molecule circulare ct i liniare. La nceput,
s-a presupus c formele liniare ar putea reprezenta fragmente ale genoamelor circulare
care s-au rupt n procesul de preparare. Din 1998 a fost admis c unele eucariote
inferioare (Paramecium, Chlamydomonas i multe sue de drojdii) posed structuri
lineare la nivelul genoamelor mitocondriale.
Surprinztor, mrimea moleculelor de ADN mitocondrial (ADNmt), numrul
i natura proteinelor pe care acestea le codific, i chiar codul genetic mitocondrial,
variaz mult ntre diferitele tipuri de organisme (Tabel 5.11 i 5.12).
Majoritatea animalelor multicelulare au genoame mitocondriale mici cu o
organizare genetic compact, genele fiind separare numai de spaii foarte reduse.
ADNmt uman este tipic pentru aceast categorie. Genomul mitocondrial este o
molecul circular care a fost complet secvenializat i care conine 16 569 perechi de
baze, fiind printre cele mai mici molecule de acest tip. Acesta codific pentru dou
molecule de ARNr prezente n ribozomii mitocondriali i pentru cei 22 ARNt folosii
n procesul de translaie de la acest nivel. ADNmt uman conine 13 secvene care ncep
cu codonul ATG (metionin) i se termin cu un codon STOP. Aceste faze de lectur,
destul de lungi pentru a codifica polipeptide de aproximativ 50 aminoacizi, au fost
identificate cu proteinele codificate. ADNmt de la mamifere, spre deosebire ADN
nuclear, este lipsit de introni i nu conine secvene necodante (Figura 5.26).
ADNmt de la nevertebrate are aproximativ aceeai mrime cu cel uman, n
timp ce ADNmt de la drojdii este de aproximativ de 5 ori mai mare (78 000 pb).
Moleculele de ADNmt de la drojdii i de la alte eucariote superioare posed gene care
la mamifere sunt dispuse n nucleii celulelor (Figura 5.26).
In contrast cu alte eucariote, care conin un singur tip de ADNmt, plantele
conin mai multe tipuri de ADNmt care par s se recombine unele cu altele. Aceste
molecule de la plante sunt mult mai mari dect la alte organisme. Se poate ntmpla ca
la o singur specie s existe diferene foarte mari n mrimea ADNmt (la pepenele
verde 330 000 pb; la pepenele galben 2 500 000 pb).

181
Tabel 5.11. Mrimea genoamelor mitocondriilor i cloroplastelor
Specie Tip de organism Mrime
genom (kb)
A. Genoame mitocondriale
Chlamydomonas reinhardtii Alg verde 16
Mus musculus Vertebrate (oarece) 16
Homo sapiens Vertebrate (om) 17
Metridium senile Nevertabrate 17
Drosophila melanogaster Nevertebrate (musc) 19
Chondrus crispus Alg roie 26
Aspergillus nidulans Ascomicete, fungi 33
Reclinomonas americana Protozoar 69
Saccharomyces cerevisiae Drojdie 75
Suillus grisellus Bazidiomicete, fungi 121
Brassica oleracea Plante cu flori (varz) 160
Arabidopsis thaliana Plante cu flori 367
Zea mays Plante cu flori (porumb) 570
Cucumis melo Plante cu flori (pepene) 2 500
B. Genoame ale cloroplastelor
Pissum sativum Pante cu flori 120
Marchantia polymorpha Plante 121
Oryza sativa Plante cu flori (orez) 136
Nicotiana tabacum Plante cu flori (tutun) 156
Chlamydomonas reinhardtii Alg verde 195

Figura 5.26. Genoamele mitocondriale de la om (a) i de la Saccharomyces cerevisiae

Spre deosebire de animale, drojdii i fungii, ADNmt de la plante conine gene


care codific pentru ARNr 5S, care este prezent numai n ribozomii mitocondriilor
182
plantelor, i pentru subunitatea a ATP-azei F1. ARNr de la plante este mult mai mare
dect cel de la alte eucariote. Secvenializarea recent a uneia dintre cele mai mici
molecule de ADNmt de la plante a evideniat c mrimea este datorat existenei de
regiuni necodante i de secvene duplicate.
Diferenele de mrime i de capacitate codant a ADNmt de la diferite
organisme poate reflecta un anumit schimb de ADN, ntre mitocondrie i nucleu, n
cursul evoluiei. Dovezi directe, n favoarea acestei afirmaii au fost furnizate de
evidenierea unor proteine ale cror gene sunt la unele specii localizate n nucleu i la
altele n mitocondrie. Se pare c este vorba de o deplasare a genelor din mitocondrie n
nucleu i invers, n timpul evoluiei. Cel mai elocvent exemplu este cel al genei cox II,
care codific subunitatea 2 a citocrom c oxidazei. Pentru toate organismele studiate,
aceast gen se gsete n ADNmt, cu excepia unei specii de legume numit Bob
(mung bean) unde gena cox II este nuclear.

Tabel 5.12. Caracteristicile genelor mitocondriale


Caracteristica C. Homo S. A. R.
reinhadtii sapiens cerevisiae thaliana americana
Numr total de gene 12 37 35 52 92
Tipuri de gene
Gene care codific proteine 7 13 8 27 62
complexul respirator 7 13 7 17 24
proteine ribozomale 0 0 1 7 27
proteine transportoare 0 0 0 3 6
ARN polimeraza 0 0 0 0 4
Factor de translaie 0 0 0 0 1
Gene care codific ARNr 2 2 2 3 3
Gene ARNt 3 22 24 22 26
Alte gene ARN 0 0 1 0 1
Numr de introni 1 0 8 23 1
Mrimea genomului (kb) 16 17 75 367 69

Multe molecule de ARN transcrise de la plante sunt procesate prin aciunea


unei enzime care catalizeaz transformarea unor resturi selecionate C n U i ocazional
a U n C. Gena nuclear cox II de la bob este mai apropiat structural de moleculele de
ARN procesate dect de gena mitocondrial cox II prezent la alte legume. Aceste date
sunt dovezi ale deplasrii genei cox II din mitocondrie n nucleu printr-un proces care
implic participarea unei molecule de ARN. Este posibil un mecanism de
reverstranscripie similar celui prin care pseudogenele procesate sunt generate n
genomul nuclear prin intermediul ARNm.
Structura cloroplastelor este similar n multe privine cu aceea a
mitocondriilor. Ca i acestea, cloroplastele conin mai multe copii de ADN i ribozomi

183
care codific pentru proteine din cloroplaste, folosind codul genetic standard. Alte
proteine specifice din cloroplastelor sunt fabricate n citoplasm i sunt transportate,
dup traducere.
ADN din cloroplaste sunt molecule circulare de aproximativ 120 000-160 000
pb, n funcie de specie. Multe dintre moleculele de ADN din cloroplaste au fost
complet secvenializate (Tabel 5.11). Genomul cloroplastelor din planta a crei denumire
popular este plmn prezint dou secvene repetitive inverse fiecare constnd n
10058 pb care conin genele ARNr i alte cteva gene duplicate. n ciuda diferenei de
mrime (plmn 121 024 pb; tutun 155 844), ntreaga organizare i compoziia
genelor de la plmn i de la tutun este foarte similar; Diferena de mrime apare, n
primul rnd, de la repetiiile inversate provenite din duplicarea anumitor gene.
Din aproximativ 120 de gene codificate de ADN din cloroplaste, aproape 60
sunt implicate n transcripia i translaia ARN i includ genele care codific pentru
ARNr, ARNt, subunitile ARN polimerazei i proteinele ribozomale. Aproximativ 20
de gene codific pentru subunitile complexelor transportoare de electroni din
cloroplast i pentru complexul FoF1 ATP-azic. De asemenea, sunt codificate de ctre
genomul cloroplastelor cele dou subuniti mari ale ribulozo 1,5 difosfat carboxilaza,
care este implicat n fixarea dioxidului de carbon n timpul fotosintezei.
Reflectnd originea endosimbiotic a cloroplastelor unele regiuni din genomul
acestora sunt similare cu cele ale ADN de la bacteriile actuale. De exemplu, ADN din
cloroplaste codific patru subuniti ale ARN polimerazei care sunt omologe cu
subunitile ARN polimerazei de la E. coli. Un alt segment al ADN din cloroplaste
codific 8 proteine care sunt omologe cu 8 proteine ribozomale de la E. coli. Ordinea
genelor este similar n cele dou tipuri de ADN. ADN din cloroplastele plmnului
posed cteva gene care nu sunt n ADN din cloroplastele tutunului i invers. Acest
lucru poate indica un posibil schimb ancestral ntre cloroplaste i nucleu.

184
185
BIBLIOGRAFIE SELECTIV

1. ALBERTS B., BRAY D., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K.,
and WALTER P. (1998) Essential Cell Biology. An introduction to the
Molecular Biology of the Cell, International Student Edition, Garland Publishing,
Inc, New York
2. ALBERTS B., JOHNSON A., LEWIS J., RAFF M., ROBERTS K., and
WALTER P. (2002) Molecular Biology of The Cell, 4th ed. Ed., Garland Science
Taylor&Francis Group, New York
3. AZOU Y., and FOGLINO M. (1999) Biologie Molculaire, Dunod, Paris
4. BEOLCHI L. (ed) (2002) European Telemedicine Glossary of Concepts,
standards, tehnologies and Users, 4th ed. Ed. Edited by Glossary, T., DG
INFSO-B1
5. BOGARD M., and LAMORIL J. (1998) Biologie Moleculaire en Biologie
Clinique, I. Methodes, Elsevier, Amsterdam, Oxford, Paris
6. BOGARD M., and LAMORIL J. (1999) Biologie Moleculaire en Biologie
Clinique., II. Applications en Infectiologie et en Cancerologie, Elsevier,
Amsterdam, Oxford, Paris
7. BOUVIER J., and BRAS-HERRENG F. (1987) L'ADN de la Cellule aux
manipulations in vitro, Dunod, Paris
8. BROWN T. A. (1995) Gene Cloning,, 3th ed. Ed., Chapman&Hall, London
9. BROWN T. A. (1999) Genomes, BIOS Scientific Ltd, Oxford
10. BUSLIRK R. V., and LIYANAGE U. K. (1977) An electronic companion to
Molecular Cell Biology, Cogito Learning Media, Inc, San Francisco
11. CAETANO-ANOLLS G., and GRESSHOFF M. P. (1997) DNA Markers
Protocols, applications and overviews, Wiley-VCH, New York
12. CAMPBELL, and REECE. (2002) Test Bank For Biology, 6th ed., Ed.,
Benjamin Cummings, San Francisco
13. CAMPBELL, and REECE. (2002) Instructor's Guide to Text and Media for
Biology, 6th ed. Ed., Benjamin Cummings, San Francisco
14. CAMPBELL, and REECE. (2002) Biology, Ed., Benjamin Cummings, San
Francisco
15. CANTOR R. C. (1988) Principles of Nucleic Acid Structure ; Springer-Verlang,
New York
186
16. CARRET R. L., DENNINSTON K. J., and TOPPING J. J. (1997) Principles and
Applications of Inorganic, Organic and Biological Chemistry, 2nd ed., WCB
McGraw-Hill, Boston
17. CAU P., and SETE R. (1999) Cours de Biologie Cellulaire, 2eme ed., Ellipses
Edition Marketing, Paris
18. Chemicals;, P. F. (ed) Sephasorb HP Ultrafine Chromatography in Organic
Solvents
19. COOPER D. N., and KRAWCZAK M. (1993) Human Gene Mutation, BIOS
Scientific Publishers, Oxford
20. COSTACHE M., and DINISCHIOTU A. (1998) Vitamine hidrosolubile, Ed.,
Protransilvania, Bucuresti
21. COTRAN R. S., KUMAR V., and COLLINS T. (1999) Robbins Pathologic
Basis of Disease, 6th ed., W.B. Saunders Company, Philadelphia, London, New
York
22. COX M. T., and SINCLAIR J. (ed) (1997) Molecular Biology in Medicine,
Blackwell Science, New York
23. DAVIS L.G., DIBNER M.D., and BATTERY J.F. (1999) Basic Methods in
Molecular Biology, Elsevier, New York
24. DELAUNAY J. (1995) Biochimie.Travaux Diriges, Hermann Lecourbe, Paris
25. DEVLIN (ed) (1998) Textbook of Biochemistry with clinical correlations, 4th
ed.,John Wiley and sons Inc, New York
26. DINISCHIOTU A., and COSTACHE M. (1998) Biochimia glucidelor, Ed.,
Protransilvania, Bucuresti
27. DUMITRU I. F., and IORDACHESCU D. (1981) Introducere in Enzimologie,
Editura Medicala, Bucuresti
28. ELLES R. (1996) Molecular Diagnosis of Genetic Diseases, Humana Press
29. ELLIOTT H. W., and ELLIOTT C. D. (1997) Biochemistry and Molecular
Biology, Oxford University Press, Oxford
30. ETIENNE J. (1997) Biochimie, Genetique, Biologie Moleculaire, 3eme ed.,
MASSON, Paris
31. FORD C. T., and GRAHAM J. M. (1991) An Introduction to Centrifugation,
Bios Scientific Publishers Limited, London
32. FREIFELDER D. (1990) Biologie Molculaire, Masson, Paris
33. GLOVER, D. M., and HAMES B. D. (1996) DNA Cloning 2, A practical
Approach, Expression Systems, IRL Press

187
34. GLOVER D. M., and HAMES B. D. (1995) DNA Cloning 3 Complex Genomes,
Oxford University Press, Oxford
35. HACKETT B. P., FUCHS A. J., and MESSING W.J. Introduction to
Recombinant DNA Techniques. Basic Experiments in Gene Manipulation,
Benjamin Cummings Publishing Company Inc, California
36. HAMES B. D., and HIGGINS S. J. (1995) Gene Probes 2 a Practical
Approach, Oxford University Press, Oxford
37. HELMREICH E. (2001) The Biochemistry of Cell Signaling, Oxford University
Press, Oxford
38. HILLIS M. D., MORITZ C., and MABLE K. B. (1996) Molecular Systematics,
2nd ed. Ed. Sinauer
39. HORTON H. R., MORAN L. A., OCHS R. S., and SCRIMGEOUR K. G.
(2002) Principles of Biochemistry, 3rd ed. Ed., Prentice-Hall Inc., Boston
40. HOWE C. (1995) Gene Cloning and Manipulation, Cambridge University Press,
Cambridge
41. IORDACHESCU D. (1997) Biochimia acizilor nucleici, Partea I, Editura
Universitatii din Bucuresti, Bucuresti
42. JULIEN R., and CENATIEMPO Y. (eds) (1993) Biotechnologies d'aujourd'hui.
Edited by JULIEN R., and CENATIEMPO Y., Pulim Universite de Limoges,
Limoges
43. KAMOUN P. (1997) Appareils et Methodes en Biochimie et Biologie
Moleculaire, Medicine-Sciences Flamarion, Paris
44. KAPLAN J. C. (1990) Biologie Moleculaire et Medecine, Medecine-Sciences
Flamarion, Paris
45. KARCHER J. S. (1995) Molecular Biology a Project Approach, Academic
Press, San Diego
46. KARP G. (1998) Biologie Cellulaire et Moleculaire, concepts et experiences,
DeBoeck Universite, Paris
47. KEARSEY J. M., and POONI S. H. (1996) The Genetical Analysis of
Quantitative Traits, Chapman&Hall, London
48. LATCHMAN D. (1991) Eukaryotic Transcription Factors, Academic Press
Limited, London
49. LE MARECHAL P., and BINET A. (1993) Biochimie, Dunod, Paris
50. LEWIN B. (1994) Genes V, Oxford University Press, Oxford
51. LEWIN B. (2000) Genes VII, Oxford University Press, Oxford

188
52. LEWIS R. (1997) Human Genetics Concepts and Applications, 2nd ed. Ed.,
WCB McGraw-Hill, Boston
53. LODISH H., BERK A., ZIPURSKY S. L., MATSUDAIRA P., BALTIMORE
D., and DARNELL J. (2000) Molecular Cell Biology, 4th ed. Ed., W. H.
Freeman and Company, New York
54. LUCOTTE G. (1985) GENETIQUE MOLECULAIRE.Initiation l'tude de la
structure et du fonctionnement du gne eucaryote, Biofutur Edition, Paris
55. MAFTAH A., and JULIEN R. (1996) Biologie Moleculaire, MASSON, Paris
56. McKEE T., and McKEE R. J. (1999) Course Ready Notes to accompany
Biochemistry. An Introduction, 2nd ed. Ed., McGraw-Hill Companies,Inc.
Boston, Boston
57. McPHERSON, M. J., HAMES, B. D., and TAYLOR G. R. (1995) PCR 2. A
practical Approach, IRL Press
58. METZELER D., and METZELER C. M. (2001) Biochemistry the chemical
reactions of living cells, 2nd ed., Ed., Harcourt Academic Press, San Diego
59. MIKEL V. U. (1994) Advanced Laboratory Methods in Histology and Pathology
60. MOLDOVEANU E., NEAGU M., and POPESCU L. M. (2001) Dictionar de
Biochimie si Biologie Moleculara, Editura Medicala, Bucuresti
61. MORGAN J., and DARLING D. C. (1993) Animal Cell Culture, BIOS Scientific
Publishers, Liverpool
62. NECHIFOR P.M., and PORR J. P. (2003) Magnesium Involvements in Biology
and Pharmacotherapy,, Casa Cartii de Stiinta, Cluj-Napoca
63. OULMOUDEN A., DELOURME D., MAFTAH A., PETIT J.M., and JULIEN
R. (1999) Gntique, Dunod, Paris
64. PETIT J. M., MAFTAH A., and JULIEN R. (1997) Biologie Cellulaire,
MASSON, Paris
65. POLLARD D. T., and EARNSHAW C. W. (2002) Cell Biology,, Elsevier
Science, Philadelphia;
66. ROSS M. H., ROMRELL L. J., and KAYE I. G. (1995) Hystology a text and
Atlas, Lippincott Williams & Wilkins, Philadelphia
67. ROSSIGNOL J. L. (1992) Genetique, 4eme ed. Ed., MASSON, Paris
68. SALISBURY R. J. (1997) Molecular Pathology, Taylor&Francis Ltd, London
69. SAMBROOK J., FRITSCH, F. E., and MANIATIS T. (1989) Molecular
Cloning. A Laboratory Manual, 2nd ed. Ed., Cold Spring Harbor Laboratory
Press

189
70. SINGER M., and BERG P. (1993) Genes and Genomes
71. STRYER A. (2003) BIiochemistry 5th ed. Ed., Freeman and Comapany, New
York
72. TAGU D. (ed) (1998) Principles des Techniques de Biologie Moleculaire,
Institut National de la Recherche Agronomique, Paris
73. TIMOTHY M. COX, and SINCLAIR, J. (1997) Molecular Biology in Medicine,
Blackwell Science
74. TURNER P. C., McLenman A. G., Bates A. D., and White M. R. H. (2000)
L'essentiel de la Biologie Mooleculaire, Port Royal Livres, Paris
75. UCL Medical School, C. o. t. C. a. G. (ed) (1996) Tutorial Problems & Problem-
Solving Exercises,, Department of Biochemistry and Molecular Biology,
University College London, London
76. VOET D., and VOET J. G. (1995) Biochemistry, 2nd Ed., John Wiley and Sons,
New York
77. ZUBAY G. (1998) Biochemistry, Ed., Wm.C.BRAWN Publishers, Dubuque

190
191
Lista figurilor

Figura 1.1. Structura polimer a acizilor nucleici ........................................ 12


Figura 1.2. Bazele majore din structura acizilor nucleici ............................ 13
Figura 1.3. Baze modificate: N6-metil adenina (bacterii) 5-metil- citozina
(plante, animale); hipoxantina. ............................................................... 14
Figura 1.4. Produii de degradare i alcaloizii vegetali derivai ai baze-lor
purinice. (Xantina; acidul uric; 1,3-dimetil-xantina = teofilina; 3,7-
dimetilxantina = teo-bromina; 1,3,7-trimetil ......................................... 15
Figura 1.5. Civa analogi sintetici ai bazelor din structura acizilor
nucleici: 5-bromouracil, aciclovir (2-hidroxi-etoxometil guanin), 5-
fluoro-uracilul; 6tiopurina; 8-azaguanina;.......................................... 16
Figura 1.6. Echilibre tautomere posibile la pH 7,0 ntre formele lactam (la
stnga) i lactim (la dreapta) ale bazelor pirimidinice i purinice
(prezente sunt form nucleozidic sau nucleotidic). ........................... 17
Figura 1.7. Stivuirea bazelor n cristalul de 9-metil-adenin (dup
Biochemistry, Voet & Voet, 1995) ........................................................... 18
Figura 1.8. Absorbia diferit n UV a moleculelor de ADN mono- i
dublucatenare nsoit de deplasarea spectrului de absorie ............... 19
Figura 1.9. Variaia absorbiei relative la 258 nm cu creterea
temperaturii:a) polimerul poli (A); b) dinucleotidul ApA (dup
Biochemistry,Voet&Voet,1995) .............................................................. 19
Figura 1.10. Reacii de dezaminare ale bazelor: a) citozin la uracil; b) 5-
metil-citozin la timin ............................................................................ 21
Figura 1.11. Dezaminri provocate de acidul azotos i consecinele acestora
.................................................................................................................... 21
Figura 1.12. Structurile furanozice ciclice cu anomerie ale ribozei i
deoxiribozei ............................................................................................... 22
Figura 1.13. Legtur -N glicozidic ntre o baz purinic i riboz ...... 23
Figura 1.14. Cele dou conformaii pe care le adopt pentoz n structur
acizilor nucleici:a) E (anvelope) i b) T (twist) (dup Biochemistry,
Voet&Voet, 1995) ..................................................................................... 25
Figura 1.15. Cele mai probabile conformaii ale ciclului furanozic (riboz i
deoxiriboz) din structura nucleotidelor. a) perspectiv; b) vedere din
fa (planul atomilor coplanari perpendiculari pe planul paginii)
(dup Biochemistry, Voet&Voet,1995) ................................................... 25
Figura 1.16. Izomerii de rotaie n jurul legturii glicozidice i definirea
unghiului de torsiune (n raport cu legtura N9-C1 i N1-C1). ..... 25
192
Figura 1.17. Exemple de nucleozide care intr n structura unor metabolii
sau/i cofactori: a) S-adenozilmetionina (SAM); b) inozina (hipoxantin
riboz); c) fosfoadenozilosfosulfat (PAPS) ............................................ 27
Figura 1.18. Structura moleculei B12 conine nucleozidul 5deoxiadenozil 28
Figura 1.19. Nucleozide atipice naturale: pseudouridina, arabinozil-citozina,
arabinozil-adenozina, puromicina ............................................................. 28
Figura 1. 20. Nucleozide de sintez: 3deoxiadenozina, 6-azauridina ......... 29
Figura 1.21. Adenozin 5-monofosfat (adenilat, AMP)................................. 29
Figura 1.22. Structura nucleozid polifosfatului derivat de la adenin (ATP)
.................................................................................................................... 33
Figura 1.23. Complexe ATP Mg2+ .................................................................. 33
Figura 1.24. Structurile AMP, ADP i ATP cu marcarea legturilor
fosfoester i fosfoanhidrid ..................................................................... 33
Figura 1.25. Exemple de intermediari metabolici activai: CDP-diacil glicerol,
CDP-etanolamin, UDP-glucoz ................................................................. 35
Figura 1.26. Structurile NAD(P)+ i FAD(H2) ............................................... 35
Figura 1.27. Structura Coenzimei A forma activ SH.................................. 36
Figura 1.28. Nucleotide ciclice: AMPc i GMPc ........................................... 36
Figura 1.29. Separarea bazelor, nucleozidelor i nucleotidelor prin
cromatografie lichid de nalt rezoluie (HPLC) n faz invers:
Coloan Alltina C18-NUC, 5 m, 250 x 4,6 mm; faz mobil: gradient
cresctor de fosfat i descresctor de metanol; debit 1,5 ml/min;
detector UV 267 nm ................................................................................. 38

Figura 2.1. Imagine electrono-microscopic a unei molecule de ADN


dublu catenar circular nchis (plasmid) ........................................... 43
Figura 2.2 Imagine de separare electroforetic a ADN n gel de agaroz:
M, marcheri de mas molecular; 1, 2, 3, 4 i 5, ADN plasmidial
scindat cu enzime de restricie ................................................................ 44
Figura 2.3. Separarea acizilor nucleici prin ultracentrifugare: a) Separare ADN
prin ultracentrifugare n gradient de CsCl; b) separare ARN prin
ultracentrifugare n gradient de zaharoz ................................................. 45
Figura 2.4. Electroforez n cmp pulsatoriu. a) principiu de separare; b)
electroforegram obinut n urma separrii unor fragmente mari de ADN.
Vizualizarea a fost realizat n urma colorrii cu bromur de etidium....... 46
Figura 2. 5. Sinteza unei monocatene de ADN: a) formarea legturii
fosfodiester ntre un dinucleotid i deoxiadenozin citidin trifosfat; b)
reprezentarea schematic a reaciei de sintez cu marcarea orientrii
5-3 a catenei n formare ........................................................................ 47
Figura 2.6. Structura unei molecule ARN: a) evidenierea nlnuirii
nucleotidelor i vectorizarea catenei; ..................................................... 48

193
Figura 2.7. Schema mecanismului de hidroliza ARN prin cataliza bazic: 1.
Hidroxilul din 2 este deprotonat de ctre ionul hidroxid; 2. Alcoxidul,
nucleofil, atac gruparea fosfodiester cu formarea unui diester ciclic
2: 3; 3. Un al doilea hidroxid provoac hidroliza uneia sau alteia
dintre legturile ester: se obin izomeri 2 i 3 fosfat. ......................... 50
Figura 2.8. Tipuri de tieturi la nivelul legturilor: exonuclea-zele i
endonucleazele de tip d scindeaz extre-mitatea 5 i duc la formarea
de 3NMP; exonucleazele i endo-nucleazele de tip p scindeaz
extremitatea 3 i determin formarea 5NMP (vezi tabelul 2.4) ........ 51
Figura 2.9. Exemple de enzime de restricie i situsurile recunoscute de
acestea ....................................................................................................... 53
Figura 2.10. Exemple de enzime de restricie i palindroamele recunoscute
de acestea cu marcarea situsurilor de clivare i a axei de simetrie: a)
obinerea de capete coezive; b) obinerea de capete drepte (dup
Biochemistry, Voet&Voet, 1995) ............................................................. 53
Figura 2.11. Separare electroforetic pe mini-geluri utilizat pentru
estimarea semi-cantitativ a fragmentelor de acizi nucleici separate: a)
principiu de separare; b) vizualizarea mini-gelului dup tratament cu
bromur de etidium ................................................................................. 55
Figura 2. 12. Principiul i prezentarea schematic secvenializrii prin
metoda Maxam i Gilbert. ....................................................................... 58
Figura 2.13. Metoda Sanger: a) Principiul de sinteza a catenei
complementare i modul de intervenie al ddNTP; b) Prezentare
schematizat a realizrii practice a secvenializrii. n urma
electroforezei celor patru loturi se obine secvena catenei
complementare. ........................................................................................ 60
Figura 2.14. Utilizarea principiului reaciei Sanger n secvenializarea
automat: a) sinteza fragmentelor complementare i marcarea
acestora folosind molecule ddNTP cuplate cu fluorocromi; b)
principiul de separare a fragmentelor pe gel sau prin electroforez
capilar; c) modalitate de prezentare a rezultatelor............................. 62
Figura 2.15. Protecia i activarea nucleotidelor. n acest procedeu fosforul
trivalent poart: i) o grupare protonat reactiv (fosforamidita)
obinut printr-o legtur de tip amid; ii) o grupare ester care
blocheaz gruparea OH (gruparea CE); iii) hidroxilul din poziia 5
este protejat cu o grupare (metoxitritril) aleas datorit capacitii
sale de clivare uoar n mediu acid (grup DMT); Gruprile amino ale
bazelor, susceptibile s reacioneze, sunt i ele protejate. .................... 62
Figura 2.16. Sinteza n faz solid a catenelor unui polinucleotid prin
metoda fosforamidiilor. ...................................................................... 63
Figura 3. 1. Tipurile de rotaii posibile n structura unei mononucleotide. 66

194
Figura 3.2. mperecheri pirimidin-purin conform Watson i Crick (formarea
legturilor de hidrogen). ............................................................................ 68
Figura 3.3. mperecheri diferite de tipul Watson-Crick: a) mperecherea
de tip Hoogsten a derivailor cuplurilor T-A (gruparea metil
nlocuiete pentoza); b) mperechere ipotetic ntre C i T; c)
mperechere de adenine n structura cristalului de 9-metil-adenin .. 69
Figura 3. 4. Legturi de hidrogen ntre bazele complementare din structura
catenelor elicei ADN: a) reprezentare n plan a legturilor de hidrogen; b)
prezentare schematic plan a vectorizrii catenelor................................ 73
Figura 3.5. Structura ADN B: a) imagine schematic a dublei elice cu
evidenierea dimensiunilor, b) vedere schematic de sus; c) imagini
ADN B cu evidenierea scheletului riboz-fosfat i a planului bazelor;
d) vederi de sus cu evidenierea cilindrului central (adaptat dup
Biochemistry, Voet&Voet, 1995) ............................................................. 73
Figura 3.6. Alte conformaii ADN: a) conformaia ADN A - vedere
normal i de sus; b) conformaia Z vedere normal i de sus
(adaptat dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995) .................................. 75
Figura 3.7. Model privind posibilitatea de trecere din conformaia B n Z
(dup Biochemistry, Voet & Voet, 1995) ................................................ 75
Figura 3.8. Curbura impus dublului helix de ctre repetarea secvenial a
bazelor. ...................................................................................................... 79
Figura 3.9. mperecherea i schema triplei elice H a ADN .......................... 80
Figura 3.10. Consecinele prezenei secvenelor repetitive pentru structura
secundar a ADN. Existena unor secvene repetitive inversate poate
provoca mperecheri ale regiunilor de pe aceeai caten. Cum cele
dou catene sunt complementare o mperechere poate determina o
mperechere simetric pe cea de a doua caten. Rezultatul l
reprezint formarea unei structuri cruciforme..................................... 80
Figura 3.11. Reprezentarea schematic a diferitelor forme de ADN
circular. numerele reprezint turele dublului helix, iar sgeile
punctate regiunile de sudur ale extremitilor. ................................... 86
Figura 3.12. Modelul unei brri elastice: cele dou laturi pot reprezenta
cele dou catene ale dublului helix. ........................................................ 87
Figura 3.13. Micrografii electronice ale topoizomerilor unei molecule de ADN
dublu-catenar circular nchis: 1) forma relaxat; 2, 3, 4, 5 forme
supra-rsucite. (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995) ........................... 88
Figura 3.14. Separarea electroforetic a topoizomerilor SV40: linia 1)
migrarea ADN nativ; linia 2) migrarea ADN supus 3 minute
tratamentului cu topoizomeraz; linia 3) migrarea ADN supus 30
minute tratamentului cu topoizomeraz. ............................................... 88
Figura 3.15. Tirozina prezent n situsul catalitic activ al topoizimerazei
esterific gruparea 5 fosfat eliberat .................................................... 90
195
Figura 3.16 Modul de aciune al topoizomerazelor de tip I ........................ 90
Figura 3.17. Modul de aciune al girazelor bacteriene: a) introducerea de
super-ture negative; b) replicarea ADN dublu catenar circular nchis
cu formarea de regiuni supra-rsucite (catenate); c) intervenia
girazelor n procesul de catenare decatenare; ....................................... 90
Figura 3.18. Model molecular al activitii catalitice a topoizomerazei II de
la E. Coli (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ......... 93
Figura 3.19. Intervenia topoizomerazei II n procesul de decatenare la
SV40. a) Imagine electronomicroscopic; b) Model de decatenare;
catenele parentale sunt reprezentate n culori nchise iar catenele fiice
n culori deschise.(dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
.................................................................................................................... 93
Figura 3.20. Aciunea bromurii de etidium asupra structurii ADN: a) structura
bromurii de etidium; b) intercalarea bromurii de etidium ntre planurile
bazelor (adaptat dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995).......................... 97
Figura 3.21. Efectul temperaturi asupra ADN dublu catenar: a) creterea
valorilor DO260 nm n urma procesului de denaturare termic; b)
efectul hipercrom al procesului de denaturare i modalitatea de
estimare a temperaturii de melting ........................................................ 99
Figura 3.22 a) Efectul hipercrom al denaturrii termice i determinarea
temperaturii de melting; b) Efectul coninutului G+C al ADN din
diferite surse asupra temperaturii de fuziune. .................................... 100
Figura 3.23 Fenomenul de denaturare i renaturare termic a acizilor
nucleici:denaturare; b) renaturare....................................................... 102
Figura 3.24. Procesul de denaturare prin nclzire i tratament alcalin
(dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ........................ 102
Figura 3.25. Ageni denaturani pentru dubla elice ADN. Sunt molecule
capabile s formeze legturi de hidrogen i s induc denaturarea
ADN ......................................................................................................... 103

Figura 4.1. Tipuri de legturi de hidrogen care sunt specifice structurii


secundare a ARN (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000) ........................................................................................................ 107
Figura 4.2. Tipuri de baze modificate prezente n structura acizilor nucleici
.................................................................................................................. 110
Figura 4.3. Structura ARN de transport: a) Motivele elementare de
structur 2-D; b) Structura teriar n form de L (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000). .................................................... 111
Figura 4.4. Tipuri de structuri secundare i teriare caracteristice
moleculelor de ARN: a) structuri secundare; b) structuri teriare i

196
pseudo-teriare (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)
.................................................................................................................. 111
Figura 4.5. Structura secundar a ARNr de 16 S de la E. Coli de 1542
nucleotide bazat pe compararea secvenelor de la diferite tulpini
(dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995) ................................................ 113
Figura 4.6. Sinteza moleculelor de ARNm: a) transcripia ARNm
policistronic la procariote; A, B; C, D i E sunt genele operonului
triptofan (trp) ......................................................................................... 115
Figura 4.7. Schema unei molecule de ARNt ncrcat: a) schema general a
structurii secundare a moleculei; b) modul de formare a legturii ntre
ARNt i aminoacil (dup Biochemistry, Voe t& Voet, 1995) .............. 117
Figura 4.8.. Codul genetic standard. Codonul AUG care codific pentru
metionin este cel mai comun codon start. Trei dintre codoni AAA,
AAG i AGA funcioneaz drept codoni STOP. Se poate observa
degenerescena codului genetic deoarece numai metionina i
triptofanul sunt codificai de un singur codon, restul aminoacizilor
fiind codificai de doi la ase codoni. .................................................... 117
Figura 4.9. Recunoaterea codon anticodon (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000) .......................................................................... 120
Figura 4.10. Tipuri de molecule de ARNt difereniate n funcie de
mrimea braului suplimentar: structurile 1, 2 i 3 aparin categoriei
clasei 1 n timp ce 4 aparine clasei 2. Sunt marcate elementele de
identitate majore n cele patru tipuri. Fiecare baz din structura
ARNt este reprezentat de cercuri pline. Cercurile roii indic
poziiile identice pentru recunoaterea ARNt de ctre aminoacil-ARNt
sintetaz. Bazele din structura anticodonului care reprezint elemente
de identificare sunt subliniate.(dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
.................................................................................................................. 120
Figura 4.11. Principalele caracteristici ale ribozomilor de la procariote i
eucariote (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ....... 122
Figura 4.12. Structura puromicinei analog cu tirozil ARNt .................... 122
Figura 4.13 Diferite tipuri de antibiotice, majoritatea cu aciune selectiv
asupra sintezei proteice la nivelul ribozomilor celulelor procariote . 124
Figura 4.14. Tipuri de structuri secundare posibile ale ARNr de tip 16S: a)
la archeobacterii; b) eucariote, drojdii; c) mitocondrie de mamifer
(bovine). Se observ conservarea filogenetic a domeniilor i
subdomeniilor din structur (dup Biochemistry, Voet&Voet, 1995)
.................................................................................................................. 127
Figura 4.15. Structura secundar cap de ciocan a unei ribozime (Lewin
B., Genes VII,2000)................................................................................. 127
Figura 4.16. Asamblarea moleculelor de ARN U pentru formarea
spliceozomului implicat n nlturarea intronilor i sudarea exonilor
197
din structura pre-ARNm (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et.
al., 2000) .................................................................................................. 128
Figura 4.17. Molecule ARNsn implicate n recunoaterea pre-ARNm i n
realizarea procesului de splicing (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000) .......................................................................... 128

Figura 5. 1. Reprezentare clasic a unei celule procariote (dup Campbell,


et al., Biology, 2002). .............................................................................. 130
Figura 5.2. Model pentru structura nucleoidului de E. coli ....................... 133
Figura 5.3. Diferite tipuri de operoni: a) operonul lactoz de la E. coli; b)
operonul triptofan de la E. coli; c) operonul mixt de la Aquifex
aeolicus .................................................................................................... 136
Figura 5.4. Nucleul celular i caracteristicile sale (dup Campbell, et al.,
Biology, 2002). ......................................................................................... 140
Figura 5.5. Complexul porului nuclear, model schematic.......................... 141
Figura 5.6. Anvelopa nuclear a ovocitelor de Xenopus vizualizat prin
microscopie electronic: a) faa citoplasmatic a complexului porului
nuclear (CPN); b) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup
ndeprtarea membranei nucleare a CPN, evideniind structura sub
form de co; c) faa nucleoplasmatic a anvelopei nucleare dup
ndeprtarea membranei nucleare prin tratament blnd cu detergent.
Reeaua laminar, care se insereaz n inelul nuclear al NPC, este
expus dup acest tratament (dup Molecular Cell Biology Lodish H.,
et. al., 2000).............................................................................................. 141
Figura 5.7. Mecanismul propus pentru transportul, din citoplasm n nucleu, a
proteinelor cargocare conin un semnal de localizare nuclear (SLN) (dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000). .......................................... 143
Figura 5.8. Semnalul de Localizare Nuclear (SLN) al antigenului T
(SV40) poate direciona o protein citoplas-matic n nucleu: a)
Piruvat kinaza normal, localizat n citoplasm, vizualizat prin
imunofluorescen dup tratarea celulelor n cultur cu un anticorp
specific; b) piruvat kinaza himer, care conine un semnal SNL al
SV40 la captul su N-terminal, este direcionat ctre nucleu.
Proteina himer a fost exprimat n urma transfeciei unei gene
modificate produs prin fuziunea unui fragment al unei gene virale
care codific NLS al SV40 cu gena piruvat kinazei (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000). .................................................... 144
Figura 5.9. Localizarea situsurilor de sintez i de maturare a pre-ARN cu
sonde fluorescente: a) vizualizarea procesului de transcripie prin
colorare cu DAPI pentru evidenierea genei i cu anticorpi fa de
heterogen nuclear ribonucleo proteine, marcai cu fluorescein; b)
evidenierea procesului de poliadenilare prin colorare cu poli-dT
198
marcat cu rodamin i cu DAPI pentru evidenierea ADN; c)
evidenierea splicingului prin utilizarea de anticorpi monoclonali, fa
de proteina de splicing SC-35, marcai cu fluorescein (dup Molecular
Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ....................................................... 145
Figura 5.10. Matricea nuclear: a) micrografie electronic a unui nucleu
izolat n prezen de detergeni i sruri 2M; b) micrografie
electronic a unei regiuni de fibroblast de oarece n urma
tratamentului cu detergent i nlturare a cromatinei i ADN .......... 146
Figura 5.11. Comparaie ntre starea cromatinei n interfaz i a
cromatinei compactate n mitoz: a) micrografie electronic
prezentnd starea dispersat a cromatinei n interfaz; b) micrografie
electronic a unui cromozom mitotic (dup Molecular Cell Biology
Lodish H., et. al., 2000) .......................................................................... 148
Figura 5.12. Cariotipul cromozomilor mitotici de la om: a) tehnic folosit
pentru obinerea de preparate de cromozomi mitotici din leucocitele
sngelui periferic; b) dup obinerea unei fotografii a cromozomilor
eliberai din nucleu, acetia sunt aranjai perechi i dup mrime... 151
Figura 5. 13. Hibridizarea fluorescent n situ (FISH) i aplicaiile ei: a)
utilizarea de sonde fluorescente pentru marcarea regiunii
centromerice a cromozomului 16; b) exemplu de cariotip spectral; c)
evidenierea prezenei telomerilor la cromozomi de oarece (adaptat
dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) ......................... 151
Figura 5.14. Completarea capetelor ADN de ctre telomeraz: a) procesul
de replicare i evidenierea formrii capetelor incomplete ale
cromozomilor pentru catena ntrziat; b) mecanismul de aciune al
telomerazei cu evidenierea motivelor repetitive de la capetele
cromozomilor .......................................................................................... 153
Figura 5.15. Schema general a organizrii cromatinei cu evidenierea
principalelor nivele cunoscute de organizare (Campbell, et al., Biology
2002). ....................................................................................................... 157
Figura 5.16: Structura i dimensiunile nucleozomilor: a) sedimentarea
nucleozomilor n gradient de sucroz duce la obinerea unei serii de
picuri care corespund formelor monomere, dimere, trimere, etc., ale
nucleozomilor; b) ADN extras din fraciile individuale este supus
electroforezei mpreun cu un martor ADN digerat cu nucleaze; c)
micrografie electronic a cromatinei eliberat dintr-un nucleu al unei
celule de Drosophila. Se observ c fibrele de cromatin sunt formate
din nucleozomi conectai ntre ei prin segmente scurte de ADN; d)
schem care demonstreaz structura unei particule nucleozomale cu o
molecul de histon H1 asociat; e) electroforez n SDS a unui
amestec de histone H3 i H4 din timus de viel. Se observ toate

199
benzile corespunztoare componentelor tetramerului (H3)2(H4)2
(Lewin B., Genes VII,2000).................................................................... 159
Figura 5.17. Structura genomului SV40. Se evideniaz regiunea lipsit de
nucleozomi n partea superioar a figurii ............................................ 160
Figura 5.18. Modelul solenoid de organizare a fibrelor de cromatin condensat
de 30 nm: a) micrografia i modul de organizare a nucleozomilor din
structur; b) micrografie prezentnd fibrele de 30 nm i modelul de
mpachetare solenoid cu caracteristicile sale structurale (adaptat dup
Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000)........................................ 163
Figura 5.19. Nivelurile structurale superioare ale cromatinei: a) micrografie
electronic prezentnd domenii de cromatin, n bucle la cromozomii n
perie izolai dintr-un ovocit de amfibian; b) model de structurare a
buclelor fibrelor de cromatin de 30 nm imaginat n urma experienelor de
hibridare in situ cu sonde (A la H) situate la distane variabile pe ADN
liniar; c) micrografie electronic a unui cromozom metafazic din celule
HeLa, lipsit de histone ca urmare a unui tratament moderat cu detergeni.
.................................................................................................................. 163
Figura 5. 20. Evidenierea heterocromatinei: a) micrografie electronic a
unei celule stem din mduva spinrii. Regiunile nchise de la periferia
nucleului i din afara nucleolului reprezint heterocromatin; b)
prezena cromozomului X inactivat sub forma corpusculului Barr
ntr-o celul de femeie. ........................................................................... 166
Figura 5.21. Tipuri de rearanjamente cromozomiale ................................. 171
Figura 5.22. Analiza translocrilor cromozomiale prin bandare (a) i prin
marcarea fluorescent a cromozomilor (b). Se observ formarea
cromozomului Filadelfia datorit translocrii unei regiuni din
cromozomul 22 pe cromozomul 9. ........................................................ 171
Figura 5.23. Mrimea coninutului n ADN a genomului haploid de la
diferite organisme. Complexitatea morfologic a organismelor,
estimat n funcie de numrul tipurilor celulare pe care le prezint,
crete de jos n sus (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al.,
2000) ........................................................................................................ 175
Figura 5.24. Prezentare comparativ a structurii genice a cromozomului
III de la Saccharomyces cerevisiae (a) i clusterului globinei de la om
situat pe cromozomul 11(b). Dreptunghiurile albastre marcheaz
fazele de lectur. Se poate constata c genomul de S. cerevisiae are un
numr foarte mic de secvene nefuncionale. La om clusterul globinei
conine secvene intergenice necodante, pseudogene ( 1 i 2) i
secvene repetitive dispersate lungi (secvenele Alu care aparin tipului
SINES) (dup Molecular Cell Biology Lodish H., et. al., 2000) .......... 179
Figura 5. 25. Curbele de reasociere (Cot) pentru ADN dublu catenar din
sursele indicate pe grafic. Se observ procesul de renaturare rapid a
200
secvenelor repetitive sau care conin satelii dup Molecular Cell
Biology Lodish H., et. al., 2000)............................................................. 179
Figura 5.26. Genoamele mitocondriale de la om (a) i de la Saccharomyces
cerevisiae ................................................................................................. 182

201
Lista tabelelor

Tabel 1.1 Denumire i simbol cu trei litere i cu o liter pentru baze i


nucleozidele lor ......................................................................................... 23
Tabel 1.2. Coenzime i molecule intermediari metabolici n structura
crora intr adenozina............................................................................. 26
Tabel 1.3. Nomenclatura i simbolurile diferitelor tipuri de nucleotide
(sunt figurate numai ribonucleotidele, n afar de timin care servete
ca exemplu pentru deoxiribonucleotide). ............................................... 32
Tabel 1.4. Constante spectrofotometrice ale nucleozidelor purinice i
pirimidinice ............................................................................................... 38

Tabel 2.1. Constituenii ARN i ADN..................................................... 41


Tabel 2.2. Mrimea unor molecule de ADN din diferite surse, comparat
cu cea a unei proteine fibroase, colagenul, i celulele procariote i
eucariote. ................................................................................................... 44
Tabel 2.3. Produii de degradare chimic a acizilor nucleici ....................... 49
Tabel 2.4. Exemple de nucleaze reprezentative i diferitele lor
caracteristici. ............................................................................................ 52
Tabel 2.5. Numrul situsurilor de tiere prezente la nivelul ADN din trei
virusuri pentru trei endonucleaze comune. ................................................ 54

Tabel 3.1. Caracteristicile diferitelor conformaii ale elicelor ADN ... 74


Tabel 3.2. Exemple de valori Tm n funcie de coninutul n (G+C) ......... 100

Tabel 5. 1. Mrimea i complexitatea genomului la cteva virusuri i


celule ........................................................................................................ 132
Tabel 5.2. Trsturile ctorva plasmide tipice ............................................ 134
Tabel 5.3. Catalog comparativ de gene pentru E. coli, H. influentze, M.
genitalium ................................................................................................ 137
Tabel 5.4. Tehnici de colorare folosite pentru bandarea cromozomilor ... 149
Tabel 5.5: Caracteristicile histonelor din timus de vac ............................ 156
Tabel 5.6. Numrul de cromozomi la diferite organisme (celula haploid)
.................................................................................................................. 174
Tabel 5.7. Mrimea genoamelor, numrul de gene i distribuia acestora
.................................................................................................................. 176
Tabel 5.8. Clasificarea secvenelor ADN de la eucariote ............................ 176

202
Tabel 5.9. Variabilitatea numrului de introni i exoni i mrimea
acestorala diferite specii ........................................................................ 178
Tabel 5. 10. Tipuri de secvene ADN repetitive i distribuia acestora ..... 178
Tabel 5.11. Mrimea genoamelor mitocondriilor i cloroplastelor ........... 182
Tabel 5.12. Caracteristicile genelor mitocondriale ..................................... 183

203