Sunteți pe pagina 1din 50

UNIVERSITATEA DE TIINE AGRICOLE I MEDICIN

VETERINAR
FACULTATEA DE ZOOTEHNIE I BIOTEHNOLOGII

ZORIA MARIA SCONA

EXTRACIA, PURIFICAREA, CARACTERIZAREA I TESTAREA IN


VITRO A FRACIILOR BOGATE N ANTOCIANI OBINUTE DIN ARONIA
MELANOCARPA I VACCINIUM SP.

REZUMATULTEZEI DE DOCTORAT

CONDUCTOR TIINIFIC
Prof. Dr. CARMEN SOCACIU

Cluj-Napoca
2012
Cuprins

INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE .................................................................................... V


REZULTATE EXPERIMENTALE .......................................................................................... VIII
CAPITOLUL I. ............................................................................................................................. IX
CARACTERIZAREA CHIMIC A UNOR VARIETI DE ARONIA MELANOCARPA I
VACCINUM SP. I DETERMINAREA ACTIVITII ANTIOXIDANTE A ACESTORA .... IX
MATERIALE I METODE ..................................................................................................... IX
Extracia. ............................................................................................................................... IX
Analiza cantitativ HPLC a antocianilor .............................................................................. IX
Coninutul total de polifenoli ................................................................................................ IX
Coninuul total de flavonoide............................................................................................... IX
Cuantificarea antocianilor totali ............................................................................................ IX
Metoda antioxidant de neutralizare a radicalului ABTS ...................................................... X
Metoda antioxidant de reducere a ionului ferric (FRAP). .................................................... X
Metoda antioxidant de reducere a ionului cupric (CUPRAC) ............................................. X
Metoda de evaluare a potentialului de neutralizare a peroxidului de hidrogen (HPS). ......... X
REZULTATE I DISCUII ...................................................................................................... X
Analiza cantitativ HPLC a antocianilor ............................................................................... X
Analiza calitativ.................................................................................................................... X
Coninutul total de polifenoli (TPC) ....................................................................................XV
Coninutul total de flavonoide .................................................................................................XV
Coninutul total de antociani ................................................................................................XV
Activitatea antioxidant ...................................................................................................XVIII
Potentialul de neutralizare asupra radicalului ABTS .......................................................XVIII
Metoda antioxidant de reducere a potenialului ionului feric (FRAP) ...........................XVIII
Potenialul antioxidant de reducere a ionului cupric (CUPRAC) ....................................XVIII
Metoda capacitii radicalului de oxigen (ORAC) ..........................................................XVIII
Efectul de neutralizare a peroxidului de hidrogen (HPS) ................................................XVIII
CONCLUZII ................................................................................................................................XX
CAPITOLUL II. ........................................................................................................................ XXII
EVALUAREA PURITII FRACIILOR BOGATE N OBINUTE DIN FRUCTE DE
ARONIA I AFINE FOLOSIND DIFERITE METODE DE EXTRACIE N FAZ SOLID
................................................................................................................................................... XXII
MATERIALE I METODE ................................................................................................. XXII
Obinerea fraciei bogate n antociani ............................................................................... XXII
Coloane C18 Sep Pack. ................................................................................................. XXII
Oasis-MCX ................................................................................................................... XXII
Amberlite XAD-7 i Sephadex LH-20. ........................................................................ XXII
Evaluarea puritii ............................................................................................................. XXII

II
Analiza HPLC-PDA i MS ........................................................................................... XXII
Absorbtivitatea molar. ................................................................................................. XXII
REZULTATE I DISCUII ................................................................................................XXIII
Evaluarea puritii prin metoda HPLC-PDA ...................................................................XXIII
Evaluarea puritii cu ajutorul absorbtivitii molare ....................................................... XXV
Compararea metodelor SPE .............................................................................................. XXV
Compararea metodelor de evaluare a puritii .................................................................. XXV
Confirmarea puritii prin analiza HPLC-MS ................................................................. XXVI
CONCLUZII ..................................................................................................................... XXVIII
CAPITOLUL III ..................................................................................................................... XXIX
EFECTELE CHEMOPROTECTOARE ALE FRACIEI BOGATE N ANTOCIANI DIN
ARONIA PRUNIFOLIA PE LINIA UMAN DE CANCER CERVICAL HeLa I PENTRU
LINIA B16F10 MELANOM METASTATIC ........................................................................ XXIX
MATERIALE I METODE ............................................................................................... XXIX
Obinerea fraciei bogate n antociani. ............................................................................ XXIX
Protocol HPLC PDA .................................................................................................... XXIX
Manipularea culturii celulare. ......................................................................................... XXIX
Metoda proliferarri celulare .......................................................................................... XXIX
Metoda determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului ................................... XXIX
REZULTATE I DISCUII ................................................................................................. XXX
Identificarea si cuantificarea antocianilor prin analiza HPLC-PDA ................................. XXX
Efectele induse de fracia bogat n antociani asupra proliferrii celulelor tumorale B16F10
i HeLa .............................................................................................................................. XXX
Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului .............................................. XXXII
CONCLUZII ..................................................................................................................... XXXIII
CAPITOLUL IV .................................................................................................................. XXXIV
DETERMINAREA ANTOCIANILOR DIN DIFERITE SOIURI DE AFINE I
PROPRIETILE LOR ANTIPROLIFERATIVE I PROAPOPTOTICE N CELULELE DE
MELANOM METASTATIC MURIN B16F10 .................................................................. XXXIV
MATERIALE I METODE ............................................................................................ XXXIV
Pregtirea fraciei bogate n antociani .......................................................................... XXXIV
Protocolul analizei HPLC PDA ................................................................................ XXXIV
Protocolul analizei HPLC-ESI-MS .............................................................................. XXXIV
Metoda de evaluare a potenialului antioxidant de reducere a ionului cupric (CUPRAC).
...................................................................................................................................... XXXIV
Manipularea culturii celulare ......................................................................................... XXXV
Analiza de proliferarea a celulelor ................................................................................. XXXV
Metoda determinarea activitii lactatdehidrogenazei (LDH) ....................................... XXXV
Analiza testul TUNEL ................................................................................................... XXXV
REZULTATE I DISCUII ............................................................................................ XXXVI

III
Identificarea i cuantificarea antocianilor din afine ..................................................... XXXVI
Determinarea activitii antioxidante .................................................................................. XLI
Evaluarea proliferrii celulelor tumorale ............................................................................ XLI
Evaluare integritii membranei celulare .......................................................................... XLII
Colorarea cu EB / AO ...................................................................................................... XLIII
Apoptoza .......................................................................................................................... XLIV
CONCLUZII ........................................................................................................................ XLVI
CONCLUZII GENERALE ................................................................................................... XLVIII
BIBLIOGRAFIA ..................................................................................................................... XLIX

IV
INTRODUCERE: SCOP I OBIECTIVE

Antocianii sunt colorani naturali, care au atras interesul nu doar datorit culorilor
plcute regsite n fructele i legume ci i datorit faptului ca sunt molecule biologic
active cu beneficii pentru sntate. Cele mai bogate surse de antociani sunt fructele de
pdure, precum afinele, soc, aronia, zmeur, legumele i unele cereale.
Antocianii prezint o serie de proprieti benefice, dintre care cea mai important
const n efectul lor antioxidant. Datorit acestei proprieti, antocianii pot asigura
organismului, n primul rnd, protecie mpotriva reaciilor nocive intense i a radicalilor
liberi (Scalbert i Williamson, 2000). Exist multe studii n literatur care au sugerat i
demonstrat c acetia ofer protecie i previn bolile degenerative (Jing i Giusti, 2011).
De asemenea, acestea pot fi utilizate n domeniul tehnologic, ca i colorani naturali
(Ahmadiani, 2012, Socaciu, 2007).
Antocianii au un rol foarte important n industria alimentar, farmaceutic i
cosmetic, nsa sunt puin folosii deoarece nu sunt foarte stabili i se extrag din materia
prima ntr-un procent redus. n prezent, majoritatea studiilor pe antociani au ca obiectiv
rezolvarea acestor probleme, precum i cele legate de purificare a extractului, i de
evaluare a efectului lor antioxidant pe culturi celulare (Castaneda-Ovando et al., 2009).

Scopul acestei teze a fost:


Utiliznd tehnica Cromatografiei de Lichide de nalt Performan (HPLC) ne-am
propus s caracterizm profilul metabolic al extractelor obinute din patru varieti de
aronia i nou varieti de afin cultivate cu precdere n Romania. Pentru extractele
caracterizate ne-am propus s evalum i s comparm coninutul n antociani, polifenoli
i flavonoide totale. De asemenea ne-am propus sa evalum capacitatea antioxidant a
extractelor prin cinci tehnici complementare, (ABTS, HPS, ORAC, FRAP, CUPRAC).
Metoda ce are la baza evaluarea efectului de neutralizare a peroxidului de hidrogen
(HPS) este o metod ce nu a fost utilizata pn n prezent pentru evaluarea activittii
antioxidante a extractelor bogate n antociani.
Un alt obiectiv al acestei teze a fost obinerea unor fracii bogate n antociani i
evaluarea potenialului lor antioxidant i chemopreventiv in vitro. Acesta este primul
studiu ce evalueaz efectul antiproliferativ i proapoptotic al antocianilor purificati din
afine i aronia asupra liniei celulare B16F10 (melanom murin).
Avnd la baz puinele date existente n literatura de specialitate referitoare la
impicaia antocianilor n prevenia i tratamentul cancerului de piele si cervical am
elaborat un experiment cu scopul de a evalua efectele anti-proliferative pro-apoptotice i
Rezumatul tezei de doctorat

ale fractiilor de antociani purificate din fructele de aronia i afin pe modelele celulare
tumorale menionate mai sus.

Principalele obiective ale tezei au fost:


1. Caracterizarea profilului metabolic prin cromatografie de lichide de nalt
performan (HPLC), pentru patru varieti de aronia, dou varieti de afine din flora
spontan i trei varieti de afine frecvent cultivate i consumate de ctre populaia din
Romnia.
2. Evaluarea activitii antioxidante i cuantificarea coninutului de polifenoli
totali a extractelor obinute din fructele de aronia i afine, prin cinci metode
complementare (ABTS, ORAC, FRAP, CUPRAC HPS).
3. Purificarea fraciei bogate n antociani din extractele de afine i aronia i
evaluarea puritii acestora prin analiza HPLC i absorptivitatea molar.
4. Evaluarea potenialului chemopreventiv i a efectului prooxidant, al fraciei
bogate n antociani din fructele de aronia, pe modelele celulare tumorale HeLa i
B16F10, determinnd proliferarea celular i nivelul speciilor reactive de oxigen.
5. Evaluarea potenialului chemopreventiv al antocianilor purificai din afine pe
celulele tumorale B16F10, determinnd proliferarea celular, eliberarea LDH, precum i
inducia apoptozei (testul colorrii cu EB / AO i metoda TUNEL).

Structura tezei
Teza, este structurat pe dou pri, prima parte conine studiul de literatur i iar n cea
de-a doua parte sunt prezentate contribuiile originale (metode de lucru, rezultate i
discuii).
Prima parte Studiul bibliografic (1-2)
Cu ajutorul datelor din literatura de specialitate n Capitolul 1 s-a condensat
informaia referitoare la biosinteza, structura, proprietile chimice, potenialul
antioxidant i metodele de analiz utilizate n studiul antocianilor.
In capitolul 2 se regsesc cteva noiuni despre patologia tumorilor i implicaiile
antocianilor n invazia tumorii i metastazei, prin inducia apoptozei.
Partea a doua cuprinde patru capitole (4-6):
n Capitolul 3 este prezentat un studiu comparativ ntre activitatea antioxidant i
a cantitatea de antociani obinuti din patru varieti de aronia, dou varieti de
afine din flora spontan si trei varieti de afine frecvent cultivate n Romnia.
n Capitolul 4 este prezentat un studiu privind evaluarea i compararea puritii
fraciilor bogate n antociani obinute prin diferite metode de extracie n faz
solid.

VI
Rezumatul tezei de doctorat

Capitolul 5 conine un studiu realizat pentru evaluarea efectului chemopreventiv


al fraciei bogate n antociani obinut din aronia, pe celulele B16F10 tumorale de
melanom murin i pe celulele HeLa tumorale de col uterin.
Capitolul 6 conine date referitoare la identificarea antocianilor din 7 varieti de
afine i determinarea activitii lor antioxidante. In acelai experiment au fost
evaluate i efectele antitumorale i proapoptotice ale fraciilor bogate n antociani
pe linia celular tumoral B16F10.
Aceast tez este rezultatul unei colaborri ntre Universitatea de tiine Agricole i
Medicin Veterinar, Cluj-Napoca, Romania, Departamentul de Chimie i Biochimie i
The Ohio University, Columbus, OH, Departamentul de Chimia alimentelor.
Acest studiu a fost finantat prin Programul FONDUL SOCIAL EUROPEAN
POSDRU/88/1.5/S/49598, Programul FONDUL SOCIAL EUROPEAN postdoctoral
POSDRU/89/1.5/S/60746 i proiectul Naional PN-II-RU-TE-109 2010.

VII
Rezumatul tezei de doctorat

REZULTATE EXPERIMENTALE

Antocianii aparin clasei de metabolii secundari vegetali, cunoscut sub


denumirea de flavonoide i sunt responsabili pentru culorile rou, portocaliu sau albastru,
conferite legumelor i fructelor (Giusti i Wrolstad, 2003) (Fig. 2).
n flori i plante ornamentale antocianii au o structur chimic mult mai complex
dect cei din fructe i legume. Excepie de la aceasta regul fac afinele i strugurii,
deoarece conin antociani n numr mare cu structuri chimice complexe (Cara et al.,
2008). Solubilitatea i stabilitatea lor n mediu apos au dus la utilizarea acestora n
industria alimentar, ca i colorani (Castanelo Osvaldo et al, 2009; Socaciu, 2007;
Pazmino-Duran et al, 2001).

Chromane ring

Lungimea de
Nume Substituie Culoarea n vizibil und max.(nm)
in MeOH-HCl
R1 R2
Cianidina (Cy) OH H Roz nchis 535
Peonidina (Pn) OCH3 H 532
Pelargonidina H H Rou 520
(Pg)
Malvidina (Mv) OCH3 OCH3 542
Purpuriu
Delfinidina OH OH 546
(Dp)
Petunidina (Pt) OCH3 OH 543
Fig. 1. Structura chimic a celor mai importani antociani (adaptat dup
Harborne,1998).
Fig. 2. Structure of the most commonly anthocyanidins (Adapted from Harborne
(1998).

Studiile de literatur in vivo i in vitro relev potenialul chemopreventiv al


antocianilor din fructele de pdure (Khknen et al., 2001).

VIII
Rezumatul tezei de doctorat

CAPITOLUL I.
CARACTERIZAREA CHIMIC A UNOR VARIETI DE ARONIA
MELANOCARPA I VACCINUM SP. I DETERMINAREA ACTIVITII
ANTIOXIDANTE A ACESTORA

Identificarea i cuantificarea antocianilor din extractele de aronia i afine s-au


realizat prin tehnica HPLC. Evaluarea i compararea activitii antioxidante a extractelor
luate n studiu s-a realizat prin cinci metode spectrofotometrice complementare (ABTS,
FRAP, CUPRAC, ORAC i H2O2).

MATERIALE I METODE
Extracia. Fructele de analizat (5 g) au fost omogenizate cu metanol coninnd
HCl (0,3%), cu ajutorul unui ultraturax (Miccra D-9 KT Digitronic, Germania).
Extractele au fost ulterior concentrate la 350 C sub presiune redus (Rotavapor R-124,
Buchi, Elveia), apoi filtrate printr-un filtru de 0.45 m nainte de a fi analizate.
Analiza cantitativ HPLC a antocianilor. Analizele HPLC s-au realizat cu
ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat cu detecie cu fotodiod. S-a folosit o coloan
Luna Phenomenex C-18 (5m, 25 cm x 4,6 mm). Gradientul de eluare a constat n: faza
mobil A - acid formic (4.5%) n ap bidistilat i faza mobil B - acetonitril.
Coninutul total de polifenoli. Cu ajutorul metodei Folin-Ciocalteu se pot masura
gruprile OH din proba luat n studiu, n condiii alcaline (ajustate cu carbonat de sodiu).
Creterea absorbanei la lungimea de und de 765 nm crete proporional cu numrul de
gruprile OH ale antocianilor. Coninutul total de fenoli a fost exprimat n echivaleni de
acid galic.
Coninuul total de flavonoide a fost determinat utiliznd o metod colorimetric
ce a fost descris anterior (Kim et al, 2003; Zhishen et al, 1999).
Cuantificarea antocianilor totali. Coninutul total de antociani a fost determinat
printr-o metod bazat pe proprietatea antocianilor de a-i schimba culoarea n funcie de
pH. Coninutul total de antociani monomerici (echivaleni cianidin 3-galactozid/100 mg
fruct proaspt) a fost calculat astfel:

coninutul de antociani (mg/L) = (A x MW x DF x 1000)/ x L,

unde A = (A510 nm pH 1.0-A700 nm pH 1,0) - (A510 pH 4.5 nm - A700 nm pH 4,5),


Masa molecular a cianidin 3-galactozidului (484.84); DF = factorul de diluie; =
absorbtivitatea molar a cianidin 3-galactozidului n metanol / HCl (34,300 M-1cm-1); L =
drumul optic (1 cm) (Giusti i Wrolstad, 2001).

IX
Rezumatul tezei de doctorat

Metoda antioxidant de neutralizare a radicalului ABTS. Principiul metodei


ABTS se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului ABTS+ de ctre antioxidani
(antociani), comparativ cu un antioxidant standard (analog al vitaminei E, Trolox).
Metoda antioxidant de reducere a ionului ferric (FRAP). Antioxidanii sunt
reductori ai Fe3+ la Fe2+, care este chelatat de ctre TPTZ (2,4,6-Tri (2-piridil)-s-triazin)
pentru a forma complex Fe2+ - TPTZ, ce absoarbe la lungimea de und de 593 nm
(Benzie i Stain, 1999).
Metoda antioxidant de reducere a ionului cupric (CUPRAC) a fost
determinat conform protocolului descris de Apak et al., 2004.
Metoda antioxidanta de evaluare a capacitii de neutralizare a radicalului de
oxigen (ORAC) se bazeaz pe capacitatea de inhibare a radicalului peroxil (Huang et al.,
2005).
Metoda de evaluare a potentialului de neutralizare a peroxidului de hidrogen
(HPS). Aceast metod a fost efectuat conform metodei raportate de Ruch et al., 1989.

REZULTATE I DISCUII
Analiza cantitativ HPLC a antocianilor
Analiza calitativ s-a realizat prin compararea timpilor de retenie i a spectrelor
UV-VIS a antocianilor din probelor luate n studiu cu cele ale standardelor (cianidin-3-
galactozid, cianidin-3-glucozid, delfinidin-3-ramnozid, pelargonidin-3-glucozid,
delfinidina, peonidin-3-glucozid, malvidin-3-glucozid, cianidin, malvidin), precum i cu
datele din literatur. Analiza cantitativ s-a realizat cu ajutorul curbelor de calibrare
obinute pentru standardul cianidin-3 glucozid. Coninutul total de antociani din aronia a
variat de la 290.69 mg / 100 g FW n AmA la 1319.18 mg / 100 g FW n AmN (Tabelul1).
In Fig. 2. sunt prezentate cromatogramele HPLC ale extractelor de aronia.

X
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 1
Derivaii cianidinei i coninutul lor din fructele de aronia (mg/100 g of FW), exprimai
n echivaleni ai cianidin 3-O-glucozidului
Table 1
Cyanidin derivatives and their determined content in chokeberries (mg/100 g of FW),
expressed as cyanidin-3-O-galactoside equivalents
Aronia
Compusul Ap AmA AmN AmV
mg/100g % mg/100g % mg/100g % mg/100g %
200.9 13
Cy-3-O-galactozid 576.7 18 a 67.1 a 69.1 906.9 20 a 68.7 271.5 10 a 67.7
Cy-3-O-glucozid 23.1 4 d 2.6 6.8 2 c 2.3 14.9 3 d 1.1 8.2 1 c 2.0
b b b b
Cy-3-Oarabinozid 209.5 12 24.3 68.1 7 23.4 352.4 15 26.7 108.2 11 27.0
c c c c
Cy-3-O-xylozid 49.9 9 5.8 14.7 3 5.0 44.8 8 3.4 12.6 4 3.1
TOTAL 859.41 100 290.69 100 1319.18 100 400.73 100
Clasificare 2 4 1 3
Not: valorile din aceeasi coloana notate cu litere diferita sunt statistic semnificative la P 0.05

n extractele obinute din fructele de Vaccinium sp. s-au identificat 13 antociani


(Fig. 3). n fructele de Vaccinium myrtillus, petunidin-3-glucozid i delfinidin-3-glucozid
reprezinta aproximativ 15% din coninutul de antociani. n Vaccinium corymbosum,
antocianul majoritar a fost peonidin-3-galactozid, absent nsa n varietatea BlueCrop.
(Tabelul 2).

XI
Rezumatul tezei de doctorat

A B

C D

Fig. 2. Cromatogramele HPLC ale extractelor de aronia Aronia melanocarpa var.


Nero (A), Aronia melanocarpa var. Viking (B), Aronia prunifolia (C) Aronia
melanocarpa var. Aron (D). Identificarea peak-urilor 1-cianidin 3-O-galactozid, 2-
cianidin 3-O-glucozid, 3- cianidin 3-O-arabinozid, 4- cianidin 3-O-xilozid
Fig. 2. HPLC chromatograms of chokeberry Aronia melanocarpa var. Nero (A),
Aronia melanocarpa var. Viking (B), Aronia prunifolia (C) Aronia melanocarpa var.
Aron (D). Peak identification 1-cyanidin 3-O-galactoside, 2- cyanidin 3-O-glucoside, 3-
cyanidin 3-O-arabinoside, 4- cyanidin 3-O-xyloside.

XII
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 2
Concentraiile de antociani din extractele de afine (mg/ 100 g FW), exprimate n echivaleni de cianidin 3-O-glucozid
Table 2
Anthocyanin concentrations in blueberry extracts (mg/100 g FW), calculated as cy-3-galactoside equivalent
Ordinea Afine
Compuii
eluie BlueCrop Wild 1 Wild 2 Elliot Duke
1. Delfinidin-3-galactozid 53.29 113.67 73.43 0.00 0.00
2. Delfinidin-3-glucozid 24.53 119.86 87.14 53.62 23.69
3. Cianidin-3-galactozid 9.96 91.85 37.95 0.00 0.00
4. Delfinidin-3-arabinozid 31.78 66.64 76.35 41.07 13.64
5. Cianidin-3-glucozid 2.08 96.48 43.34 3.09 0.11
6. Petunidin-3-galactozid 28.54 38.36 17.53 0.00 0.00
7. Petunidin-3-glucozid 25.14 146.27 85.19 21.35 8.18
8. Paeonidin-3-galactozid 0.00 8.71 0.00 125.79 37.11
9. Petunidin-3-arabinozid 12.70 12.80 9.66 0.00 0.00
10. Paeonidin-3-glucozid 54.37 108.81 28.91 12.14
11. Malvidin-3-galactozid 37.97 119.53 39.00 67.45 27.55
12. Malvidin-3-glucozid 34.75 17.51 6.04 0.00 0.00
13. Malvidin-3-arabinozid 0.00 tr tr 0.00 0.00
Total 315.11 940.50 504.55 312.38 122.43

XIII
Rezumatul tezei de doctorat

A B

C D

Fig. 3. Cromatogramele HPLC ale extractelor de afine: (A) Bluecrop, (B) Duke,
(C) Elliot, (D) Wild 1, (E) Wild 2. Identificarea peak-urilor: 1-Delfinidin-3-O-galacozid,
XIV
Rezumatul tezei de doctorat

2-Delfinidin-3-O-glucozid, 3-Cianidin-3-O-galactozid, 4-Delfinidin-3-O-arabinozid, 5-


Cianidin-3-O-glucozid, 6-Petunidin-3-O-galactozid, 7-Petunidin-3-glucozid, 8-Cianidin-
3-O-arabinozid, 9- Paeonidin-3-O-galactozid, 10-Petunidin-3-O-arabinozid, 11-Malvidin-
3-O-galactozid, 12-Malvidin-3-O-glucozid, 13-Malvidin-3-O-arabinozid

Fig. 3. HPLC chromatogram of blueberry extracts: (A) Bluecrop, (B) Duke, (C)
Elliot, (D) Wild 1, (E) Wild 2. Peak identification: 1-Delphinidin-3-O-galactoside, 2-
Delphinidin-3-O-glucoside, 3-Cyanidin-3-O-galactoside, 4-Delphinidin-3-O-arabinoside,
5- Cyanidin-3-O-glucoside, 6-Petunidin-3-O-galactoside, 7-Petunidin-3-glucoside, 8-
Cyanidin-3-O-arabinoside, 9- Paeonidin-3-O-galactoside, 10-Petunidin-3-O-arabinoside,
11-Malvidin-3-O-galactoside, 12-Malvidin-3-O-glucoside, 13- Malvidin-3-O-arabinoside

Coninutul total de polifenoli (TPC)


Coninutul total de polifenoli din probele de aronia variaz ntre 1586.5 - 2059.5
mg GAE/100 g FW, fiind apropiate de valorile raportate anterior n literatura de
specialitate. AmN a avut cel mai mare coninut de polifenoli totali n toate varietile
studiate. Rezultatul obinut pentru AmN 1756.4 mg GAE / 100 g FW a fost de dou ori
mai mare dect valorile raportate anterior pentru acelai cultivar, 690.2 mg GAE / 100 g
FW (Benvenuti et al., 2004).
Coninutul de polifenoli totali (TPC) al extractelor de afine analizate a variat de
424.84 pn la 819.12 mg GAE/100 g. FW. Dintre toate varietile analizate, Wild 1 s-a
dovedit a fi cel mai bogat n TPC (819.12 g echivaleni acid galic /100 FW), fiind urmat
de Wild 2 (672.59 mg GAE/100g). Dintre varietile cultivate, Bluecrop a avut cel mai
mare TPC (652.27 mg GAE/100g), n timp ce pentru varietatea Duke s-a nregistrat cea
mai mic valoare (424.84 mg GAE/100g). (Tabelul 3)
Coninutul total de flavonoide
Coninutul de flavonoide totale (TFC) obinut pentru varietile de aronia a variat
de la 47.67 mg / 100 g fw (Ap) la 75.53 mg / 100 g fw (AmN), (Tabelul 3). Coninutul
total de flavonoide din afine a variat de la 84.33 mg QE/100 g pentru varietatea Duke la
112.5 mg QE/100 g pentru Wild 2. Pentru celelalte varieti de afine TFC a fost dup
cum urmeaz: Wild 1 (110.36 mg QE/100 g), Bluecrop (103.18 mg QE/100 g), Elliot
(92.82 mg QE/100 g) i Duke (84.33 mg QE/100 g).

Coninutul total de antociani


Cu ajutorul unei metode simple pentru cuantificarea antociani monomerici totali
(TAC), s-a determinat coninutul de antociani din cele patru varieti de aronia: AmA,
AmN i AmV i Ap. Valorile au variat ntre 176 - 437 mg / 100g FW (Tabelul 3).
Cel mai mare coninut de antociani identificat in afine a fost determinat pentru
cultivarul Wild 1 (300.02 mg/100g), urmat de Wild 2 (252.23 mg/100g), Elliot (163.4

XV
Rezumatul tezei de doctorat

mg/100g), Bluecrop (160.76 mg/100g). Cu cel mai redus TAC a fost determinat pentru
varietatea Duke (69.58 mg/100g). Rezultatele au fost statistic semnificativ diferite (p
<0,05) pentru probele Wild 1, Wild 2 i Duke.

XVI
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 3
Polifenolii totali, flavonoidele totale i coninutul total de antociani din aronia, afine cultivate i cele din flora spontan
Table 3
Total polyphenol, total flavonoid and total anthocyanin content of chokeberry, wild and cultivated blueberries
Aronia Afine
Aprunifolia Aron Nero Viking Elliot Bluecrop Duke Wild 1 Wild 2
Polifenoli totali
GAE mg/100gr 2059.5 145.8 a 1586.5123.7 d
1756.4 136.4 b 1713 110.2 c 526.3 26d 652.27 30c 424.84 20e 819.12 36a 672.59 30

Flavonoide
totale
mg QE/100g 47.67 3.7 d 60.0 4.62 c 75.53 4.8 a 64.04 5.43 b 92.82 8.4a 103.18 10.2a 84.33 8 110.36 12.3a 112.50 15a

Antociani totali
C3GE mg /100g
366.16 1.4 b 176.18 19.4 d 437.40 6.9 a 277.13 25.1 c 163.40 16.4c 160.76 13.9c 100.58 13.5 300.02 27.9a 252.23 18b

Not: valorile din aceeasi coloana notate cu litere diferita sunt statistic semnificative la P 0.05
a) Exprimate n echivaleni acid galic (mg GAE/100g FW)
b) Exprimate n echivaleni quercetin (mg/100g FW)
c) Exprimate n echivaleni cianidin-3-galactozid (mg/100 g FW)

XVII
Rezumatul tezei de doctorat

Activitatea antioxidant

Potentialul de neutralizare asupra radicalului ABTS


Activitatea antioxidant a extractelor de aronia a variat ntre 95 i 180 mol Trolox/
g FW, date statistic semnificative s-au obinut pentru extractul din AmN. Dintre extractele
de afine analizate, Wild 1 a avut cea mai intens activitate antioxidant (56.65 mol TE /
g), ns cea mai redus activitate antioxidant fost obinut pentru varietatea Duke.

Metoda antioxidant de reducere a potenialului ionului feric (FRAP)


Rezultatele obinute pentru extractele de aronia i pentru cele de afine sunt
prezentate n Tabelul 4. Extractul din AmN a demonstrat a avea cel mai ridicat potenial
antioxidant (341.9 14.2 mol Fe2 + / g FW), urmat de Ap (300.2 10,6 mol Fe2 + / g
FW). Extractul din afinele Wild 1 a demonstat cea mai ridicat activitate antioxidant
(73.71 M Fe2 + / g), cel mai redus potenial antioxidant a fost demonstrat pentru varietatea
Duke. (Tabelul 5)

Potenialul antioxidant de reducere a ionului cupric (CUPRAC)


Varietile Ap i AmN au avut cele mai mari valori CUPRAC, mai mult de 200 mol
TE/g FW, valoril statistic diferite fa de cele obinute pentru soiurile AmA i AmV, 158.8,
respectiv 177.8 mol TE/g FW . Valorile CUPRAC pentru soiurile de afin au fost cuprinse
ntre 20.37 i 44.58 mol TE/g FW. Rezultatele obinute sunt prezentate n Tabelul 4 i 5.

Metoda capacitii radicalului de oxigen (ORAC)


Valorile ORAC pentru extractele de aronia au variat de la 35.3 la 42.3 mol Trolox/
g FW, iar pentru extractele de afine valorile obinute nu au fost semnificativ diferite ntre
probele analizate, variind ntre 34.85 - 38.49 mol Trolox/ g FW.

Efectul de neutralizare a peroxidului de hidrogen (HPS)


Valorile obinute pentru extractele AmV, AmN, AmA i Ap privind evaluarea
potenialului antioxidant au fost 61.9, 83.6, 53.3 i 65.0 H2O2 mol/ g FW (Talelul 4).
Varietatea AmN a demonstrat a avea cel mai mare potenial antioxidant comparativ cu AmV
care a nregistrat cel mai mic procent de inhibare a H2O2. Valorile obinute pentru
extractele obinute din fructele de afine au fost cuprinse ntre 25.30-44.37 mol TE/g.

XVIII
Rezumatul tezei de doctorat

Table 4
Activitatea antioxidant a extractelor din fructe de aronia, prin cinci metode complementare
Table 4
Antioxidant capacity of selected chokeberry cultivars, measured by different complementary assays. Details in
Materials and methods.
Aronia ABTS FRAPb CUPRACc ORACa HPSa WA d Rank
a

Ap 167.6 6.2a 300.2 10.6b 232.3 14.2a 42.3 2.0a 65.0 2.6b 1.10 2
AmA 95.9 7.3b 185 8.6c 177.8 9.6c 35.3 1.7c 53.3 1.5c 0.79 4
AmN 180.5 8.1a 341.9 14.2a 203.8 8.7b 37.1 1.3b 83.6 3.2a 1.15 1
AmV 171.7 6.8a 206.2 9.4c 158.8 8.3d 41.7 1.2a 61.9 1.9b 0.94 3
Media 153.9 258.4 193.2 39.2 66.0
Not: valorile din aceeasi coloana notate cu litere diferite sunt statistic semnificative la P 0.05
a) Exprimate n echivaleni Trolox (mol /g FW)
b) Exprimate n echivaleni Fe2+, (mol Fe2+/g FW)
c) Exprimate n echivaleni Cu2+, (mol Cu2+/g)
d) WA- calcul pentru media msuratorilor

XIX
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 5
Activitatea antioxidant a extractelor din fructe de afine, prin trei metode
complementare (FRAP, ABTS, ORAC)
Table 5
Antioxidant activity for blueberry fruits, using three different complementary assays
(FRAP, ABTS, ORAC)
FRAP ABTS ORAC
M Fe2+/g TEmol /g TE mol/g

Vaccinium corymbosum

Elliot 50.74 1.9c 36.46 4.26c 38.051.56a


Bluecrop 60.39 1.6b 37.96 2.98bc 37.04 1.7a
Duke 33.03 2.54d 24.33 3.76d 34.85 1.3b

Vaccinium myrtillus
Wild 1 73.71 3.2a 56.65 3.79a 38.49 1.01a
Wild 2 64.87 2.9b 43.08 2.3b 37.78 0.89a

CONCLUZII

In urma studiului comparativ al profilului metabolic a unor varietati de Aronia


melanocarpa i Vaccinium sp. concluzionam:
1. Extractul de Aronia melanocarpa "Nero' a fost cel mai bogat n polifenoli,
flavonoide i antociani, rezultat obtinut in urma analizei HPLC. Cianidininele glicozilate
sunt antocianii majoritari n fructele de aronia, n particular cianidin 3-O-galactozidul i
cianidin-3-O-arabinozidul.
2. Extractul de afine Wild 1 a prezentat valori ridicate n ceea ce privete coninutul
total de polifenoli, flavonoide i antociani. Antocianii majoritari din Vaccinium myrtillus au
fost delfinidina i petunidina, n timp ce n Vaccinium corymbosum a fost delfinidina i
malvidina.
3. Concentraia de polifenoli totali din extractele de aronia a variat ntre 1586.5 -
2059.5 mg/ g FW. Cel mai scazut coninut de compui fenolici a fost determinat pentru
varietatea Duke, n timp ce cea mai mare coninut de compui fenolici n a fost determinat
n Wild 1.
4. Capacitatea antioxidant a extractelor analizate, determinat prin cinci metode
complementare (ABTS, HPS, ORAC, FRAP, CUPRAC), a fost corelat pozitiv cu
coninutul total de antociani. Coeficientul Pearson pentru extractele de afine a fost mai
mare in urma comparatiei comparatiei metodelor antioxidante ABTS si CUPRAC (0.96), in

XX
Rezumatul tezei de doctorat

timp ce pentru extractele de aronia in urma comparatiei intre metoda antioxidanta HPS si
continutul total de antociani valoarea coeficientului a fost de 0.97.
In urma rezultatelor obtinute putem afirma ca fructele de aronia i afine (de cultura
si din flora spontana) din Romania sunt o surs bogat de antociani si au o capacitate
antioxidanta ridicata. Afinele din flora spontana conin o cantitate ridicat de antociani,
implicit i o activitate antioxidant mai mare, dect cele de cultur.

XXI
Rezumatul tezei de doctorat

CAPITOLUL II.
EVALUAREA PURITII FRACIILOR BOGATE N OBINUTE DIN
FRUCTE DE ARONIA I AFINE FOLOSIND DIFERITE METODE DE
EXTRACIE N FAZ SOLID

Scopul acestui studiu a fost evaluarea i compararea puritatii fraciilor bogate n


antociani obinute din extractul crud de afine si aronia, prin tehnica SPE folosind coloanele
C18 Sep Pack, Oasis-MCX, i Amberlit XAD-7 & Sephadex LH-20. Cromatografia de
lichide de nalt performan cuplat cu spectrometria de mas i absorbtivitatea molar au
fost utilizate pentru a determina puritatea fraciei bogate n antociani.

MATERIALE I METODE
Extracia antocianilor s-a realizat cu ajutorul metodei raportate de Abdel-Aal (2003),
cu unele modificri minore.

Obinerea fraciei bogate n antociani


Pentru obinerea fraciei bogate n antociani s-a utilizat extracia n faz solid
(SPE), fiind o metoda simpl, eficient, care nu implic un cost ridicat i nu necesit
echipamente sofisticate (Xiaoke i Zhimin, 2011).
Coloane C18 Sep Pack. Sorbentul C18 este cel mai eficient i frecvent utilizat n
purificarea antocianilor. Mecanismul de purificare include o faz staionar nepolar i o
faz mobil polar (Rodriguez-Saona i Wrolstad, 2001).
Oasis-MCX. Principiul acestei coloane combin schimbul cationic cu interaciunea
faz-inversat. Acest tip de coloan a fost pentru prima dat utilizat de ctre He i Giusti
(2011), n scopul de purifica antociani din surse diferite.
Amberlite XAD-7 i Sephadex LH-20. n acest caz, purificarea antocianilor s-a
realizat utiliznd dou coloane diferite. Prima purificare s-a realizat pe Amberlit XAD-7,
iar extractul obinut a fost ncrcat ulterior ntr-o alta coloana Sephadex LH-20.

Evaluarea puritii
Analiza HPLC-PDA i MS s-a realizat cu ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat
cu detecie cu fotodiod i cu detector SPD-M20A PDA. Sistemul Shimadzu LCMS-2010
EV (Shimadzu instrumente tiinifice, Inc, Columbia, MD ), echipat cu un detector de SPD-
M20A PDA, monoquadrupol cu ionizare electronic de pulverizare (ESI) cu detector MS a
fost utilizat pentru identificarea antocianilor. S-a folosit pentru separarea antocianilor
coloana C18 Waters Corp (3.5m, 4.6150mm; Milford, MA). Faza mobil utilizata a fost
acid formic 4,5% n ap, respectiv acetonitril.
Absorbtivitatea molar. Puritatea antocianilor a fost mai nti verificat cu ajutorul
tehnicii HPLC-PDA, ulterior cu ajutorul absorbtivitatii molare. Calculul puritii
XXII
Rezumatul tezei de doctorat

antocianilor s-a realizat conform legii lui Lambert-Beer, folosind factorul de extincie al
cyanidin 3 glucozidului.

(Conc. Experimental/ Conc actual)*100)

REZULTATE I DISCUII

Evaluarea puritii prin metoda HPLC-PDA


Patru tipuri de sorbeni au fost utilizai pentru purificarea antocianilor. Puritatea cea
mai ridicat (%AUC) pentru aronia a fost obinut n urma utilizrii coloanei Oasis MCX
(97,7% 2,0), fiind urmat de puritatea obinut n urma utilizrii coloanei C18 (93,3%
2,8). Puritatea cea mai redus a fost obinut pentru complexul de coloane Amberlite XAD-
7 & Sephadex LH-20 (82,6% 4.3). Puritatea fraciile bogate n antociani obinute din
afine, calculat pentru cei trei sorbeni a avut valori cuprinse 99,9% 1,975.90% 4,8.
Figura 44 i 45 se observa procentul puritii pentru fiecare din fraciile bogate n
antociani obinute din aronia i afine.

Fig. 4. Evaluarea puritii prin metoda HPLC-PDA a antocianilor obinuti din aronia
(A) i afine (B) utiliznd trei metode SPE: C18, Oasis MCX, Amberlite XAD-7&Sephadex
LH20
Fig. 4. Purity evaluation by HPLC-PDA of chokeberry (A) and blueberry (B) ARFs
using three different SPE methods: C18, Oasis MXC, Amberlite XAD-7& Sephadex LH-
20

XXIII
Rezumatul tezei de doctorat

A B

Fig 5. Cromatogramele HPLC-PDA max-plot ale extractelor obinute din Aronia (A) i afine (B), utiliznd trei
metode SPE: C18, Oasis MCX, Amberlite XAD-7& Sephadex LH-20
Fig. 5. HPLC-PDA max-plot of purified chokeberry(A) and (B) extracts using three different SPE methods: C18,
Oasis MXC, Amberlite XAD-7& Sephadex LH-20

XXIV
Rezumatul tezei de doctorat

Evaluarea puritii cu ajutorul absorbtivitii molare


Absorbtivitatea molar este metod spectrofotometric utilizat pentru calcularea
puritii unor soluii, avnd la baza legea Lambert-Beer.
Pentru extractele din fructe de aronia, puritatea cea mai ridicat obinut prin aceast
metod a fost cea pentru fracia obinut prin coloana Oasis-MCX (79.18%), urmat de
fraciile purificate pe coloanele C-18 Sep Pack (63.39%), respectiv Amberlite XAD-7 &
Sephadex LH-20 (72.46%). Pentru extractele din fructe de afine, puritatea cea mai ridicat
calculat a fost pentru fracia obinut prin coloana pentru Oasis MCX (78,2%) urmat
fracia purificat pe coloanele C18 Sep Pack, respectivAmberlite XAD-7 & Sephadex LH-
20 (68,3%, 59,8%) (Fig. 6).
Valorile calculate pentru evaluarea puritii prin aceast metod au fost mai mici
dect valorile raportate anterior, obinute prin metoda HPLC.

Fig 6. Evaluarea puritii prin metoda absorptivitii molare a antocianilor obtinui


din aronia (A) i afine (B) utiliznd trei metode SPE: C18, Oasis MCX i Amberlite XAD-
7& Sephadex LH-20
Fig. 6. Purity evaluation of chokebery (A) and bluebery (B) ARFs by molar
absorptivity, using three different SPE methods: C18, Oasis MXC, Amberlite XAD-7&
Sephadex LH-20
Compararea metodelor SPE
Puritatea extractelor obinute din aronia si afine a fost mai mare pentru sorbentul
Oasis MCX (> 97%), dect pentru ceilali sorbeni. Eficiena sorbentului const n
capacitatea acestuia de a elimina compuii nedorii.

Compararea metodelor de evaluare a puritii


Datele obinute n urma evalurii purittii prin metodele HPLC-PDA i
absorbtivitii molare sunt semnificative din punct de vedere statistic. Dei cea mai

XXV
Rezumatul tezei de doctorat

eficient i acurat este tehnica HPLC, n anumite cazuri absorbtivitatea molar este
tehnica ce poate fi utilizat. De exemplu poteniale impuriti, cum ar fi acizii sau diferite
sruri nu se pot detecta prin HPLC-DAD folosind un singur protocol, nsa ar putea fi
determiate ca impuriti prin metoda absorbtivitii molare.

Confirmarea puritii prin analiza HPLC-MS


In Figura 7 este prezentat concentraia de ioni din extractele purificate din aronia i
afine totali i monitorizate de un detector MS.

XXVI
Rezumatul tezei de doctorat

A B
Fig. 7. Impuritile nregistrate i evideniate prin zgomotul peak-urilor n cromatograma MS pentru fraciile bogate n
antociani obinute din aronia (A) i afine (B) utiliznd trei tipuri coloane SPE: C18, Oasis MCX, Amberlite XAD-7&
Sephadex LH-20
Fig. 7. Impurities recorded in chokeberry (A) and blueberry (B) ARF by the appearance of noise peaks in the MS
chromatogram using three different SPE columns C18, Oasis MXC, Amberlite&Sephadex

XXVII
Rezumatul tezei de doctorat

CONCLUZII
Trei metode SPE (C18, Oasis-MCX Amberlite XAD-7& Sephadex LH-20) au fost
utilizate pentru obtinerea fraciilor bogate n antociani din aronia i afine. Sorbentul Oasis
MCX s-a dovedit a avea eficacitate mai mare dect celelalte metode SPE folosite pentru
obinerea extractelor bogate n antociani. Acest fapt poate fi explicat prin adsorbia i
desorbia antocianilor pentru sorbentul Oasis-MCX, influentata de pH-ul si de ncrctura
electric electrica a acestora. Antocianinii, molecule ncarcate pozitiv interacioneaz cu
sorbentul Oasis-MCX puternic schimbtor de cationi, n timp ce ali compui, nencrcai
pozitiv si care nu raman legati de sorbent pot fi ndeprtati cu uurin.
Valorile obinute prin metoda HPLC pentru extractele de aronia au variat ntre
97,7% si 82,6%, pentru coloana Oasis MCX, respectiv Amberlite XAD-7 & Sephadex LH-
2, iar pentru extractele afine valorile obinute au variat ntre 99,9% si 75.90% pentru
coloana Oasis MCX, respectiv Amberlit XAD-7 & Sephadex LH-20.
Puritatea cea mai mare pentru extractele din aronia s-a obinut prin purificarea pe
coloana Oasis MCX fa de puritatea obinut n urma purificrii pe celelalte coloane,
Amberlite XAD-7 & Sephadex LH-20, respectiv C-18 Sep Pack. Puritatea cea mai mare
pentru extractele de afine a fost mai mare n urma purificrii pe coloana Oasis MCX, fa
de C18 Sep Pack i Amberlit XAD-7 & Sephadex LH-20.

XXVIII
Rezumatul tezei de doctorat

CAPITOLUL III
EFECTELE CHEMOPROTECTOARE ALE FRACIEI BOGATE N
ANTOCIANI DIN ARONIA PRUNIFOLIA PE LINIA UMAN DE CANCER
CERVICAL HELA I PENTRU LINIA B16F10 MELANOM METASTATIC

Scopul acestui experiment a fost evaluarea aciunii citotoxice i a efectului


prooxidativ al fraciei bogate n antociani pe linii de celulare tumorale HeLa, respectiv
B16F10.
MATERIALE I METODE
Obinerea fraciei bogate n antociani. Fructele de analizat (5 g) au fost
omogenizate cu metanol coninnd HCl (0,3%), cu ajutorul unui ultraturax (Miccra D-9 KT
Digitronic, Germania). Extractele au fost concentrate la 350 C sub presiune redus
(Rotavapor R-124, Buchi, Elveia. Extractul apos rmas n urma evaporrii a fost ncrcat
n coloana C18 Sep-Pak (5ml, 1g sorbent) Waters Corp Milford. MA). Purificarea s-a
realizat cu protocolul descris de Giusti et al, (1999).
Protocol HPLC PDA. Analizele HPLC au fost efectuate cu ajutorul unui sistem
Shimadzu, echipat cu detecie cu fotodiod. S-a folosit o coloan Luna Phenomenex C-18
(5m, 25 cm x 4,6 mm) si faze mobile continand acid formic (4.5%) n ap bidistilat i
acetonitril.
Manipularea culturii celulare. Linia celular tumoral uman de col uterin HeLa a
fost cultivat n mediu Dulbecco Eagle Medium, suplimentat cu ser fetal 10%, 1 mM
glutamin, 1% gentamicin, 1% aminoacizi non-esseniali la o temperatur de 37C, 5%
CO2, i umiditate relativ 90%. Celulele metastatice B16F10 de melanom au fost cultivate
n mediu Dulbecco Eagle modificat (MDEM) coninnd 1g / L, ser fetal bovin 10%, 1
glutamin, 1% penicilin/streptomicin la 370C, 5% de CO2, iar umiditatea relativ de
95%. Dup atingerea confluenei, celulele au fost tripsinizate i nsmnate n vase de
cultur si lsate s adere de vas pentru 24 de ore, dup cum urmeaz 5 x 103 celule/godeu
pentru HeLa i 8x103 celule/godeu pentru linia celular B16F10. Mediul de cultur a fost
apoi nlocuit cu mediu complet coninnd concentraii cuprinse ntre 0 - 250 g/ml
antociani pentru HeLa i 0 la 600 g/ml antociani pentru B16F10.
Metoda proliferarri celulare dup tratamentul cu extractul bogat n antociani a
fost evaluat prin metoda MTT.
Metoda determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului. Metoda
determinrii nivelului speciilor reactive de oxigen (ROS) se bazeaz pe oxidarea 2,7-
dichlorodihidrofluorescein (DCHF) de ctre speciile reactive de oxigen generate
intracelular cu formarea compusului fluorescent 2,7-diclorofluorescein (DCF), a crei
fluorescen a fost nregistrat cu ajutorul unui cititor de plci.

XXIX
Rezumatul tezei de doctorat

REZULTATE I DISCUII
Identificarea si cuantificarea antocianilor prin analiza HPLC-PDA. Dup
fiecare purificare fracia bogat n antociani obinu a fost dizolvat ntr-o cantitate
cunoscut de ap steril apoi filtrat prin filtru de 0.45m i analizat prin HPLC-DAD.
Soluia stoc obinut a fost diluat cu mediu de cultur n diferite concentraii cuprinse ntre
250-800 g cianidin-3-glucozid/mL. Cromatograma extractului obinut este prezentat n
Fig. 8.

Fig. 8. Cromatograma HPLC a extractului purificat din aronia

Fig. 8. HPLC chromatogram of purified chokebery extract


Efectele induse de fracia bogat n antociani asupra proliferrii celulelor
tumorale B16F10 i HeLa

Viabilitatea celular este exprimat ca procent din control, considerat 100%.


Tratamentul cu fracia bogat n antociani a inhibat proliferarea celulelor HeLa cu 40% la o
concentraie de 200 g/ml dup 48 de ore (Fig. 9A), exprimat n echivaleni cianidin 3-O-
galactoside, respectiv 51%, la o concentraie de 400 g/ml dup 24 de ore pentru linia
celular B16F10 (Fig. 9B). De asemenea, morfologia celulelor a fost alterat i poate fi
observat n Figura 10.

XXX
Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 9. Rezultatele testului MTT de proliferare celulara (proliferare%) pentru linia


uman de cancer cervical HeLa (A) i pentru linia B16F10 (B) melanom metastatic dupa
tratamentul cu C-ARF

Fig. 9. Results of MTT proliferation assay (proliferation %) of human cervical


cancer HeLa (A) and of B16F10 (B) metastatic murine melanoma cells -treated cells by C-
ARF

XXXI
Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 10. Comparaie ntre morfologia celulelor B16F10 tratate i netratate cu extract
bogat n antociani
Fig. 10. Comparative morphology of B16F10 cells non-treated and treated with
anthocyanin-rich fraction
Determinarea nivelului speciilor reactive ale oxigenului
Pentru a determina generarea ROS n celulele HeLa i B16F10 tratate cu fracia
bogat n antociani s-a fost folosit 2 `, 7` dichlorodihydrofluorescein, marker specific
pentru detectarea peroxidului de hidrogen. O suprimare semnificativ a producerii ROS a
fost observat pentru celulele B16F10-tratate cu urmtoarele concentraii: 200, 300, 400 g
/ ml (Fig. 11A).
S-a observat de asemenea o cretere semnificativ dependent de timp i doz dup
30 de minute de la tratament n celule HeLa (fig. 11B). O reducere iniial a ROS a fost
remarcat pentru concentraiile de 25 g/mL and 50 g/mL cianidin-3-glucozid dup 4 h.
Pentru concentraiile 100, 150, i 200 g/mL cianidin-3-glucozid, nivelul ROS a fost
crescut fa de control dup 30 de minute, nsa nivelul de ROS acumulat a fost redus treptat
n timp. Este posibil ca aceast cretere a stresului oxidativ, s fi fost responsabil de
moartea celulelor.

Fig. 11. Nivelul speciilor intracelulare reactive de oxigen n celulele metastatice


B16F10 de melanom murin tratate cu antociani obtinui din aronia determinate cu testul
florescent 2,7-diclorofluoresceina (DCF). In celulele tratate cu extract de aronia s-a
observat o cretere a intensitii florescenei comparativ cu cele netratate. Datele sunt
exprimate ca medieSD (n=3), **P<0.01 (foarte semnificativ) fa de control, ***P<0.001
(extrem de semnificativ) fa de control.
Fig. 11. Intracellular reactive oxygen species level in human cervical cancer HeLa
(A) and B16F10 (B) metastatic murine melanoma cells cells treated with chokeberry
anthocyanins, as determined by the fluorescence test with 2,7-dichlorofluorescein (DCF).
The cells treated with chokeberry extract showed increased fluorescence compared with
untreated cells. Data are meanSD values (n=3), **P<0.01 (very significant) from
corresponding control, ***P<0.001 (extremely significant) from corresponding control.

XXXII
Rezumatul tezei de doctorat

CONCLUZII
Studiile in vitro, pe culturi celulare umane pe cancer de col uterin HeLa i celulele
B16F10 melanom metastatic murin au demonstrat c cianidinele glicozilate purificate din
Aronia prunifolia inhib proliferarea celulelor tumorale dup 24 de ore, respectiv 48 de ore
de tratament i induce generarea de ROS.

1. Morfologia celulelor tumorale utilizate n acest experiment s-a modificat n


funcie de concentraia i durata tratamentului.
2. Extractul bogat n antociani a inhibat proliferarea celulelor tumorale HeLa, la o
valoare IC50 de 171g/ml, n timp ce pentru linia tumoral B16F10 IC50 a fost 313 g/ml.
3. Speciile intracelulare reactive de oxigen, determinate prin metoda fluorescent cu
2 ', 7'-diclorofluorescein (DCF), n celulele tratate cu extract de aronia fluorescen au
crescut n comparaie cu celulele netratate, indicnd efectul proapoptotic prin acumularea
ROS n cele doua linii celule tumorale.
Antocianii din aronia pot aciona ca ageni antitumorali, astfel aceste fructe pot fi
recomandate pentru consumul zilnic.

XXXIII
Rezumatul tezei de doctorat

CAPITOLUL IV
DETERMINAREA ANTOCIANILOR DIN DIFERITE SOIURI DE AFINE I
PROPRIETILE LOR ANTIPROLIFERATIVE I PROAPOPTOTICE N
CELULELE DE MELANOM METASTATIC MURIN B16F10

Scopul principal al acestui studiu a fost de a investiga potenialul protectiv al


antocianilor din afine pe celule de melanom murin de oarece. Obiectivele acestui studiu au
fost de a cuantifica i identifica antocianii individuali din diferite soiuri de afine romneti
i de a evalua potenialul lor antioxidant, cu scopul de a selecta cea mai bogat surs de
antociani, cu cea mai mare activitate antioxidant i de a-l testa pentru evaluarea inhibrii
proliferarrii celulare i a efectului proapoptotic asupra celulelor B16F10 metastatice de
melanom murin.

MATERIALE I METODE
Pregtirea fraciei bogate n antociani.
apte soiuri de afine Bluegold, Nui, Darrow, Legacy, Nelson, Hannahs Choice h au
fost omogenizate cu metanol coninnd HCl (0,3%), cu ajutorul unui ultraturax (Miccra D-
9 KT Digitronic, Germania), apoi depozitate la 4 C n ntuneric timp de 24 de ore.
Extractul obinut a fost filtrat prin hrtie de filtru de mai multe ori, apoi concentrat prin
evaporare la 350 C pentru a elimina metanolul. Extractul, coninnd att antociani ct i ali
compui ce au fost ndepartai prin partiia cu acetat de etil. Fracia apoas obinut a fost
apoi aplicat pe o coloana cromatografic de Amberlite XAD-7 (1 x 0,5 cm), apoi
purificat pe o coloana LH-20 Sephadex (2,5 x 0,5 cm).
Protocolul analizei HPLC PDA.
Analizele HPLC au fost efectuate cu ajutorul unui sistem Shimadzu, echipat cu
detecie cu fotodiod. S-a folosit o coloan Luna Phenomenex C-18 (5m, 25 cm x 4,6
mm) i faze mobile coninnd acid formic (4.5%) n ap bidistilat i acetonitril.
Protocolul analizei HPLC-ESI-MS.
Probele au fost analizate cu ajutorul unui sistem Agilent Technologies 1200 HPLC
de sistem (Chelmsford, MA, USA) dotat cu pomp cuaternar G1311A, degazor G1322A,
autoinjector G1329A, foto-diod G1315D (PDA), detector i spectrometru de masa
cuadrupolar 6110 (Agilent Technologies, Chelmsford, MA , USA) echipat cu ESI. Faza
mobil a constat n solvent A-(acid formic 1% n ap bidistilat) i solvent B - (acetonitril).
Metoda de evaluare a potenialului antioxidant de reducere a ionului cupric
(CUPRAC).
Pentru evaluarea potenialul antioxidant de reducere a ionului cupric a extractelor de
afine s-a folosit o metoda raportat de Apak et al., (2007). Absorbana a fost citit utiliznd

XXXIV
Rezumatul tezei de doctorat

un spectrofotometrul JASCO V-630 (International Co, Ltd., Japonia), la 450 nm fa de


control. O curb standard a fost realizat folosind diferite concentraii Trolox, iar
rezultatele au fost exprimate ca mol Trolox/ g FW.
Efectul de neutralizare asupra radicalului ABTS. Aceast metod descris de
Arnao et al. (2001), se bazeaz pe capacitatea de neutralizare a radicalului ABTS+ de ctre
antioxidani, comparativ cu un antioxidant standard (Trolox).
Metoda capacitii de neutralizare a radicalului de oxigen (ORAC). Capacitatea
antioxidant a fost elaborat conform celei descrise anterior de Huang et al., 2005. Valorile
ORAC au fost exprimate ca mol Trolox /g FW.

Manipularea culturii celulare


Linia celular B16F10 de melanom metastatic murin a fost obinut de la American
Type Culture Collection (Rockville, MD, USA). Celulele B16F10 au fost cultivate n
DMEM suplimentat cu 1 g/l glucoz, 10% FBS, 2 mM glutamin, penicilin i 1%
streptomicin, 0,1% amfotericin. Celulele au fost cultivate ntr-o atmosfer umed, 5% CO2
la 370C. Pentru analiza microscopic, celulele au fost cultivate pe lame de sticl.

Analiza de proliferarea a celulelor


Testul de proliferarea celular s-a realizat cu ajutorul reactivului MTT. Rezultatele
au fost exprimate ca rat de supravieuire n raport cu un martor netratat.

Metoda determinarea activitii lactatdehidrogenazei (LDH)


Deteriorarea membranei plasmatice a fost evaluat n celulele B16F10 prin
msurarea creterii LDH. Valorile absorbanei au fost nregistrate la 490 nm, folosind un
cititor de microplci BioTek Synergy HT (BioTek Instruments Inc,USA) i au fost corelate
cu activitatea LDH n raport cu celulule netratate.
Protocolul de colorare celulara cu EB / AO n plci cu 96 godeuri
n scopul de a evalua indicele apoptotic i integritatea membranei celulare, s-a
efectuat colorarea cu portocaliu de acridin (AO)/bromur de etidiu (EB). Celulele aflate n
apoptoz timpurie au nucleu colorat verde deschis, cu cromatina condensat sau
fragmentat i celulele aflate n apoptoz trzie sunt colorate n portocaliu i prezint
cromatina condensat i nucleul fragmentat. Celulele care au murit prin necroz au nucleu
colorat rou (Ribble et al., 2005).

Analiza testul TUNEL


Pentru aceasta analiz celulele tumorale aderente B16F10 au fost fixate cu 4%
paraformaldehid timp de 15 min. Lamele au fost pregtite pentru testul TUNEL folosind
kitul Red In Situ Apoptosis Detection (Chemicon, Millipore, USA). Nucleii au fost colorai
i numarai cu in urma coloratiei cu 5 mM Draq5 1:1000 diluat n ap distilat timp de 5

XXXV
Rezumatul tezei de doctorat

minute la temperatura camerei. Imaginile fluorescente au fost surprinse cu un microscop


confocal de scanare cu laser (Zeiss LSM 710).

REZULTATE I DISCUII

Identificarea i cuantificarea antocianilor din afine


Pn n prezent nu au fost raportate studii privind identificarea si cuantificarea
antocianilor din dou varieti de afine folosite n acest studiu, Nui i Hannah 'Choice.
Chromatogramele HPLC ale probelelor analizate sunt prezentate n Fig. 12. n total, 12
antociani au fost identificai (Tabelul 7). Pe baza datelor din literatur privind ordinea de
eluie s-au identificat urmtorii derivai ai antocianilor: galactozid, glucozid i arabinozid
(Gavrilova et al, 2011.). Fragmentarea derivailor delfinidinei n MS a dus la formarea
agliconului de delfinidin (m / z = 303 [M + H] +). Prezena semnalului 162 indic un
galactozid sau glucozid n cazul compuilor 1 i 2, iar prezena semnalului 132 indic un
arabinozid pentru compusul 4.

A B

C D

XXXVI
Rezumatul tezei de doctorat

E F

G
Fig. 12. Cromatogramele HPLC ale extractelor de afine: (A)Bluegold, (B) Nui, (C)
Darrow (D)Nelson, (E) Hanna`s Choice, (F) Toro, (G) Legacy. Identificarea peak-urilor: 1-
Delfinidin-3-O-galactozid, 2-Delfinidin-3-O-glucozid, 3-Cianidin-3-O-galactozid, 4-
Delfinidin-3-O-arabinozid, 5- Cianidin-3-O-glucozid, 6-Petunidin-3-O-galactozid, 7-
Cianidin-3-O-arabinozid, 8- Paeonidin-3-O-galactozid, 9-Petunidin-3-O-arabinozid, 10-
Malvidin-3-O-galactozid, 11- Malvidin-3-O-glucozid, 12- Malvidin-3-O-arabinozid
Fig.12. HPLC chromatogram of blueberry extracts: (A)Bluegold, (B) Nui, (C)
Darrow (D)Nelson, (E) Hanna`s Choice, (F) Toro, (G) Legacy. Peak identification: 1-
Delphinidin-3-O-galactoside, 2-Delphinidin-3-O-glucoside, 3-Cyanidin-3-O-galactoside, 4-
Delphinidin-3-O-arabinoside, 5-Cyanidin-3-O-glucoside, 6-Petunidin-3-O-galactoside, 7-
Cyanidin-3-O-arabinoside, 8- Paeonidin-3-O-galactoside, 9-Petunidin-3-O-arabinoside, 10-
Malvidin-3-O-galactoside, 11- Malvidin-3-O-glucoside, 12- Malvidin-3-O-arabinoside

Datele privind coninutul de antociani individuali din probele analizate sunt


prezentate n Tabelul 8. Cel mai mare coninut de antociani a fost gsit n varietatea Toro

XXXVII
Rezumatul tezei de doctorat

(195.01 mg / 100g FW), urmat de Legacy, n timp ce cea mai mic cantitate a fost obinut
pentru varietatea Bluegold (101.88 mg / 100g FW). Delfinidin-3-O-galactozidul (peak 1) a
fost identificat ca fiind compusul majoritar din varietatea Toro i minoritar n varietatea
Bluegold, n timp ce malvidin-3-O-galactoside (peak 10) a fost identificat ca fiind unul
dintre compuii majoritari n Toro, Bluegold, Legacy, Nelson i n cantitate acazut n
varietatea Hannah`Choice . Malvidin-3-O-galacozidul a fost antocianul majoritar urmat de
delfinidin-3-O-galactozid i petunidin-3-O-galactozid, care mpreun reprezint mai mult
de 56% din toi antocianii.

XXXVIII
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 6
Timpii de renie i caracteristicile spectofotometrice ale antocianilor obinui din afine
Table 6
Retention times, UV-Vis and mass spectral data of anthocyanins in analyzed ARF samples obtained from blueberry cultivars
Molecular Fragment
Peak tR max (m/z) MW Compusul
(m/z)
An 1 8.1 276, 526 465 303 465 Definidin-3-O-galactozid
303
An 2 9.3 276, 524 465 465 Definidin-3-O-glucozid

An 3 11.2 279, 517 449 287 449 Cianidin-3-O- galactozid

An 4 11.5 276, 524 435 303 435 Delfinidin-3-O-arabinozid


287
An 5 12.9 280, 517 449 449 Cianidin-3-O- glucozid

An 6 13.6 276, 526 479 317 479 Petunidin-3-O- galactozid

An 7 15.2 279, 517 419 287 419 Cianidin-3-O-arabinozid


301
An 8 18.0 276, 526 463 463 Paeonidin-3-O- galactozid

An 9 18.2 276, 526 449 317 449 Petunidin-3-O-arabinozid

An 10 20.5 276, 527 493 331 493 Malvidin-3-O- galactozid


331
An 11 23.4 276, 526 493 493 Malvidin-3-O- glucozid

An 12 26.3 276, 528 463 331 463 Malvidin-3-O-arabinozid

XXXIX
Rezumatul tezei de doctorat

Tabel 7
Antocianii din fructele de afine determinai prin metoda HPLC-DAD.
Table 7
The anthocyanin content in blueberries determined by HPLC-DAD.
Vaccinium corymbosum L. (mg per 100 g FW

Compusul
Hannah s
Peak Bluegold Nui Darrow Legacy Nelson Toro
Choice

Antociani totali 101.88 2.36 150.27 2.01 168.50 2.95 189.26 2.70 161.31 4.66 147.12 2.21 195.01 2.65

An 1 Definidin-3-O-galactozid 9.51 3.29e 12.50 1.06e 29.55 1.10c 50.41 6.27a 36.52 1.48b 21.23 5.67d 35.57 4.36b

An 2 Definidin-3-O-glucozid 3.64 0.15de 23.76 1.95a 14.05 1.58b 4.37 0.35cd 3.65 1.65de 3.00 0.87e 5.01 0.17c

An 3 Cianidin-3-O-galactozid 6.17 0.01c 7.62 1.77c nd 19.00 0.84a 11.64 5.12b 7.29 0.77c 13.72 1.45b

An 4 Definidin-3-O-arabinozid 5.61 1.46e 12.78 1.99cd 28.34 0.79a 19.32 6.27b 17.47 7.27bc 9.33 0.45de 14.79 3.85bc

An 5 Cianidin-3-O-glucozid 3.33 0.18b 13.91 5.68a 4.73 0.64b 3.53 0.39b 3.17 1.34b 2.65 0.32b 3.68 0.50b

An 6 Petunidin-3-O-galactozid 10.78 3.84d 7.22 0.67d 20.52 9.84bc 25.28 4.23ab 21.22 7.58bc 19.94 5.43c 27.85 3.43a

An 7 Cianidin-3-O-arabinozid 4.68 0.05e 21.78 1.54a 13.78 0.19b 9.16 1.28c 6.88 3.07d 4.50 0.65e 6.09 0.95de

An 8 Paeonidin-3-O-galactozid 4.92 0.28bc 3.08 0.47c nd 5.14 0.28ab 4.49 2.15b 3.93 0.78bc 6.27 0.30a

An 9 Petunidin-3-O-arabinozid 5.97 1.33c 6.02 0.89c 12.02 1.31b 10.31 2.54bc 9.74 3.55bc 48.73 8.99a 9.97 1.73bc

An 10 Malvidin-3-O-galactozid 29.33 12.69b 11.95 2.21de 19.18 6.14cd 25.66 5.74bc 28.44 4.91b 4.30 0.88e 48.33 12.77a
An 11 Malvidin-3-O-glucozid 4.43 0.56d 24.66 3.63a 13.17 2.76c 4.42 0.17d 4.31 1.80d 19.93 1.23b 5.21 0.93d

An 12 Malvidin-3-O-arabinozid 13.53 4.43b 5.01 2.28c 13.15 5.11b 12.67 4.06b 13.78 2.62b 2.29 0.56c 18.53 1.86a

Datele sunt exprimate ca medie SD, n=3. Literele diferite intre coloane denota diferenta statistica la p < 0.05; nd -nedetectat

XL
Rezumatul tezei de doctorat

Determinarea activitii antioxidante


Activitatea antioxidant a extractelor din afine bogate n antociani a fost determinat
folosind trei metode, CUPRAC, ABTS i ORAC, iar rezultatele obinute au fost exprimate
n echivaleni Trolox (mol TE/ g FW) (Tabel 8).
Rezultatele obinute prin metoda CUPRAC pentru varietile de afin au variat ntre
134.76 i 185.78 mol TE/ g FW, iar activitatea antioxidant cea mai ridicat s-a nregistrat
pentru varietatea Toro. n prezent, nu exist date publicate privind activitatea antioxidant a
extractelor de afine prin metoda CUPRAC.
Metoda ABTS folosete K2S2O8 ca oxidant i msoar capacitatea antioxidanilor de
a neutraliza radicalul ABTS+ n comparaie cu Trolox, un analog al vitaminei E.
Rezultatele au variat ntre 6.05 i 11.96 mol TE/ g FW (Tabel 8).
Metoda ORAC msoar capacitatea neutralizare a antioxidanilor mpotriva
radicalilor peroxil. Valorile ORAC pentru probele analizae au fost cuprinse ntre 21.2 i
34.5 mol TE/ g FW. Fracia bogat n antociani obinut din varietatea Toro a demonstrat
a avea cea mai mare capacitate antioxidant.
Tabel 8
Rezultatele privind activitatea antioxidant obinut prin metodele complementare ABTS,
CUPRAC i ORAC pentru diferite cultivaruri de afine
Table 8
Antioxidant activity results obtained by complementary assays ABTS, CUPRAC and
ORAC on selected cultivar of blueberry.
Activitatea antioxidant (M TE/ g fr.wt)
Afine
CUPRAC ABTS ORAC
a a
Bluegold 134.76 53.03 6.05 1.34 21.21 3.26a
Nui 163.04 23.45ab 7.91 3.67b 22.35 6.77b
Darrow 168.65 30.33ab 8.43 2.18b 25.43 2.19b
Legacy 171.15 46.49ab 8.73 2.22b 28.99 5.31c
Nelson 175.25 69.06ab 9.12 1.23bc 30.27 4.74d
Hannas Choice 153.89 57.12ab 7.68 1.09bc 20.36 2.23d
b c
Toro 185.78 92.06 11.96 3.45 34.58 3.25d
Not: valorile din aceeasi coloana notate cu litere diferita sunt statistic semnificative la P 0.05

Evaluarea proliferrii celulelor tumorale


Antocianii din afine inhib proliferarea celulelor B16F10 ntr-o manier dependent
de doz. Tratamentul cu 200 i 400 g/ ml, timp de 24 h a stimulat proliferarea celulelor
B16F10 cu 20%. Tratamentul cu 550, 600 i 650 g/ ml, pentru 24 de ore a sczut cu
16,5%, 46,9%, respectiv 59,0% proliferarea celulelor B16F10. Concentraii mai mari de

XLI
Rezumatul tezei de doctorat

650 g/ ml au sczut proliferarea celulelor cu mai mult de 70%. IC50 calculat a fost de
615.2 g/ ml (Fig.13).

140
*** **

Cell proliferation (%)


120
100 ns
80 *

60 ***
40 ***
***
20
0 ***
0 200 400 600 800
Anthocyanins (g/mL)

Fig. 13. Antocianii din afine reduc proliferarea celular n celule tumorale de
melanom metastatic B16F10 tratate cu 500, 550, 600, 650, 700, 750 g/ ml ARF-T pentru
24 h. Proliferarea celulara a fost determinat prin metoda MTT. Datele exprima
valorileSEM (n = 5). Diferene semnificative: *p< 0.05, **p< 0.01, *** p < 0.001
comparativ cu controlul
Fig. 13. Blueberry anthocyanins reduces the proliferation of melanoma murine cells
B16F10 treated with 500, 550, 600, 650, 700, 750 g/ ml ARF-T for 24 h. Cell
proliferation was assessed by MTT assay. Data are expressed as mean SEM (n = 5).
Statistically significant differences: *p< 0.05, **p< 0.01, *** p < 0.001 compared with
control

Evaluare integritii membranei celulare


Pentru a evalua integritatea membranei celulelor B16F10 dup 24 h de la incubare
cu/i fr tratament, s-a msurat lactat dehidrogenaza secretat (LDH). Tratamentul cu 550,
600, 650 g/ ml a stimulat creterea lactat dehidrogenazei (LDH) eliberate de celulele
B16F10 comparativ cu controlul (Fig. 14).

XLII
Rezumatul tezei de doctorat

120 *** ***


***

LDH leakage (%)


90

60

30

0
0 550 600 650
Anthocyanins (g/mL)

Fig. 14. Eliberarea LDH din celulele B16F10 de melanom murin dup 24 h de la
incubarea cu 550, 600, 650 g/ ml ARF-T. Pezultatele sunt prezentate ca medie SEM (n
= 5). Diferenele statistic semnificative: *p< 0.05, **p< 0.01, *** p < 0.001 comparativ cu
controlul.
Fig.14. LDH leakage from B16F10 melanoma murine cells after 24 h incubation
with the 550, 600, 650 g/ ml ARF-T. Results are presented as mean SEM (n = 5).
Statistically significant differences: *p< 0.05, **p< 0.01, *** p < 0.001 compared with
control.

Colorarea cu EB / AO
Pierderea integritii membranei celulare i formarea corpilor apoptotici n celulele
B16F10 expuse tratamentului cu antociani poate fi observat n Fig. 15A. Aproximativ
20% dintre celule viabile, tratate si ulterior numrate au fost n apoptoz (Fig. 58B).
Scderea proliferrii celulelor se datoreaz induciei apoptozei. Aproximativ 18% dintre
celulele numrate apar colorate n rosu, care ar putea fi n necroz, survenit dup mai mult
timp de la apariia apoptozei. Rezultatele obinute sugereaz c antocianii din afine (600
g/ ml) pot induce apoptoza n celulele B16F10 de melanom murin dup 24 h de la
tratament (fig. 15B).

XLIII
Rezumatul tezei de doctorat

C T
ontrol reated

Fig. 15. Efectele antocianilor din afine asupra celulelor tumorale B16F10 (A).
Microscopie n contrast de faz pentru celulele B16F10 tratate cu ARF-T pentru 24 h. (B)
Colorarea EB/AO celulelor B16F10 cells cu si fara tratament pentru 24 h. Celulele au fost
observate cu microscopul cu florescen inversat. Sgetile albe indic celule apoptotice
(magnificaia: 40
Fig. 15. Effects of blueberry anthocyanins on B16F10 murine melanoma cells (A).
Phase contrast microscopy on B16F10 cells treated by ARF-T for 24 h. (B) 96-well-based
EB/AO staining without ARF-T treatment and after treatment of B16F10 cells for 24 h with
ARF-T. Cells were observed under inverted fluorescence microscope. The white arrows
indicate apoptotic cells (original magnification: 40)
Apoptoza
O caracteristic distinctiv a apoptozei la nivel biochimic este fragmentarea ADN n
fragmente oligonucleosomale reprezentate de multiple perechi de baze 200-500. n Fig. 16
un numr mare de celule B16F10 de melanom murin tratate au fost observate ajutorul
colorrii imunocitochimice, ca pozitive la TUNEL, comparativ cu celulele netratate.
Tratamentul cu 600 g/ ml extract bogat n antociani pentru 24 de ore a crescut numrul de
celule pozitive la TUNEL cu 14%, comparativ cu celulele control corespunztoare acestora
i anume 2% (fig. 17). Datele obinute n acest studiu demonstreaz c fraciile bogate de
antocini din afine induc apoptoza n celulele de melanom murin B16F10.

XLIV
Rezumatul tezei de doctorat

Fig. 16. Microscopia confocal pentru celulele B16F10 cu i fr tratamentul cu ARF-T


pentru 24h. Celulele TUNEL pozitive sunt colorate in verde. Nucleii normali sunt colorai
n rou cu Draq5.
Fig. 16. Confocal microscopy of B16F10 cells TUNEL staining with or without ARF-T
treatment for 24 h. TUNEL-positive cells are shown as green fluorescence. Numerous
normal nuclei stained in red with Draq5

XLV
Rezumatul tezei de doctorat

21 U
***
18 T

Apoptosis index (%)


15
12
9
6
3
0
Fig. 17. Cuantificarea apoptozei induse n celulele B16F10 tratate cu ARF-T pentru
24 h. Cuantificarea prin testul TUNEL. Datele sunt exprimate ca procent al celulelor
pozitive la TUNEL, din 1000 celule numarate; U-celule netratate; T- ARF-T celule tratate
Fig. 17. Quantification of apoptosis induction in B16F10 cells treated with ARF-T
for 24 h. Quantification by TUNEL assay - Data are presented as percentage of TUNEL-
positive cells per 1000 cells; U-untreated cells; T- ARF-T treated cells.

Date cu privire la efectele antocianilor din afine asupra proliferarii celulelor de


melanom murin nu au fost raportate anterior. Din pacate, mecanismul de aciune al
antocianilor rmne necunoscut. Intr-un studiu recent a fost sugerat c antocianii din
fructele de dud pot media metastaza n celulele B16-F1 prin reducerea activiti a MMP-2
i MMP-9 implicate n suprimarea cii de semnalizare Ras/PI3K (Huang et al., 2008).

CONCLUZII
1. Cinci variti de afine au fost recoltate de la fermierii locali i analizate
prin HPLC-DAD-ESI-MS pentru identificarea i cuantificarea coninutului antociani.
2. Purificare a extractelor a fost realizat pe coloane de Ambertite XAD-7 &
Sephadex LH-20, n scopul de a obine fracii bogate n antociani i de a le testa pentru
capacitatea lor de a inhiba proliferarea celular i de a stimula apoptoza pe linia celular
B16F10 de melanom murin.
3. Dup analiza chromatografic 12 antociani au fost identificai i
cuantificai. Malvidin-3-O-galactozid, petunidin-3-O-galactozid i delfinidin-3-O-
galactozid fiind antociani majoritari n toate soiurile luate in studiu.
4. Cel mai ridicat coninut de antociani determinat a fost pentru varietatea
Toro (195.01 mg / 100g FW), urmat de varietatea Legacy, n timp ce cea mai redus
cantitate s-a nregistrat pentru varietatea Bluegold (101.88 mg / 100g FW).

XLVI
Rezumatul tezei de doctorat

5. Antociani din afine inhib proliferarea celulelor B16F10 ntr-o manier


dependent de doz. Tratamentul cu 200 i 400 g/ ml, timp de 24 h a stimulat
proliferarea celulelor B16F10 cu 20%.
6. Tratamentul cu 550, 600, 650 g/ ml a stimulat creterea lactat
dehidrogenazei (LDH) n celulele B16F10, n B16F10 cu 9%, 10% i 12%, comparativ
cu controlul
7. Procentul de celulele apoptotice determinat prin colorarea cu portocaliu de
acridin/ bromur de etidiu. a fost de aproximativ 20% din totalul celulelor tratate.
8. Tratamentul cu 600 g/ ml extract bogat n antociani pentru 24 de ore a
crescut numrul de celule pozitive la TUNEL cu 14%, comparativ cu celulele control
corespunztoare (2%) .

Datele obinute n acest studiu demonstreaz c fraciile bogate de antocani din


Vacciunium corymbosum var. Toro ar putea inhiba proliferarea celular i induce apoptoza
n celulele tumorale B16F10.

XLVII
Rezumatul tezei de doctorat

CONCLUZII GENERALE

Avnd n vedere obiectivele principale ale acestui studiu, rezultatele obinute prin
diferite metode experimentale pot fi grupate astfel :
1. S-a realizat o evaluare comparativ a cantitii de antociani i activitii
antioxidante a acestora din patru varieti de aronia , trei soiuri de afine cultivate i dou
tipuri de afine slbatice.
2. S-au comparat diferite metode de extracie n faz solid pentru a obine
extracte bogate n antociani de puritate ridicat.
3. Au fost demonstrate efectele chemopreventive ale tratamentului cu fracii
bogate n antociani oninute din aronia asupra dou linii celulare canceroase (B16F10 de
melanom murin i HeLa de col uterin).
4. A fost realizat un studiu complet asupra antocianilor din diferite varieti de
afine privind identificarea, cuantificarea, purificarea i determinarea activitii antioxidante
a acestora precum i efectele antitumorale i proapoptotice ale fraciei bogate n antociani
pe linia celulara tumoral B16F10.

XLVIII
Rezumatul tezei de doctorat

BIBLIOGRAFIA

ABDEL-AAL E. S. M., J. C. YOUNG, P. J. WOOD, I. RABALSKI, P. HUCL, D. FALK


AND J. FREGEAU-REID, 2002. Einkorn: A potential candidate for developing
high lutein wheat, Cereal Chemistry 79(3) 455-457.
APAK R., GL K., DEMIRATA B., OZYREK M., CELIK S.E., BEKTAOLU
B., BERKER K.I., OZYURT D., 2007. Comparative evaluation of various total
antioxidant capacity assays applied to phenolic compounds with the CUPRAC
assay, Molecules. 12(7):1496-547
BENZIE, F.F. and STRAIN, J.J., 1999. Ferric Reducing/Antioxidant Power
Assay:DirectMeasure of Total antioxidant Activity of Biological Fluids
and Modified Version for Simultaneous Measurement of Total
Antioxidant Power and Ascorbic Acid Concentration. Methods in
enzymology. vol. 299:15-23
CARA R. WELCH, QINGLI WU and JAMES E. SIMON, 2008. Recent Advances in
Anthocyanin Analysis and Characterization, Curr Anal Chem, 4(2): 75101.
CASTANEDA-OVANDO A., PACHECO-HERNANDEZ M.D.L., PAEZ-HERNANDEZ
M.E., RODRIGUEZ J.A., and GALAN-VIDAL C.A., 2009. Chemical studies of
anthocyanins: A review. Food Chem; 113:859-871.
GAVRILOVA V., KAJDZANOSKA M., GJAMOVSKI V., STEFOVA M., 2011.
Separation, characterization and quantification of phenolic compounds in
blueberries and red and black currants by HPLC-DAD-ESI-MSn. J. Agric. Food
Chem, 59, 4009-4018
GIUSTI M. M., RODRIGUEZ-SAONA L. E. and WROLSTAD R. E., 1999. Molar
absorptivity and color characteristics of acylated and non-acylated pelargonidin-
based anthocyanins. J Agr Food Chem, 47(11):4631-4637.
GIUSTI M.M., WROLSTAD R.E., 2003. Acylated anthocyanins from edible sources and
their applications in food systems. Biochemical Engineering Journal 14: 217-225
HE J. and GIUSTI M.M. 2010.Anthocyanins: natural colorants with health-promoting
properties. Food Sci. Tech. 1: 163-187.
HE J. and M.M. GIUSTI, 2011. High-purity isolation of anthocyanin mixtures from fruits
and vegetables a novel solid-phase extraction method using mixed mode cation-
exchange chromatography.Journal of Chromatography, A 1218:7914-7922
HUANG D. et al.,2005. The chemistry behind antioxidant capacity assays, J Agric Food
Chem, 53(6): 1841-1856
KHKNEN M. P., HOPIA A. I., and HEINONEN M., 2001. Berry phenolics and their
antioxidant activity. Journal of Agricultural and Food Chemistry 49, 4076-4082
KIM K.S., S. LEE, Y.S. LEE, S.H. YUNG, Y. PARK, K.H. SHIN and B.K. KIM,
2003. Anti-oxidant activities of the extracts from the herbs ofArtemisia apiacea. J.
Ethnopharmacol., 85: 69-72
RIBBLE D., GOLDSTEIN N. B., NORRIS D. A., SHELLMAN Y. G., 2005. A simple
technique for quantifying apoptosis in 96-well plates. BMC Biotechnol, 5, 12.

XLIX
Rezumatul tezei de doctorat

RODRIGUEZ-SAONA L.E. and R.E. WROLSTAD, 2001. Extraction, isolation, and


purification of anthocyanins. Current Protocols in Food Analytical Chemistry.
Hoboken, NJ, John Wiley & Sons, Inc.: F1.1.1-F1.1.11
RUCH R. J., CHENG S. J., and KLAUNIG J., E., 1989. Prevention of cytotoxicity and
inhibition of intercellular communication by antioxidant catechins isolated from
Chinese green tea. Carcinogenesis 10:1003-1008.
SCALBERT A., WILLIAMSON G., 2000. Dietary intake and bioavailability of
polyphenols. J Nutr, 130(8s):2073S-85S.
SOCACIU C., 2007. Food colorants: chemical and functional properties. Boca Raton:
Taylor & Francis. 616-617
XIAOKE HU and ZHIMIN XU, 2011. Chapter 15. Isolation Characterization of Bioactive
Compounds in Fruits and Cereals Fruit and Cereal Bioactives Edited by zlem
Tokuolu and Clifford Hall III CRC Press ,319336 Print ISBN: 978-1-4398-0665-
4
ZHISHEN J., MENGCHENG T., JIANMING W., 1999. The determination of flavonoid
contents in mulberry and their scavenging effects on superoxide radicals. Food
Chem, 64:555-559.
HUANG H.P., SHIH Y.W., CHANG Y.C., HUNG C.N., WANG C.J., 2008.
Chemoinhibitory effect of mulberry anthocyanins on melanoma metastasis involved
in the Ras/PI3K pathway. J. Agric. Food Chem, 56, 9286-9293.