UNIVERSIDAD NACIONAL DE CRDOBA

FACULTAD DE PSICOLOGA
CTEDRA DE NEUROFISIOLOGA Y PSICOFISIOLOGA

GUA DEL TRABAJO PRCTICO DE MICROSCOPA DEL SISTEMA

NERVIOSO

Autores: Walter Krainbuhl; Leandro Magnotti; Ana Paula Rocco; Laura Legeren; Luis Cisneros; Aylen
DAlessandro; Adrin Bueno (Agosto de 2015). Basada en la Gua homnima hecha por Vernica
Balaszczuk y Christian Bender, de la cual conserva algunos apartados modificados.
 INTRODUCCIN

La intervencin de la psicologa en el marco de las neurociencias implica el dctil manejo de diferentes

mtodos, aplicando y usando experimentalmente diversas tcnicas, herramientas, instrumentos e
insumos. En el estudio de la fisiologa del comportamiento, la psicologa comparte actividades con la
neuroanatoma, la fisiologa, la bioqumica, la histologa, la inmunologa y la endocrinologa, evaluando
procesos tanto normales como patolgicos en el contexto de la psicologa experimental.
Ante este amplio contexto, esta gua pretende ser una sntesis especficamente de aquellos mtodos
que permiten el estudio a nivel microscpico del tejido nervioso, y que por lo mismo requieren
necesariamente de la implementacin de procedimientos histolgicos, con sus herramientas, aparatos
e instrumentos particulares.
Este manuscrito puede ser abordado considerando 2 grandes secciones, una primera que describe los
procedimientos aplicados y la aparatologa asociada a la evaluacin del material histolgico, y la
segunda que detalla las tcnicas ms comnmente utilizadas en microscopa.
La gua, a su vez, requiere como complemento la asistencia al Trabajo Prctico de Microscopa del
Sistema Nervioso, en que se incluye una Sesin de Posters, donde se mostrarn las principales
tcnicas de tincin para estudiar morfologa, fenotipo y conexiones de las distintas poblaciones
neuronales, y una Sala con Microscopios para observar muestras de tejido cerebral teidas con las
tcnicas descriptas.

OBTENCIN DEL MATERIAL NEUROHISTOLGICO

Perfusin transcardaca por bomba peristltica

Para aplicar las tcnicas de tincin que permiten estudiar el tejido cerebral a nivel microscpico, el
mismo debe ser sometido a un proceso llamado fijacin. El objetivo de este paso es detener la
autolisis, endurecer el blando y frgil tejido, conservar la estructura de las protenas y eliminar
cualquier microorganismo que pudiera destruirlo. Existen muchos tipos de fijadores, siendo el
paraformaldehdo (conocido como formol) el ms utilizado.
En animales de laboratorio, la aplicacin del fijador se realiza mediante perfusin transcardaca. La
perfusin implica la extraccin de la sangre y la sustitucin con otro liquido, en este caso, con el
formol. Bsicamente, a una rata anestesiada se le conecta un catter en la aorta ascendente, que es la
arteria que lleva la sangre al cerebro. El
catter est conectado a una bomba
peristltica (como el aparato para las
nebulizaciones) que impulsa el fijador hacia la
aorta y desde all a todas las arterias que
irrigan las clulas del cerebro. Mediante este
procedimiento el fijador llega a todas las
regiones del cerebro, tal como lo hace la
sangre cuando el animal est vivo.

Figura 1: Se introduce una cnula a travs del ventrculo

izquierdo del corazn para que la solucin fijadora
penetre a partir del sistema circulatorio. Se utiliza una
bomba peristltica de perfusin (aparato que imita el
bombeo del corazn) para introducir los dos tipos de
soluciones.

2
Obtencin de cortes mediante micrtomo
Finalizada la perfusin, se extrae el cerebro del crneo y se lo coloca en una solucin crioprotectora
que prepara al tejido para el siguiente paso de seccionamiento. El cerebro se corta en laminas finas
(por ejemplo de 40 micrones -1 micrn es la milsima parte de un milmetro-) mediante un aparato
llamado micrtomo (del latn, aquello que corta en finas laminas). Los cortes se colocan de manera
seriada, en una cubetera con solucin fijadora o con sales especiales para mantener el tejido,
dependiendo de la tcnica que se use a posteriori. Despus de aplicar la tcnica, los cortes se montan
en portaobjetos cubrindolos con un vidrio fino denominado cubreobjetos.

Figura 2: A la izquierda se muestra un micrtomo con su cuchilla especial y a la derecha cortes coronales de cerebro de rata.

APARATO ESTEREOTXICO

El aparato estereotxico fue desarrollado a principios del siglo XX por los neuroanatomistas
norteamericanos Horsely y Clark. A pesar de su antigedad y sencillez, este dispositivo contina
siendo una herramienta insustituible en la investigacin neurocientfica.
El instrumento permite inmovilizar la cabeza
del animal de manera estndar gracias a la
insercin de barras de acero en los conductos
auditivos y una prensa que se ajusta al hocico.
El aparato tambin cuenta con un brazo que
se puede mover en tres direcciones: anterior-
posterior, dorsal-ventral y lateral-medial. En la
punta del brazo se colocan las pipetas,
cnulas o electrodos segn el experimento
que se vaya a realizar. La virtud de este
sistema radica en que, con la gua de un atlas
estereotxico, es posible ubicar cualquier rea
del cerebro en donde queramos inyectar una
sustancia o implantar un electrodo.
Una vez obtenidas las coordenadas
estereotxicas a partir del atlas, se anestesia
al animal y, luego de colocarlo en el aparato,
se le practica una incisin en el cuero cabelludo. Figura 3: Esquema del aparato estereotxico.

3
Posteriormente se localiza el bregma, un punto en el crneo que se toma de referencia calcular todas
las distancias, y se coloca el brazo en los nmeros adecuados segn el rea que se pretende localizar,
sitio en el que finalmente se perfora el crneo para poder insertar la pipeta, cnula o electrodo que se
vaya a utilizar para registrar actividad elctrica, estimular areas especificas, administrar drogas o
provocar lesiones. Adems, tambin es posible instalar cnulas de modo permanente que permiten la
posterior aplicacin de frmacos o para medir concentraciones de neurotransmisores u otras
molculas dentro del cerebro.
Los aparatos estereotxicos se utilizan para investigacin con animales experimentales, aunque
tambin los hay para realizar tratamientos en seres humanos. Por lo general, se valen de mltiples
puntos de referencia para verificar la localizacin del electrodo o la pipeta insertada en el encfalo,
tomando imgenes de resonancia magntica antes de realizar la intervencin.

Figura 4: Izquierda: Fotografa de una intervencin quirrgica en humanos utilizando aparato estereotxico. Derecha: Rata
anestesiada en un aparato estereotxico.

ATLAS ESTEREOTXICO

Es un mapa del sistema nervioso en que se delimitan los contornos de todas y cada una de las
estructuras. Dado que el atlas contiene las coordenadas milimtricas, su uso es indispensable para
realizar micro-cirugas con el aparato esterotxico. Se han hecho atlas de diversos animales,
incluyendo humanos, basados en series de cortes coronales, horizontales y sagitales.

Figura 5: A la izquierda se observa un esquema del atlas estereotxico de un corte coronal del cerebro de una rata, utilizado
como referencia para hacer la intervencin con el aparato estereotxico.

4
 ANALISIS MICROSCPICO DE LAS NEURONAS

El ojo humano puede distinguir dos puntos slo si estn separados por ms de una dcima de
milmetro (100 m). Por consiguiente, podemos decir que 100 m es prcticamente el lmite de
resolucin a simple vista. Las neuronas tienen un dimetro aproximado de 20 m, por lo que el
microscopio ptico fue un desarrollo necesario antes que pudiera estudiarse la estructura neuronal. A
pesar de que los primeros microscopios datan desde el siglo XVIII, es recin a finales del siglo XIX
cuando los padres de la neuroanatoma, Camilo Golgi y Santiago Ramn y Cajal, lo aplicaron para
estudiar las clulas nerviosas.
Con el devenir de los aos, se ha logrado incorporar en la investigacin distintos tipos de microscopios
que sirven para estudiar diferentes aspectos del sistema nervioso. El uso de uno u otro depender de
la pregunta que el investigador se haga. A continuacin se mencionan los microscopios ms utilizados.

Microscopio ptico: Se trata de un instrumento que

contiene una o varias lentes que permiten obtener una
imagen aumentada del objeto y que funciona por
refraccin. Los elementos mecnicos que lo componen
son: pie, columna, tubo, revolver (pieza giratoria que
soporta los objetivos), platina y tornillos. Posee 3
sistemas pticos: condensador, objetivos (cantidad de
aumento) y oculares. Este microscopio se utiliza para
observar la mayora de los preparados vistos en la
seccin anterior.

Microscopio con focal: Con este microscopio se pueden Figura 6: Microscopio ptico.
visualizar molculas fluorescentes en un plano de foco
simple, creando una imagen muy ntida. La muestra es barrida con luz excitante desde un rayo lser.
Los rayos luminosos de la imagen que convergen, la atraviesan y son recogidos por un detector que
transfiere la informacin a una computadora para integrarlos en la pantalla de un monitor.

Microscopio Electrnico de Transmisin: Se utiliza para ver estructuras tan pequeas como las
vesculas sinpticas y detalles de los orgnulos celulares. Con l se pasa un haz de electrones de un
lado a otro del tejido a examinar. Este microscopio tiene un can electrnico con filamento de
tungsteno (fuente de electrones). Por calentamiento del filamento y diferencia de voltaje entre ctodo y
nodo se desprenden electrones que son acelerados y forman un haz que viaja por una columna al
vaco. Hay lentes electromagnticas condensadoras, con objetivos y proyectores. El campo magntico
enfoca a los electrones y la imagen se forma en una pantalla fluorescente.

Microscopio invertido: Se usa para la observacin de clulas vivas en cultivos. Provisto de

condensador y objetivos para contraste de fase, cara fotogrfica y sistema de video para registrar
procesos dinmicos. Es una variante del microscopio convencional que tiene invertida la posicin de
los objetivos ubicados por debajo de la platina mientras que la fuente de iluminacin, condensador y
diafragma estn situados sobre la platina.

5
Microscopio Electrnico de Barrido: Permite obtener una imagen en tres dimensiones. Se diferencia
del electrnico de transmisin en que ofrece imgenes a menor aumento y en que sirve para revelar la
superficie de los objetos en estudio en vez de sus componentes internos.

TECNICAS DE TINCIN HISTOLOGICA

TECNICA DE NISSL
Esta tcnica es una de las tinciones ms utilizadas y fue introducida por el alemn Franz Nissl a finales
del siglo XIX. Este cientfico puso de manifiesto que una serie de colorantes bsicos (azul de metileno,
violeta de cresilo, rojo neutro) tean los ncleos celulares y aglutinaciones presentes en el citoplasma
conocidas como retculo endoplasmtico rugoso. La tincin de Nissl sirve para el estudio de la
citoarquitectura del sistema nervioso.
Concretamente permite: describir la disposicin de las neuronas en ncleos o capas, estudiar el
nmero de neuronas que componen cada rea cerebral, y realizar apreciaciones acerca del tamao y
morfologa de las neuronas. Es importante mencionar que esta tcnica no tie axones ni dendritas.

Figura 7: Neuronas de la amgdala del cerebro de una rata tenidas con tcnica de NISSL. Ntese como esta tcnica permite
visualizar los cuerpos celulares bien definidos, pero no tie sus prolongaciones.

TINCION DE GOLGI
En 1873 el histlogo Camillo Golgi descubri que, sumergiendo el tejido cerebral en una solucin con
sales de plata, un pequeo porcentaje de neuronas se tean completamente de negro, lo que puso de
relieve que el cuerpo de la neurona, la nica regin que se pone de manifiesto con la tincin de Nissl,
es solo una pequea fraccin de su estructura.
En efecto, la tincin de Golgi evidencia un soma neuronal del que irradian numerosas proyecciones
finas, denominadas dendritas y axones, demarcando con gran detalle la morfologa total de la clula,
haciendo posible as diferenciar los diversos tipos de neuronas existentes (bipolares, estrelladas,
piramidales, granulares, de Purkinge y otras multiformes).
En este procedimiento, la coloracin negra de las clulas teidas est asociada a las sales de plata
que se depositan en las protenas de las neuronas, y por este motivo la tcnica de Golgi es

6
considerada una tcnica argntica, atento a que la palabra plata en latn es argentum, vocablo del
que deriva el smbolo qumico de la plata, Ag, en la tabla peridica de los elementos.

Figura 8: Neuronas de la corteza cerebral tenidas con la tcnica de Golgi. Ntese como esta tcnica no solo tie el soma, sino
tambin sus axones y dendritas.

TCNICAS DE PLATA O ARGNTICAS SUPRESORAS

Estas tcnicas son utilizadas especficamente para detectar neuronas muertas que han sido injuriadas
accidental o experimentalmente, ya sea por dao fsico o por intoxicacin con drogas, virus u otro tipo
de exposiciones y tratamientos que derivan en procesos de degeneracin neuronal.
Generalmente son denominadas de plata o argnticas, pues la coloracin est basada en la tincin
de las neuronas con sales de plata, principio por el que se asemeja a la tcnica de Golgi. De hecho, y
similar a la tcnica de Golgi, las tcnicas argnticas supresoras tien de color negro a la totalidad de
una neurona, marcando tanto somas como prolongaciones, pudiendo determinarse as la morfologa
de las neuronas daadas.
No obstante, con la tcnica de Golgi solo se tien neuronas normales, en tanto que las tcnicas
argnticas supresoras tien selectivamente a las neuronas que se encuentran en estado degenerativo.
Y esto es posible porque en las tcnicas argnticas supresoras, al procedimiento bsico de la tcnica
de Golgi se le agrega un paso ms, en el que se realiza un barrido final que suprime la tincin de las
sales de plata adheridas a las neuronas normales, de modo que slo quedan en el tejido aquellas
sales de plata que se han adherido a las protenas descompuestas de una neurona muerta.
Se han desarrollado distintas variantes de tcnicas argnticas supresoras, algunas de las cuales
permiten detectar neuronas que estn muriendo tanto por mecanismos necrticos como apoptticos.
Otras tienen sensibilidad para detectar degeneracin neuronal an semanas despus de la injuria, con
las que se hace evidente la tincin de axones desglosados a modo de cuentas de rosario, un proceso
denominado degeneracin Walleriana que aparece luego de que las microglias han comenzado su
trabajo de limpieza. Tambin se han logrado teir clulas gliales usando procedimientos argnticos
supresores, aunque utilizando un barrido final diferente del empleado para marcar neuronas en estado
degenerativo.
Una ventaja de las tcnicas argnticas supresoras es que el tejido nervioso, una vez procesado, puede
ser sometido a una tincin con el mtodo de Nissl, con lo cual se tien los cuerpos celulares normales
facilitando el contraste con las neuronas en estado degenerativo. A tal procedimiento se lo llama
contra-tincin.

7
Figura 9: corte sagital de la corteza parietal del cerebro de una rata tratada con el bloqueante glutamatrgico MK-801. La
tcnica argntica utilizada (de Olmos y col, 1994) permite detectar degeneracin de clulas piramidales, cuyos cuerpos se
localizan en la capa IV, con sus axones dirigindose a la superficie (ver recuadro). La densa tincin de la capa I corresponde
a los botones terminales, mientras que en las capas II y III se visibilizan fracciones de los axones de las neuronas afectadas.

TECNICA INMUNOCITOQUIMICA
La tcnica inmunocitoqumica o inmunohistoqumica es la tcnica ms popular de todos los mtodos
de tincin. El espectacular desarrollo de la neurobiologa en las ltimas dcadas se debe en gran
medida a la invencin de esta tcnica.
Esta tcnica utiliza anticuerpos, que se unen de manera ultra-especifica a la molcula que se quiere
localizar, la cual funciona como antgeno. Al administrar anticuerpos en las clulas, las molculas-
antgeno reaccionan qumicamente ante stos, provocando una seal visible en el microscopio. sta
tincin, por lo tanto, no tie la clula en s mismo, sino protenas (cualquier molcula que funcione
como antgeno).
Este mtodo sirve para definir la
distribucin de los receptores
cerebrales, neurotransmisores,
neuropptidos, enzimas, canales
inicos, hormonas u otras molculas
presentes en el sistema nervioso.

Figura 10: Mecanismo de accin de la

tcnica inmunohistoqumica. El objetivo es
detectar una molcula determinada,
agrandando la seal con anticuerpos para
hacerla visible al microscopio.

El mecanismo de accin de la tcnica inmunohistoqumica funciona de la siguiente manera: se busca

identificar una protena en particular en las neuronas. stas se incuban con anticuerpos que se unen
selectivamente a la protena de inters (llamado anticuerpo primario). Luego se incuba con un segundo
anticuerpo de mayor tamao (anticuerpo secundario) que se une al primario, para que aumente la
seal de ste anticuerpo y por lo tanto de la protena a teir. Finalmente una tercera solucin se une al

8
anticuerpo secundario llamada ABC (Complejo Avidina-Biotina) que se utiliza para hacer ms visible la
unin de los anticuerpos con la molcula de inters.
Si observramos estos cortes hasta este punto, todava no se podra ver ninguna tincin. La marca
visual se obtiene luego de introducir un sustrato (de la enzima peroxidasa) y un cromgeno que da
color a la reaccin. Una vez preparados los cortes que contienen el tejido, se observan las neuronas
marcadas con la protena teida en el microscopio. De esta manera se puede establecer la
neuroqumica de los distintos ncleos del encfalo, constatando en qu clulas o en qu rea de una
neurona se concentra la protena marcada.

Figura 11: Neuronas dopaminrgicas de las sustancia

nigra de una rata, cuyo tejido fue procesado con el
mtodo inmunocitoqumico utilizando un anticuerpo de la
tiroxina hidroxilasa, enzima que transforma a la tiroxina en
DOPA durante el proceso de sntesis de las
catecolaminas.

Figura 12: Espinas dendrticas que fueron teidas de amarillo con una tcnica inmunohistoqumica, usando como antgeno la
actina, una protena estructural, que permite observar la diferencia morfolgica en las espinas dendrticas.

Obtencin de los anticuerpos que se utilizan en las tcnicas inmunocitoqumicas.

Se inyecta la molcula que se desea estudiar en el torrente sanguneo de un animal provocando una
respuesta inmunitaria. Un aspecto de la respuesta inmunitaria es la generacin de anticuerpos que
pueden unirse ajustadamente a sitios especficos de la molcula extraa. Estos anticuerpos
especficos pueden recuperarse a partir de una muestra de sangre del animal inmunizado y, luego de
un proceso de purificacin, son aptos para su uso en investigacin.

9
En la actualidad, existen laboratorios que se
dedican a fabricar y vender diversos
anticuerpos, lo que ha facilitado la utilizacin
de esta metodologa.

Figura 13: Representacin de los pasos en la

produccin de anticuerpos utilizados en la investigacin
cientfica.

TECNICA PARA DETECTAR METALES PESADOS

El mtodo de sulfuro de plata de TIMM es considerado un procedimiento muy sensible para observar
metales pesados, en particular zinc, dentro del sistema nervioso. El principio de esta tcnica es que los
metales del tejido nervioso pueden ser transformados a sulfuros metlicos. Posteriormente, estos
sulfuros metlicos catalizan la reduccin de los iones de plata, por un agente reductor, a los granos
metlicos que son visibles microscopio electrnico.
Los estudios que utilizan esta tcnica han proporcionado una mejor comprensin, no slo de la
localizacin y distribucin de zinc, sino tambin su posible funcin en el cerebro. El zinc es uno de los
ms abundantes oligoelementos en la clula, habindose observado que pequeas cantidades de
iones de zinc regulan la activacin de protenas, receptores y factores de transcripcin enzimticas que
son fundamentales para la conexin entre las neuronas.

Figura 14: En estos cortes coronales, las zonas oscuras revelan la concentracin de zinc en cerebros de ratas. A la izquierda
puede verse densamente teido el ncleo principal de la estra terminal (BST), y a la derecha las reas CA3 y CA4 del
hipocampo.

10
TECNICAS PARA LA TINCION DE MIELINA
Estas tcnicas se basan en el uso de colorantes con afinidad por las protenas unidas a los
fosfolpidos, por lo que tien especficamente la mielina que recubre los axones.

Mtodo de Klver-Barrera
La tincin de Klver-Barrera marca de un color los somas y de otro color la mielina que recubre a los
axones, permitiendo detectar las principales rutas por las que las neuronas proyectan a otras reas.
Esta tcnica implica una doble tincin del mismo tejido, por lo que se lleva a cabo en 2 etapas, donde
cada una de ellas comprende una de las tinciones. La primera que se realiza es la tincin de la mielina
mediante una solucin de azul luxol que pone de manifiesto a la sustancia blanca, mientras que en
segunda instancia se realiza una contra tincin de Nissl para teir los cuerpos celulares. En esta contra
tincin suele emplearse el colorante rojo neutro o violeta de cresilo, ya que contrastan mejor con el
azul de luxol.

Figura 15: Se observa el contraste entre el soma teido de rojo, y la vaina de mielina del axn, visible en color azul.

Mtodo del tetrxido de osmio

En esta tcnica histoqumica el osmio reacciona con los lpidos a nivel de sus enlaces no saturados, lo
cual permite que la vaina de mielina se tia de negro por su alto contenido de lpidos no saturados.
Puede distinguirse tanto al microscopio ptico como al microscopio electrnico debido a su alta
densidad.

Figura 16: Corte coronal de un cerebro humano en que

se observan, de negro, las vainas de mielina teidas con
tetrxido de osmio.

11
TECNICA PARA TEIR MICROGLIA - Mtodo del carbonato de Plata Amoniacal
Tcnica desarrollada en 1919 por Pio del Rio Hortega como una modificacin del mtodo de
Achucarro. Consiste en la introduccin del carbonato de plata, reactivo mucho ms seguro y verstil
que el oxido de plata, el cual resulta de la precipitacin del nitrato de plata con carbonato sdico y la
posterior disolucin del precipitado con amoniaco. El carbonato posibilita teir aquellos elementos de la
neuroglia que haban escapado al microscopio. Gracias a este mtodo se pudo estudiar en detalle la
neuroglia, identificando dos de los principales
tipos, la microglia o clulas de Hortega, y
los oligodendrocitos.
El papel de la microglia es fundamental frente
a los procesos de muerte neuronal, pues se
activa como respuesta inflamatoria
transformndose sucesivamente en clulas en
bastoncito, clulas ameboides y, finalmente,
en corpsculos granulo-adiposos con
capacidad fagocitara. Esta activacin conlleva
la traslacin de estas clulas al sistema
nervioso, hasta alcanzar el foco inflamatorio,
por lo que su deteccin implica la presencia de
toxicidad o injuria neuronal.
Figura 17: Microglias teidas con mtodo de carbonato de plata amoniacal.

TECNICAS PARA EL TRAZADO DE VIAS NEURONALES

Existe una serie de tcnicas que permiten descifrar con ms detalle los circuitos neuronales y sus
interconexiones, y que han aportado avances significativos. Entre estas tcnicas se pueden mencionar
el marcado antergrado, retrgrado y transneuronal. stas tcnicas combinadas contribuyen a obtener
un diagrama del cableado neural del encfalo. Las tres comparten el mismo principio: utilizando el
aparato estereotxico a travs de micropipetas se inyecta en reas cerebrales especficas una
protena, en el caso del marcado antergrado y retrgrado, o un virus para el marcado transneuronal.

Marcadores Antergrados
Antergrado significa que se mueve hacia delante. Es un mtodo que se utiliza para marcar axones
eferentes de las distintas estructuras cerebrales, empleando sustancias que son captadas por las
dendritas y los somas celulares y transportadas, mediante transporte axoplsmico rpido, a lo largo del
axn hasta los botones terminales. La sustancia antergrada ms utilizada es una protena llamada
PHA-L (phaseolus vulgaris leukoaglutinin) producida por una planta conocida como juda.
Pocos das luego de la inyeccin, las molculas de PHA-L difunden por el soma y las prolongaciones
hasta alcanzar a los botones terminales de las neuronas. Para poder ver las molculas de PHA-L, se
aplica un mtodo de inmunocitoqumica, y las preparaciones se examinan al microscopio.

12
 Figura 18: Esquema que muestra el funcionamiento de PHA-L, una tcnica de marcado antergrado.

Marcadores Retrgrados
Retrogrado significa que se mueve hacia atrs. Sirve para identificar las aferencias que recibe una
determinada regin del encfalo y el proceso es similar al utilizado para identificar sus eferencias. Lo
nico que se modifica en el marcado retrgrado respecto del antergrado, es la sustancia a utilizar, en
este caso es el oro fluorado (fluoro gold). Esta molcula es absorbida por los botones terminales y
transportada a los somas celulares mediante transporte axoplsmico retrogrado. Pocos das despus
se examina el tejido bajo una luz de longitud de onda adecuada y las molculas de oro fluorado emiten
fluorescencia bajo esta luz.
Entonces, en las partes del cerebro en donde se observan los cuerpos neuronales que hayan
incorporado el trazador, son las estructuras que envan aferencias al rea donde se inyect el
marcador retrogrado.

Figura 19: Experimentos de trazado de tractos antergrado (arriba) y retrgrado (abajo).

Marcado Transneuronal
Permite identificar una serie de dos, tres o ms neuronas que forman conexiones sinpticas en serie
unas con otras. Este mtodo puede utilizarse para marcar los circuitos, ya sea en direccin
13
antergrada o retrgrada. El marcado transneuronal ms eficaz emplea un virus de la seudorrabia, una
forma debilitada del virus herpes que originalmente se concibi como vacuna. El virus se inyecta
directamente en una regin cerebral y es captado por las neuronas del lugar, las cuales se infectan; la
infeccin se extiende a travs de las neuronas y finalmente es liberado de las mismas, contagiando a
las neuronas con las que establece conexiones sinpticas.

TCNICA DE CULTIVO CELULAR

Las tcnicas que se han estudiado hasta ahora sirven para el estudio del tejido intacto. Pero existen
mtodos que se aplican a clulas cerebrales que han sido aisladas del tejido cerebral. En su conjunto
se las conoce como tcnicas in Vitro o de cultivo celular. Esta metodologa permite la evaluacin de
diversos parmetros de manera independiente a las mltiples interacciones que participan in vivo,
porque asla la clula del medio que la rodea. De esta manera se pueden analizar los mecanismos
intracelulares que seran imposibles de realizar en el tejido intacto.
Los cultivos celulares permiten estudiar la actividad intracelular incluyendo la trascripcin de ADN,
sntesis de protenas, metabolismo energtico, metabolismo de drogas, ciclo celular, diferenciacin y
apoptosis. Tambin se puede estudiar el flujo intracelular de ARN, receptores de hormonas o
transduccin de seales, as como la interaccin clula-clula, morfognesis, adhesin y motilidad
celular. La accin de agentes biolgicos, como virus y bacterias, de agentes qumicos, y diferentes
tipos de radiaciones son as mismo abordables con neuronas cultivadas.

Cmo se cultiva una neurona

El cultivar neuronas comienza por la extraccin del cerebro de un animal experimental, que se sacrifica
para tal fin. Luego se utilizan medios fsicos (disociacin mecnica) y qumicos (enzimas) para separar
las neuronas entre s, y se las coloca en una cpsula de Petri, donde son mantenidas en un medio
lquido que contiene todos los nutrientes que necesitan para sobrevivir, y son mantenidas en estufas a
37C. Una vez que estn en sus cpsulas, se pueden realizar todo tipo de estudios ya que existe un
verdadero arsenal tcnico para estudiar las clulas en cultivo.

Figura 20: Las imgenes muestran las etapas de la neurona en cultivo: a) se observa la clula sin ramificaciones, recin
sembrada en la cpsula de Petri; b) muestra las primeras ramificaciones de la neurona; c) aqu ya se visibiliza el axn largo,
con sus ramificaciones, las que se consolidarn en la cuarta etapa (d).
14
 PALABRAS FINALES

En este trabajo se realiz un recorrido por las metodologas utilizadas para estudiar el sistema
nervioso a nivel microscpico. Muchas tcnicas han quedado afuera de esta presentacin, pero lo
fundamental ha sido expuesto. Lo que debe quedar como mensaje es que no hay una sola tcnica o
un nico experimento que pueda responder a las preguntas que plantean los neurocientficos. Esto se
obtiene del trabajo de miles de investigadores y es el conjunto de datos obtenidos desde distintas
perspectivas de donde se alcanzan las respuestas. Por otro lado, continuamente se desarrollan
nuevas tecnologas que permiten la visualizacin de componentes celulares a nivel microscpico. Por
lo tanto, el conocimiento actual viene con fecha de vencimiento. A no dejarse estar.

BIBLIOGRAFIA Y FUENTES FOTOGRAFICAS

- Bear, M; Connors, B; Paradiso; M (1998) Neurociencia Explorando el cerebro. Masson-Williams & Wilkins.
Espaa.
- Beltz,B.& Burd,G. (1989) Immunocytochemical Techniques (Principles and Practice). Blackwell Scientific
Publications. USA.
- Carlson, N. (2006) Fisiologa de la conducta. 8va Ed. Pearson Educacin. Madrid
- Centro de Microscopia Electrnica. Cba-Arg (2006): Curso de Postgrado Tcnicas de Biologa Celular y
Molecular utilizadas en Investigacin Bsica y Aplicada. Dictado por la Facultad de Ciencias Medicas (UNC.
- Dansher, G. (1981) Histochemical demonstration of heavy metals. A revised version of the sulphide silver
method suitable for both light and electronmicroscopy. Histochemistry, 71, 1-16.
-de Olmos, J.; Beltramino, C.; de Olmos de Lorenzo, S. (1994) Use of Amino-Cupric-Silver technique for the
detection of early and semiacute neuronal degeneration caused by neurotoxicants, hypoxia, and phisical trauma.
Neurotoxicol Teratol, 16: 545-561.
- Escarabajal Arrieta (2005) Fundamentos de psicobiologa: libro de prcticas I. Delta Publicaciones.
-Gallyas, F.; Gldner, F.; Zoltay, G.; Wolff, J. (1990) Golgi-like demonstration of dark neurons with an
argyrophilic III method for experimental neuropathology. Acta Neuropathol, 79: 620-628.
- Hamilton,L. (1976): Basic Limbic System Anatomy of The Rat. Plenum Press, New York
- Kandel, E; Jesell, T; Schwartz, J. (1997) Neurociencia y Conducta. Prentice Hall. Madrid
- MAPS Brain Maps (http://brainmaps.org/)
- Paxinos, G; Watson, C. (2007) The rat brain in stereotaxic coordinates. 6ta edicin. Elsevier.
- Pinel, J. (2007) Biopsicologa. Ed. Pearson Prentice Hall. 6ta edicin.
- Purves y cols. (2008) Neurociencia. Ed. Mdica Panamericana. 3ra edicin.
-Switzer III, R. (2000) Application of silver degeneration stains for neurotoxicity testing. Toxicol Pathol, 28:70-83.
- Tecnicas de tincin del Sistema Nervioso (http://medicina-uba.blogspot.com.ar/2009/05/tecnicas-de-tincion-del-
sistema.html)
- Tcnica de tincin de mielina (http://microscopy.arizona.edu/gallery/luxol-fast-blue-histology-stain-myelin-cmm-
histology-lab-cromey-grantham) y (http://www.telesa.org/SpecialStain/LAB_ISTOCHIMICA/UK/Luxolfastblue
cresylviolet.htm)
- Tcnicas neurohistolgicas (http://campus.usal.es/~histologia/histotec/neurotec/neurotec.htm)

15