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INSTITUTO POLITCNICO NACIONAL

ESCUELA NACIONAL DE CIENCIAS BIOLGICAS


DEPARTAMENTO FISIOLOGA VEGETAL

LABORATORIO RELACIN PLANTA-MICROORGANISMO

MICROPROPAGACIN

INTEGRANTES:

Canizal Ramos Adriana

Ramrez Hernndez Perla Isabel

Villalvazo Gonzlez Marcos Paris

GRUPO: 6QV2 EQUIPO: 7

FECHA: 09-junio-17
Introduccin

La micropropagacin consiste en la La correcta eleccin y preparacin del explante


propagacin de plantas en un ambiente incide directamente sobre la calidad del mismo
artificial controlado, empleando un medio de y su respuesta frente a los dos principales
cultivo adecuado. El cultivo es as una problemas que afectan al establecimiento del
herramienta muy til en los programas de cultivo, que son la contaminacin con
mejoramiento, ya que tiene el potencial de microorganismos y la oxidacin del explante.
producir plantas de calidad uniforme a escala Los factores que influyen sobre la calidad del
comercial, a partir de un genotipo selecto y con explante son: el tipo de rgano que sirve como
una tasa de multiplicacin ilimitada. Esto es explante, la edad ontognica y fisiolgica del
posible gracias a la propiedad de totipotencia mismo, la estacin en la cual se colecta el
que tienen las clulas vegetales; esto es la material vegetal, el tamao y el estado
capacidad de regenerar una planta completa sanitario general de la planta donante. La
cuando estn sujetas a los estmulos planta donante debe elegirse en base a una
adecuados. As, las clulas somticas de seleccin masal positiva para las
cualquier tejido podran formar tallos, races o caractersticas agronmicas deseables. Una
embriones somticos de acuerdo con la vez seleccionados los individuos, es preciso
competencia que posea y al estmulo que definir el tipo de explante a establecer en
reciban . Dependiendo de las caractersticas condiciones in vitro. En general, los rganos
de la planta que se pretenda propagar y del jvenes o bien rejuvenecidos son los que
objetivo perseguido, la micropropagacin tienen mejor respuesta en el establecimiento
puede realizarse a travs de tres vas de que los obtenidos a partir de materiales
regeneracin: brotacin de yemas adventicias adultos. El empleo de explantes que se
preexistentes, produccin de yemas de novo y encuentran expuestos a bajos niveles de
embriognesis somtica. 2 Etapas de la patgenos puede resolver el problema de la
micropropagacin La micropropagacin contaminacin por hongos y bacterias durante
presenta cuatro etapas principales: 1) el establecimiento del cultivo in vitro. Se
establecimiento del cultivo, 2) desarrollo y recomienda colectar explantes primarios a
multiplicacin de vstagos o embriones, 3) campo durante la estacin primaveral y estival,
enraizamiento y 4) aclimatacin de las cuando existe una brotacin activa de las
plntulas. Generalmente, las etapas de yemas, ya que el empleo de yemas en estado
enraizamiento y aclimatacin pueden de dormicin ocasiona serios problemas de
combinarse en condiciones ex vitro. En el caso contaminacin. A fin de lograr explantes de
de la embriognesis somtica, el ptima calidad es conveniente hacer crecer las
enraizamiento es reemplazado por una etapa plantas donantes por un tiempo mnimo en
de maduracin y germinacin de los embriones condiciones de invernculo. De esta forma es
para la diferenciacin de los pices caulinar y posible incidir directamente sobre el estado
radicular. En algunos casos tiene importancia sanitario y la calidad de los explantes mediante
considerar una etapa previa (Etapa 0) que es el control de la intensidad lumnica,
la etapa de preparacin de los explantes para temperatura y reguladores de crecimiento.
el establecimiento. Para especies ornamentales tropicales y
subtropicales se recomienda mantener las
Etapa 0: Preparacin del material vegetal plantas donantes en condiciones de alta
temperatura (25C) y baja humedad relativa
(75%) a fin de reducir la proliferacin de generales para patgenos cultivables como el
patgenos. Los procesos morfognicos de empleo de medios de cultivo para el
floracin, dormicin y bulbificacin son crecimiento de bacterias y hongos y mtodos
controlados por el fotoperodo y la especficos para la deteccin e identificacin
temperatura. Controlando estos factores de patgenos intracelulares como virus,
tambin es posible obtener plantas donantes y viroides y bacterias. La realizacin de estos
explantes ms homogneos durante todo el anlisis directamente sobre las plantas
ao. Pueden aplicarse adems pretratamientos donantes, previo establecimiento, presenta dos
con reguladores de crecimiento a las plantas ventajas. En primer lugar, el empleo de tejidos
donantes, as como tambin a los explantes maduros permite visualizar los sntomas ms
mismos. En especies leosas suele utilizarse marcados de la enfermedad, en segundo lugar,
como pretratamiento la inmersin de los la carga de patgenos es mayor y por lo tanto
explantes primarios en soluciones con la precisin del sistema de deteccin aumenta.
citocininas a fin de inducir la brotacin de Por otro lado, las plantas enfermas pueden
yemas. tratarse con tcnicas adecuadas para la
eliminacin de patgenos como la
Etapa 1: Establecimiento del cultivo termoterapia, la quimioterapia a travs de la
El objetivo de esta etapa es establecer cultivos aplicacin de antibiticos, desinfectantes,
viables y axnicos. El xito est determinado antivirales y el cultivo de meristemas. La
por la calidad del explante a utilizar. En esta desinfeccin superficial incluye varios pasos: el
etapa los principales procesos a controlar son lavado de los explantos con agua corriente, el
la seleccin, el aislamiento y la esterilizacin empleo de etanol al 70% por 1 minuto, seguido
de los explantes. Los materiales que de concentraciones variables de hipoclorito de
demuestran tener mayor capacidad sodio (0,5 a 1,5% de cloro activo) con unas
regenerativa son los obtenidos de tejidos gotas de tensoactivos para favorecer su
meristemticos jvenes, ya sean yemas penetracin y actividad. Posteriormente, los
axilares o adventicias, embriones o semillas en explantos deben ser enjuagados al menos tres
plantas herbceas y aquellos tejidos veces con agua destilada estril. Algunos
meristemticos que determinan el crecimiento patgenos permanecen latentes y se expresan
en grosor, como el cambium en las plantas cuando son transferidos a un medio de cultivo
leosas. En este sentido, es importante nuevo. En general, estos pat- genos incluyen
sealar que el empleo de yemas adventicias los patgenos superficiales del material
(tambin llamadas yemas formadas de novo) vegetal, los patgenos endgenos y los
est asociado con una mayor probabilidad de patgenos propios del manejo en laboratorio.
ocurrencia de variantes somaclonales respecto En la Etapa 1 tambin pueden observarse
de los sistemas de propagacin basados en la infecciones por bacterias y hongos asociados a
regeneracin a partir de yemas axilares o trips que sobreviven a los tratamientos de
embriones somticos. La obtencin de cultivos esterilizacin y por patgenos endgenos
axnicos puede lograrse trabajando tanto latentes dentro del sistema vascular, resultado
sobre aspectos preventivos como curativos. de una esterilizacin inefectiva de los
Una accin preventiva la constituye el empleo explantos. Estos patgenos latentes podran
de mtodos de verificacin de patgenos en manejarse mediante el empleo de
los explantes. Esto puede realizarse mediante bacteriostticos o antibiticos en el medio de
anlisis especficos para las enfermedades del cultivo.
cultivo, tales como DASELISA o PCR, anlisis
Etapa 2: Multiplicacin produccin de vstagos, ya que ocurre en
sitios distintos al de los meristemas.
El objetivo de esta etapa es mantener y
aumentar la cantidad de brotes para los La embriognesis somtica es una va ms
nuevos ciclos de multiplicacin sucesivos conveniente porque permite saltar las etapas
(subcultivos) y poder destinar parte de ellos a de formacin de yemas y enraizamiento,
la siguiente etapa de produccin regenerando plantas en una forma mucho ms
(enraizamiento, bulbificacin, etc.). Ambas vas rpida y eficiente. A su vez, la disponibilidad de
de regeneracin, organognesis y protocolos para la obtencin de embriones
embriognesis, pueden darse en forma directa somticos es clave para la automatizacin de
o indirecta. Esta ltima implica la formacin de la micropropagacin y la consecuente
callo. En general, la organognesis conduce a reduccin de costos para su implementacin a
la produccin de vstagos unipolares que escala comercial. Los biorreactores son
enrazan en etapas sucesivas, mientras que equipos que contienen aproximadamente 2
por embriognesis somtica se forman litros de medio de cultivo lquido estril y donde
embriones bipolares a travs de etapas los embriones somticos pueden regenerar y
ontognicas similares a la embriognesis madurar a partir de suspensiones celulares,
cigtica. Es importante sealar que cualquiera sustentados por la circulacin permanente de
sea la va de regeneracin empleada, es nutrientes y de aire. Hoy en da, el empleo de
conveniente evitar la formacin de callo para biorreactores para la micropropagacin a gran
disminuir el riesgo de variacin somaclonal. escala est limitado por dos motivos crticos.
Los medios de cultivo, los reguladores de En primer lugar, el declinamiento de las lneas
crecimiento como auxinas, citocininas y cido celulares (clones) por efecto de la variacin
giberlico y las condiciones de crecimiento somaclonal y segundo, por los altos costos
juegan un papel crtico sobre la multiplicacin asociados con la conversin de estos
clonal de los explantos. La organognesis embriones somticos en plntulas. Las
puede darse por induccin de yemas axilares o condiciones culturales en las cuales crece el
adventicias. La induccin de yemas axilares explante son el resultado de la interaccin de
comprende la multiplicacin de yemas tres factores: el estado del explante o material
preformadas, usualmente sin formacin de vegetal, determinado en parte por el medio de
callo. La induccin de yemas adventicias cultivo, el recipiente de cultivo y el ambiente
comprende la induccin de tejido externo o condiciones de crecimiento del
meristemtico localizado mediante un cuarto de cultivo. La capacidad de respuesta
tratamiento con reguladores de crecimiento, de los explantes a un mismo medio de cultivo
conduciendo a la diferenciacin del primordio y cambia con el nmero de subcultivos, el tipo
desarrollo del vstago, esto ltimo de explante subcultivado y el mtodo del
generalmente en ausencia del regulador de repique. Por esto mismo, el medio de cultivo
crecimiento que indujo la organognesis. La debe optimizarse a fin de lograr la mayor tasa
principal desventaja del primer mtodo es que de multiplicacin vegetativa. Comnmente se
el nmero de yemas axilares por explanto emplea como medio basal el medio MS
limita la cantidad de vstagos. Esto se ve completo sugerido por Murashige & Skoog
compensado, sin embargo, por un aumento en (1962) suplementado con 3% de sacarosa
la tasa de multiplicacin con los sucesivos como fuente de carbono. A este medio se le
subcultivos. La formacin de yemas adicionan adems reguladores de crecimiento,
adventicias ofrece mayor potencial para la tanto del tipo de auxinas como de citocininas.
La etapa de multiplicacin generalmente asociada con tejidos vegetales sometidos a
comprende dos perodos, la fase de induccin situaciones de estrs, tales como aquel
y la fase de multiplicacin propiamente dicha. provocado por el dao mecnico producido
La primera implica, generalmente, el empleo durante el aislamiento del explante de la planta
de concentraciones elevadas de reguladores madre o durante la transformacin. Los
de crecimiento (generalmente de auxinas ms compuestos fenlicos liberados al medio
que citocininas) para favorecer la pueden inhibir el crecimiento e incluso matar al
desdiferenciacin. La segunda etapa requiere explante. Para minimizar el dao de estos
del empleo de un balance hormonal adecuado compuestos se emplean agentes adsorbentes
para favorecer los procesos de diferenciacin y de fenoles en el medio de cultivo, tales como el
multiplicacin celular. En este caso el sistema carbn activado y la polivinilpirrolidona o
es ms dependiente de reguladores del tipo de antioxidantes como el cido ascrbico, la
las citocininas. En algunos casos, como ocurre modificacin del potencial redox con agentes
en la formacin de embriones somticos, se reductores, la inactivacin de las fenoloxidasas
requiere de una tercera y cuarta etapa, con agentes quelantes o la reduccin de su
denominadas de maduracin y de germinacin actividad o afinidad por el sustrato utilizando
respectivamente, cuya duracin vara entre 1 a un bajo pH, bien cultivando in vitro en
2 semanas. Para la etapa de maduracin se condiciones de oscuridad. Es recomendable
adiciona ABA (cido absccico) al medio basal adems lograr que la tasa de intercambio
en rangos de 5 a 20 M, seguido del subcultivo gaseoso entre los ambientes del recipiente y
a un medio basal conteniendo AG (cido externo sea ptima, evitndose la acumulacin
giberlico) en concentraciones de 0,1-1 M, de CO2 y de etileno. En este sentido el sellado
cuyo fin es lograr la germinacin de los del recipiente es importante, el intercambio
embriones obtenidos. Los tipos de auxinas gaseoso es ms limitado con el empleo de una
ms empleados son IBA, 2,4-D, AIA, ANA y tapa de plstico que con un film de polietileno
picloram, y las citocininas BA, CIN, ZEA, 2ip y extensible. La utilizacin de una tapa perforada
TDZ. El rango de concentracin empleado con tapn de gomaespuma es altamente
vara con el regulador del crecimiento, as es recomendable. El principal problema que
que el 2,4-D, por ejemplo se utiliza en puede presentarse durante los sucesivos
concentraciones de 4-35 M mientras que otra subcultivos in vitro es la vitrificacin. La cual
auxina como el IBA, tiene un rango de 0,1 a 2 consiste en un proceso de morfognesis
M. anormal con cambios anatmicos,
morfolgicos y fisiolgicos que producen hojas
Los tipos de reguladores, sus combinaciones y de una apariencia vidriosa. Este fenmeno
rangos de concentraciones deben ser est regulado por dos factores clave que son la
optimizados para cada especie, genotipo y humedad relativa y el potencial agua, y afecta
etapa de multiplicacin determinada. Las a dos procesos fisiolgicos fundamentales, la
condiciones de incubacin de los cultivos in fotosntesis y la transpiracin. Debido a la
vitro dependen de las especies con que se disfuncin metablica asociada, las plantas se
trabaje. En el caso de las especies vuelven completamente hetertrofas y
subtropicales, por ejemplo, los cultivos se transpiran excesivamente debido a un mal
incuban en luz a 272 C con 14 horas de funcionamiento estomtico y a cambios
fotoperodo e intensidad lumnica moderada estructurales en las paredes celulares. La
(100 mol m-2 s-1). La presencia de principal consecuencia de la vitrificacin es la
compuestos fenlicos oxidados se encuentra baja supervivencia de las plntulas obtenida
durante la aclimatizacin ex vitro. Por ello, es incrementan el porcentaje de enraizamiento de
fundamental conocer el rol de los distintos vstagos axilares en plantas latifoliadas. El
factores que inciden negativamente sobre el empleo de agar presenta ventajas y
desarrollo morfognico normal (parcialmente desventajas sobre la rizognesis. Por un lado,
auttrofo) in vitro. Estos factores son el el enraizamiento de especies forestales en
ambiente de cultivo, los componentes agar se favorecera al producirse una
orgnicos e inorgnicos del medio, los rizognesis ms sincrnica como resultado del
reguladores de crecimiento, la luz y la contacto ntimo de las estacas con el medio de
temperatura. Una baja humedad relativa, cultivo. Sin embargo, las races producidas por
elevada irradiacin, la remocin de la fuente de este mtodo son usualmente engrosadas y no
carbohidratos del medio de cultivo y la poseen pelos radiculares. Adicionalmente, el
defoliacin de las plantas para estimular la empleo de agar est asociado con la formacin
formacin de hojas nuevas estimulan la de callo en la base de las estacas, que
fotosntesis y otras actividades metablicas de conduce al establecimiento de conexiones
las hojas en forma normal. Otras estrategias vasculares interrumpidas entre races y
para lograr un ptimo crecimiento implican el vstagos. Comnmente, a fin de proceder a su
empleo de retardantes del crecimiento para enraizamiento, los vstagos de buenos
estimular la formacin de hojas nuevas tamaos provenientes de la etapa de
despus del transplante. O bien, el empleo de multiplicacin y provistos de al menos 4-5
altos niveles de CO2 (antagonista del etileno) yemas, se colocan durante periodos cortos en
para estabilizar la va de lignificacin y prevenir soluciones con concentraciones elevadas de
la vitrificacin a travs de la inhibicin de la auxinas. La auxina ms utilizada es el IBA, que
hiperhidratacin, la hipolignificacin y la puede utilizarse a concentraciones de 1-10 M
formacin de aernquima. durante pocas horas. Alternativamente se
pueden emplear niveles ms bajos de auxinas
Etapa 3: Enraizamiento y aclimatizacin (0,1 a 1 M), pero manteniendo la induccin
En esta etapa se produce la formacin de por un periodo ms prolongado (3 a 7 das).
races adventicias. En las especies herbceas Luego los vstagos se transfieren a un medio
es relativamente fcil mientras que en muchas de cultivo basal desprovisto de reguladores de
especies leosas resulte ms complicada por crecimiento para permitir el desarrollo de las
su limitada capacidad rizognica. El races. Aproximadamente 20 das despus del
enraizamiento puede realizarse tanto en tratamiento de induccin, es posible la
condiciones in vitro como ex vitro. En el primer obtencin de una adecuada cantidad de races
caso pueden emplearse varios tipos de funcionales que permitan continuar hacia la
substratos y reguladores de crecimiento etapa de aclimatizacin. Es importante
(principalmente auxinas) para promover la acentuar que el uso de auxinas a elevadas
rizognesis. Los substratos incluyen: medio concentraciones es contraproducente porque
solidificado con agar, perlita y/o vermiculita induce la formacin de callo en la base de las
humedecidas con medio nutritivo o agua. En estacas. Por ello para cada cultivo es
un medio solidificado con agar, los nutrientes necesario optimizar un protocolo de
se reducen de a de la composicin rizognesis que minimice la formacin de callo
original, y la sacarosa se reduce a una y maximice la tasa de rizognesis y
concentracin final de 1-2%. Medios con baja supervivencia de las plantas. El enraizamiento
concentracin salina, como el WPM (Lloyd & ex vitro permite que el enraizamiento y
McCown, 1981) y GD (Gresshoff & Doy, 1972) aclimatizacin se logren simultneamente y
que raramente se forme callo en la base de las pimientos y zanahorias) y leguminosas
estacas, asegurando as una conexin forrajeras (alfalfa, man, trbol blanco) y
vascular continua entre el vstago y la raz. Sin protocolos para especies modelo como
embargo, el estrs asociado a la transpiracin Arabidopsis y tabaco. En todos los casos, las
acelerada de las plantas durante las etapas formas de propagacin son las mismas. Se
iniciales del trasplante puede reducir emplean vas de regeneracin por formacin
considerablemente la tasa de supervivencia. de yemas axilares, yemas adventicias y
Por ello, es conveniente contar con embriognesis somtica. En los dos primeros
instalaciones de invernadero o cmaras de casos, el sistema de propagacin a travs de
crecimiento adecuadas para brindar la organognesis directa asegura la estabilidad
temperatura y humedad relativa moderadas gentica de las plantas regeneradas y se
que permitan lograr la rusticacin de las emplean cuando el objetivo es la propagacin
plantas en forma progresiva. Bajo condiciones clonal a gran escala. La embriognesis u
ex vitro se utilizan diferentes substratos, organognesis indirecta, con formacin de
mezclas de tierra y arena y/o abonos, los callo, se emplea en cambio para generar
cuales convienen que estn debidamente variabilidad en programas de mejoramiento. En
desinfectados. el caso de ajo y cebolla, por ejemplo, las
etapas de la micropropagacin incluyen tanto
La micropropagacin de especies herbceas la multiplicacin de yemas axilares por el
est orientada a proveer material libre de cultivo de meristemas, la formacin directa de
patgenos, propagar material seleccionado por yemas adventicias en explantos obtenidos a
su mayor rendimiento o por su mayor partir de placas basales o umbelas inmaduras
resistencia a enfermedades y estreses y la formacin indirecta de yemas adventicias
ambientales, conservar la diversidad especfica y/o embriones somticos obtenidos a partir de
en bancos de germoplasma, obtener material callos que provienen de distintos tipos de
para estudios fisiolgicos y genticos y sentar explantos (meristemas, brotes, placa basal
las bases para la aplicacin de tcnicas de races). En el caso de alfalfa y otras
ingeniera gentica. Existe una gran variedad leguminosas como soja y man la
de protocolos, desarrollados en funcin de la micropropagacin es llevada a cabo por la va
especie y de los objetivos de la propagacin. de la embriognesis somtica, donde los
Existen protocolos generales para embriones se obtienen utilizando tejidos
monocotiledneas como en el caso ciertos juveniles (embriones, cotiledones y pecolos)
cereales (trigo, maz, cebada, avena, arroz), como explantos. En algunos casos como pasto
pasturas (pasto bermuda, festuca alta, raigrs, llorn (Eragrostis curvula) es posible la
pasto llorn) y hortcolas (cebolla, ajo, puerro); regeneracin de plantas mediante embriog-
protocolos generales para dicotiledneas que nesis, organognesis y regeneracin directa a
incluyen especies hortcolas (tomate, papa, partir de los explantos.
Resultados

Discusin de micropropagacin

Como bien sabemos la micropropagacin consiste en la propagacin asexual de plantas usando la


tcnica de cultivo de tejidos vegetales. Esto significa que una porcin pequea de tejido vegetal de
una planta selecta por determinadas caractersticas, en el caso de la practica de violeta africana
Saintpaulia ionantha WendI se introduce en un recipiente estril, con medio de cultivo para que la
planta tenga todos los nutrientes que necesita. En el caso ideal la planta crece y va generando
nuevos vstagos que pueden subdividirse usualmente cada 4 a 8 semanas, generando nuevos
plantines clonados a partir de ese explante original4.

Dentro de los cinco pasos de la micropropagacin (Etapa 0: seleccin y acondicionamiento de la


planta madre, etapa 1: establecimiento de cultivos axnicos, etapa 2: regeneracin de las plantas a
partir del explante, etapa 3: procesamientos de alargamiento y etapa 4: aclimatacin) los puntos
clave son la seleccin de la planta madre, el trabajo en condiciones aspticas y la proporcin de
condiciones de cultivo adecuadas. De acuerdo al prembulo anterior y a los resultados obtenidos en
la presente prctica se realiza el siguiente anlisis:

De acuerdo a los resultados mostrados en los explantes en la primera revisin, podemos decir que la
cantidad de estos que no presentaron contaminacin y tampoco estaban oxidados en el caso de
nuestro equipo fueron mayores a la media reportada, as como en el caso de los no contaminados y
oxidados, por lo que en este punto haba una ventaja pues se reflejaba la buena respuesta por parte
de los explantes. Para aquellos cultivos que se encontraban contaminados y no oxidados no se
reportaron valores en el equipo, aunque si para aquello contaminados y oxidados, siendo estos
valores mucho menores a la media establecida por el grupo, con ello hasta ese momento podamos
decir que se haba estado trabajando adecuadamente pues los valores de contaminacin de
explantes eran mucho menores a los valores de explantes contaminados. Ahora bien, para la
segunda revisin ya se haban desechado todos aquellos explantes contaminados encontrados en la
primera revisin, de acuerdo a los resultados obtenidos esta segunda vez la cantidad de explantes
no contaminados, as como no oxidado era mucho mayor a la del grupo en general, mientras que la
cantidad de aquellos explantes no contaminados pero oxidados descendi en gran medida
comparada con el grupo. En cuanto a los contaminados, en el caso del equipo no se mostr
presencia de ninguno.
Para los frascos se realiz una lectura inicial y una final, en el caso de la primera como podemos ver
en la tabla correspondiente, la cantidad de frascos no contaminados y no oxidados en el equipo fue
mayor comparada con los datos del grupo en general. Cuando se observaron los no contaminados
oxidados obtuvimos valores ligeramente por debajo de la media. En el caso de los contaminados y
no oxidados no se reportaron datos en el equipo y finalmente en los contaminados y oxidados
definitivamente nuestros valores superaron a los de la media. Ahora bien en la ltima revisin la
cantidad de frascos que no estaban contaminados ni oxidados fueron mucho menores a los primero
reportados, pero se mantuvieron por arriba de los resultados grupales. En cuanto a los frascos no
contaminados pero oxidados los valores obtenidos por el grupo disminuyeron comparados con los de
la primera lectura y respecto a ellos tambin los valores obtenidos por el equipo. En esta ltima
lectura ya no se encontraron frascos contaminados no oxidados o contaminados oxidados.

La contaminacin en los frascos y explantes por parte del equipo pudo deberse a las malas
condiciones de siembre y resguardo de estos, as como a la falta de cuidado al tapar los frascos,
siendo los hongos los principales tipos de agentes que pueden provocar su contaminacin pues
estos son cosmopolitas, entre ellos los ms comunes son Aspergillus, Fusarium, Penicillium1.

La oxidacin presente en explantes y frascos tiene una explicacin ms profunda. la oxidacin u


oscurecimiento de tejidos cultivados in vitro, se puede definir como la oxidacin, por radicales libres,
de diferentes componentes celulares, as como, la oxidacin de compuestos fenlicos catalizado por
la enzima polifenol oxidasa (PPO) para producir quinonas, las cuales son especies qumicas muy
reactivas y propensas a reaccionar, generando dao e incluso la muerte celular (Amiot et al. 1996,
Bray et al. 2000). Segn lo reportado por George 1993, Tabiyeh et al. 2006, Van Staden et al. 2006,
Abdelwahd et al. 2008 en el caso particular del cultivo de tejidos in vitro, los procesos de oxidacin
son causados principalmente por el efecto abrasivo del agente desinfectante aplicado durante la
asepsia del explante, los cortes que sufre el explante, composicin del medio de cultivo, volumen y
calidad del frasco de cultivo3.

El medio de cultivo empleado contaba con todos los promotores de crecimiento vegetal necesarios,
as como con los macro nutrientes, micronutrientes y necesarias para el desarrollo de nuestro
explante, sin mencionar tambin la presencia de agentes quelantes como el EDTA para la
disponibilidad de hierro2 y la presencia de agar para sostener el nuevo cultivo y donde estaban
dispersos todos estos compuestos. Cabe destacar que la mayora de los cultivos de clulas
vegetales no son auttrofos y por lo tanto dependen completamente de una fuente externa de
carbono. En muchos casos, se prefiere sacarosa como en l nuestro. Por lo anterior podemos decir
que la falta de crecimiento de estos no se ve atribuida a problemas en la cantidad y tipo de sustratos
aadidos, a continuacin, se mencionan las cuales fueron esos sustratos aadidos: Macroelementos
(N, P, K, Ca, Mg, S) y micro elementos (Fe, Co, Zn, Ni, B, Al, Mn, Mo, Cu, I) en proporciones
adecuadas. Vitaminas: piridoxina y acido nicotnico. Hormonas reguladoras del crecimiento como
auxinas: promueven la elongacin celular, la formacin de callos y races adventicias, inhiben la
formacin de brotes axilares adventicios y, en ocasiones, inhiben la embriognesis. Citocininas:
promueven la divisin celular, regulan el crecimiento y el desarrollo de los tejidos vegetales.

Conclusin

La micropropagacin de violeta africana Saintpaulia ionantha WendI no pudo concluirse de acuerdo


a lo planteado en el procedimiento de la prctica, esto debido a la falta de explantes viables. Tal
situacin la propiciaron diversos factores, dentro de los cuales uno de los ms importante fue la
contaminacin de los medios por falta de cuidado por parte de los alumnos, sin embargo, podemos
decir que la aplicacin de esta biotcnica resulta una metodologa apropiada para la multiplicacin a
gran escala de esta especie cuando se lleva a cabo de manera apropiada, es decir cuidando la
seleccin de la planta madre, el trabajo en condiciones aspticas y el propiciamento de condiciones
de cultivo adecuadas.

Bibliografia

1. Hongos y levaduras; https://prezi.com/bmb-v_btc-xe/hongos-y-levaduras-que-afectan-a-los-alimentos/ ; consulta 05 de


junio de 2017 a las 6:05 pm
2. MANUAL DEL LABORATORIO E CULTIVO DE TEJIDOS ELABORADO POR: Dr. Jess Agustn Badillo Corona Dra.
Mara del Carmen Oliver Salvador IBt. Karen Gisela Moreno Guerrero
http://www.biblioteca.upibi.ipn.mx/Archivos/Material%20Didactico/Manual%20del%20Laboratorio%20de%20Cultivo%20d
e%20Tejidos%20.pdf Consulta 08 de junio de 2017 a las 11:00 am
3. PROBLEMAS DE OXIDACIN Y OSCURECIMIENTO DE EXPLANTES CULTIVADOS in vitro; lvaro Azofeifa2
http://www.mag.go.cr/rev_meso/v20n01_153.pdf consulta 08 de junio de 2017 a las 12:17 pm
4. Micropropagacin de Saintpaulia ionantha H. Wendel var. Bangle Blue. Terenti, C. M.; P. Verdes;
http://www.exactas.unca.edu.ar/HUAYLLUBIOS/num-7/2.pdf consulta 07 de junio de 2017 a las 3:00 pm
Villalvazo Gonzlez Marcos Paris

Los explantes son de diversa naturaleza, pueden ser porciones de tejido, clulas sueltas,
protoplastos, esporas, granos de polen o semillas. Con excepcin de los vulos y el polen, los
explantes estn constituidos por tejidos y/o clulas somticas. El tipo de explante a usarse en los
procesos de micropropagacin depende de la especie con la que se est trabajando y de los
objetivos que se persigan. Explantes como los meristemos apicales y las yemas axilares son
genticamente muy estables, este tipo de explantes sirve para reproducir mltiples clones de una
forma o variedad con caractersticas especiales que se desea mantener en el cultivo. Otros
explantes como las yemas adventicias son ms bien genticamente inestables y producen un alto
grado de variabilidad en los clones, este procedimiento no es til para la produccin de plntulas con
una determinada caracterstica de cultivo, pero si lo es para el fitomejoramiento, ya que mediante
esta variacin semi natural, es posible obtener nuevas lneas de cultivo.

Pueden ser aplicaciones para: Estudios bsicos. En este caso, los explantes cultivados pueden ser
diversos. Si lo nico que se quiere lograr es un sistema de callos para estudiar algn proceso
fisiolgico, se puede cultivar cualquier rgano, tejido o clula viva. En este caso en que lo nico que
se busca es la induccin de callos lo ideal es cultivar explantes jvenes, derivados de semillas en
germinacin, donde se obtienen respuestas rpidas y, en general, hay menores problemas de
contaminacin con microorganismos. Obtencin de plantas con sanidad controlada. Es muy comn
la utilizacin del cultivo de tejidos para la obtencin de plantas libres de virus. El explante ideal para
ello es el meristema (dependiendo de la especie, de 0,2 - 0,5mm de longitud) consistente del domo y
de un par de primordios foliares. Micropropagacin. En este caso depender del sistema que se
quiere utilizar. Si lo que se quiere explotar es la brotacin de meristemas, los pices terminales y los
segmentos uninodales de ramas jvenes constituyen excelentes explantes. En este caso el
cultivador de tejidos debe conocer perfectamente la biologa de la reproduccin de la planta para
aprovechar aquellos explantes que en forma natural son propgulos. En cambio, si se pretende
micro propagar mediante el empleo de semillas sinttica el explante original deber posibilitar la
induccin de la embriognesis somtica. En este caso, la utilizacin de embriones zigticos
inmaduros u hojas, suelen ser frecuentes como explantes. Obtencin de hbridos interespecficos.
Una de las primeras aplicaciones del cultivo de tejidos en la agricultura lo constituy su empleo como
ayuda para la obtencin de hbridos derivados de cruzamientos interespecficos, donde se produce el
aborto temprano de embriones. En estos casos, el explante cultivado es el embrin cigtico en
estadios tempranos de su desarrollo. Con la misma finalidad tambin se utilizan ovarios u vulos
fecundados. Obtencin de plantas de semillas con embriones rudimentarios. Para esta finalidad los
explantes pueden ser semillas (por ej. orqudeas) o bien, se aslan los embriones en un estado
temprano de desarrollo (corazn) como en el caso de yerba mate o de algunas variedades de
duraznero. Obtencin de plantas haploides: En este caso, los explantes ms utilizados son las
anteras, aunque tambin pueden emplearse microsporas aisladas, vulos y ovarios no fertilizados.
Induccin de variacin somaclonal. En este caso se pueden utilizar varios explantes, pero si la
finalidad de su utilizacin es la aplicacin en planes de mejoramiento gentico de plantas, los
explantes utilizados deben posibilitar la regeneracin de plantas enteras. Produccin y/o conversin
de sustancias tiles. Se puede utilizar una gran variedad de explantes. Los de races suelen ser muy
utilizados. Obtencin de hbridos somticos. Para esta finalidad se recurre a la fusin de
protoplastos. En la mayora de los casos se aslan los protoplastos de mesfilos de hojas y de
suspensiones celulares. Conservacin e intercambio de germoplasma. Los meristemos son los
explantes preferidos para el desarrollo de sistemas de conservacin a mediano y largo plazo
(crioconservacin con nitrgeno lquido) y para el intercambio de material gentico. Establecimiento
de suspensiones celulares. En este caso se recomienda iniciar los cultivos a partir de explantes
extrados de semillas en germinacin (hipoctilo, epictilo, cotiledones, races).
Posibilidad de contaminacin con microorganismos
De ser posible, se deben cultivar explantes de plantas donantes que crecen en condiciones
de invernadero, con ello se reduce sustancialmente las tasas de contaminacin. Por otra parte, es
recomendable evitar el uso de explantes sucios (races, rizomas) que provienen de plantas crecidas
en macetas o en el campo, dado que en la mayora de los casos no es posible conseguir una buena
desinfeccin de los mismos.

Edad fisiolgica
Este es un aspecto de gran influencia en la morfognesis. Como regla general se puede decir que
cuando ms joven e indiferenciado se encuentre el explante a cultivar, mejor ser su respuesta in
vitro. Es por ello que los meristemos apicales y axilares son ampliamente usados en numerosas
especies. En el caso de la micropropagacin de plantas leosas, la edad del explante es un factor
crtico. Si los tejidos son jvenes, la micropropagacin tiene mayores posibilidades de ser exitosa
que con tejidos maduros. Este hecho genera la necesidad de realizar tratamientos de
rejuvenecimiento de las plantas donantes de explantes.

Tamao
En general, cuanto ms grande sea el explante mayores sern las posibilidades de inducir la
proliferacin de callos o la regeneracin directa de rganos. Sin embargo, a mayor tamao de
explante tambin son mayores las probabilidades de que los cultivos se contaminen con
microorganismos. Tambin es necesario tener en cuenta que existe un tamao mnimo del explante,
que depende de la especie y del material vegetal, por debajo del cual no es fcil lograr el
establecimiento de los cultivos. Los explantes muy pequeos suelen requerir del empleo de medios
ms complejos o de los denominados medios acondicionados.

poca del ao
Es un factor que suelen tener mucha importancia en la micropropagacin y que generalmente est
asociado al grado de dormicin que presentan ciertos explantes (yemas, por ejemplo) y tambin con
la posibilidad de mayor o menor proliferacin de microorganismos.
Organognesis y Embriognesis

La organognesis es la formacin de brotes o races mediante el cultivo in vitro de explantes (directa)


o de callos (indirecta). Este proceso puede ocurrir mediante dos vas; organognesis axilar u
organognesis adventicia. La axilar es la formacin de brote a partir de yemas preexistentes,
mientras que la adventicia (de novo) consiste en la induccin de regiones meristemticas. En plantas
dicotiledneas y en reas como cultivo in vitro, micropropagacin e ingeniera gentica, la produccin
de brotes adventicios va organognesis es muy utilizada.

La morfognesis es la regeneracin de brotes, races o embriones, para dar lugar a una planta
mediante dos vas: embriognesis somtica y organognesis, los cuales pueden ser directos (clulas
diferenciadas que dan lugar a una nueva estructura a partir del tejido original de la planta, sin
formacin de callo) o indirectos (clulas no especializadas, desorganizadas y desdiferenciadas,
formacin de callo). Estos procesos se basan en la totipotencia celular por la que todas las clulas
vegetales tienen la capacidad de regenerar plantas completas.

Para estas dos vas se involucran 3 fases, en las cuales implica un desarrollo organizado que
consiste en la activacin de clulas quiescentes o inactivas para que sean capaces de dividirse.
Fase 1. Las clulas adquieren competencia morfognica o capacidad para responder a las seales
hormonales. La desdiferenciacin consiste en que las clulas adultas vivas, an cuando sean clulas
especializadas y con una estabilidad fisiolgica, puedan recobrar su actividad meristemtica cuando
son estimuladas adecuadamente. Este proceso se puede ver afectado cuando hay una modificacin
profunda del protoplasto o su desaparicin. Se desarrolla actividad meristemtica la cual consiste en
la activacin metablica de las clulas quienes tendrn la facilidad de volver a una clula quiescente
(inactiva) en clulas en divisin y con va a desdiferenciacin.

Fase 2. Las clulas se vuelven competentes. Son clulas que adquieren capacidad inductiva
(determinacin de las clulas para formar rganos especficos en respuesta a seales exgenas
producidas por hormonas y a la interaccin celular o induccin).

Fase 3. Las clulas se diferencian morfolgicamente. Formacin de rganos independientemente de


la aplicacin de reguladores exgenos (reaccin a seales especficas) (diferenciacin).

La embriognesis es uno de los procesos ms importantes en el ciclo de vida de las plantas, el cual
comienza con una fecundacin doble (embriognesis cigtica), seguido de la determinacin de los
ejes embrionarios (basal y apical) y el cambio morfolgico de estos (globular, torpedo y corazn).
Este proceso es regulado por numerosos factores incluyendo fitohormonas, enzimas y otras
sustancias relacionadas con la embriognesis.

La embriognesis somtica es el proceso asexual por el cual las clulas somticas se diferencian en
embriones somticos (sin fusin de gametos, no forma conexin vascular con el tejido original), sin
embargo, los embriones somticos son morfolgicamente parecidos a los embriones cigticos.
Durante este proceso se lleva a cabo la expresin de diferentes genes que confieren a las clulas
somticas la capacidad de manifestar su potencial embriognico. Este proceso implica por lo tanto
una gran cantidad de eventos moleculares que abarcan no solo la expresin de genes, si no de
diversas vas de transduccin de seales de activacin / represin de una gran cantidad de genes,
los cuales provocan cambios fisiolgicos, bioqumicos, metablicos y morfolgicos.