Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427

www.elsevier.com/locate/patbio

Mini-symposium sur les microbilles et cytométrie

Microbilles, nanobilles et cytométrie : applications à l’analyse

et à la purification cellulaire et moléculaire
Microbeads, nanobeads and cytometry: applications to the analysis
and purification of cells and biomolecules
G. Lizard a,*, L. Duvillard a, N. Wedemeyer b, C. Muller c, F. Ghiringhelli d, A. Cesbron e,
P. Poncelet f, F. Gallet g, E. Kahn h, P. Gambert a, W. Göhde i
a
Laboratoire de biochimie médicale, CHU/hôpital du Bocage, Inserm U498, IFR 100, BP 77908, 21079 Dijon cedex, France
b
Praenadia GmbH, Hafenweg 46–48, 48155 Münster, Allemagne
c
UFR de sciences pharmaceutiques, université Louis-Pasteur, UMR CNRS 7034, 74, route du Rhin, BP 24, 67401 Illkirch cedex, France
d
Faculté de médecine, Inserm U517, IFR 100, 7, boulevard Jeanne-d’Arc, 21000 Dijon, France
e
Laboratoire HLA, EFS Pays de la Loire, 34, boulevard Jean-Monnet, BP 91115, 44011 Nantes cedex 1, France
f
BioCytex, 140, chemin de l’Armée-d’-Afrique, 13010 Marseille, France
g
Université Paris VII, UMR CNRS 7057, FR 2438, case 7056, 2, place Jussieu, 75251 Paris cedex 05, France
h
CHU, Pitié-Salpétrière, Inserm U494, 91, boulevard de l’Hôpital, 75634 Paris cedex 13, France
i
Institut für Strahlenbiologie, Westfälische Wilhelms-Universität Münster, Domagkstr. 11, 48149 Münster, Allemagne

Reçu le 14 mars 2003 ; accepté le 17 avril 2003

Résumé

Les nanobilles et les microbilles sont des outils importants en cytométrie. Les microbilles ont d’abord été utilisées pour optimiser les
signaux de diffraction et de fluorescence analysés par cytométrie en flux ainsi que pour évaluer la phagocytose. Couplées de façon covalente
à des anticorps, les nanobilles ont servi à révéler des antigènes cellulaires. Actuellement, des microbilles particulières permettent de quantifier
de manière absolue des sites antigéniques. Par ailleurs, les nanobilles et les microbilles magnétiques constituent un outil important de
purification cellulaire et moléculaire. Les méthodes analytiques faisant appel aux microbilles se sont étendues à la détection de protéines,
d’acides nucléiques et d’ions. Pour cela, des microbilles de fluorescences différentes sont couplées à des anticorps, des oligonucléotides ou des
chélatants. Les applications de ces méthodes multiplexées qui permettent l’identification et la quantification simultanée de plusieurs ions ou
macromolécules concernent aussi l’identification d’activités enzymatiques et les analyses de polymorphisme. Avec les microbilles utilisées
comme support réactionnel, les domaines d’application de la cytométrie en flux vont ainsi de l’analyse cellulaire à l’analyse moléculaire. Les
microbilles sont aussi utilisées comme outil de calibration en microscopie confocale mais aussi pour la micromanipulation d’objets
biologiques à l’échelle cellulaire ou moléculaire. Des innovations méthodologiques importantes associées aux nano et aux microbilles sont
prévisibles en biologie, médecine, agro-alimentaire et environnement.
© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Abstract

Nano and microspheres are important tools in cytometry. They have been used in first to optimize fluorescent signals detected by flow
cytometry and to evaluate phagocytosis. Some antigens were also detected by using nanospheres covalently coupled to antibodies. Specifically
dedicated microspheres are now widely used for antigenic quantitation by flow cytometry, and magnetic nano and micropheres are very usefull
for cellular and molecular purifications. To date, analytical methods based on the use of microspheres are developed to detect proteins, nucleic
acids, and ions. To this end, antibodies, oligonucleotides, or chelating agents are bound to microspheres characterized by different
fluorescences. The applications of these multiplexed microspheres assays allow to identify and quantify simultaneously some macromolecules
and ions, but they also permit to analyze enzymatic activities and to perform polymorphism analyses. With microspheres used as reactive

* Auteur correspondant.
Adresse e-mail : Gerard.Lizard@u-bourgogne.fr (G. Lizard).

© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

doi:10.1016/S0369-8114(03)00127-5
 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427 419

support, molecular analyses are therefore possible by flow cytometry. Nano and microspheres are also usefull tools for calibration in confocal
microscopy as well as for micromanipulations of biomolecules and of living cells. Inovative methods based on the use of nano and
microspheres are expected in the fields of biology, medicine, food industry, and environmental sciences.
© 2003 Éditions scientifiques et médicales Elsevier SAS. Tous droits réservés.

Mots clés : Microbilles ; Nanobilles ; Quantification ; Tri ; Analyse multiplexée ; Cytométrie

Keywords: Microspheres; Nanospheres; Quantification; Purification; Multiplexed analysis; Cytometry

1. Introduction tion lumineuse (stabilité), chemin optique (filtres, miroirs),

Les progrès de la cytométrie, en particulier de la cytomé-
trie en flux, sont difficilement concevables sans prendre en
compte les technologies associées aux microbilles et aux
nanobilles. En effet, ces dernières sont non seulement néces-
saires pour s’assurer du bon fonctionnement des cytomètres
en flux et des microscopes confocaux en permettant d’opti-
miser la détection des signaux de diffraction et de fluores-
cence [1] mais elles constituent aussi des outils indispensa-
bles dans de nombreux domaines de la biologie pour la
quantification antigènique [2], la purification cellulaire et la
purification moléculaire [3]. Grâce à l’élaboration de micro-
billes fluorescentes couplées à des anticorps, à des protéines
ou à des oligonucléotides, des méthodologies conduisant à
quantifier simultanément par cytométrie en flux plusieurs
protéines ou nucléotides émergent actuellement et laissent
envisager le développement de techniques d’analyses multi-
plexées performantes (simples, rapides et sensibles) dans de
nombreux domaines : biologie (bactériologie, génétique, pa-
rasitologie, virologie), médecine humaine (médecine infan-
tile, médecine d’urgence, cancérologie, endocrinologie,
transplantation, transfusion) et vétérinaire, agro-alimentaire
(contrôle qualité), environnement (qualité de l’eau et de l’air)
[4–7].
photomultiplicateurs et système d’exploitation des données.
Mélanger à l’échantillon à analyser, les microbilles peuvent
aussi servir de standard interne pour du dénombrement afin
de déterminer une quantité de cellules par unité de volume
[9].
En microscopie confocale, l’utilisation des billes permet
aussi de bien caractériser chacun des éléments de la chaîne
d’acquisition (objectifs, filtres, miroirs, source d’excitation)
tant en terme de fluorescence qu’en terme de résolution
spatiale. Les billes fluorescentes sont des outils qui modéli-
sent les fluorochromes et permettent de vérifier leur détecta-
bilité et de conditionner les caractéristiques de leur détection
(choix des longueurs d’onde d’excitation, des filtres d’émis-
sion, de l’amplification et de la sensibilité des détecteurs,
analyse de la vitesse de blanchiment, présence d’autofluores-
cence, perte de spécificité, altérations de balayage, décalages
dans les chemins optiques). En microscopie confocale, les
microbilles permettent ainsi de vérifier que les appareils de
mesure sont optimisés et que les images conduisant à juger
de colocalisation et d’analyse 3D ou 4D sont pertinentes
[10].
3. Microbilles, cytométrie en flux et quantification
antigénique

2. Utilisation des microbilles pour l’optimisation
des signaux en cytométrie en flux et en microscopie
confocale
Afin d’obtenir par cytométrie en flux des résultats repro-
ductibles et comparables, fondés sur la quantification de
fluorescence, la détermination de la taille et l’évaluation des
structures internes (définies sous le terme de granularité
cellulaire), il est nécessaire d’optimiser régulièrement le
fonctionnement des cytomètres en flux utilisés. Une des
premières applications des microbilles a donc été l’optimisa-
tion des signaux de fluorescence et de diffraction aux petits
angles et aux grands angles mesurés par l’intermédiaire des
cytomètres en flux [8]. Pour cela, des microbilles fluorescen-
tes de diamètres de l’ordre de 3 à 5 µm sont généralement
utilisées (www.polysciences.com ; www.probes.com ; www.
spherotech.com ; www.dukescientific.com). Elles permet-
tent simplement et rapidement d’évaluer les capacités et les
performances d’un cytomètre en flux à différents niveaux :
système fluidique (écoulement laminaire), source d’excita-
Les cytomètres en flux sont couramment utilisés pour
étudier une population cellulaire hétérogène et pour y détec-
ter des cellules particulières sur la base d’informations qua-
litatives (positivité d’un ou plusieurs marqueurs) ainsi que
pour en établir le dénombrement. Mettre la métrie dans
l’immunocytométrie, c’est utiliser au mieux les performan-
ces de mesure des intensités de fluorescence que les cytomè-
tres peuvent effectuer sur chaque cellule prise indépendam-
ment. C’est, au-delà du dénombrement des cellules, réaliser
le dénombrement des molécules présentes sur ces cellules.
Classiquement, ces mesures d’intensité de fluorescence dé-
terminées par cytométrie en flux sont établies de façon rela-
tive (unités arbitraires de fluorescence) : telle sous-
population est plus fortement marquée que telle autre issue
du même échantillon ou d’une même série. À l’instar du
dosage immunologique d’une molécule soluble (rendu par
exemple en ng/ml), le résultat d’un dosage moléculaire sur
cellules devrait être exprimé en unités physiques tangibles
(nombre de molécules par cellule). Pour arriver à ce mode
d’expression de résultats par cytométrie en flux, on a recours
420 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427
Schéma 1 : différents types de billes de calibration.
à des systèmes de calibrage qui relient, plus ou moins direc-
tement, l’intensité de fluorescence mesurée par l’instrument
au nombre de molécules d’anticorps monoclonaux fixées sur
l’antigène cellulaire. Ces calibrants doivent fournir une série
de niveaux différents en intensité et correspondent aux stan-
dards de type III A, B ou C selon la nomenclature suggérée
par A. Schwartz [11]. Les points-clefs de ces dosages d’anti-
gènes cellulaires se situent au moins autant dans la maîtrise
des réactifs immunologiques que dans le calibrage de l’ins-
trument. Il est donc justifié de les classer par type de billes :
billes de calibrage fluorescentes dans la masse ou en surface,
billes de calibrage immunologiques (Schéma 1).
Les billes fluorescentes dans la masse fournissent des pics
de fluorescence très fins, d’une excellente stabilité et d’une
proportionnalité parfaite entre les divers niveaux d’intensité,
ces systèmes sont d’excellents outils pour le contrôle de la
linéarité en fluorescence d’un instrument ainsi que dans le
contrôle de sa stabilité dans le temps. Leurs limitations pour
des applications d’immunodosages cellulaires sont toutefois
nombreuses : pas de cohérence spectrale avec les réactifs
[12] ce qui signifie que le calibrage dépend des filtres opti-
ques de chaque instrument, de la nature des fluorochromes
sensibles ou non à l’environnement (pH, fixateurs, etc.) mais
aussi de paramètres immunologiques (taux de couplage F/P,
valence de l’anticorps monoclonal utilisé). Une erreur fonda-
mentale consisterait à utiliser directement en immunocyto-
métrie quantitative les valeurs de calibration fournies, pour
information seulement, en molécules d’équivalent fluoro-
chrome (MEF).
Avec les billes fluorescentes en surface, le fluorochrome
greffé en surface est (en théorie au moins) le même que celui
des anticorps monoclonaux conjugués. Il présente la même
sensibilité au pH (important dans le cas de l’isothiocyanate
de fluorescéine (FITC)) et un spectre de fluorescence identi-
que [11,12]. La réalité est parfois décalée de la théorie. Ainsi,
la phycoérythrine (PE), dont la brillance change selon la
pureté et les lots de production, n’est pas toujours identique
sur les billes et les anticorps monoclonaux–PE et les tandems
PE–Cy5, déjà variables d’un conjugué à l’autre. Pour quan-
tifier les molécules d’anticorps monoclonaux fixées sur des
cellules en immunofluorescence directe avec de tels cali-
brants, il faut impérativement maîtriser le taux de couplage
(rapport F/P) des réactifs [13]. Hormis le cas des conjugués
anticorps monoclonaux–PE garantis, vendus pour utilisation
avec les billes QuantiBrite®, cette information est rarement
disponible et sa maîtrise délicate [13].
Pour ce qui est des calibrants immunologiques, ils
contiennent des billes non fluorescentes dotées d’une capa-
cité de fixation des anticorps fluorescents (ABC pour Anti-
body Binding Capacity ou Antibody Bound per Cell). Dans
le système Quantum Simply Cellular® (Bang’s Laborato-
ries, États-Unis), les billes fixent les anticorps monoclonaux
conjugués par une anti-immunoglobuline. Ces calibrants
sont adaptés à l’immunofluorescence directe et sont étalon-
nés en nombre de molécules d’anticorps monoclonaux fixées
par billes (ABC) à saturation complète. À ce titre, ils ne
réclament pas la maîtrise du F/P et garantissent l’utilisation
du même fluorochrome que celui porté par les anticorps
monoclonaux. Ce concept à la fois simple et générique a
attiré de nombreux utilisateurs. Cependant, sa fiabilité a été
remise en cause par des utilisateurs experts, du fait de 2 limi-
tations techniques majeures [14,15] : d’une part, les concen-
trations d’anticorps monoclonaux et les temps de contact
avec les billes sont très supérieurs aux conditions pratiquées
 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427
avec les cellules ; ce décalage aboutit à des surcoûts impor-
tants et/ou à des surévaluations artéfactuelles des ABC mesu-
rés sur cellules ; d’autre part, les valeurs ABC mesurées avec
le même anticorps monoclonal conjugué FITC, PE ou PE–
Cy5 étant différentes, les calibrations ne peuvent être consi-
dérées comme fiables. Par ailleurs, une technique de quanti-
fication par immunofluorescence indirecte [15] est à la base
de plusieurs générations de calibrants, progressivement amé-
liorés dans leur utilisation pratique et leurs performances
[16]. Ces derniers sont composés de billes chargées d’IgG de
souris qui miment les cellules marquées à différents niveaux
par un anticorps monoclonal. Ces calibrants ont été étalonnés
par comparaison à des techniques radio-immunologiques.
Après le Qifikit®, outil de calibration pour les grosses cellu-
les dans des techniques avec lavages, des calibrants adaptés à
l’exploration des plaquettes par leur taille (3 µm), leur
gamme de calibration (1000–100 000 ABC) et l’absence de
lavage, ont été proposés, soit sous forme de kits complets
orientés vers des applications précises (gamme Platelet, Bio-
Cytex), soit sous forme de kits de calibration ouverts à tous
les anticorps monoclonaux de souris (Platelet Calibrator). Le
Cellquant Calibrator, optimisé pour l’analyse des leucocytes
en sang total, permet la calibration immunologique sur la
fluorescence verte du FITC avec contre-marquages dans les
autres couleurs. Ces systèmes allient une série d’avantages :
• sensibilité : le marquage indirect apporte une amplifica-
tion permettant la mesure de 500 molécules d’anticorps
monoclonal par cellule ;
• aspect générique : un calibrage unique sert à l’ensemble
de tous les anticorps monoclonaux d’une même série,
aussi grand soit le panel d’anticorps monoclonaux ;
• contrôles de bruit de fond : alors qu’en immunofluores-
cence directe les contrôles négatifs sont quasiment irréa-
lisables du fait des F/P très disparates cette approche
d’immunofluorescence indirecte permet de mesurer le
marquage non spécifique avec un contrôle isotypique
[17]. La correction ainsi permise est particulièrement
significative pour les cellules à fort bruit de fond (mono-
cytes, macrophages, cellules myéloïdes, cellules dendri-
tiques ou endothéliales, etc.) et les antigènes faiblement
représentés (< 3000 ABC pour des plaquettes,
< 10 000 ABC pour des lymphocytes) ;
• fiabilité : garantie par la reproductibilité lot à lot main-
tenue sur de longues années [15] et, pour les approches
avec contre-marquage, par la priorité donnée à l’anti-
corps monoclonal de mesure (évite les inhibitions stéri-
ques apportées par les conjugués PE) et le choix du canal
FITC (le moins perturbé par les fuites optiques et les
problèmes de compensation de fluorescence).
Ainsi, l’utilisation des microbilles comme outils de cali-
brage illustre la portée de la dimension « mesure » disponible
dans l’immunocytométrie, et permet d’envisager largement
(grâce aux valeurs absolues fournies) l’accès à la biologie
clinique. Au laboratoire, cette méthode de quantification an-
tigénique par cytométrie en flux a été appliquée avec succès
chez des patients diabétiques de type 2 pour évaluer les effets
421
de l’insuline au niveau de l’expression des récepteurs des
lipoprotéines de faible densité exprimés par les monocytes
circulants [18].
4. Nanobilles et microbilles : applications au tri
cellulaire et moléculaire
Depuis longtemps, les phénomènes magnétiques ont été
utilisés pour isoler les substances magnétiques. L’application
de ces techniques en biologie pour séparer des cellules ou des
molécules non magnétiques s’est développée ces dernières
années grâce à l’apparition de nouvelles particules magnéti-
ques. La séparation cellulaire par billes magnétiques a de
nombreux avantages par rapport aux autres techniques de
séparation. En effet, cette technique permet d’isoler des cel-
lules provenant directement d’échantillons non traités
comme le sang ou la moelle osseuse. Comparée aux autres
techniques de séparation cellulaire, cette technique est sim-
ple et rapide. De plus, contrairement au tri par cytomètrie en
flux, il n’y a pas d’interférence avec les mouvements d’ions
et la sélection d’une population de cellules viables en grande
quantité est effectuée très rapidement.
Actuellement, 2 méthodes de séparation magnétique fon-
dées sur le phénotype cellulaire existent :
• la première consiste à séparer des cellules contenant
assez de substances magnétiques pour être retenues par
l’aimant ; cela n’est possible que pour 2 types cellulai-
res : les érythrocytes, dont l’hémoglobine contient une
forte concentration d’une substance paramagnétique et
les bactéries magnétotactiques contenant de petites par-
ticules magnétiques [19] ;
• la deuxième consiste à marquer avec une particule ma-
gnétique un ligand, la plupart du temps un anticorps,
reconnaissant une structure cellulaire de surface.
Le principe du tri par billes magnétiques repose sur un
marquage de la sous-population à isoler (ou à éliminer) par
un anticorps spécifique couplé à une bille magnétique. Après
marquage avec cet anticorps spécifique, les cellules sont
introduites dans une colonne qui traverse le champ magnéti-
que créé par un aimant. Les cellules, qui sont entourées de
billes métalliques, sont retenues sur la colonne par cet
aimant, alors que les cellules non marquées sont éluées et
récupérées dans un premier tube à essai. Les cellules mar-
quées par les billes sont ensuite récupérées par gravité après
avoir retiré l’aimant dans le deuxième tube (Fig. 1). Il est
ainsi possible d’effectuer une sélection positive en marquant
les cellules d’intérêt, celles-ci étant alors retenues dans la
colonne. L’autre alternative consiste à effectuer une sélection
négative lorsqu’il y a un risque de modification de la fonction
cellulaire par l’anticorps ou qu’il n’existe pas de marqueur de
ce type cellulaire. On utilise alors une technique de déplétion
en marquant toutes les cellules non désirées, celles-ci étant
alors retenues dans la colonne.
Un exemple d’utilisation courante du tri cellulaire dans le
domaine médical est l’utilisation pour les greffes de moelle
osseuse ou de précurseurs hématopoïétiques du sang péri-
422 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427
Fig. 1. Schéma du tri cellulaire phénotypique monoparamètrique
(www.miltenyibiotec.com).
phérique. Les techniques de sélections sont utilisées pour les
autogreffes de sauvetage chez les patients atteints de cancer
et bénéficiant d’une chimiothérapie intensive. La sélection
négative sert alors à éliminer les cellules tumorales du gref-
fon. Les techniques de sélection positive sont utilisées pour
les allo- et les autogreffes et servent à la sélection des progé-
niteurs hématopoïétiques exprimant la molécules de surface
CD34 [20].
Les techniques de sélections négatives ont 3 objectifs :
• éliminer toutes les cellules cibles non désirées de la
suspension cellulaire de départ ;
• récupérer toutes les cellules non marquées dans un état
viable ;
• éliminer toutes les microbilles de la suspension cellu-
laire.
Schéma 2 : avantages et inconvénients des microbilles et des nanobilles magnétiques utilisées pour le tri cellulaire.
Ces 3 objectifs nécessitent d’utiliser un excès de micro-
billes et d’anticorps reconnaissant les cellules à éliminer puis
l’exposition à un champ magnétique intense pour s’assurer
qu’aucune cellule non désirée ou bille reste dans la suspen-
sion cellulaire.
Quant aux techniques de sélections positives elles ont
également 3 objectifs :
• récupérer toutes les cellules marquées ;
• éliminer toutes les cellules non désirées ;
• éliminer les microbilles des cellules sélectionnées.
L’élimination des billes peut être obtenue par méthode
physique ou enzymatique. Les billes colloïdales sont sponta-
nément biodégradables.
À ce jour, 2 méthodes de tri cellulaire monoparamètrique
existent présentant chacune des avantages et des inconvé-
nients (Schéma 2).
La première méthode de tri cellulaire par méthode immu-
nomagnétique a été décrite au début des années 1980 par
John Ugelstad et John Kemshead [21]. Elle utilise des parti-
cules de polystyrène poreux de 1 à 4 µm contenant de l’oxyde
de fer. Le polymère de surface protège les cellules de la
possible toxicité du fer. Ces particules sont des éléments
superparamagnétiques, c’est-à-dire qu’ils ne présentent des
propriétés magnétiques que lorsqu’ils sont soumis à un
champ magnétique.
Pour permettre un tri cellulaire efficace, ces billes doivent
remplir des critères importants [22] : rester stables et ne pas
s’agréger dans le milieu de sélection ; rester magnétiques
après avoir été soumis au champ magnétique ; ne pas se lier
de manière aspécifique aux cellules ; permettre une rapide et
quasi-totale séparation des cellules ayant fixé les billes ; être
d’une taille qui limite au maximum la phagocytose. Ces
billes magnétisables sont bloquées par le champ magnétique
et se dispersent librement sans agrégation quand le champ
 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427
magnétique est retiré. Cette interaction entre la bille et la
cellule peut alors être responsable d’une dépression de la
membrane plasmique et ainsi de la formation de pseudopodes.
Le second procédé de tri cellulaire par microbilles magné-
tiques a été développé à l’université de Cologne par Miltenyi
[23] et est devenu la technique la plus utilisée. Cette techni-
que est fondée sur l’utilisation de billes colloïdales consti-
tuées de petites particules paramagnétiques (100 nm) et d’un
puissant champ magnétique. Cette technique permet l’isola-
tion de 108 cellules en 15 min. L’enrichissement est de plus
de 100 fois et on obtient une déplétion d’un facteur 1000.
Ces billes sont 1 million de fois plus petites que les
cellules eucaryotes et sont à peine visibles en microscopie
électronique. Leur faible taille limite le stress cellulaire. Ces
billes restent en suspension dans le milieu de culture et leur
composition (oxyde de fer et polysaccharide) les rend rapi-
dement biodégradables. La plupart du temps, les billes ne
modifient pas la fonction ni la viabilité cellulaire, il n’y a
donc pas besoin de les détacher des cellules récupérées par
sélection positive. Ce système permet d’obtenir une pureté
cellulaire de plus de 95 % et de récupérer plus de 90 % des
cellules exprimant l’antigène.
Les 2 types de techniques utilisant soit des billes de grande
taille (microbilles), soit des billes de petite taille (nanobilles),
ont été utilisés avec succès, mais les nanobilles semblent être
d’un intérêt supérieur pour la sélection positive car elles ne
déforment pas la surface des cellules et il n’est pas nécessaire
de les enlever de la surface des cellules triées pour pouvoir
les utiliser. Les microbilles nécessitent d’être agitées en per-
manence lors de l’incubation avec les cellules pour éviter
leur sédimentation ; au contraire les nanobilles diffusent en
suivant les mouvements browniens des fluides et se distri-
buent dans la suspension cellulaire sans agitation. Les micro-
billes ont l’avantage de ne pas nécessiter un champ magnéti-
que intense et donc le matériel de séparation reste d’un faible
coût contrairement au matériel de séparation pour les nano-
billes. Le tri par billes magnétiques permet de purifier une
sous-population cellulaire avec une bonne efficacité, et d’ob-
tenir plusieurs centaines de millions de cellules en une di-
zaine de minutes, ce qui est donc beaucoup plus rapide qu’un
tri par cytomètrie en flux. En revanche, un unique critère de
tri peut être pris en compte avec cette technique standard et
seuls les marquages de surface sont utilisables.
Toutefois, une techniques de séparation multiparamètri-
que a été développée depuis peu [24]. Cette dernière permet
de sélectionner positivement des cellules en fonction de
2 critères phénotypiques. Cette technique est utile lorsqu’une
partie des cellules que l’on veut éliminer expriment l’anti-
gène utilisé pour la sélection positive. Cette technique est
aussi utile lorsque l’on cherche à sélectionner une population
de cellules très rares. Cette technique de double sélection
positive s’effectue en 2 étapes. Tout d’abord les cellules
subissent une première sélection positive permettant d’élimi-
ner les cellules non désirées. Les billes magnétiques sont
ensuite détachées de la fraction positive. Et enfin la fraction
423
cellulaire désirée est récupérée par une deuxième sélection
positive pour obtenir un pool cellulaire très pur.
Le tri magnétique a aussi abouti à la purification de cellu-
les transfectées et à l’isolement de cellules produisant des
cytokines (tri cellulaire fonctionnel). Pour sélectionner les
cellules transfectées par tri magnétique, on utilise un plas-
mide vecteur contenant une séquence codant pour une pro-
téine membranaire (par exemple une molécule CD4 tron-
quée). Il est alors nécessaire qu’il y ait entre le gène d’intérêt
et le marqueur de sélection une séquence Ires (internal ribo-
somal entry site) permettant alors l’expression des 2 gènes
[25]. Dans le cadre du tri fonctionnel, des procédés permet-
tant de séparer les cellules en fonction de leur sécrétion de
cytokines ont été développés. Ceux-ci permettent de récupé-
rer des fractions enrichies en cellules sécrétant un type de
cytokine. Le tri par billes magnétiques présente alors un
avantage essentiel par rapport au cytomètre en flux ; en effet
cette technique permet de disposer de cellules viables utili-
sables pour des tests fonctionnels.
Enfin, les billes magnétiques offrent aussi la possibilité de
purifier des macromolécules. Ainsi, il a été développé des
techniques permettant de sélectionner par tri magnétique des
protéines notamment pour des immunoprécipitations ou des
co-immunoprécipitations [26]. Pour cela, des microbilles
magnétiques conjuguées à une protéine A de 42kDa (protéine
de la membrane des staphylocoques) ou une protéine G de
33kDa (protéine de la membrane des streptocoques) sont
utilisées. Ces protéines ont la propriété de se lier au fragment
Fc des IgG. Pour purifier une protéine dans le but d’effectuer
une immunoprécipitation, les cellules sont lysées puis les
protéines cellulaires sont incubées avec un anticorps spécifi-
que de la protéine recherchée et avec les billes. La solution
est ensuite passée sur une colonne magnétique. La protéine
d’intérêt est ensuite éluée de la colonne. Par ailleurs, des
méthodologies sont aussi disponibles pour la purification
d’ARNm cellulaires ou tissulaires [27]. Le principe consiste
à lyser les cellules. Ensuite l’ARNm est hybridé avec des
billes magnétiques porteuses d’une sonde constituée d’un
oligo-dT qui a la propriété de s’hybrider à la queue polyA des
ARNm. La solution est ensuite passée sur une colonne ma-
gnétique et seuls les ARNm hybridés avec les billes magné-
tiques restent fixés sur la colonne.
En raison des nombreuses méthodes de purification asso-
ciées aux nanobilles et aux microbilles, ces dernières sont
devenues des outils importants et souvent incontournables en
biologie cellulaire et moléculaire.
5. Microbilles, cytométrie en flux et analyses
multiplexées
L’identification des macromolécules d’intérêt biologique
(protéines, lipides, glucides et acides nucléiques) fondée sur
leurs propriétés physicochimiques fait appel à des techniques
d’électrophorèse mono- ou bidimensionnelle, de chromato-
graphie et de spectrométrie qui permettent une détection et
une caractérisation simultanée de plusieurs constituants mais
424 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427

Fig. 2. Analyse multiplexée d’interleukines par cytométrie en flux. Exemple du système CBA (Cytometric Bead Array). Les microbilles homogènes en taille
(Forward scatter : FSC) et en diffraction à 90° (Side scatter : SSC) se distinguent en fonction de leurs fluorescences rouges (FL3). Dans le contrôle négatif, les
6 populations de microbilles identifiées selon FL3 (au-delà de 670 nm), ne génèrent aucune fluorescence en FL2 (575 ± 10 nm). Dans l’essai, en fonction de la
quantité d’interleukines présentes, la fluorescence des microbilles en FL2 est plus ou moins importante.

qui en raison de leurs degrés de sophistication et des coûts
élevés de l’équipement requis ne sont accessibles que dans
des laboratoires extrêmement spécialisés. Grâce au dévelop-
pement de technologies utilisant des anticorps monoclonaux
et des oligonucléotides, certaines de ces macromolécules
(protéines, acides nucléiques et éventuellement lipides) de-
viennent facilement identifiables et quantifiables dans des
liquides (biologiques ou autres) mais aussi dans des extraits
cellulaires ou tissulaires. Ainsi, pour les analyses de protéi-
nes (ou de lipides lorsque des anticorps sont disponibles), les
techniques Elisa sont largement utilisées. Pour la détection
d’acides nucléiques (présents même en faible quantité),
l’amplification génique est devenue une méthode facile à
mettre en œuvre. Toutefois, en Elisa, les capacités analyti-
ques sont limitées à une protéine (ou un lipide) par échan-
tillon, et avec les techniques d’amplification génique multi-
plexées disponibles la détection simultanée de plusieurs
nucléotides par échantillon demeure difficile. En raison de
ces limites, des méthodes multiplexées prometteuses utili-
sant la cytométrie en flux et des microbilles fluorescentes sur
lesquelles sont fixées de façon covalente des protéines (anti-
corps, antigènes, substrats) ou des oligonucléotides se déve-
loppent actuellement [4–7,28].
En cytométrie en flux, une application d’analyse multi-
plexée assez aisée à mettre en œuvre concerne le dosage
d’interleukines développé par la société BD Biosciences
Pharmingen (www.bdbiosciences.com). Avec ce système
(Cytometric Bead Array : CBA), qui est utilisable sur des
cytomètres équipés d’une source d’excitation lumineuse
émettant à 488 nm, 6 interleukines sont simultanément iden-
tifiées dans un faible volume d’échantillon (5–50 µl), en
utilisant 6 types de microbilles de tailles homogènes qui sont
distinguées en fonction de leurs différences d’intensités de
fluorescence rouges et qui portent chacune des anticorps de
capture dirigés contre des interleukines différentes. Après
incubation avec l’échantillon, les interleukines présentes qui
se sont fixées à l’anticorps de capture sont détectées avec des
anticorps de révélation couplés à de la phycoérythrine
(Fig. 2). Grâce à des standards, les interleukines mises en
évidence peuvent être quantifiées.
Cette possibilité de détecter simultanément plusieurs mo-
lécules a conduit à la mise au point de cytomètres en flux et
de microbilles spécifiquement dédiés aux analyses multi-
plexées (www.luminexcorp.com ; www.lincoresearch.com ;
www.biosource.com ; www.bendermedsystems.com) qui
présentent un intérêt majeur dans de nombreux domaines de
la biologie, en particulier en biologie de la transplantation
dans le cadre de typage HLA et en endocrinologie. Actuelle-
ment, le système Luminex fait office de référence dans le
domaine. Ce système est équipé de 2 lasers et permet d’iden-
tifier simultanément 100 billes ce qui rend une identification
et une quantification simultanée de 100 macromolécules.
Parmi les 2 lasers, l’un émet à 532 nm et l’autre à 633 nm. Le
premier laser est destiné à exciter des fluorochromes émet-
tant vers 575 nm (comme la phycoérythrine : PE), le second à
identifier les microbilles distinguées selon leurs fluorescen-
ces rouges à 675 nm et au-delà de 712 nm. Ces microbilles
sont couplées soit à des antigènes, des anticorps ou des
oligonucléotides ce qui permet la quantification respective
d’anticorps, d’antigènes ou de nucléotides (Fig. 3). Les nu-
cléotides sont alors analysés en faisant ou non appel à une
amplification génique [5,29,30].
Par ailleurs, l’évolution rapide des techniques d’analyses
multiplexées dans le domaine de la biologie moléculaire a
abouti à des méthodologies originales appliquées aux études de
polymorphismes (OLA : Oligonucleotide Ligation Assay ;
 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427 425

Fig. 3. Illustration du principe Luminex permettant l’analyse simultanée de 100 macromolécules. Le système d’analyse Luminex utilise 2 sources d’excitation
laser (532 nm, 633 nm) et fait appel à des billes à la fois colorées par 2 fluorochromes rouges et couplées soit à des antigènes, des anticorps ou des
oligonucléotides ce qui conduit à détecter respectivement des anticorps, des antigènes ou des nucléotides (résultant ou non d’amplification génique). PE,
phycoérythrine ; SA, streptavidine.

SBCE : Single Base Chain Extension) (Figs. 4 et 5) [31,32] et
à la détection d’agents infectieux [33–35]. Actuellement, les
divers avantages des méthodes multiplexées (faible volume
d’échantillon, facilité et rapidité d’exécution, fiabilité) condui-
sent aux développement de nombreuses applications. En biolo-
gie clinique, les plus récentes concernent le dosage simultané
d’ions sodium et potassium par l’intermédiaire de microbilles en
polychlorure de vinyl couplées à des ionophores sélectifs [36].
6. Pinces optiques, microbilles et applications à
la manipulation de cellules et de macromolécules
biologiques
Les pinces optiques constituent un outil bien adapté pour
la micromanipulation d’objets biologiques à l’échelle cellu-
laire ou moléculaire [37,38]. Le principe consiste à utiliser
les forts gradients de champ électrique au voisinage du point

Fig. 4. Principe d’analyse de polymorphisme ponctuel par la méthode OLA (Oligonucleotide Ligation Assay) et l’utilisation de microbilles (Kellar KL et
Iannone MA Exp Hematol 2002, 30, 1227–1237). Dans cette méthode, le dernier nucléotide de la sonde de capture est aligné avec la base polymorphe. La sonde
« reporter » n’est liée par la ligase que s’il y a complémentarité totale entre la sonde de capture et la séquence d’ADN amplifiée contenant le polymorphisme
ponctuel. Par ailleurs, chaque microbille est associée à une séquence cZip spécifique et à une fluorescence unique ce qui confère d’une part une spécificité à la
réaction d’hybridation et d’autre part une spécificité à la détection. La séquence luciférase est utilisée afin de s’assurer au préalable que toutes les billes portent
la même quantité de séquences cZip.
426 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427

Fig. 5. Principe d’analyse de polymorphisme ponctuel par la méthode SBCE (Single Base Chain Extension Assay) et l’utilisation de microbilles (Kellar KL et
Iannone MA Exp Hematol 2002, 30, 1227–1237). Dans cette méthode, le dernier nucléotide de la sonde de capture est positionné juste avant le nucléotide du
polymorphisme ponctuel présent sur l’ADN amplifié. Dans ces conditions, le didésoxynucléotide fluorescent n’est lié par la ligase à la sonde de capture que s’il
est complémentaire du nucléotide de la séquence d’ADN amplifiée correspondant au polymorphisme ponctuel. Chaque microbille est associée à une séquence
cZip spécifique et à une fluorescence unique ce qui confère d’une part une spécificité à la réaction d’hybridation et d’autre part une spécificité à la détection. La
séquence luciférase est utilisée afin de s’assurer au préalable que toutes les billes portent la même quantité de séquences cZip.

de convergence d’un faisceau laser pour piéger un petit objet
diélectrique, en général une bille micrométrique en silice ou
en latex. Pour une bille de taille et de nature donnée, il est
possible de réaliser un étalonnage des forces appliquées. Une
ou plusieurs billes, fixées à la membrane cellulaire ou aux
extrémités d’une molécule biologique, servent de « poi-
gnées » pour appliquer à l’objet étudié des forces calibrées et
donc mesurer sa réponse mécanique à une contrainte contrô-
lée. Les forces exercées sont de l’ordre de la centaine de
piconewtons pour une puissance laser de quelques centaines
de mégawatts. Ceci correspond aux échelles des forces d’ori-
gine physiologique à l’échelle cellulaire ou subcellulaire.
Parmi les applications possibles à la biologie, les pinces
optiques sont utilisées pour réaliser des expériences quanti-
tatives sur des molécules uniques : étude de l’élasticité des
polymères biologiques ou mesure de la force exercée par un
moteur moléculaire se déplaçant le long d’un filament. De
même, à l’échelle cellulaire, les pinces optiques permettent
de sonder les propriétés de la membrane et du cytosquelette
sous-jacent, qui constitue l’architecture dynamique de la
cellule. À l’aide des pinces optiques, on peut caractériser la
réponse visco-élastique du cytosquelette à une contrainte
bien définie, en régime statique ou dynamique.
7. Conclusions et perspectives
Les possibilités offertes par la cytométrie en flux et par les
méthodologies associées aux microbilles et aux nanobilles
ont évolué de manière parallèle et complémentaire. Ces tech-
niques offrent aux biologistes de nombreux outils pour ré-
pondre à des questions fondamentales non seulement en
biologie cellulaire mais aussi en biologie moléculaire. La
consécration de ces méthodes rapides et fiables est associée
au développement d’une nouvelle génération de cytomètres.
Ces derniers à l’interface de plusieurs disciplines font appel
aux progrès les plus récents de la physique des lasers, de la
chimie des fluorochromes, de l’immunologie, de la biologie
moléculaire et de l’informatique. Ces appareils conçus pour
fonctionner en utilisant des microbilles vont amener à conce-
voir des analyses biologiques multiplexées qui aboutiront à
des innovations importantes dans divers domaines de la bio-
logie médicale (transplantations, endocrinologie, médecine
d’urgence, médecine infantile, microbiologie, virologie, pa-
rasitologie), de l’agro-alimentaire (contrôle qualité) et de
l’environnement (contrôle des eaux et de l’air associés aux
risques chimiques et biologiques).
Références
[1] Haugland P. Handbook of fluorescent probes and research products.
Ninth Edition, 2002.
[2] Poncelet P, George F, Papa S, Lanza F. Quantitation of hemopoietic
cell antigens in flow cytometry. Eur J Histochem 1996;40(suppl.1):
15–32.
[3] Haukanes BI, Kvam C. Application of magnetic beads in bioassays.
Biotechnology 1993;11:60–3.
[4] Vignali DAA. Multiplexed particle-based flow cytometric assays. J
Immunol Methods 2000;243:243–55.
[5] Wedemeyer N, Potter T. Flow cytometry: an “old” tool for novel
applications in medical genetics. Clin Genet 2001;60:1–8.
[6] Kellar KL, Iannone MA. Multiplexed microsphere-based flow cyto-
metric assays. Exp Hematol 2002;30:1227–37.
[7] Jani IV, Janossy G, Brown DWG, Mandy F. Multiplexed immunoas-
says by flow cytometry for diagnosis and surveillance of infectious
diseases in resource-poor settings. Lancet 2002;2:243–50.
[8] Kerker M. Elastic and inelastic light scattering in flow cytometry.
Cytometry 1983;4:1–10.
[9] Stewart CC, Steinkamp JA. Quantitation of cell concentration using
the flow cytometer. Cytometry 1982;2:238–43.
 G. Lizard et al. / Pathologie Biologie 51 (2003) 418–427
[10] Pawley J. Handbook of Biological Confocal Microscopy. Second
Edition. New York: Plenum Press; 1995.
[11] Schwartz A. Quantitative immunophenotyping. In: Stewart CC,
Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping. Wiley-Liss; 2000. p.
83–104.
[12] Gratama JW, D’Hautcourt JL, Mandy F, Rothe G, Barnett D,
Janossy G, et al. Flow cytometric quantitation of immunofluorescence
intensity: problems and perspectives. Cytometry 1998;33:166–78.
[13] Redelman D. Flow cytometric analysis of cell phenotype. In: Stew-
wart CC, Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping. Wiley-Liss;
2000. p. 49–104.
[14] Serke S, Van Lessen A, Huhn D. Quantitative fluorescence flow
cytometry: a comparison of three techniques for direct and indirect
immunofluorescence. Cytometry 1998;33:179–87.
[15] Bikoue A, Janossy G, Barnett D. Stabilised cellular immunofluores-
cence assay: CD45 expression as a calibration standard for human
leukocytes. J Immunol Methods 2002;266:19–32.
[16] Poncelet P. Clinical applications of quantitative immunophenotyping.
In: Stewwart CC, Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping.
Wiley-Liss; 2000. p. 105–32.
[17] Roederer M, Herzenberg LA. Changes in antigen densities on leuko-
cyte subsets correlate with progression of HIV disease. Int Immunol
1996;8:1–11.
[18] Duvillard L, Florentin E, Lizard G, Petit JM, Galland F, Monier S,
Gambert P, Verges B. Cell surface expression of low density lipopro-
tein receptor is decreased in type 2 diabetic patients and is normalized
by insulin therapy. Diabetes Care 2003 sous presse.
[19] Safarik I, Safarikova M. Use of magnetic techniques for the isolation
of cells. J Chromatogr B Biomed Sci Appl 1999;722:33–53.
[20] Hardwick RA, Kulcinski D, Mansour V, Ishizawa L, Law P, Gee AP.
Design of large-scale separation systems for positive and negative
immunomagnetic selection of cells using superparamagnetic micro-
spheres. J Hematother 1992;1:379–86.
[21] Treleaven JG, Gibson FM, Ugelstad J, Rembaum A, Philip T,
Caine GD, et al. Removal of neuroblastoma cells from bone marrow
with monoclonal antibodies conjugated to magnetic microspheres.
Lancet 1984;8368:70–3.
[22] Kemshead JT, Ugelstad J. Magnetic separation techniques: their
application to medicine. Mol Cell Biochem 1985;67:11–8.
[23] Miltenyi S, Muller W, Weichel W, Radbruch A. High gradient mag-
netic cell separation with MACS. Cytometry 1990;11:231–8.
[24] Nicol A, Nieda M, Donaldson C, Denning-Kendall P, Bradley B,
Hows J. Analysis of cord blood CD34+ cells purified after cryopreser-
vation. Exp Hematology 1995;23:1589–94.
427
[25] Innocente SA, Abrahamson JL, Cogswell JP, Lee JM. p53 regulates a
G2 checkpoint through cyclin B1. Proc Natl Acad Sci (USA) 1996;
96:2147–52.
[26] Harlow E, Lane D. Immunoprecipitation in antibodies: a laboratory
manual. (NY): Cold spring harbor laboratory; 1988.
[27] Sakamoto A, Abe M, Masaki T. Delineation of Genomic Deletion in
Cardiomyopathic Hamster. FEBS Lett 1999;447:124–8.
[28] Iannone MA. Microsphere-based molecular biology. Clin Lab Med
2001;21:731–42.
[29] Wedemeyer N, Göhde W, Pötter T. Flow cytometric analysis of
reverse transcription-PCR products: quantificationof p21WAF1/CIP1
and proliferating cell nuclear antigen mRNA. Clin Chem 2000;46:
1057–64.
[30] Wedemeyer N, Pötter T, Wetzlich S, Göhde W. Flow cytometric
quantification of competitive reverse transcription-PCR products.
Clin Chem 2002;48:1398–405.
[31] Iannone MA, Taylor JD, Chen J, Li MS, Rivers P, Slentz-
Kesler KA, et al. Multiplexed single nucleotide polymorphism geno-
typing by oligonucleotide ligation and flow cytometry. Cytometry
2000;39:131–40.
[32] Chen J, Iannone MA, Li MS, Taylor D, Rivers P, Nelsen AJ, et al. A
microsphere-based assay for multiplexed single nucleotide polymor-
phism analysis using single base chain extension. Genome Res 2000;
10:549–57.
[33] Defoort JP, Martin M, Casano B, Prato S, Camilla C, Fert V. Simulta-
neous detection of multiplex-amplified human immunodeficiency
virus type 1 RNA, hepatitis C virus RNA, and hepatitis B virus DNA
using a flow cytometer microsphere-based hybridization assay. J Clin
Microbiol 2000;38:1066–71.
[34] Ye F, Li MS, Taylor JD, Nguyen Q, Colton HM, Casey WM, Wag-
ner M, Weiner MP, Chen J. Fluorescent microsphere-based readout
technology for multiplexed human single nucleotide polymorphism
analysis and bacterial identification. Hum Mut 2001;17:305–16.
[35] Zammateo N, Alexandre I, Ernest I, Le L, Brancart F, Renacle J.
Comparison between microwell and bead supports for the detection of
human cytomegalovirus amplicons by sandwich hybridization. Anal
Biochem 1997;253:180–9.
[36] Retter R, Peper S, Bell M, Tsagkatakis L, Bakker E. Flow cytometric
ion detection with plasticized poly(vinylchloride) microspheres con-
taining selective ionophores. Anal Chem 2002;74:5420–5.
[37] Svoboda K, Block SM. Biological applications of optical forces. Annu
Rev Biophys Biomol Struct 1994;23:247–85.
[38] Sheetz MP, editor. “Lasers tweezers in cell biology”, Methods in cell
biology, vol. 55. Academic Press; 1998.