Tema 1 Reacciones Enzimaticas

Planta Piloto de Fermentaciones
Departamento de Biotecnologa
Reacciones enzimticas
Sergio Huerta Ochoa

UAM-Iztapalapa
Sntesis de compuestos orgnicos

aturaleza Industria qumica
La naturaleza de las enzimas
1) La reaccin qumica se lleva a cabo

bajo condiciones suaves
2) Accin especfica de acuerdo a la
clase de enzima
3) Tasas de reaccin muy rpidas
4) Numerosas enzimas para diferentes
objetivos
Enzymes at work (www.novozymes.com)
Enzimas tpicas usadas en procesos industriales

Clase Enzimas Industriales
1. Oxidoreductasas Peroxidasas, catalasas, glucosa
oxidasas, lacasas
2. Transferasas Fructosil-transferasas, glucosil-
transferasas
3. Hidrolasas Amilasas, celulasas, lipasas,
pectinasas, proteasas, pululanasas
4. Liasas Pectato-liasas, -acetolactato
decarboxilasas
5. Isomerasas Glucosa isomerasa
6. Ligasas o son usadas actualmente
Enzymes at work (www.novozymes.com)

Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos

Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos

Mercado mundial de enzimas industriales

($1,500,000 USD en el ao 2000)
(McCoy, 2000)
10 %
25 %
65 %
Enzimas tcnicas (Industrias: Detergentes, almidn, textil, curtidos, pulpa y

papel, y cosmticos
Enzimas en la industria alimentaria: lctea, cerveza, vinos y jugos, grasas y
aceites, y panificacin.
Enzimas en alimentacin animal

Puntos principales de la aplicacin comercial de

un catalizador enzimtico
Velocidad de reaccin
(actividad cataltica)
Extensin de la reaccin
(constante de equilibrio)
Duracin de la actividad
(estabilidad)
Energa de activacin
Diseo de biorreactores Balance de materia

F (S i S o ) = v r V reactor
F, S0
donde:
F, Si r = velocidad de reaccin
Leyes fundamentales de la cintica

Velocidad de la reaccin
[P]
[A]0
v0
Orden de la reaccin
d[P] Orden cero
---- = v =k A P
dt
d[P] A P
---- = v = k CA Orden uno
dt
d[P] Orden dos A+ B P

---- = v = k CA CB
dt
Consideraciones al definir el orden de una reaccin
No se puede decir que todas las

reacciones poseen un cierto orden
(Reacciones complejas)
No se debe intentar deducir el orden de

una reaccin de su ecuacin
estequiomtrica
(Depende del mecanismo de la reaccin)
Sitio activo y formacin del complejo: enzima-sustrato

Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato
Efecto de proximidad y efecto de orientacin

Modelo de ajuste inducido
Hexoquinasa
Modelo llave-cerradura
S P
k1
k cat
E ES EE
k -1
k1
k cat
E+S ES E+P
k -1
Los experimentos cinticos revelan propiedades

enzimticas
Cintica qumica
Los experimentos examinan la cantidad de producto

[P] / t)
(P) formado por unidad de tiempo (
Velocidad (v) la tasa de una reaccin
(vara con la concentracin de reactante)
Constante de la tasa (k) indica la velocidad o
eficiencia de una reaccin
Cintica enzimtica
Complejo enzima-substrato (ES) - complejo formado
cuando el substrato especfico se enlaza al sitio activo de la
enzima
E + S ES E+P
Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molcula de

substrato (la enzima esta saturada con el substrato)
Bajo estas condiciones la tasa depende solamente de [E],
y la reaccin es pseudo-primer orden
Velocidad inicial (vo)

La velocidad al inicio de una reaccin catalizada
enzimticamente es
vo (velocidad inicial)
k1 y k-1 representan una rpida asociacin
/disociacin no covalente de substrato del sitio
activo de la enzima
kcat = constante de la tasa para formacin de
producto de ES
k1 kcat
E+S ES E+P
k-1
Curva de progreso para una reaccin catalizada
enzimticamente
La velocidad inicial (vo) es la

pendiente de la porcin lineal
inicial de la curva
La tasa de la reaccin se duplica
cuando se usa el doble de
enzima
Leonor Michaelis Maud Menten

1875-1949 1879-1960
Consideraciones de equilibrio rpido
(Ecuacin de Henri-Michaelis-Menten)
1. Reacciones involucradas k1 k cat
E+S ES E+P
k -1
2. Balance de masa [E ]t = [E ] + [ES ]
3. Velocidad limitante v = kcat [ES ]
v k [ES ]
4. Dividir por [E]t = cat
[E]t [E] + [ES]
KS =
[E ][S ] , [ES ] = [S ] [E ]
5. Expresin de equilibrio [ES ] KS
k
[S ] [E]
cat
v KS
6. Sustituir en trminos de [E] =
[E]t [E] + [S ] [E]
KS
v
=
[S ]
7. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax K S + [S ]
Briggs JBS Haldane

Consideraciones de estado estacionario
(Ecuacin de Briggs-Haldane)
k1 k cat
1. Reacciones involucradas E+S ES E+P
k -1
d [ES ]
2. Balance de masa = k1 [E ] [S ] (k 1 + kcat ) [ES ]
dt
d [ES ]
3. En estado estacionario =0
dt
4. Constante de Michaelis [E ] [S ] = k1 + kcat = KM
[ES ] k1
5. Velocidad limitante v = k cat [ES ]
v k [ES ]
= cat
6. Dividir por [E]t [E ]t [E ] + [ES ]
[S ] [E ]
v KM
=
7. Sustituyendo [ES] kcat [E ]t [E ] + [S ] [E ]
KM
v
=
[S ]
8. Donde Vmax = kcat [E]t Vmax K M + [S ]
Cintica de Michaelis-Menten

Vmax
Vmax [S]
= Vmax
KM + [S]
2
KM [S]
La ecuacin de Michaelis-Menten
La Velocidad mxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima est

saturada con el substrato (alta [S])
A altas [S] la tasa de reaccin es independiente de [S] (orden

cero con respecto a S)
A bajas [S] la reaccin es de primer orden con respecto a S
La forma de una curva vo versus [S] es una hiprbola

rectangular, indicando saturacin del sitio activo de la enzima
conforme [S] se incrementa
Grficas de velocidad inicial (vo) versus [S]

(a) Cada punto vo vs [S] se obtiene
de un experimento cintico
(b) La constante de Michaelis (KM)

iguala la concentracin de
substrato necesario para
alcanzar de la velocidad
mxima
El significado de KM
KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax

KM k-1 / k1 = Ks (es la constante de disociacin
enzima-substrato ) cuando kcat << k1 or k-1
Entre ms bajo sea el valor de KM, ms ajustado
ser el enlace del substrato
KM puede ser una medida de la afinidad de E for S
KM y concentraciones de substrato fisiolgicas
Los valores de KM para las

enzimas son tpicamente
arriba de [S], tal que las
tasas enzimticas son
sensibles a pequeos
cambios en [S]
Las constantes cinticas indican la actividad

enzimtica y la especificidad
La constante cataltica (kcat) constante de la tasa de orden uno

para la conversin de complejo ES a E + P
kcat es ms fcilmente medible cuando la enzima esta saturada con
S
La relacin kcat /KM , llamada tambin coeficiente de
especificidad, es una constante de segundo orden para
E+S E+P
a bajas concentraciones de [S]
Significados de kcat y kcat/KM

Ejemplos de constantes catalticas

Enzyme kcat(s-1)
Valores of kcat/KM
kcat/KM puede aproximar la tasa de

encuentro de dos molculas no cargadas
en solucin (108 to 109 M-1s-1)
kcat/KM es tambin una medida de la
especificidad de la enzima por diferentes
substratos (constante de especificidad)
Aceleracin de la tasa = kcat/KM
Clculo de KM y Vmax
La grfica doble-
recproca
Lineweaver-Burk es
una transformacin
lineal de la grfica de
Michaelis-Menten
(1/vo versus 1/[S])
Reacciones reversibles
k1 k2
E+S ES E+P
k -1 k -2
Consideracin de estado estacionario
V max d
[S ] V maxr
[P ]
K ms K mp
v neta =
1+
[S ] +
[P ]
K ms K mp
Donde:
V maxd = k 2 [E ]t V maxr = k 1 [E ]t
k 2 + k 1
k + k 1 K mp =
K ms = 2 k 2
k1
Inhibicin por substrato
(Consideracin de equilibrio rpido)
KS k cat
1. Reacciones involucradas E+S ES E+P
+
S
KI
ES2
2. Balance de masa [E ] t = [E ] + [ES ]+[S2]
3. Velocidad limitante v = k cat [ES ]
v = k cat [ES ]
4. Dividir por [E]t [E ] t [E ] + [ES ] + [ES2]
KS =
[E ][S ] , KI =
[ES ][S ]
5. Expresiones de equilibrio [ES ] [ ES2 ]
k cat
[S] [E ]
v = KS
6. Sustituir en trminos de [E] [E ] t [E ] + [S ] [E ] + [S ]2 [E ]
KS K S KI
v =
[S ]
+ [S ]
7. Donde Vmax = kcat [E]t + [S ]2
V max KS
KI
Vmax [S ] 1 KM 1 1 1
v= = + + [S ]
K M + [S ] +
[S ]
2
v Vmax [S ] Vmax Vmax K I
Ki
Inhibicin por substrato 0.25
25.0000 0.2
20.0000 0.15
V nmol/l*min
1/v
15.0000
0.1
10.0000
0.05
5.0000
[S]max
0.0000 0
0.00E+00 2.00E+06 4.00E+06 6.00E+06 0.00E+00 5.00E-06 1.00E-05 1.50E-05
[S] nM 1/[S]
1/V
1 KM 1 1
= +
v Vmax [S ] Vmax
KM/Vmax
KI se calcula de: 1/Vmax
[S ]max = K M Ki
-1/KM 1/[S]
Inhibicin enzimtica
Los inhibidores de enzimas son importantes por varias

razones
1) Pueden ser usados para obtener informacin acerca de la forma del sitio
activo de la enzima y los residuos de amino cidos en el sitio activo
2) Pueden ser usados para obtener informacin acerca del mecanismo qumico
3) Pueden ser usados para obtener informacin acerca de la regulacin o control
de una va metablica
4) Pueden ser muy importantes en el diseo de medicamentos
Sistemas de inhibicin simple
Inhibicin competitiva
inhibicin no competitiva
Inhibicin acompetitiva
Modelo de inhibicin competitiva

I P
S
KS
kp
E ES E
KS kp
Ki
E+S ES E+P
+
Consideracin de equilibrio rpido
I
v
=
[S ]
EI Ki
Vmax
1 +
KS
[I]
+ [S ]
EI
K i
Inhibicin competitiva
1/v0 Incremento de
[I]
1/Vmax KM aumenta
Vmax no cambia
-1/KM
1/[S]
Pend.
-KI [I]
Modelo de inhibicin no competitiva
S
KS
E ES E+P
I
Ki Ki
KS
EI ESI
KS
E + S ES E+P
+ v
=
[S]
+ V max K S + [S ]
I I
Ki KS Ki

1 +
[I ]
K i
EI + S ESI
Inhibicin no competitiva
1/v0
Incremento de
[I]
KM no cambia
Vmax disminuye
1/Vmax
-1/KM Inter. 1/[S]
-KI [I]
Modelo de inhibicin acompetitiva
E + S ES
kcat
E+P
KS
+ I Ki
ESI
KS
kcat
E+S ES E+P
Ki v
=
[S ]
Vmax Km
+ [S ]
ESI
1 +
[I ] 1 + [I ]
K i K i
Inhibicin acompetitiva
Incremento de
[I]
1/v0
KM disminuye
Vmax disminuye
1/Vmax
-1/KM 1/[S]
Inter.
-KI [I]
Equilibrio rpido en sistemas bi y tri-reactantes
E +A+B EAB E+P
donde:
B = Sustrato
A = Cosustrato, coenzima o coactivador
E = Enzima
otas:
1. La aproximacin de equilibrio rpido es til y vlida
para los sistemas de enlace aleatorio
2. La mayora de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones

ordenadas se prefiere la aproximacin de estado estacionario
Sistemas bi-reactantes aleatorios

KB
E+B EB
+ +
A A
KA KA
KB kp
EA + B EAB E+P

[A ] [B ]
v K AK B
=
V max
1+
[A ] + [B ] + [A ] [B ]
KA KB K AK B
Sistemas bi-reactantes ordenados
E +A EA + B EAB E+P

[A ] [B ]
v K AK B
=
V max
1+
[A ] [A ] [B ]
+
KA K AK B
Sistemas tri-reactantes aleatorios
EAB
+C EABC
KC
+C
EA
KC EAC
E+P+ Q+R
EB +C
EBC
KC
+C
E EC
KC

[A ] [B ] [C ]
v K AK B KC
=
Vmax
1+
[A ] + [B ] + [C ] + [A ] [B ] + [A ] [C ] + [B ] [C ] + [A ] [B ] [C ]
K A K B KC K AK B K AKC K B KC K AK B KC
Sistemas tri-reactantes ordenados

Sistema Ter Ter ordenado
KA KB KC KP KQ KR
E EA EAB kp EQR ER E
(EABC EPQR)

[A ] [B ] [C ]
v K AK B KC
=
V max
1+
[A ] + [A ] [B ] + [A ] [B ] [C ]
KA K AK B K AK B KC
Multisitios de enlace de sustrato

Sitios de enlace no cooperativos
n 1
[S ] 1 + [S ]
v K S K S
=
[S]
n
V max
1 +
KS
v
=
[S]
V max K S + [S ]
Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n molculas de enzina de un

sitio sencillo de enlace, producen la misma curva de velocidad de una
molcula de n sitios de enlace
Enzimas alostricas
1.0
0.9
0.8 (a)
0.7
0.6
0.5 (b)
v
0.4
0.3
0.2 Enzima alostrica

0.1
0.0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9
[S]
Comparacin de curvas de velocidad.

(a) Respuesta hiperblica, (b) respuesta sigmoidal
Enzimas alostricas
Sitios de enlace cooperativos
(Modelo de interaccin simple: Adair Pauling)
Ejemplo: Enzima con dos sitios de enlace

KS kp
E+S ES E+P
+ +
S S
KS KS
kp KS kp
P+ E SE + S SES SE + P
ES + P
Enzimas alostricas
Sitios de enlace cooperativos
(Modelo de interaccin simple: Adair Pauling)
Ejemplo: Enzima con cuatro sitios de enlace

[S ] + 3[S ]2 3[S ]
+ 2 +
3
[S ] 4
v KS aK S2 a bK S3 a 3b 2cK S4
=
4[S ] 6[S ] 4[S ] [S]
2 3 4
V max
1+ + 2
+ 2 3
+ 3 2 4
KS aK S a bK S a b cK S
donde: Vmax = 4 kp [E]t

Enzimas alostricas
Ecuacin simplificada para enzimas alostricas
(Ecuacin de Hill)
Si la cooperatividad de los sitios en el enlace del sustrato

es muy marcada
v
=
[S]
n
K '+[S ]
n
V max
Donde:
n = nmero de sitios de enlace de sustrato por molcula de enzima
K = Constante que involucra los factores de interaccin y a la constante

de disociacin intnseca

Tema 1 Reacciones Enzimaticas

Încărcat de

Informații document

Drepturi de autor

Formate disponibile

Partajați acest document

Partajați sau inserați document

Opțiuni de partajare

Vi se pare util acest document?

Este necorespunzător acest conținut?

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Tema 1 Reacciones Enzimaticas

Încărcat de

Drepturi de autor:

Formate disponibile

Planta Piloto de Fermentaciones

Sergio Huerta Ochoa

Sntesis de compuestos orgnicos

La naturaleza de las enzimas

1) La reaccin qumica se lleva a cabo

Enzimas tpicas usadas en procesos industriales

6. Ligasas o son usadas actualmente

Enzymes at work (www.novozymes.com)

Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos

Algunos ejemplos de enzimas industriales y sus usos

Mercado mundial de enzimas industriales

Enzimas tcnicas (Industrias: Detergentes, almidn, textil, curtidos, pulpa y

Enzimas en alimentacin animal

Puntos principales de la aplicacin comercial de

Diseo de biorreactores Balance de materia

Leyes fundamentales de la cintica

d[P] Orden dos A+ B P

Consideraciones al definir el orden de una reaccin

No se puede decir que todas las

No se debe intentar deducir el orden de

Sitio activo y formacin del complejo: enzima-sustrato

Diferentes modelos de enlace enzima-sustrato

Efecto de proximidad y efecto de orientacin

Modelo de ajuste inducido

Los experimentos cinticos revelan propiedades

Los experimentos examinan la cantidad de producto

Cuando [S] >> [E], cada enzima enlaza una molcula de

Velocidad inicial (vo)

La velocidad inicial (vo) es la

Leonor Michaelis Maud Menten

Briggs JBS Haldane

5. Velocidad limitante v = k cat [ES ]

La Velocidad mxima (Vmax) se alcanza cuando una enzima est

A altas [S] la tasa de reaccin es independiente de [S] (orden

A bajas [S] la reaccin es de primer orden con respecto a S

La forma de una curva vo versus [S] es una hiprbola

Grficas de velocidad inicial (vo) versus [S]

(b) La constante de Michaelis (KM)

KM = [S] cuando vo = 1/2 Vmax

KM y concentraciones de substrato fisiolgicas

Los valores de KM para las

Las constantes cinticas indican la actividad

La constante cataltica (kcat) constante de la tasa de orden uno

Significados de kcat y kcat/KM

Ejemplos de constantes catalticas

kcat/KM puede aproximar la tasa de

Los inhibidores de enzimas son importantes por varias

Sistemas de inhibicin simple

Modelo de inhibicin competitiva

-1/KM Inter. 1/[S]

Equilibrio rpido en sistemas bi y tri-reactantes

E +A+B EAB E+P

2. La mayora de las enzimas que catalizan secuencias de reacciones

Sistemas bi-reactantes aleatorios

Consideracin de equilibrio rpido

Sistemas bi-reactantes ordenados

Consideracin de equilibrio rpido

Consideracin de equilibrio rpido

Sistemas tri-reactantes ordenados

Consideracin de equilibrio rpido

Multisitios de enlace de sustrato

Si todos los sitios de enlace son equivalentes, n molculas de enzina de un

0.2 Enzima alostrica

Comparacin de curvas de velocidad.

6. Ligasas o son usadas actualmente