Subiecte

1. Definii factorul de selectivitate al unei coloane () n cazul a 2 specii.

R: Factorul de selectivitate al unei coloane reprezint raportul dintre constanta de distribuie a

speciei mai puternic reinut de coloan i constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de
coloan.

=

KB constanta de distribuie a speciei mai puternic reinut de coloan
KA - constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan.

este prin definiie mai mare dect 1.

Factorul de selectivitate se utilizeaz mpreun cu factorul de retenie la rezolvarea problemelor
referitoare la caracterizarea unei coloane cromatografice.
 2. Care sunt efectele variaiei temperaturii asupra cromatogramelor?

R: Temperatura influeneaz coeficientul de difuzie care este o msur a mprtierii benzii

cromatografice. Creterea temperaturii duce la scderea vscozitii fazei mobile i astfel la
creterea vitezei de curgere a acesteia. Cu ct viteza de curgere a fazei mobile este mai mare, cu att
procesul de difuziune este mai redus.
De asemenea, temperatura intervine i n valorile coeficienilor de transfer de mas. Transferul de
mas depinde de vscozitatea fazei mobile, care este invers proporional cu temperatura. Astfel,
prin creterea temperaturii, crete numrul proceselor de transfer de mas, crete numrul de talere
teoretice, ceea ce duce la creterea eficienei coloanei i la o rezoluie de separare mai bun.
 3. Care este semnificaia termenului de eluie n gradient?

R: Termenul de eluie n gradient semnific modificarea fazei mobile n timpul separrii

cromatografice, prin creterea continu a concentraiei, obinndu-se un gradient de concentraie, cu
scopul obinerii condiiilor optime de separare pentru fiecare din componentele probei,
De exemplu, la concentraii mici de solvent vor fi separai compuii care interacioneaz slab cu
faza staionar, iar pe msur ce cretem concentraia fazei mobile vor fi antrenai pe coloan i
compuii care interacioneaz mai puternic cu faza staionar.
 4. Cromatografia cantitativ pe coloan metode de analiz.

R:
 5. Pentru determinarea volumului spaiului gol se utilizeaz :
a. albastrul de bromfenol
b. Coomassie Brillant blue
c. Blue dextran 2000
d. albastru de metilen
Precizai caracteristicile unei substane utilizabile n determinarea volumului total al unei coloane.

c. Blue dextran 2000

R: Pentru ca o substan s poat fi utilizat n determinarea volumului total al unei coloane aceasta
trebuie s nu interacioneze cu faza staionar, s aib o mas molecular foarte mare i s fie un un
compus colorat, pentru a se putea urmri eluarea lui din coloan.
 6. Descriei succint trei metode de determinare a masei moleculare a unei proteine.

R: Electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezenta de dodecil sulfat de sodiu (SDS-PAGE)

presupune tratarea proteinelor cu SDS, un detergent denaturant care se leag la proteine i determin
anularea sarcinilor lor intrinseci, conferindu-le o sarcin global negativ. Astfel, separarea
electroforetic va avea loc numai n funcie de masa molecular a proteinelor. Prin utilizarea unor
markeri de mas molecular se poate determina masa proteinei de interes, prin extrapolare pe
graficul logM=f(Rf), unde Rf =distana parcurs de protein/distana parcurs de colorantul de
urmrire.

Gel-filtrarea : prin trecerea unui amestec proteic pe coloan, componentele probei vor interaciona
cu suportul astfel : proteinele cu V mic vor ptrunde mai adnc n porii suportului, proteinele cu V
mai mare vor interaciona mai puin cu suportul, iar proteinele foarte mari nu vor interaciona deloc.
Determinarea masei moleculare a unei proteine necunoscute se face extrapolnd V eluie al proteinei
pe graficul log M=f(Ve), realizat cu ajutorul unor proteine cu mas molecular cunoscut.

Electroforeza pe gel de poliacrilamid n prezen de bromur de cetil trimetil amoniu (CAT-PAGE)

este o metod care permite determinarea maselor moleculare a proteinelor native. CTAB este un
detergent care leag proteinele, conferindu-le sarcin net pozitiv. Acestea vor migra ctre polul
pozitiv i se vor separa n funcie de masa lor molecular.
 7. Se pregtete o soluie de acrilamid-bisacrilamid prin dizolvarea a 7,3 g acrilamid si 0,2
g bisacrilamid n 25 ml ap distilat.
Din aceast soluie se folosesc 2,5 ml la pregtirea unui amestec de polimerizare cu un volum
final de 10 ml.
a. Calculati T% initial i final
b. Calculati C% initial i final
c. Gelul obinut se poate utiliza drept gel de concentrare sau de separare?

a. T% = cantitatea de acrilamid plus cantitatea de bisacrilamid n 100 ml soluie

25 ml soluie.(7,3+0,2) g acrilamid+bisacrilamid
100 ml soluie.T% initial
T% initial = (7,3+0,2)x4=30%.

100 ml.30 g acrilamid+bisacrilamid

2,5 mlx
x=0,75 g acrilamid+bisacrilamid
10 ml.0,75 g acrilamid+bisacrilamid
100 ml.T% final
T% final=7,5%

b. C%= 100
+

0,2
C% initial = 7,3+0,2 100 = 2,66

25 ml soluie.7,3 g acrilamid0,2 g bisacrilamid

2,5 ml soluie.xy
x=0,73 g acrilamid ; y=0,02 g bisacrilamid
0,02
C% final=0,73+0,02 100 = 2,66

Gelul realizat se poate utiliza ca gel de separare deoarece are un T% suficient de mare pentru ca
procesul de cernere molecular s se desfoare. Gelul nu poate fi utilizat ca gel de concentrare,
deoarece acestea trebuie s aib un T% mai mic : 4-5%.
8. Precizai i descriei sumar o serie de metode de denaturare utilizate n analiza electroforetic
a unei proteine.
- denaturare cu detergeni (SDS, LDS, CTAB)
- denaturare folosind uree (6-8M)
- denaturare cu clorur de guanidin (6-8 M)
- denaturare folosind ageni reductori ai punilor disulfurice : -mercaptoetanol, ditiotreitol,
ditioeritritol.
- denaturare prin incubare la fierbere
 9. Determinati masele moleculare (lgMM) ale celor doua
proteine separate prin PAGE (linia 3)

Markerii moleculari sunt miozina (200 kDa), beta-

galactozidaza (116 kDa), fosforilaza b (97 kDa), albumina
serica bovina (66 kDa), ovalbumina (45 kDa), anhidraza
carbonica (31 kDa), inhibitorul tripsinei (21,5 kDa) si
lizozimul (14,4 kDa).

MM lg MM
200000 5,30103
116000 5,064458
97000 4,986772
66000 4,819544
45000 4,653213
31000 4,491362
21500 4,332438
14400 4,158362
10. Se amestec 28,5 g acrilamid cu 0,5 g bisacrilamid i se aduce la 100 ml cu ap distilat
a. Calculai T% si C%
b. Se realizeaz un amestec de polimerizare compus din

Gel 1
Acrilamid/bisacrilamid 2,69 ml
Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 2,5 ml
Ap distilat 4,75 ml
SDS 100l
TEMED 20l

Gel 2
Acrilamid/bisacrilamid 0,85 ml
Tris HCl, 1,5M, pH 8,9 ; 1,3 ml
Ap distilat 2,8 ml
SDS 50l
TEMED 5l

Calculai T% si C%. Care este rolul celor doua geluri?

a. T%=28,5+0,5=29%
0,5
C%= 100 = 1,72
28,5+0,5
b. Soluie stoc acrilamid/bisacrilamid T=29%

Gel 1 :
100 ml29 g acrilamid+bisacrilamid
292,69
2,69 mlx ; x= 100 = 0,78 g

V gel 1 = 2,69+2,5+4,75+0,1+0,02=10,06 ml
0,78 g.10,06 ml
T%..........100 ml
T%=7,75%

100 ml....28,5 g acrilamid........0,5g bisacrilamid

2,69 ml....a g acrilamid.............b g bisacrilamid
a=0,76665 g ; b=0,01345
0,01345
C%=0,76665+0,01345 100 =1,72 %

Gel 2 :
100 ml29 g acrilamid+bisacrilamid
0,85 mlx ; x= 0,2465g

V gel 2 = 0,85+1,3+2,8+0,05+0,005=5,005 ml
0,2465 g.5,005 ml
T%..........100 ml
T%=4,92%

C%=1,72%
11. Definii Ka si Kav (asemnari/deosebiri)
12. Avantajele eluiei n trepte

R: n cadrul eluiei n trepte, coloana este eluat cu soluii cu putere de eluie cresctoare.
Avantajele acestei metode sunt timpul scurt de realizare i obinerea componentelor probei
ntr-o form mai concentrat...............
13. n cazul cromatografiei n strat subire n sistem cloroform-butanol 7:3, o proba A se rezolv
n 2 spoturi intim legate. Expunei cile/metodele de crestere a rezolutiei.
14. Fenomene de adsorbie nespecific n cromatografia de gel filtrare enumerai cauzele
acestui proces.
 15. Completai locurile libere. Volumele calculate sunt de 100 ml.

Componenta T=7,5% T=10%

Acrilamida 4,75 g 9,5 g
Bis 0,25 g 0,375 g
C%

Componenta T=5% T=7,5% T=10%

Acrilamida 4,75 g 7,125 g 9,5 g
Bis 0,25 g 0,375 g 0,5 g
C%
16. Aplicaii ale electroforezei n flux liber continuu n separarea celulelor
 17. Calculai log Masa molecular a unei proteine utiliznd relaia:
log M = -1,10 log a + 6,23, unde a este panta dreptei
valorile experimentale sunt :

D (cm) V*h*103
0,15 2,5
0,25 5
0,4 7,5
0,56 15
0,77 20
1 25
1,2 30

D (cm) 35

30

25

20

15

10

0
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4
V*h*103

panta dreptei = 26,80471244

log MM = -1,10 log (26,804) + 6,23
18. Explicai rolul Blue Dextran 2000 n cromatografie.
Ce se poate spune despre o protein care migreaza odat cu Blue Dextran? Cum se poate crete
tR pentru aceasta protein?

Blue dextran 2000 se utilizeaz pentru determinarea timpului mort (tM) i a volumului spaiului
gol (void volume) n gel-filtrare. Blue dextran 2000 este un conjugat al dextranului (polizaharid
cu masa molecular foarte mare ) cu un colorant i datorit mrimii foarte mari trece prin coloan
fr a interaciona cu aceasta. Timpul de eluie al blue dextran 2000 pe coloan va reprezenta
tM, iar volumul de eluie va fi void volume.
Dac o protein migreaz o dat cu blue dextran 2000 se poate spune c aceasta nu
interacioneaz cu faza staionar, din cauza mrimii foarte mari care nu permite ptrunderea
acesteia prin porii gelului. Pentru a crete tR pentru aceast protein trebuie s alegem un
domeniu de selectivitate n care s se regseasc proteina de interes. n funcie de mrimea
proteinei alegem mrimi diferite ale particulelor gelului.
19. Un compus A nu poate fi extras din linia de start n sistemul cloroform-metanol-ap 7:2:1.
ncercai s explicai fenomenul si s gasii soluia adecvat pentru a produce migrarea
acestuia pe suport.
Compusul a rmas n linia de start deoarece alegerea fazei mobile nu a fost adecvat, aceasta
fiind prea puin polar n raport cu compusul pentru a permite eluarea acestuia pe suportul
cromatografic. Pentru a produce migrarea compusul A pe suport putem s mrim proporia
metanolului n sistemul de solveni ales sau putem s folosim un solvent mai polar.
20. In cazul cromatografiei de schimb ionic se poate vorbi de void volume? Ce proprieti
trebuie s aib o substan pentru msurarea acestuia?

Void volume se poate determina i n cazul cromatografiei de schimb ionic. n acest caz, se
introduce pe coloan o protein care posed aceeai sarcin superficial ca i sarcina
schimbtorului de ioni. Aceast protein nu va interaciona deloc cu schimbtorul de ioni, astfel
nct se poate determina volumul spaiului gol ca fiind volumul necesar eluiei proteinei pe
coloan.
21. Explicai relaia dintre timpul de retenie i volumul de eluie.
Timpul de retenie i volumul de eluie sunt termeni echivaleni i sunt caracteristice pentru un
compus dat. Timpul de retenie este definit ca timpul necesar unui compus s treac printr-o
coloan cromatografic, n timp ce volumul de eluie reprezint volumul de faz mobil necesar
eluiei acelui compus de pe coloan.
22. Gel filtrarea principiu, aplicatii, avantaje, dezavantaje
 23. Preparai 10 ml gel poliacrilamid cu T=10% dintr-un amestec acrilamid-bisacrilamid
29,2:0,8 g/100 ml. Calculai C%. Calculai volumul de ap tiind c amestecul de
polimerizare conine 2.5 ml tampon Tris-HCl 1.5 M, pH 8.8, 0.1 ml APS 10% ; 0.05 ml
TEMED i 0.1 ml SDS. Care este rolul : APS, TEMED i SDS? Ce fel de gel s-a preparat?
Care este rolul su n separarea electroforetic? Peste acest gel se toarn un nou gel cu T=4%,
dar tamponul utilizat are pH 6,8. Care este rolul acestui gel? Modificarea lui T% conduce la
modificarea C%?

29,2 g acrilamid i 0,8 g bisacrilamid

0,8
C%= 100 = 2,66
29,2+0,8

T=10% 10 g acrilamid+bisacrilamid 100 ml

xg 10 ml
x=1 g acrilamid+bisacrilamid

T% initial=30%
30 g 100 ml
1 g acrilamid+bisacrilamid y=3,33 ml soluie acrilamid + bisacrilamid
VH20=10-(3,33+2,5+0,1+0,05+0,1)=3,92 ml
Gelul preparat reprezint un gel de poliacrilamid cu SDS i are rolul de a separa proteinele n
funcie de masa lor molecular, fiind gel de separare ntr-o electroforez in sistem discontinuu.
Gelul cu T=4% reprezint gelul de concentrare i are rolul de a stivui componentele probei n benzi
subiri, proteinele migrnd sub aceast form n gelul de separare, unde sunt rezolvate.
Modificarea T% nu duce la modificarea C%.
24. Metode de transfer pe membrane i de detectie dup transfer.
25. Electroforeza n camp pulsatoriu principiu, aparatur, utilizri.
26. Definii sumar urmtorii termeni: eluie, faza mobil, faza staionar, constanta de
distribuie, timp de retenie, factor de selectivitate, nlimea talerului teoretic, rezoluia
coloanei, eluent.
Eluie trecrea compuilor pe coloan la adugarea continu de faz mobil
Faza mobil solventul utillizat pentru eluia probelor
Faza staionar mediul utilizat n cromatografie prin care componentele probei trec i unde
sunt separate n funcie de tria interaciei stabilite cu faza staionar
Constanta de distribuie raportul dintre concentraia molar a solutului din faza staionar
i concentraia molar a solutului din faza mobil
Timp de retenie timpul necesar unui compus s treac printr-o coloan cromatografic
Factor de selectivitate raportul dintre constanta de distribuie a speciei mai puternic reinut
de coloan i constanta de distribuie a speciei mai puin reinut de coloan.
nlimea talerului teoretic raportul dintre lungimea coloanei mpachetate i numrul
talere teoretice; la nivelul fiecrui taler teoretic se stabilete un echilibru ntre faza
mobil i faza staionar.
Rezoluia coloanei msur a capacitii coloanei de separare a 2 analii
Eluent volumul de faz mobil
27. Descriei problema general a eluiei.
28. Cum poate fi manipulat factorul de retentie n cazul unui solut?
n cazul cromatografiei cu faza mobil gazoas, factorul de retenie poate fi crescut prin
creterea temperaturii. n schimb, n cazul cromatografiei cu faz mobil lichid, creterea
temperaturii are un efect neglijabil asupra factorului de retenie, n acest caz, factorul de retenie
putnd fi modificat prin schimbarea compoziiei solventului. Creterea factorului de retenie
duce n general la creterea rezoluiei, mbuntind semnificativ separarea compuilor.
29. Definii procesul de alterare a fazei mobile i stationare. Exemple
30. Descriei o metod de determinare a numrului de talere teoretice dintr-o coloan.
31. Caracterizai timpul de retentie i volumul de eluie n cazul unui solut.
32. Descriei tipul de cromatografie de partiie n functie de starea stationar i mobil.
33. Dou proteine A i B se determin prin focalizare izoelectric avnd pIA=7,5 i pIB=8,0.
Cele doua proteine se separ prin cromatografie de schimb ionic. Stabilii tamponul de eluie
i matricea cromatografic utilizat.
Matricea cromatografic : suport Dietilaminoetil (de ex. DEAE-Sephadex)
Soluie tampon : tampon fosfat pH alcalin
Eluie n gradient sau n trepte cu NaCl
34. Cromatograma de mai jos prezint modul de separare a doua proteine. Calculai rezoluia de
separare a celor dou proteine i factorul de asimetrie al acestora. Care este factorul de
trenare?
35. Descriei succint o metod cromatografic de determinare a masei moleculare a dou
proteine.
 36. Amestecul a doua proteine se supune separrii prin electroforez nativ pe un gel de poliacrilamid
preparat astfel :
Gel de concentrare (T=4,5%)
Acrilamid (29,5 g) si bisacrilamid (0,5 g) aduse
la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 1,3
Ap distilat
Persulfat de amoniu 20 l
TEMED 5 l
Volum total 5 ml
Gel de separare (T= )
Acrilamid (29,5 g) si bisacrilamid (0,5 g) aduse 3,33 ml
la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 2,5
Ap distilat 4,14
Persulfat de amoniu 50 l
TEMED 10 l
Volum total 10 ml

a. Determinati T% si C% in soluia de acrilamid : bisacrilamid iniial.

b. Completai locurile libere din cele dou tabele.
c. Care este C% n gelul de concentrare? Dar in gelul de separare?

a. T%=29,5 g acrilamid+0,5 g bisacrilamid=30%

0,5
C%=29,5+0,5x100=1,66%

b. Gel de concentrare (T=4,5%)

Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) aduse 0,75 ml
la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 1,3 ml
Apa distilata 2,925 ml
Persulfat de amoniu 20 l
TEMED 5 l
Volum total 5 ml

4,5 g acrilamid+bisacrilamid100 ml
x........5 ml x=0,225 g

30 g100 ml
0,225 g..y y=0,75 ml acrilamid+bisacrilamid

Gel de separare (T= 10% )

Acrilamida (29,5 g) si bisacrilamida (0,5 g) aduse 3,33 ml
la 100 ml
Tampon Tris-HCl pH 6,8 2,5 ml
Apa distilata 4,14 ml
Persulfat de amoniu 50 l
TEMED 10 l
Volum total 10 ml

100 ml......30 g
3,33 ml.....x
x=0,99 g
0,99 g...10 ml
T%...........100 ml
c. C% are aceeai valoare n ambele geluri i este egal cu C% din soluia iniial.
0,5
C%= x100=1,66%
29,5+0,5
37. Tamponul de migrare utilizat n PAGE este Tris-glicina pH 8,3. Explicai succint rolul
glicinei n separarea electroforetic a dou proteine. Dar a SDS?

Ionul glicinat are rol de ion terminal pentru c este un ion lent i migreaz ultimul. ntre
ionul glicinat i ionul clorur (care este ionul frontal, deoarece migreaz rapid n cmpul
electroforetic) se dispun componentele proteice ale probei, aceasta fiind stivuite n gelul de
concentrare i migrnd n gelul de separare sub aceast form (se dezvolt).
38. Amestecul a dou proteine se separ prin electroforez pe gel de poliacrilamid n prezen
de SDS. Dupa colorare, proteina B conduce la dou benzi.
a. Ce se poate spune despre cele doua proteine?
b. Care este rolul SDS?
c. Care este rolul -mercaptoetanolului?

a. Proteina A este alctuit dintr-o singur caten polipeptidic, n timp ce proteina B este o
protein oligomer, fiind alctuit din 2 subuniti.
b. SDS este un detergent anionic, care are rolul de a conferi proteinelor o sarcin total
negativ, sarcinile intrinseci ale proteinelor devenind neglijabile, astfel nct separarea se
realizeaz numai n funcie de masa molecular.
c. -mercaptoetanolul este un agent reductor al punilor disulfurice i este implicat n
denaturarea proteinelor i separarea acestora n subunitile componente.
39. Variabilele cinetice care afecteaz mprtierea zonei cromatografice.
40. Utilizarea gel-filtrrii la separrile de grup ale proteinelor.
41. Rini schimbtoare de ioni utilizate n cromatografia de schimb ionic a proteinelor.
Caracteristici.
42. Prezentai succint o serie de factori care influeneaz rezoluia de separare i mobilitatea
electroforetic a unei proteine (se dezvolt).
- pH-ul soluiei tampon sarcina electric este funcie de pH, deci alegerea unei soluii
tampon cu pH corespunztor conduce la rezoluii de separare superioare;
- difuziunea post-electroforetic apare de la oprirea curentului electric pn n momentul
prelucrrii gelului i depinde de tipul de electroforez;
- factori proprii particulelor care se separ: mrime, form, sarcin, concentraie, grad de
hidratare, grad de disociere;
- factori caracteristici mediului de separare: pH, vscozitate, intensitatea cmpului
electric, timpul de migrare;
43. Aplicaii ale electroforezei frontale.
44. Calculul voltajului n sistemele electroforetice pe gel de agaroz submarine.
45. Factorii de care depinde viteza reaciei de polimerizare a acrilamidei : bisacrilamidei (se
dezvolt).
- concentraia de monomeri i de radicali liberi
- temperatura (reacia de iniiere necesit cldur)
- puritatea reactivilor
- concentraia de inhibitori : oxigenul atmosferic este cel mai important inhibitor, acesta
putnd fi eliminat prin dezaerare.
Ali inhibitori : amidele alifatice, H+
46. Principiul separrii proteinelor prin cromatografie de afinitate.
47. Principiul separrii proteinelor prin cromatografie de afinitate cu ion de metal imobilizat.
48. Comparai tehnica de separare a proteinelor prin cromatografie de prin cromatografie de
afinitate cu ion de metal imobilizat .
49. Definii Rf n cromatografie i electroforez. Prezentai asemnri i deosebiri ngtre cei
doi parametrii.
50. Definii rezoluia de separare n cromatografie i electroforez. Prezentai asemnri i
deosebiri ngtre cei doi parametrii.
51. Sisteme utilizate n denaturarea proteinelor n cazul electroforezei.
52. Rezoluia coloanei.
53. Prezentai succint o tehnic de cromatografie pe coloan.
54. Diagrama Ferguson n cazul a dou proteine care difer prin sarcin dar au aceeai
dimensiune moleculara. Ce reprezint intersecia cu axa OY?

Diagrama Ferguson se obine prin separarea celor dou proteine n geluri cu T% cresctor i
reprezentarea grafic a mobilitii electroforetice relative (Rm, Rf) funcie de T%. Panta
dreptei obinute este o msur a masei moleculare i se numete factor de retardare.
Intersecia cu axa OY reprezint mobilitatea electroforetic relativ n condiii libere i
reprezint o msur a sarcinii electrice.
n acest caz, diagrama Ferguson va fi reprezentat de 2 drepte paralele, cu pant egal, dar
care vor intersecta axa OY n puncte diferite, n funcie de sarcina electric a proteinelor.
55. Prezentai componentele unui sistem de polimerizare n SDS-PAGE n condiii denaturante.
Descriei succint rolul fiecrui component.
Componente :
Gel de poliacrilamid alctuit din monomerii acrilamid i bisacrilamid.
Acrilamida este o substan care sufer o polimerizare cap-coad pentru a produce polimeri
lungi. Aceti polimeri sunt legai n reea de ctre bisacrilamid, care este agentul de
reticulare.
APS este o surs de radicali liberi i are rol de iniiator al reaciei de polimerizare.
TEMED este catalizatorul reaciei de polimerizare, crescnd viteza de polimerizare.
SDS este un detergent ionic folosit pentru a denatura proteinele. SDS se leag la proteine n
proporie mare, astfel nct sarcina intrinsec a proteinelor devine neglijabil fa de sarcinile
negative induse de prezena detergentului.
Soluia tampon are rol n meninerea pH-ului la valoarea dorit i de asemenea, confer
contraionii necesari migrrii electroforetice.
(se dezvolt)
56. Se prepar un amestec de polimerizare :
2,5 ml acrilamid:bisacrilamid 29,5:0,5g%
2,5 ml tampon Tris-HCl pH 8, 1,5M
100 l persulfat de amoniu
50 l TEMED
ap distilat pn la 10 ml.
Calculai T% initial i final i C% initial i final.

T% initial=29,5+0,5=30%

100 ml soluie.30 g acrilamid+bisacrilamid

2,5 mlx
x=0,75 g acrilamid+bisacrilamid

0,75 g acrilamid+bisacrilamid n 10 ml amestec de polimerizare

T%.................................................100 ml
T% final=7,5%

0,5
C% iniial=C% final= 29,5+0,5 100 = 1,66
57. Punctul isoelectric al 6 fosfogluconat dehidrogenazei este 6. Explicai de ce tampoanele
folosite n cromatografia pe DEAE-celuloz trebuie s aib pH mai mare de 6, dar mai mic
de 9, pentru ca enzima s se lege la suport. Se va lega aceast enzim la CM-celuloz n
acelai domeniu de pH folosit pentru DEAE-celuloz? Explicai. n ce domeniu de pH v
ateptai s se lege aceast dehidrogenaz la CM-celuloz? Explicai.
DEAE celuloza este un schimbtor de ioni ncrcat pozitiv i leag proteine cu sarcini
negative. La valori de pH mai mari de pH-ul izoelectric, proteinele au sarcin net negativ
i enzima se poate lega la suport. Totui, nu se poate lucra la orice valoare de pH, deoarece
enzima i poate pierde activitatea biologic, dac se afl la un pH n afara domeniului su
de stabilitate.
CM-celuloza este un schimbtor de ioni ncrcat negativ i va lega doar proteinele cu sarcin
net pozitiv. Enzima nu se poate lega la CM-celuloz n domeniul de pH 6-9, deoarece este
ncrcat negativ. Pentru ca 6-fosfogluconat dehidrogenaza s se lege la suport ar trebui
lucrat la o valoare de pH sub valoarea pI.
58. Ce metod cromatografic este adecvat pentru separarea urmtoarelor perechi de peptide :
Ala-Ala-Lys i Ala-Phe-Lys?
Pentru separarea celor dou peptide se poate utiliza cromatografia cu faz invers pe
coloan, n care faza staionar este hidrofob i faza mobil este hidrofil, iar proteinele
interacioneaz cu faza staionar prin intermediul aminoacizilor nepolari. Aceast metod
este foarte specific, permind separarea peptidelor care difer printr-un singur aminoacid.
(se dezvolt)
 59. Cunoscnd faptul c pI-urile urmtoarelor proteine sunt :
Mioglobin (cal) 7
Hemoglobin (om) 7,1
Ribonucleaz A (bovina) 7,8
Citocrom c (cal) 10,6
indicai ce metode cromatografice ar fi adecvate pentru separarea perechilor de substane :
mioglobin-hemoglobin i ribonucleaz A-citocrom c.

Mioglobin-hemoglobin cromatografie de gel-filtrare

Ribonucleaz A-citocrom c cromatografie de schimb ionic
(se dezvolt)
60. Stabilii corespondena dintre proprietile proteinelor prezentate n coloana din stnga i
metodele de separare i purificare prezentate n dreapta.
a. Mrime 1. electroforeza
b. Sarcin 2. Gel filtrare
c. Legare specific 3. Salting-out
d. Solubilitate 4. Imunoprecipitare
5. focalizare izoelectric
6. cromatografie de afinitate
7. cromatografie de schimb ionic
8. ultracentrifugare zonal

1. a, b
2. a
3. d
4. c
5. b
6. c
7. b
8. a
61. Descriei succint principiul urmtoarelor tehnici de cromatografie : cromatografie pe
hidroxiapatit, cromatografia n faz invers a proteinelor, cromatografia de interacie
hidrofob, cromatografia de adsorbie tiofil, cromatografia de schimb ionic.
n care din aceste tehnici se utilizeaz sulfatul de amoniu? Care este rolul lui? Dar clorura
de magneziu i clorura de sodiu?
62. Rolul glicinei n electroforeza multifazic pe gel de poliacrilamid.
63. Descriei 3 metode de determinare a masei moleculare n biochimia analitic.
64. Matrici (suporturi) utilizate n cromatografia de schimb ionic.
65. Rolul Blue dextran 2000 n calcularea caracteristicilor unei coloane cromatografice.
66. Descriei parametrii T% i C% n caracterizarea unui gel de poliacrilamid.
67. Rolul albastrului de brom fenol n determinarea masei moleculare a proteinelor prin
electroforez.
68. Principiul electroforezei native n prezen de Coomasie Brillant Blue (BN-PAGE).utilizri.
69. Geluri solubilizabile utilizate n electroforez. Caracteristici.
70. Definii factorul de retenie i modalitatea sa de determinare.
71. Talerul teoretic. Definiie i rolul su n determinarea eficienei de separare a unor compui.
72. Definii centrii C i P ai unui gel de hidroxiapatit. Rolul lor.
73. Separarea populaiilor de celule prin electroforez n flux continuu.
74. Ageni de reticulare ai acrilamidei utilizai n electroforez. Caracteristici.
75. Factorul de ntrziere (Rf). Definiie i rolul su n determinarea eficienei de separare a
unor compui prin electroforez i cromatografie.
76. Caracteristici ale agarozelor utilizate n separarea proteinelor. Rolul gruprilor ncrcate
electric din structura acestora i importana punctului de topire n utlizarea specific a
acestora.