INTRODUCCIN

Actualmente es posible extraer secuencias especficas de un

fragmento de ADN por medio de las endonucleasas de restriccin.
Luego estas secuencias extradas, se pueden desnaturalizar y
marcar ya sea con una enzima o con un istopo radioactivo. A estas
cadenas marcadas y que tienen una secuencia conocida se llaman
sondas de cidos nucleicos. Hoy en da se estn produciendo
sondas de cidos nucleicos sintticas, con lo que se obtiene sondas
de oligonucletidos de muy alta especificidad que estn disponibles
comercialmente y son las ms usadas en los laboratorios.
OBJETIVOS

Definir a las sondas gnicas y el uso que tienen en la

sociedad.

Conceptualizar la funcin de los diferentes tipos de sondas

gnicas, que se usan actualmente en el mercado.

Dar ejemplo del uso de las sondas gnicas en la deteccin de

enfermedades.

SONDAS GNICAS
El anlisis genotpico, a diferencia del anlisis fenotpico, nos va a permitir
examinar el genotipo de un carcter de un individuo independientemente de su
manifestacin externa, o fenotpica. Por tanto, tanto en expresin dominante
como regresiva, homo como heterocigtica, ser posible detectar dicho rasgo o
alteracin.
Los primeros estudios del genoma humano con fines diagnsticos se realizan
en 1976, descubrindose la primera deleccin en un gen humano,
concretamente en el de la (X,-talasemia, y en 1978 el mismo Y. W. Kan
descubre el primer polimorfismo de restriccin asociado a una enfermedad, que
fue la drepanocitosis.
Desde entonces, aunque la metodologa ha logrado importantes mejoras, el
fundamento del anlisis genotpico sigue basndose en los mismos principios.
Independientemente del mtodo en concreto aplicado, el anlisis genotpico se
basa en:
Las propiedades de
asociacin entre cadenas de
DNA de hebra simple. En
concreto, la asociacin entre
una cadena de DNA de hebra
simple del sujeto en estudio y
otra cadena de hebra simple
conocida, con un tamao
mnimo de 20 nucletidos, a
la que llamamos sonda.
Asociacin que es debida al apareamiento entre las bases complementarias de
estos cidos nucleicos. Entre la Adenina y la Timina (o Uracilo en el caso del
RNA) y la Guanina y la Citosina, apareamiento ste ms estable que el
anterior. Otros apareamientos entre estas bases resultan en formas de
asociacin mucho menos estables o completamente inestables (tabla I)
Porqu se asocian estas bases? Sencillamente porque asociadas entre s se
encuentran en un nivel energtico ms estable.
Ahora bien, en la asociacin resultante entre las muchas bases de estas
cadenas, de cientos o miles de nucletidos, alcanzar ese nivel de mxima
estabilidad o de mxima asociacin, no slo requiere una mxima
complementariedad, sino que adems, las condiciones qumicas (de tipos y de
concentracin de iones, acidez, etc.) y fsicas (temperatura, etc.) del medio han
de ser 10 ms adecuadas posibles para permitir el encuentro "dndole tiempo>
de las respectivas bases complementarias, y una vez encontradas entre s, que
les permitan permanecer tranquilamente asociadas mediante esos puentes
de hidrgeno, dos para la pareja adenina-timina y tres para la pareja guanina-
citosina.
Por el contrario, toda dificultad al emparejamiento de estas bases, debido a:
poco tiempo de reaccin, reaccionantes en condiciones poco adecuadas por
influencia de las propiedades qumicas del medio o demasiado movimiento
molecular debido a una temperatura inadecuada, dificultan el establecimiento y
mantenimiento de los enlaces que hacen posible y estabilizan estas uniones.
Todo esto puede producir interferencias en esta asociacin y por tanto, errores.
De esto creo que queda muy claro que en la realizacin de estas tcnicas, es
muy importante para "poderse fiar de los resultados, la precisin y rigor en el
desarrollo de las mismas. Estos estudios pueden tener un margen de fiabilidad
muy bajo cuando son realizados por quien no conoce bien esta problemtica, o
laboratorios insuficientemente preparados en material o personal para ello.
Adems de esta asociacin o "hibridacin, como la denominamos
tcnicamente, entre el DNA del sujeto y la sonda, es tambin absolutamente
preciso, disponer de un sistema de corte de gran precisin y especificidad en el
sitio donde corta el DNA del sujeto; a lo cual sirven de forma muy eficaz los
llamados enzimas (endonucleasas) de restriccin. ENDONUCLEASAS porque
son enzimas que cortan en el interior del cido nucleico, en este caso DNA, y
de RESTRICCION porque proceden de un sistema de autodefensa de las
bacterias frente a DNAs extraos a los que rompen con estos enzimas.
Estos enzimas tienen la propiedad de cortar el DNA en puntos muy precisos,
que van a ser secuencias de tres, cuatro, cinco o ms nucletidos.
Lgicamente, cuanto mayor sea el nmero de bases de la secuencia que
precisan reconocer, menos frecuente ser dicho sitio y por tanto los fragmentos
que produzca al corte sern mayores al producirse menos cortes de un DNA.
De este modo se puede elegir el tamao de los fragmentos que se quiere
obtener del DNA del sujeto. Tambin se deduce que si los cortes de la
fragmentacin han tenido lugar en secuencias precisas de nucletidos, como
hemos dicho, dos DNAs exactamente iguales sern cortados en fragmentos
exactamente iguales en tamao y contenido, y por tanto cuanto ms
semejantes sean un DNA a otro, cabe esperar que tendrn ms fragmentos
iguales. Otros criterios se suman en la eleccin de los enzimas adecuados en
cada caso.
El anlisis genotpico, en lneas generales, nos va a permitir estudiar la
patologa de los DNAs alterados, por deleccin, reordenamiento o mutaciones
puntuales, tanto de origen hereditario o gentico, como adquirido o somtico
como es el caso del cncer.
Otros objetivos ms a largo plazo sern el estudio completo del mapa gentico
humano, los llamados proyectos genoma humano, del que se conoce menos
del1 % de sus genes, sus enfermedades, o sencillamente estudiar en ms
profundidad los mecanismos de la regulacin de la expresin de esos genes,
conocimiento clave para comprender la morfognesis, la diferenciacin,
el envejecimiento, el cncer o
la neurobiologa.
El anlisis genotpico, se va a
llevar a cabo sobre el DNA de
cualquier clula nucleada
donde permanece invariable,
si exceptuamos los genes de
la inmunidad, pudiendo
resolver numerososas
dificultades del anlisis
fenotpico (Tabla ll)

Una vez establecidos los

fundamentos tericos del
anlisis genotpico, hemos de entrar en ms detalles respecto a sus
caractersticas y desarrollo.
Lo primero que es importante, es conocer qu enfermedades son accesibles
al estudio con estos mtodos? El primer lmite que se establece es de orden
tcnico, aparte de los generales antes citados de tipo metodolgico, es preciso
disponer de unas sondas adecuadas que permitan reconocer tanto al gen en
estudio como a marcadores genotpicos prximos a l, reconocimiento basado
en la hibridacin entre sus nucletidos y los de la sonda.
Se denomina sonda gentica, a todo fragmento de DNA (o RNA), homlogo a
una secuencia celular de DNA (o RNA), que es capaz de unirse por hibridacin
con esa secuencia celular de forma estable y altamente especfica por
reasociacin entre bases complementarias independientemente de la
concentracin o abundancia de esa secuencia de cido nucleico que se busca,
de la clula; en la muestra en estudio una sola sonda puede reconocer su
homlogo nico entre millones. La sonda precisa como se ha dicho
anteriormente un mnimo de 20 nucletidos.
La obtencin de sondas est condicionada al conocimiento del gen en estudio
y la posibilidad de clonar dicho gen. Clonar es separar el DNA de ese gen del
resto de todo el DNA humano, inmensamente mayoritario, e introducirlo en uno
mucho ms pequeo y controlable, denominado vector, que suele ser el DNA
de un minicromosoma llamado plsmido, de bacterias domsticadas como el
Escherichia Coli. El DNA con el gen que interesa para el estudio, se obtiene del
total del DNA celular con una endonucleasa de restriccin, que le va a cortar en
secuencias especficas y posterior purificacin del fragmento.
Para su conservacin y replicacin se introduce habitualmente en ese plsmido
o minicromosoma al que tambin se ha cortado con esa misma endonucleasa
para dejar los extremos del corte en modo tal que encajen perfectamente
con los de la sonda; se une con una ligasa y ~ll queda disponible para
recuperarlo cuando sea necesario, cortando el plsmido de nuevo con la
misma endonucleasa usada anteriormente, se obtiene el fragmento tal y como
fue insertado. Adems, en este plsmido se puede replciar aparte de que haya
plsmidas que se repliquen ellos solos muchas veces en la bacteria portadora,
estas bacterias, E. coli, pueden duplicarse, en condiciones ptimas de
crecimiento cada 20 minutos, lo cual significa que en 12 horas una bacteria.
podra dar lugar a casi un billn de nuevas bacterias y por tanto de copias de la
sonda. De esta manera, se tiene aislada y disponible la sonda (con la
secuencia de DNA que interesa). Es
Las sondas que se usan en la prctica son de dos tipos, a las que se
denominan:
- SONDAS DIRECTAS que corresponden al gen que se quiere estudiar.
- SONDAS INDIRECTAS que son secuencias en las cuales no hay localizado
ningn gen conocido, que reconocen polimorfismos de restriccin
genticamente ligados a locus mrbidos o rasgos conocidos y que van a servir
como marcadores genticos.

HIBRIDACIN POR SONDAS

Las sondas (probes) son segmentos de ADN o ARN que han sido marcados
con enzimas, sustratos antignicos, quimioluminiscencia o radioispotos, los
que se pueden unir con una alta especificidad a una secuencia complementaria
de cido nucleico. Estas sondas pueden ser dirigidas a un segmento de ADN o
ARN seleccionado, que puede tener de veinte a miles de bases de largo. Las
sondas de menos de 50 pares de bases son denominadas oligonucletidos y
pueden ser sintetizadas y purificadas con relativa facilidad por instrumentos
comerciales actualmente disponibles. Las sondas de oligonucletidos tienen la
ventaja de hibridar ms rpidamente a las molculas blanco (target) y pueden,
bajo ciertas condiciones, detectar el cambio de un nucletido dentro de una
secuencia de cido nucleico.

Existen varias condiciones que afectan el proceso de unin o hibridacin entre

la sonda y el segmento blanco, como temperatura, concentracin de sal y pH
de la reaccin. Por ejemplo bajas concentraciones de sal y altas temperaturas
permiten que slo el segmento blanco se una a la sonda, miestras que, por el
contrario, si la temperatura de la reaccin es baja, segmentos no
complementarios pueden unirse a la sonsa. Por lo tanto, las condiciones deben
ser cuidadosamente controladas para evitar falsos positivos.

La deteccin de la hibridacin puede hacerse de varias maneras, dependiendo

del mtodo usado para marcar la sonda. Por ejemplo, si se usa una enzima, la
hibridacin se puede visualizar por un cambio de color y si se usa
quimioluminiscencia, por emisin de luz un luminmetro.

TIPOS DE SONDAS GNICAS

Sondas Locus Especficas (LCI)

Estas sondas se hibridan a una regin particular de un gen. Esta sonda es til
cuando se ha aislado una pequea parte de un gen y se quiere averiguar en
que cromosoma se encuentra.
FISH puede usarse sobre clulas en metafase para detectar microdeleciones
especficas ms all de la resolucin de la citogentica de rutina o para
identificar material extra de origen desconocido.
Puede tambin ser de ayuda en casos donde es difcil determinar mediante la
citogentica de rutina si un cromosoma tiene una delecin simple o est
implicado en una reorganizacin sutil o compleja.
El nmero de sndromes de microdelecin diagnosticados por FISH est
aumentando con rapidez.
La sensibilidad de estos ensayos es en todos los casos mejor que la de la
citogentica de rutina, pero depende del sndrome en concreto . En algunos, la
sonda es especfica para el gen defectuoso, como en el Sndrome de Williams,
donde se ha encontrado una delecin en el gen de la elastina en el 96% de los
pacientes con diagnstico confirmado. En otros sndromes como el de Prader-
Willi/Angelman, la etiologa es heterognea y las microdeleciones slo forman
una parte de los casos (60%).

Sndromes de Microdelecin - Diagnosticables mediante FISH

Sndrome de Kallman.
Sndrome de Beckwith-Wiedemann.
Sndrome de Williams -Beuren.
Sndrome de Wolf-Hirschhorn.
Sndrome de Prader-Willi/Angelman.
 Sndrome del maullido (cri-du-chat).
Sndrome de Miller-Dieker.
Sndrome de Smith-Magenis
Deficiencia de esteroide-sulfatasa.
Sndrome de Rubinstein Taybi.
Sndrome DiGeorge/Velo-Cardio-Facial/CATCH 22/Shprintzen.

Sondas Mono-locus (SLP)

Son especficas para una regin de un determinado cromosoma. Se unen a

secuencias largas de nucletidos y presentan mayor variabilidad que las
sondas multi-locus. Como resultado se observan una o dos bandas por
individuo, segn sea homocigoto o heterocigoto. El patrn de bandas obtenido
con estas sondas se denomina perfil unilocus de ADN o DNA profiling

Sondas Multi-locus (MLP)

Hibridan con secuencias minisatlites presentes en varios loci de diferentes

cromosomas. Son sondas de 10 a 15 nucletidos que se repiten mltiples
veces y tras el revelado se observan de 10 a 20 bandas por persona. Este
patrn de mltiples bandas se conoce como huella gentica multilocus o DNA
fingerprint.

Las sondas multi y mono-locus presentan una serie de ventajas con respecto a
una serie de parmetros como son:

- Informacin aportada: Las sondas multi-locus tienen una mayor

capacidad discriminativa al aparecer mltiples bandas. No obstante, las
mono-locus son ms especficas ya que el fragmento de ADN con el que
hibridan es de mayor tamao.
- Cantidad y calidad del ADN: Cuando se usan sondas multi-locus se
requiere aproximadamente un microgramo de ADN sin degradar
mientras que en el caso de las mono-locus se necesita menos de 100 ng
 y este ADN no necesariamente debe estar en perfecto estado, siempre y
cuando el fragmento complementario a la sonda est intacto.
- Especificidad entre especies: Las sondas multi-locus permiten su uso
sobre el ADN humano y de cientos de animales superiores, mientras que
las mono-locus son exclusivas de ADN humano.

Sondas Centromricas o ADN satlite

Las sondas satlites o centromricas son secuencias especficas de cada

cromosoma generadas a partir de secuencias altamente repetitivas tomadas de
los satlites de las regiones centromericas, pericentromricas y
heterocromticas de cada cromosoma
Estas sondas hibridan con las regiones o satlites u otras secuencias
repetitivas de la regin centromrica del cromosoma. Son de utilidad para
detectar alteraciones cromosmicas numricas. Como hemos dicho
anteriormente, esta tcnica puede aplicarse sobre clulas en divisin o ncleos
interfsicos, por tanto podemos detectar anomalas cromosmicas numricas
sin necesidad de tener clulas en metafase.
Estas sondas permiten la rpida identificacin de un cromosoma en concreto
en metafase y la deteccin de aneuploidas en interfase y metafase.
Los colores que se pueden utilizar para este tipo de sonda son rojo y verde,
siendo el rojo para el cromosoma 13 o verde para el cromosoma 21 como
ejemplos.

Sondas Radioactivas

Para visualizar las molculas diana se utiliza una sonda marcada o

radiactivamente, o mediante marcaje inmunolgico. Para el uso de ADN de
doble cadena primeramente es necesario desnaturalizarlo mediante calor o en
condiciones de alta alcalinidad. Esta sonda de cadena simple marcada se une
a la diana; y los lugares de unin se detectan porque los mtodos de marcaje
dejan una seal detectable mediante fotografa. En los mtodos ms
avanzados se utilizan marcajes mediante fluorescencia que emiten seales
detectadas mediante lser, como el utilizado en la PCR a tiempo real.
La sonda de ADN es una tcnica que permite corta, copiar, multiplicar y
seleccionar fragmentos de ADN.
La Hibridacin Molecular es una secuencia de ADN o raramente de ARN
conocida y se confronta con otra secuencia se son iguales son
complementarias. Sirve para diagnosticar enfermedades infecciosas como por
ejemplo viral.

Sondas Subtelomricas:

Son sondas de ADN que identifican regiones cromosmicas prximas a los

telmeros, que contienen secuencias nicas que son especificas de cada
cromosoma. Posee una alta resolucin que varia segn la medida de la sonda
utilizada (30.100Kb), han demostrado ser una herramienta muy til para la
deteccin de muchas anomalas cromosmicas que implican las regiones
telomericas. Dicha identificacin es importante dado que estas regiones
subtelomricas contienen gran cantidad de genes.

Alteraciones subtelomricas La mayora de las regiones subtelomricas

presentan una elevada concentracin de genes y adems son muy propensas
a sufrir recombinaciones debido a la gran similitud de secuencias. Desde 1995,
se reconoce que una de las causas significativas del RM idioptico son las
alteraciones crpticas en las regiones subtelomricas que producen ganancias
o prdidas y provocan un desequilibrio de dosis gnica [30]. Ello ha propiciado
el desarrollo de distintas tcnicas para abordar el estudio de las
reorganizaciones subtelomricas. Actualmente hay varios estudios en series
amplias de RM idioptico que coinciden en que la frecuencia de alteraciones es
del 5-7% de los casos [11, 13, 31,32]. Las regiones subtelomricas de los
cromosomas corresponden mayoritariamente a bandas G negativas y
morfolgicamente son muy similares, por lo que resultan difciles de detectar en
el cariotipo. Entre las tcnicas alternativas ms empleadas para el estudio de
estas regiones est la FISH multisonda, que consiste en la hibridacin de
sondas subtelomricas sobre metafases y permite detectar deleciones,
traslocaciones desequilibradas y equilibradas, y en menor medida
duplicaciones. Sin embargo, para la rutina asistencial es una tcnica laboriosa
y costosa. Ms recientemente se est utilizando la tcnica de MLPA que
mediante una sonda especfica para cada subtelmero y en una nica reaccin
en cadena de la polimerasa (PCR) identifica deleciones y duplicaciones de
todas las regiones subtelom- ricas. Se trata de una tcnica ms rpida y
menos costosa, y evidencia un mayor nmero de duplicaciones que la tcnica
anterior, aunque tiene como inconvenientes que no detecta reorganizaciones
equilibradas y que se deben confirmar todas las alteraciones mediante FISH
[31]. La mayor proporcin de alteraciones subtelomricas corresponde a las
deleciones. Una de las deleciones ms comunes es en 1p36, ocurre en 1 de
cada 5.000 nacimientos, y debido a su elevada frecuencia el fenotipo est bien
establecido y el reconocimiento clnico permite dirigir el diagnstico. Se asocia
a hipotona, RM generalmente grave, retraso de crecimiento, obesidad, y
dismorfismo facial: frente prominente, puente nasal deprimido, hipoplasia
hemifacial, asimetra de orejas y barbilla en punta. En algunos casos ayuda al
diagnstico el hecho de que las cejas sean rectas y de implantacin baja. Hay
malformaciones cardacas, prdida auditiva y visual. Para las deleciones como
1q, 2q, 9p y 9q, ya se ha empezado a delinear el fenotipo, pero an hay
muchas otras en que el fenotipo no es consistente debido al escaso nmero de
casos comunicados. Las caractersticas clnicas ms habituales observadas en
las delecciones subtelomricas corresponden a una historia familiar positiva,
retraso de crecimiento prenatal, alteraciones en el crecimiento postnatal, dos o
ms rasgos dismrficos faciales y uno o ms defectos congnitos no faciales;
la microcefalia es la anomala ms constante. En los estudios del RM idioptico
que analizan las alteraciones subtelomricas y seleccionan a los pacientes
teniendo en cuenta estos indicadores con una puntuacin de tres o ms, la
frecuencia de reorganizaciones aumenta hasta el doble [33]. En los primeros
trabajos se observ que el mayor porcentaje de alteraciones subtelomricas se
encontraba en pacientes con RM grave [34,35]; no obstante, en estudios ms
recientes se ha podido comprobar que una gran proporcin de alteraciones a
menudo se asocia a RM leve [36,37]. Un gran porcentaje de las anomalas
subtelomricas, alrededor del 50%, son heredadas. Entre ellas, la mayora
corresponde a cromosomas derivados de una traslocacin equilibrada parental,
en un grupo ms reducido se encuentran las delecciones/ duplicaciones, y ms
raramente se observan traslocaciones aparentemente equilibradas. En los
casos familiares con una delecin/duplicacin heredada del progenitor, ste en
general presenta unas caractersticas clnicas ms leves comparadas con las
que presenta el hijo e incluso hay casos sin una clnica evidente. Muchas de
estas anomalas podran corresponder a polimorfismos benignos sin ninguna
relacin causal, mientras que en otros se tratara de un efecto de anticipacin
que causara manifestaciones ms graves en las generaciones jvenes o bien
existira un efecto de impronta genmica. En cuanto a las reorganizaciones
aparentemente equilibradas, algunas se han asociado a pequeas deleciones
de tamao variable (0,8-15 Mb), por lo que se aconseja utilizar tcnicas
moleculares complementarias antes de decidir si estas anomalas son
patognicas o por el contrario no tienen repercusin fenotpica

Sondas de pintado cromosmico

Se denominan sondas de pintado cromosmico a aquellos fragmentos de ADN

que se obtienen mediante separacin cromosmica por citometra de flujo y se
marcan directamente mediante DOP-PCR. Slo pueden utilizarse en metafase
y sirven para detectar alteraciones estructurales (translocaciones, cromosomas
marcadores, derivativos, etc.) difciles de identificar con la citogentica
convencional, como la t(12;21)(p12;q22) en la leucemia aguda linfoblstica B
del nio.
Con la sonda de pintado cromosmico simple correspondiente a un
determinado cromosoma se consigue pintar solo los cromosomas homlogos
correspondientes, permitiendo as detectar de forma rpida alteraciones
numricas y estructurales intercromosomicas que afecten a ese cromosoma
especifico. Son sondas complejas de ADN, generadas a partir de cromosomas
microdiseccionados que se amplifican por DOP-PCR, se marcan e hibridan con
mltiples secuencias del cromosoma, con excepcin de las regiones
centromericas y telomericas. As, tras la hibridacin aparece pintado
uniformemente todo el cromosoma. Estas sondas, tambin conocidas como
sondas WCP sirven fundamentalmente para detectar translocaciones difciles
de identificar con las tcnicas de citogentica convencional, asi como para
identificar el origen de material adicional presente en un cromosoma derivativo
o en pequeos marcadores supernumerarios. Si bien se pueden utilizar en
interfase, se aconseja su uso sobre metafases.
Los principales inconvenientes de la utilizacin de estas sondas son la no
deteccin de inversiones paracentromricas y su baja resolucin, que impide
detectar pequeas delecciones, duplicaciones y translocaciones.
Con el pintado cromosmico mltiple se consigue pintar de forma simultanea
todos los cromosomas pero en metafase independientes.
CONCLUSIONES

Se definieron a las sondas gnicas y el uso que tienen en la

sociedad.

El grupo logr conceptualizar la funcin de los diferentes tipos

de sondas gnicas, que se usan actualmente en el mercado.

Se dieron ejemplo del uso de las sondas gnicas en la

deteccin de enfermedades.

REFERENCIAS BIBLIOGRFICAS
 Lexel IN VITRO experience. Disponible en:
http://lexelmedical.com/lexel/cromosoma-13.pdf..

SERVICIO DE SONDAS Y CENTRO DE REFERENCIA. Disponible en:

http://www.sondas.org/sondas.html.