CURS 4

STRUCTURA SECUNDAR A ADN

Este o caracteristic a lumii vii de a avea o anumit redundan informaional, ceea ce

asigur o transmitere ct mai fidel a coninutului informaional.
n cadrul fenomenului ereditar exist un joc de doi i anume:
- factorii ereditari exist sub form de pereche gene alele
- cromozomii exist sub form de perechi (crs.omologi)
- fiecare cromozom este alctuit din dou cromatide.
Nici structura macromoleculei informaionale care este ADN nu face excepie de la acest
joc de doi pe care l realizeaz fenomenul ereditar, deoarece, starea nativ a ADN este aceea de
macromolecul bicatenar, ADN fiind alctuit din dou catene polinucleotidice. Descifrarea
structurii bicatenare a ADN s-a realizat ca urmare a cercetrii sale cu metode precum
spectrofotometria, rezonana magnetic nuclear, absorbia n UV, cromatografia, electroforeza.
Dintre toate aceste metode, cea a difraciei n raze X a dat cele mai sigure i neechivoce
rezultate.
Primele cercetri privind descifrarea structurii ADN prin analiza imaginilor difraciei n
raze X au fost ntreprinse de ctre Astbury n anul 1938. n acelai an Astbury i Bell au artat c
macromolecula de ADN are o structur fibrilar, pe axa sa lung bazele azotate stnd
perpendicular, ntre dou baze azotate vecine de pe coloana glucido-fosforic existnd o distan
de 3,4 .
Cele mai bune imagini ale difraciei ADN n raze X sunt ns obinute n perioada 1950
1952 de ctre M. H. F. Wilkins i R. Franklin.
De o deosebit importan n elucidarea structurii secundare a ADN s-au dovedit a fi
cercetrile lui Chargaff din 1950, prin care s-a stabilit c cele patru baze azotate principale nu
intr n proporii egale n structura ADN de la diferitele specii analizate. Mai mult, Chargaff a
stabilit regula echivalenei dup care ntotdeauna cantitatea de A este egal cu cea a T (A=T), iar
cantitatea de citozin este egal cu aceea de guanin (C=G), de unde rezult un raport A/T, ca i
cel C/G =1 la organisme foarte diferite precum Mycobacterium tuberculosis avium,
Saccharomyces cervisiae, Bos taurus sau Homo sapiens. Pe de alt parte, raportul A/G este
diferit de unitate, ca dealtfel i raportul C/T.
n aceste constatri cunoscute i sub denumirea de legile lui Chargaff i are izvorul ideea
mperecherii bazelor azotate purinice cu bazelepirimidinice - idee ce a constituit piatra de temelie
n elaborarea de ctre J. D. Watson i F. C. H. Crick a modelului de structur secundar a ADN.
Raportul A+T/G+C este caracteristic fiecrei specii, fiind mult mai apropiat la organismele
nrudite filogenetic.
Sintetiznd aceste date din domeniul biochimiei acizilor nucleici, acumulate n literatura
de specialitate, bazai i pe experiene proprii de modelare molecular, n anul 1953, Watson i
Crick au propus modelul de structur bicatenar al ADN, care a fost ulterior unanim acceptat i
considerat cea mai mare descoperire din domeniul biologiei n sec. XX i una dintre cele mai
mari n istoria tiinei. n elaborarea modelului dublului-helix, Watson i Crick au inut seama i
de fotografiile privind difracia n raze X a ADN puse la dispoziie de R. Franklin i realizate n
laboratorul de la Londra al lui Wilkins.
Modelul de structur bicatenar al ADN, propus de Watson i Crick admite c
macromolecula de ADN este format din dou helice coaxiale, adic din dou catene
polinucleotidice paralele, nfurate plectonemical n jurul unui ax virtual comun i avnd una
direcie ascendent n care nucleotidele se leag prin puni fosfodiesterice (legturi intracatenare)
1
de la 3 la 5, iar cealalt caten are direcie descendent n care nucleotidele se leag prin puni
fosfodiesterice cu orientare de la 5 la 3. Rezult c cele dou catene polinucleotidice sunt
antiparalele.
Structura bicatenar a ADN face ca el s mai fie numit dublu - helix ADN. Datorit
rsucirii plectonemicale, n spiral, a celor doua catene, structura secundar a ADN mai este
numit i structur dublu - helicoidal. Rsucirea celor dou catene ale dublului helix ADN este
dextral, spre dreapta, i n toate sistemele biologice se ntlnete acest tip de spiralizare spre
dreapta, astfel c n mod normal ADN este dextral.
Bazele azotate se afl spre interiorul dublului helix, pe cnd gruprile fosfat sunt
dispuse la exterior, unind dezoxiribozele nucleotidelor nvecinate prin legturi covalente
puternice, fosfodiesterice, intracatenare, alctuind o veritabil coloan glucido-fosforic.
Realizarea structurii bicatenare este consecina complementaritii dintre bazele azotate
purinice i bazele azotate pirimidinice. Prin proprietile sale structurale adenina prezint
complementaritate fa de tinin, astfel c, atunci cnd intr n structura ADN, adenina se unete
cu T prin intermediul a dou puni de H. Se formeaz astfel perechea de baze azotate A=T sau
T=A. Pe de alt parte, G prezint complementaritate fa de C cu care se unete, n cadrul
structurii bicatenare, formnd perechi C G sau G C prin intermediul a trei puni de H.
Complementaritatea purin pirimidin impune restricii secveniale, astfel nct,
secvena de baze azotate de pe o caten a dublului helix ADN este dependent de secvena
celeilalte catene, reprezentnd imaginea n oglind a acesteia, catenele complementare
presupunndu-se reciproc ca secvenialitate n cadrul structurii bicatenare.
Complementaritatea strict purin pirimidin sau pirimidin purin confer structurii
helicoidale bicatenare de ADN o form regulat, cu un diametru constant de-a lungul ntregului
su traiect.
Structura bicatenar prezint repetiii ale nfurrii sale dup fiecare 10 perechi de baze
azotate, adic dup 34 , care poart numele de pasul helixului sau pasul helicei. Planurile
bazelor azotate sunt perpendiculare pe axa fibrei. Diametrul dublului helix ADN este de 20 ,
avnd o spir (un pas) de 34 , astfel c fiecare spir a dublului helix cuprinde cte 10 perechi
de nucleotide, ceea ce nseamn c dimensiunea unei perechi de nucleotide este de 3,4 . Cele
dou catene polinucleotidice sunt antiparalele, la una legturile fosfodiesterice realizndu-se
ntre C3 al dezoxiribozei unui nucleotid i C5 al dezoxiribozei nucleotidului urmtor, pe cnd la
cealalt caten, legturile fosfodiesterice au orientarea C5 C3.
Structura bicatenar a ADN prezint de regul o mare stabilitate fizic, asigurat pe
vertical de punile fosfodiesterice intracatenare, iar pe orizontal de punile de H intercatenare i
de stivuirea perechilor de baze azotate, n cadrul dublului helix, toate acestea fcnd ca ADN
dublu catenar s apar ca o structur oarecum rigid, paracristalin.
Caracteristicile structurale finale ale dublului helix ADN sunt dictate de moleculele de
dezoxiriboz care se aeaz cu oxigenul inelului orientat n sus n cadrul unei catene i orientat n
jos n cadrul catenei complementare.
Din cauza acestui aranjament opus al moleculelor de dezoxiriboz n cele dou catene i
deoarece zahrul se leag la o poziie excentric a bazelor azotate, ntreaga molecul de ADN
este obligat s se rsuceasc, s se spiralizeze, rezultnd nu o structur bicatenar dreapt, ci
una spiralizat, rsucit helicoidal (de unde denumirea de dublu-helix ADN) n care fiecare
pereche succesiv de baze azotate se ntoarce cu 36o n direcia acelor de ceasornic, dublul helix
fcnd un tur complet (360o) la fiecare 10 perechi de nucleotide, acesta reprezentnd de fapt
pasul helicei ADN.
n cadrul dublului helix ADN, din nfurarea plectonemical a celor dou catene, rezult
o alternan regulat de adncituri minore i adncituri majore, astfel c la un nivel dat al
dublului helix o adncitur minor de pe o parte corespunde la o adncitur major de pe cealalt
parte.
La unele polinucleotide sintetice, n care o caten este format numai din resturi de G, pe
cnd catena complementar numai din resturi de C, asemenea nucleotide numindu-se poli d (G-
2
C), s-a constatat existena unei spiralizri cu orientare spre stnga (senestr), asemenea ADN
numindu-se ADN de stnga. ADN de stnga prezint aceeai regularitate intern, aceleai
asocieri de baze azotate ca i ADN de dreapta, dar i unele diferene structurale considerabile.
Astfel, n ADN de stnga grupele fosfat se dispun nu dup un traiect rectiliniu, ci dup un traiect
n zig-zag, ADN de stnga numindu-se i ADN-z. Dac n ADN nativ, normal, de dreapta,
perechile de baze azotate sunt ascunse la interiorul dublului helix, n ADN de stnga perechile
de baze sunt expuse mai spre exteriorul dublului helix i pasul helicei cuprinde nu 10 ci 6 perechi
de baze, din care cauz forele de stivuire sunt mai mici, iar molecula de ADN-z apare mai
fragil, avnd i un diametru mai mic. Este posibil ca structuri de tip ADN-z s apar n anumite
condiii chiar i n cadrul structurii ADN nativ, cu spiralizare de dreapta, doar pe anumite
segmente ale sale, n cadrul desfurrii anumitor procese fiziologice normale, cum ar fi
replicarea i transcrierea, regiunile dextre i cele senestre putnd fi reparate doar de dou perechi
de nucleotide. Este posibil ca spiralizarea de stnga a ADN, n care perechile de baze azotate
sunt mai expuse interaciunilor cu substane mutagene sau carcinogene, s stea la baza genezei
unor stri patologice.
Acizii nucleici reprezint polimeri cu suficiente componente (monomeri) care s permit
o mare varietate de aranjamete. n acizii nucleici nu se nregistreaz o repetiie monoton a
monomerilor, ca n cazul celulozei unde se repet un acelai monomer-glucoza, ci are loc o
niruire statistic, aleatorie a celor patru nucleotide, ceea ce d posibilitatea realizrii unui
numr nelimitat de aranjamente de secvene de nucleotide, fiecare aranjament reprezentnd o alt
informaie ereditar. Aceasta st la baza enormei diversiti a vieuitoarelor, ntlnit n natur,
de la apariia lor pn astzi.

PROPRIETILE FIZICO-CHIMICE ALE ADN

Greutatea molecular
Fiind polimeri de nucleotide, acizii nucleici reprezint substane cu greutate molecular
mare care depete 10.000 Da, ajungnd la 107 4 x 108 Da, din care cauz ele reprezint
macromolecule. Macromolecula de ADN este cel mai mare polimer din materia vie. Mrimea
macromoleculei acizilor nucleici poate fi mai uor intuit dac se ia n consideraie faptul c
greutatea molecular a unui nucleotid purinic este de 354 Da, iar a unui nucleotid pirimidinic de
314 Da.
Greutatea molecular a moleculelor de ADN de la diferite specii este diferit, mrimea
macromoleculei de ADN fiind o caracteristic de specie i depinznd de regul de complexitatea
informaiei ereditare pe care o deine fiecare specie. Astfel, greutatea molecular a ADN al
bacteriofagului X 174 este de 1,7 x 106 Da, pe cnd la bacterii aceasta este de 4-5 x 106 Da. Ca
regul, un fragment de ADN de 100 lungime are 30 de perechi de nucleotide i o greutate
molecular de cca. 20.000 Da. Lungimea ADN uman per complement haploid (n = 22 A + X)
corespunde la 2,9 x 109 perechi de baze (2,9 x 106 kilobaze) ceea ce ar reprezenta 1m lungime
de ADN, dac moleculele de ADN de la fiecare cei 23 cromozomi ai complementului
cromozomial haploid ar fi puse una n continuarea celeilalte i ar fi n stare extins, nu
compactat, superspiralizat cum se afl ele n mod normal n cromozomi. Dac am considera
lungimea moleculelor de ADN din cromozomii tuturor celulelor umane de ordinul mai multor
miliarde n condiiile artate mai sus, lungimea ADN uman ar depi de cteva ori distana de
la Pmnt la Soare.

Denaturarea i renaturarea

3
 n condiii fiziologice normale, macromolecula de ADN se prezint ca o structur stabil.
Stabilitatea ei este conferit de:
legturile fosfodiesterice intracatenare
legturile de hidrogen intercatenare (dou ntre A i T i trei ntre G i C, regiunile
ADN bogate n perechi G-C fiind mai stabile dect cele bogate n A-T)
forele de stivuire (suprapunerea perechilor de nucleotide n cadrul structurii
bicatenare).
Aceste fore ce asigur stabilitatea macromoleculei de ADN fac ca o molecul de acid
nucleic ce are mai mult de 10 perechi de nucleotide s fie stabil la temperatura camerei.
Peste anumite limite de temperatur (ntre 63 C i 100C) stabilitatea legturilor de
hidrogen cedeaz, avnd loc desfacerea dublului-helix n cele dou catene polinucleotidice
complementare, fenomen numit denaturare termic, ADN trecnd de la condiia dublu catenar,
la condiia monocatenar, nsoit de reducerea drastic a vscozitii soluiei de ADN. Cea mai
sczut temperatur de denaturare cunoscut este de 65C i se nregistreaz n cazul
polinucleotidului sintetic poli d (A-T).
Temperatura de denaturare numit i punct de topire sau temperatur de topire (melting
temperature) este diferit la diferitele specii, n funcie de bogia n perechi G-C din ADN al
speciei respective: cu ct acesta conine un numr mai mare de perechi G-C ntre care exist trei
puni de H, fa de numrul perechilor A-T, ntre care exist doar dou puni de H, cu att
temperatura cerut pentru ruperea legturilor de hidrogen i separarea catenelor este mai mare.
Dac amestecul de monocatene rezultate prin denaturarea dublului helix ADN se rcete
brusc, monocatenele rmn permanent separate i un asemenea ADN se numete ADN denaturat.
Dac amestecul de monocatene se rcete treptat, lent, are loc o reasociere a catenelor, cu
refacerea legturilor de hidrogen dintre ele i cu restabilirea structurii bicatenare a ADN.
Acest fenomen de restabilire a structurii bicatenare din monocatene complementare s-a
numit renaturarea ADN.
Temperatura de topire cerut pentru denaturarea ADN poate constitui un indicator
indirect grosier al compoziiei n baze azotate a ADN considerat. Astfel un ADN bogat n perechi
A-T va prezenta o temperatur de denaturare mai mic fa de un ADN n care predomin
perechile G-C. Cnd o soluie de ADN este supus unor temperaturi mai mari de 100C are loc
ruperea legturilor fosfodiesterice cu ruperea coloanei fosfoglucidice.
Denaturarea ADN este nsoit de efectul hipercromic, adic de creterea intensitii
absorbiei razelor UV de ctre soluia de ADN denaturat, ca urmare a demascrii, a expunerii
bazelor azotate la exterior, n direct contact cu radiaia UV. Aceast demascare este realizat
prin trecerea de la structura bicatenar normal (n cadrul creia bazele azotate sunt mascate de
coloanele fosfoglucidice, fiind deci ascunse spre interiorul dublului helix ADN) la structura
monocatenar, n monocatene bazele azotate fiind expuse incidenei directe a razelor UV, oferind
suprafee mult mai mari pentru absorbia acestor raze UV, bazele azotate fiind cromofile i
hidrofobe.
Renaturarea ADN este nsoit de efectul hipocrom, adic de reducerea absorbiei razelor
UV, deoarece prin refacerea structurii dublu-catenare, bazele azotate se ascund din nou spre
interiorul structurii bicatenare.
Dac denaturarea este iniiat la nivelul unor sectoare din dublul helix ADN bogate n
perechi A-T, acestea fiind zonele de mai slab stabilitate, renaturarea este iniiat la nivelul unor
regiuni ale monocatenelor ADN ce cuprind bazele complementare G i C, cu realizarea de
perechi G-C, mai stabile dect perechile A-T. Asemenea sectoare la nivelul crora se iniiaz
renaturarea ADN se numesc puncte de nucleaie sau nuclee de renaturare, respectiv de
reasociere.
Denaturarea i renaturarea acizilor nucleici sunt procese fizice foarte importante, folosite
de ctre cercettori fie n studiul relaiilor filogenetice dintre specii, fie n tehnologia ADN
recombinant. Speciile nrudite filogenetic au o secven de baze azotate (o informaie genetic)
cu un grad nalt de similitudine i deci i temperaturi apropiate de denaturare a ADN, realiznd i
4
o renaturare mai rapid a monocatenelor lor, atunci cnd sunt amestecate, fa de speciile mai
ndeprtate filogenetic.
Procentul de renaturare ntre monocatene de ADN de la om i monocatene de ADN de la
cimpanzeu este de 90% pe cnd cel dintre ADN uman i ADN de oarece este de numai 25%.
n tehnologia ADN recombinant, hibridarea molecular ajut la stabilirea exact i rapid
a transferului unor gene eucariote n celula bacterian prin folosirea a ceea ce s-a numit sonda
radioactiv, care nu este altceva dect o monocaten ADN sau ARN marcat radioactiv i care
este complementar segmentului genei eucariote transferate. Dac are loc reasocierea unei
asemenea sonde radioactive cu un segment de ADN extras de la celula bacterian n care a fost
clonat gena eucariot, nseamn c transferul acestei gene n celula bacterian a fost eficient,
real.
Totodat, prin hibridri moleculare ADNARN se poate realiza cartarea genelor
rspunztoare de sinteza ARN prin aa-numita hibridare in situ, adic fr extracia de ADN,
denaturarea acestuia realizndu-se la nivelul cromozomilor, n preparate citologice pe lame
microscopice. Aceste preparate sunt incubate cu molecule de ARN ribosomal, de un tip dat,
marcate radioactiv i aflate ntr-o soluie salin, corespunztoare, astfel c monocatenele ARN se
vor uni pe baz de complementaritate cu un segment dat al monocatenelor ADN pe care se afl
gena pentru acel tip de ARN ribosomal. Dup splarea lamelor pe care se afl preparatele
citologice spre a ndeprta restul de monocatene ARNr rmase neasociate, pe aceste lame se
aplic emulsie fotografic, se incubeaz la ntuneric spre a se realiza impresionarea, se
developeaz i se analizeaz la microscop, astfel c acolo unde s-a realizat la nivelul
cromozomului hibridarea ADN-ARN apar zone colorate caracteristic (negru), acela fiind locul
unde se afl gena pentru tipul de ARNr folosit n hibridare.
Prin asemenea experiene de hibridare se poate localiza poziia i a altor gene, folosind
alte tipuri de ARN marcat radioactiv cum ar fi ARN solubil sau de transfer i ARN mesager. De
exemplu, folosind n hibridare ARNm ce poart mesajul genetic pentru sinteza insulinei, ARNm
ce poate fi uor izolat din celulele pancreasului endocrin, se poate localiza pe cromozom poziia
genei insulinei.