Efecto Radiosensibilizacin de nanopartculas de oro-folato conjugado en clulas l La

cancerosas bajo
ortovoltaje tcnicas de radioterapia superficial
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Efecto Radiosensibilizacin de
nanopartculas de oro-folato conjugado en
Clulas cancerosas HeLa en virtud de ortovoltaje
tcnicas de radioterapia superficial
Karim Khoshgard, Bijan Hashemi, Azim Arbabi,
Mohammad Javad Rasaee y Masoud Soleimani

1. Departamento de Fsica Mdica, Universidad Tarbiat Modares, Tehern, Irn

2. Departamento de Radioterapia, Hospital Imam Hossein, Shahid Beheshti
Universidad de Ciencias Mdicas, Tehern, Irn
3. Departamento de Biotecnologa Mdica, Universidad Tarbiat Modares, Tehern,
Irn
4. Departamento de Hematologa, Tarbiat Universidad Modares, Tehern, Irn

E-mail: bhashemi@modares.ac.ir
Recibido el 22 de octubre de 2013, revisado 05 de febrero 2014
Aceptado para su publicacin el 26 de febrero 2014
Publicado 15 de abril 2014

Resumen
Debido al nmero atmico alto de nanopartculas de oro (PNB), que son conocidos como
nuevos agentes radiosensibilizadores para mejorar la eficiencia de las tcnicas de
radioterapia superficiales mediante el aumento de la dosis absorbida en las clulas
tumorales en las que se pueden acumular selectivamente. El objetivo de este estudio fue
comparar el efecto de diferentes niveles bajos de energa comunes de los rayos X y los
rayos gamma ortovoltaje megavoltage (Co-60) en la mejora de la eficacia teraputica de
las clulas cancerosas HeLa en presencia de folato conjugado y no conjugado (pegilado)
PNB. Para lograr esto, PNB con un dimetro medio de 52 nm se sintetizaron y conjugado
con molculas de cido flico. PNB pegilado con un dimetro medio de 47 nm tambin se
sintetizaron y se utiliza como PNB de folato no conjugados. Ensayo de citotoxicidad de los
PNB folato conjugados pegilados y sintetizados se realiz utilizando diferentes niveles de
concentracin de nanopartculas se incubaron con clulas HeLa durante 24 h. El efecto
radiosensibilizador de ambos los PNB conjugados pegilados y sobre las clulas a una
concentracin de 50 mM se compar con MTT, as como ensayos clonognicos despus
de exponerlos a 2 Gy de radiacin ionizante producida por una mquina de rayos x de
ortovoltaje en cuatro KVPS y diferentes rayos gamma de una unidad de Co-60. Se
observaron diferencias significativas entre los diversos grupos irradiados con y sin la
conjugacin de cido flico, con un factor de aumento de dosis media (DEF) de 1,64
0,05 y 1,35 0,05 para los PNB folato conjugados y pegilados, respectivamente. El
mximo DEF se obtuvo con el haz 180 kVp de rayos x para ambos de los PNB. PNB-
folato conjugado pueden mejorar significativamente el potencial de muerte celular de
energas de rayos x ortovoltaje (especialmente a 180 kVp) en las clulas que expresan el
receptor de folato de cncer, tales como HeLa, en las tcnicas de radioterapia superficial.

Palabras clave: radiosensibilizacin, nanopartculas de oro, folato, radioterapia

ortovoltaje, Co-60 (Algunas cifras pueden aparecer en color slo en la revista en lnea)
Introduccin
Ms de la mitad de los pacientes con cncer pasar a travs de los procedimientos de
radioterapia durante su perodo de tratamiento (Brun et al 2009). A pesar de las mejoras
realizadas en la eficiencia de la radioterapia, los efectos secundarios de la radiacin
ionizante en los tejidos normales son los factores limitantes de la dosis que restringen
dosis ms altas en los tumores (Drouet y Lagrange 2010). Sin embargo, el aumento de la
dosis absorbida en las clulas diana solas podran aumentar considerablemente la
probabilidad de control del tumor. Una forma de aumentar la dosis de radiacin slo a las
clulas cancerosas se puede hacer mediante el uso de agentes de radiosensibilizacin
acumulados preferiblemente en tales clulas. Estudio del efecto de radiosensibilizacin
materiales de alto nmero atmico se inici hace ms de 30 aos investigando el factor
radioenhancing de yodo (Matsudaira et al 1980). Sin embargo, debido a los recientes
logros de la nanotecnologa, hoy en da cada vez parece ms posible acumular
selectivamente nanopartculas de oro (PNB) con altos nanomateriales nmero atmico
como agentes radioenhancing en las clulas cancerosas (Brun et al 2009). En los ltimos
aos, el uso de PNB en la investigacin biolgica ha aumentado rpidamente (Jain et al
2011). PNB tienen propiedades especiales, tales como el tamao de nanoescala,
biocompatibilidad, la sntesis cmodo y bioconjugacin, intensas propiedades de
absorcin y dispersin. Debido a estas propiedades, PNB han proporcionado diversas
aplicaciones en la administracin dirigida de frmacos (Yang et al 2005), imgenes de
clulas (Shukla et al 2005, Chen et al 2005) y la terapia del cncer (Hainfeld et al 2004,
Chen et al 2007). La toxicidad y baja biocompatibilidad de los PNB ha designado como el
mejor candidato para ser utilizado para los propsitos (Shukla et al 2005, Lewinski et al
2008) radioenhancing. El efecto radiosensibilizador de los PNB en radioterapia ha
informado principalmente por Hainfeld et al (2004). Ms recientemente, la mejora de la
sensibilidad a la radiacin celular por PNB desnudos (Rahman et al 2009) y PNB pegilado
(Liu et al 2010) tambin se investig el uso de diversas modalidades de haz de radiacin,
entre los que se inform superficial kilovoltage de rayos X pasa a ser el ms eficiente
modalidad. Adems, Butterworth et al (2012) revis la base fsica y los mecanismos
biolgicos del efecto radiosensibilizacin PNB. Resultados contradictorios del factor de
aumento de dosis inducida PNB irradiaciones (DEF) con kilovoltage energa de rayos X se
han revisado en el ltimo estudio, lo que indica una variacin significativa de los
resultados del informe de un estudio a otro. De acuerdo con el estudio anterior, por
ejemplo, en un estudio in vitro (Rahman et al 2009) usando el mismo tipo de clulas
(clulas BAEC), tamao PNB (1,9 nm) y la concentracin (1 mM), las DEFs reportados
tena ms de diez veces variacin (24,6 a 2,2 para 80 y 150 kVp rayos X,
respectivamente). Sin embargo, las energas de los fotones incidentes para crear el efecto
fotoelctrico deben ser superiores a la energa de los tomos de unin a la diana de
electrones (Attix 2004). Por lo tanto, para los electrones K-shell de oro (que tiene una
energa de unin a 80,7 keV), se espera que la probabilidad de que el efecto fotoelctrico
sera ms alto para los 150 kVp polienergtico vigas de rayos x en comparacin con 80
kVp, ya que proporciona ms fotones, con las energas cercanas a la de oro K-shell
energa de enlace. Por otra parte, una disparidad se reivindica (Butterworth et al 2012)
para existir entre los DEFs experimentales predichos fsica y observadas en la literatura,
revelando el efecto de los mecanismos biolgicos en PNB radiosensibilizacin, tales como
la funcionalizacin de la superficie de estas nanopartculas. Algunos estudios se han
centrado en la entrega especfica de los PNB a las clulas diana del cncer utilizando
PNB de superficie modificada (Roa et al 2009, Kong et al 2008). La sobre-expresin de
receptores de folato (FR) en algunas clulas cancerosas se informa que es 100 veces
ms que en las clulas sanas normales y se ha explotado para apuntar agentes
teraputicos folato ligado especficamente a los tumores (Sega y Baja 2008, Doucette FR-
expresando y Stevens 2001). El folato tambin tiene caractersticas prometedoras como
no inmunogenicidad, la especificidad de las clulas cancerosas, y la posibilidad de
conjugar con PNB (Mansoori et al 2010). Estas propiedades han hecho que sea una
posicin de avanzada como un resto de direccin en muchos tratamientos contra el
cncer (Mansoori et al 2010). Clulas cancerosas HeLa se inform de que un alto nivel de
expresin FR (Masters 2002). Tambin se espera que la conjugacin con folato PNB
aumenta el potencial de muerte de rayos x de ortovoltaje cuando se irradian las clulas
HeLa, debido a la alta expresin de FR de estas clulas. Por lo tanto, el propsito
principal de este estudio in vitro fue comparar el efecto de diferentes bajos niveles de
energa de rayos x de ortovoltaje as como megavoltaje Co-60 rayos gamma en
presencia de folato conjugado y pegilado (folato no conjugado) PNB en la mejora de la
eficacia teraputica de las clulas cancerosas HeLa.

Material y mtodos

Productos qumicos y lneas celulares

Los principales materiales qumicos utilizados para la sntesis de las nanopartculas eran
tetracloroaurato de hidrgeno (III) trihidrato (HAuCl4.3H2O), borohidruro de sodio
(NaBH4), citrato trisdico (Na3C6H5O7), N, N? Diciclohexilcarbodiimida (C13H22N2), 4-
aminotiofenol (C6H14NS) y cido flico (C19H19N7O6), todos adquiridos de Sigma-
Aldrich (Alemania); y diclorometano (CH2Cl2), dimetilsulfxido (DMSO), metanol
(CH3OH), polietilenglicol (PEG, peso molecular de 2 kDa), adquirido de Merck (Alemania).
Los materiales utilizados para los cultivos celulares y ensayos de MTT incluyen medio de
Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), suero fetal bovino (FBS), azul de tripano,
penicilina / estreptomicina, EDTA tripsina 0,25% y MTT (3 [4,5-dimetiltiazol 2-il] -2,5-
difeniltetrazolio) todo comprado de GIBCO (Invitrogen, Alemania). La lnea celular HeLa
fue proporcionada por Bonyakhteh Co. (Tehern, Irn).

Sntesis PNB folato-conjugado

El mtodo general para la sntesis de PNB funcionalizados conjugados con folato se ha

descrito antes (Shakeri-Zadeh et al 2010a, 2010b). Este mtodo fue utilizado y mejorar
cambiando el peso del reductor para obtener PNB con un dimetro medio de 50 nm. El
folato se uni covalentemente a los PNB en dos etapas para formar PNB folato cubiertas
funcionalizados. En primer lugar, la molcula de 4-aminotiofenol (4ATP) usado como un
enlazador se une a los PNB desde su extremo -SH durante la sntesis para formar 4ATP-
PNB. Entonces, el folato fue obligado a 4ATP-PNB a forma estabilizada flico cido
4ATP-PNB (FA-4ATP-PNB). El esquema de este procedimiento de sntesis se muestra en
la figura 1, dibujado por software ChemDraw Ultra, versin 7.0.3. Las mediciones de FT-
IR se registraron utilizando pastillas de KBr a temperatura ambiente para verificar la
formacin de conjugacin. Imgenes de microscopa electrnica de transmisin (TEM) de
las nanopartculas se tomaron con un microscopio LEO 906 (Alemania) operado a 100 kV.
Las muestras se prepararon para las mediciones de TEM mediante la colocacin de una
gota de solucin coloidal sobre una rejilla de cobre carboncoated se deja secar en el aire.
Basado en las fotografas TEM, la distribucin y el tamao promedio de los PNB se
determinaron con el software ImageTool (ImageTool para Windows, 3,00).
Figura 1 Diagrama esquemtico del procedimiento de sntesis de la GNP-4ATP (a) y el
folato PNB-4ATP (b).

Sntesis pegilado PNB

Pegilado PNB se sintetizaron y se utiliza como los PNB no folato conjugados. Para este
propsito, se utiliz el mtodo propuesto por Turkevich et al (1951), en el que se utiliza
citrato trisdico como reductor para sintetizar PNB desnudos. El peso del reductor, como
el factor ms eficiente que participan en el control del tamao de las nanopartculas, se
cambi para obtener PNB con un dimetro medio de 50 nm. A partir de entonces, se
aadieron molculas de PEG (con un peso molecular de 2000 Da, 0,05% en peso) al
coloide PNB mientras se agita para sintetizar nanopartculas estabilizados estricamente.
El esquema de esta sntesis se muestra en la figura 2, elaborado por el software
ChemDraw Ultra, versin 7.0.3. Las imgenes TEM de estas nanopartculas fueron
tomadas con el mismo microscopio LEO 906 a 100 kV, y de stos, la distribucin y el
tamao promedio de PNB se determinaron utilizando el software ImageTool.

Figura 2. Diagrama esquemtico del procedimiento de sntesis de los PNB pegilado.

Cultivo celular

Las clulas HeLa fueron cultivadas como una monocapa usingDMEMsupplemented con
10% de FBS, 20 mM de D-glucosa, 100 UI ml-1 de penicilina y 100 gml 1-estreptomicina
en matraces de 75 cm2 (BD-Falcon, BD Biosciences, EE.UU.). El crecimiento de las
clulas se llev a cabo en una atmsfera humidificada que contiene 5% de CO2 a 95% de
aire a 37 C. El medio de cultivo se cambi con regularidad para obtener un nmero
suficiente de clulas. Cuando las clulas estaban en ms de 70 por ciento de confluencia,
se lavaron con PBS y se incubaron con la solucin de tripsina-EDTA durante 3 min a 37
C para separarlas del matraz. Las clulas despus se resuspendieron en el medio de
cultivo para la siembra. Tincin con azul de tripano se realiz para determinar la densidad
celular y la viabilidad antes de la siembra.

Ensayos de captacin de PNB

Se requieren mediciones de absorcin atmica de las concentraciones de oro en las

clulas para determinar la tendencia de las nanopartculas de internalizacin en las
clulas, as como para la eleccin de un programa de tiempo adecuado para la irradiacin
de las clulas despus de la incubacin PNB. Por lo tanto, un nmero de 104 clulas /
pocillo se sembraron en placas de seis pocillos durante un perodo de 48 h.
Posteriormente, se incubaron con el cido flico y el folato no conjugado (pegilado) PNB
(FA-PNB y PEGGNPs) durante perodos de tiempo de 6, 12, 24 y 48 h en grupos
triplicados. Posteriormente, cada grupo de clulas se lav tres veces en la solucin de
PBS, se trataron con tripsina, EDTA inactivada de la tripsina mediante la adicin de FBS,
las contadas manualmente, y finalmente se centrifugaron a 1200 rpm durante 5 min antes
de que se elimin el sobrenadante. Entonces, el sedimento que contiene las clulas fue
digerido en agua regia. A partir de entonces, el contenido de oro internalizado en las
clulas se determin usando un horno de instrumento de espectroscopia de absorcin
atmica AA-670G (Shimadzu, Japn). Este procedimiento se realiza con base en una
curva estndar obtenida por el instrumento utilizando una solucin estndar a partir del
cual se calcul y se atribuye a la concentracin de oro de cada muestra el valor de la
absorcin de oro grabado a 242,8 nm.

La irradiacin de las clulas y ensayos de radiobiolgicas

Se sembraron una serie de 5 103 clulas por pocillo en placas de 96 pocillos durante 48
h. A continuacin, se incubaron con los PNB folato conjugados pegilados y durante 24 h
antes de la irradiacin. La irradiacin de los diferentes grupos de las clulas se realiz
mediante la entrega de 2 Gy de rayos gamma utilizando una mquina de Co-60
(Theratronphonix, Canad), as como una mquina de ortovoltaje tratamiento con rayos x
(Stabilipan2, Siemens, Alemania) operado a diferentes valores kVp que van desde 120 a
250 la unidad ortovoltaje tenan varios conos aplicadores con diferentes longitudes y
aberturas, lo que nos permite definir la distancia de tratamiento y campo de tamao. Sin
embargo, las dimensiones geomtricas de las placas nos llev a elegir un aplicador con
un tamao de campo 10 15 cm2 y un enfoque a la distancia de la superficie de 30 cm.
Mediciones Aire Kerma de la mquina ortovoltaje se realizaron utilizando un electrmetro
PTW UNIDOS E-calibrado y una cmara de ionizacin Farmer con un volumen sensible
de 0,6 cc (PTW, Alemania). Todos los parmetros pertinentes de las radiografas
ortovoltaje y megavoltage rayos gamma de las unidades de radioterapia, as como las
energas equivalentes de la radiografa beamsmeasured bajo la condicin de la geometra
de haz estrecho (Attix 2004) se enumeran en la tabla 1 La clula la muerte o la
proliferacin como la respuesta de la radiacin y la citotoxicidad de las nanopartculas se
establecieron con MTT y ensayos clonognicos realizaron a 48 h y 14 das despus de la
irradiacin, respectivamente (Kong et al 2008). El nivel de biotoxicidad la radiacin en las
clulas representadas con el porcentaje relativo de supervivencia de las clulas en
presencia de la PNB a que con la radioterapia sola fue indicada como la DEF. Los
experimentos se repitieron tres veces. Los valores de supervivencia de clulas que se
presentan en las figuras muestran la media desviacin estndar. El porcentaje de los
valores de supervivencia celular entre los diferentes grupos se compararon mediante
anlisis unidireccional de la varianza (ANOVA) seguido de Tukey para comparaciones
mltiples pruebas con un intervalo de confianza del 95%.

Tabla 1. parmetros relevantes de los rayos X ortovoltaje y Co-60 unidades de

radioterapia.

a. Una tasa de dosis fija de 1,7 Gy min-1 fue utilizado por el cambio de la SSD para
diversas condiciones de irradiacin.
b. Tener slo 0,5 MMCU filtracin adicional.
c. Tener 0.5 MMCU + 4,32 MMAL filtracin adicional.
d. La energa media comn derivado de los rayos gamma dominantes (1,17 y 1,33
MeV) de Co-60 unidades.
e. Logrado en un SSD igual a 50 cm.

Resultados

Sntesis y caracterizacin de la PNB

Los PNB-folato conjugado se sintetizaron utilizando borohidruro de sodio como agente

reductor y se conjug con la molcula 4ATP, un enlazador bifuncional capaz de unirse por
separado con PNB y cido flico de su -SH y -NH2 extremos, respectivamente (Shakeri-
Zadeh et al 2010a, 2010b). El anlisis de los espectros FT-IR de 4ATP, 4ATP-PNB y FA-
4ATP-PNB verificado la formacin de la conjugacin final como sugerido por otros
(Shakeri-Zadeh et al, 2010a, 2010b). La morfologa esfrica de los PNB tambin se
verific mediante TEM microfotografa. El anlisis de las imgenes de TEM llevadas a
cabo en ms de 200 nanopartculas indic un promedio
dimetro de 52 11,5 nm para los PNB (figura 3). Los PNB pegilado fueron sintetizados
utilizando citrato trisdico a travs de un mtodo diferente al utilizado para los PNB-folato
conjugado. TheTEMmicrographs mostraron una morfologa casi esfrica para estos PNB.
Un anlisis similar de las imgenes de TEM realizado en ms de 200 de estas PNB indica
un dimetro promedio de 47 8,2 nm (figura 4).

Los ensayos de captacin de folato y cido flico no conjugado (pegilado) PNB

La Figura 5 muestra el nmero medio de FA-PNB y PEG-PNB de clulas HeLa por

comparacin con el perodo de tiempo de incubacin calculado a partir de las
concentraciones de oro (Liu et al 2007), despus de exponer las clulas a los PNB. La
figura indica que la internalizacin de las nanopartculas en las clulas HeLa se aument
rpidamente hasta 24 y 12 h despus de la incubacin de la FA-PNB y PEG-PNB,
respectivamente. Por lo tanto, se utiliz un perodo de tiempo de incubacin de 24 h para
el estudio del ensayo de citotoxicidad, as como la toxicidad de la irradiacin de las
clulas.

Figura 3. (a) La transmisin de electrones microscopa imagen de nanopartculas de oro-

folato conjugado (FA-PNB). (b) Distribucin del dimetro PNB obtenido a partir de anlisis
de ms de 200 PNB utilizando el software ImageTool.
La citotoxicidad del PNB

Para determinar la citotoxicidad de la FA-PNB y PEG-PNB en las clulas HeLa, las

clulas se incubaron con diferentes concentraciones de PNB (0, ya que el control, y 10,
20, 50 y 100 mM) durante un perodo de 24 h. La citotoxicidad de los PNB realizadas por
el ensayo MTT no mostr diferencias significativas (p-valor> 0,05) entre los controles y los
tratados con PEG-PNB en todo el rango de concentraciones de PNB, mientras que para
los tratados con el FA-PNB la diferencia no significativa con los controles termin a 50 mM
(figura 6 (a)). Por lo tanto, la incubacin de las clulas con una concentracin 100 mM de
FA-PNB demostr ser txico (valor de p <0.05). De acuerdo con estudios anteriores (Gu
et al 2009), la citotoxicidad de las nanopartculas podra ser dependiente del tiempo. Por
lo tanto, las clulas se incubaron durante diferentes perodos de tiempo (0, 1, 2, 6, 12, 24
y 48 h) con una concentracin fija (50 mM) de FA-PNB, as como PEG-PNB. La
incubacin de ambos de los PNB no mostr ningn efecto sobre la citotoxicidad de las
clulas de hasta 24 h (p-valor> 0,05). Sin embargo, las clulas incubadas con el FA-PNB
durante 48 h demostraron (valor de p <0,05) a ser txico (figura 6 (b)).

Figura 4. (a) La transmisin de electrones microscopa imagen de PNB pegilado. (b)

Distribucin de dimetro PNB obtenido a partir de anlisis de ms de 200 PNB utilizando
el software ImageTool.
Figura 5. El nmero medio de internalizado FA-PNB y PNB PEG de clulas HeLa por la
base de mediciones de absorcin atmica con respecto al periodo de tiempo de
incubacin.

Folato y cido flico no conjugado sensibilidad a la radiacin PNB

Cuando las clulas incubadas Hela Hela clulas incubadas con el 50Mconcentration del
PNB para el 24 de ustedes expuestos a 2 Gy de radiacin ionizante utilizando diversas
energas ortovoltaje de la mquina de rayos x, diferencias significativas (p-valor <0,05) se
observaron entre sus tasas de supervivencia en comparacin con sus grupos de control
debido a la presencia de los PNB, como se muestra de la MTT (figura 7) y ensayos
clonognicos (Figura 8). Adems, hubo diferencias significativas (p-valor <0,05) entre las
tasas de supervivencia de las clulas HeLa incubadas con folato y no folato (pegilado)
PNB (figuras 7 y 8). Sin embargo, cuando las clulas se expusieron a 2 Gy de la
megavoltaje rayos gamma de la unidad de Co-60, se observ una diferencia significativa
slo en la supervivencia de las clulas HeLa incubadas con FA-PNB en comparacin con
su grupo de control (figuras 7 y 8). Los valores de DEF de todas las energas de fotones
tanto de los PNB se muestran en la tabla 2. Como se puede observar en el cuadro, todos
los haces de rayos X ortovoltaje eran superiores a los de Co-60 rayos gamma en la
mejora de los efectos debido a radiosensibilizacin el PNB (valor de p <0,05). Adems, la
tabla indica el haz de rayos x que el 180 kVp tiene la mxima DEF en comparacin con
otras vigas ortovoltaje, aunque no estadsticamente significativa (valor p> 0,05). Tambin
hemos introducido un parmetro llamado el factor de orientacin, presentado en la ltima
columna de la tabla 2. Este factor indica la proporcin de la DEF de las clulas HeLa
utilizando los PNB de folato y cido flico no basa (Befa-PNB / DEFPEG-PNB) en el MTT
comn y mtodos de ensayo clonognicos resultantes de la orientacin de los PNB-folato
conjugado internalizados en consecuencia en las clulas HeLa que tienen un
significativamente alto nivel de FR. El Fa-PNB eran superiores a los de PEG-PNB en la
celda objetivo. Los resultados tambin indicaron que la irradiacin de las clulas a 180
kVp vigas ortovoltaje es ms eficiente. Por lo tanto, diversas dosis a esta energa se
aplicaron en las clulas incubadas con y sin el FA-PNB para dibujar sus curvas de
supervivencia. Las curvas de supervivencia resultantes de las clulas HeLa en presencia
y. ausencia de FA-PNB se muestra en la figura 9. Como se puede observar en la figura,
hubo un aumento en los valores de DEF con el aumento de la dosis absorbida en este
kVp.
Figura 6. porcentaje de supervivencia de las clulas HeLa se incubaron con diferentes
concentraciones de PNB a un tiempo de incubacin fijo de 24 h (A); y en diversos
periodos de tiempo con una concentracin fija de PNB 50 mM (B).
discusin

Este estudio se centr en la modificacin de los PNB mediante la conjugacin con folato
para facilitar su internalizacin en clulas HeLa cancerosas. Tambin se centr en el
impacto de las diferentes energas de fotones (que van desde kilo voltaje a megavoltaje)
en la mejora de los daos en las clulas cuando se hicieron irradiaciones en presencia de
las nanopartculas. Con base en los resultados, se puede concluir que todas las energas
de fotones ortovoltaje comunes investigados en este estudio (120 a 250 kVp) mejoran la
tasa de muerte de las clulas cancerosas que contienen la FA-PNB y PEG-PNB. Sin
embargo, los DEF de todos los haces ortovoltaje eran mayores que las de los Co-60
rayos gamma. Esto se puede atribuir al aumento de la seccin transversal interaccin
fotoelctrica de los fotones pertinentes de los haces de rayos x de ortovoltaje con los PNB
en comparacin con el Co-60 megavoltaje rayos gamma (Van den Heuvel et al 2010).
Por otra parte, los DEF de las clulas conjugados con el FA-PNB eran mayores que los
conjugados con PNB no folato (PEG-PNB) para todas las energas de los fotones
utilizados. Esto puede ser debido al alto nivel de FRS en la membrana celular HeLa que
conduce posteriormente a la mayor internalizacin de los PNB de folato en las clulas,
como se indica en la figura 5. Aunque se prefieren PNB-conjugado de folato por su mayor
internalizacin en las clulas en comparacin a PNB pegilados, es posible sintetizar
qumicamente-folato conjugado PNB pegilados (Fa-PNB-PEG) para crear la ventaja de
dos modificaciones de superficie diferentes de un compuesto de este tipo; a saber, la
orientacin de clulas y una buena estabilidad coloidal. De acuerdo con un estudio
anterior (Chithrani et al 2006) la absorcin ptima de PNB se produce con PNB esfricos
con un dimetro de 50 nm. Por lo tanto, hemos intentado sintetizar PNB de este tamao y
conjugado con el cido flico para tener una absorcin mxima. Nuestro estudio in vitro
mostr un aumento de la acumulacin de FA-PNB en las clulas. Sin embargo, tambin
se demostr que las nanopartculas-conjugado de folato tienen un gran potencial para
dirigir selectivamente las clulas tumorales vascularizados que expresan niveles
significativos de FRS, donde se administran por va intravenosa en situaciones en vivo
(Leamon y Low 2001). Tambin utilizamos una concentracin fija de PNB para realizar
una comparacin fiable entre la irradiacin ms FA-PNB y / o grupos de PEG-PNB.
Estudios previos (Brun et al 2009, Rahman et al 2009, Shakeri-Zadeh et al 2010a, 2010b)
han informado de que el aumento de la concentracin de PNB conducira al aumento de
la DEF. Por lo tanto, hemos utilizado la mayor concentracin de PNB que tiene el nivel
ms bajo de toxicidad en base a nuestros ensayos de citotoxicidad (figura 6 (a)). Para que
el tratamiento de radiacin ms eficiente en los tumores cargados con PNB, es necesario
seleccionar la energa del haz ms eficiente. Sobre la base de un enfoque conceptual, la
irradiacin de tales tumores con una energa igual o justo por encima del oro K-borde
puede ser considerada como una buena opcin (Brun et al 2009). Sin embargo, la
irradiacin de clulas de glioma cargados con platino (Pt) ha mostrado resultados
idnticos utilizando energas del haz por debajo y por encima del borde K Pt (Biston et al
2004). En un amplio estudio realizado por Brun et al (2009), el efecto de los tres
parmetros clave (tamao PNB y de concentracin y de la energa del haz) sobre el nivel
radiosensibilizacin PNB se ha investigado. La energa de los fotones ms eficiente
reportado en este estudio fue de 50 keV entre un rango estimado de las energas de 15 a
70 keV. Para racionalizar esta observacin, se centraron en la relacin de las en /
valores de oro al agua, que est disponible gratuitamente en el Instituto Nacional de
Estndares y Tecnologa sitio web. Sobre la base de la en relevante / valores de oro y
el agua a diferentes energas que van desde unos pocos a varios Kevs Mevs, la relacin
mxima de en / de oro al agua se produce a entre 40 y 50 Kevs. En nuestro estudio se
obtuvo el DEF mximo (1,67 0,11) a una energa equivalente a 48,1 keV (Tabla 1), que
se puede atribuir a la mayor proporcin de en / de oro al agua a esta energa. Adems,
nos hemos centrado en el efecto de la orientacin de los PNB en el dao celular. En un
estudio similar (Roa et al 2009), la combinacin de tio-glucosa-tapado PNB (Glu-PNB) con
200 kVp radiografas resultaron en 1.5 a 2 DEF dentro de las 72 h, lo que est de acuerdo
con nuestros resultados. Sin embargo, varios valores de los DEF reportados por otros
oscil entre un valor ms bajo de 1,23 a un valor mucho ms alto de 24,6 (Brun et al
2009, Rahman et al 2009, Liu et al 2010, Kong et al 2008) utilizando ortovoltaje de rayos X
vigas muy diferente de la nuestra. Una gama tan amplia de variacin en los DEF debe
haber surgido de las diferencias en el tamao de PNB, la concentracin y la conjugacin,
as como las diferentes lneas celulares utilizadas en estos estudios. Tambin se investig
el efecto de mejora de la dosis de radiacin en la presencia de los PNB utilizando los
mtodos radiobiolgicos comunes de MTT y ensayos por clonacin con diferentes puntos
finales que confirmaron entre s por lo que indica una tendencia creciente de los DEF con
la radiografa ortovoltaje barras de hasta 180 kVp.

Figura 7. Comparacin de los porcentajes de supervivencia de las clulas HeLa con la

presencia y ausencia de FA- y PEG-PNB para la onMTTassay basada control y diversos
grupos de tratamiento hecho 48 h despus de exponerlos a 2 Gy de radiacin ionizante
utilizando diferentes x- ortovoltaje y rayos gamma . (NB: la concentracin de
nanopartculas en los grupos de tratamiento fue de 50 m, y 200 y 200 kVpa kVpb
representan los grupos irradiados a 200 kVp vigas que tiene slo 0,5 y 0,5 CMMD CMMD
+ 4,32 filtraciones MMAL, respectivamente.)
Tabla 2. Valores DEF resultantes de la combinacin de los 50 M FA-PNB y 2 Gy de
radiacin ionizante producida en diferentes energas ortovoltaje de rayos X y de Co-60
rayos gamma por clulas HeLa utilizando MTT y ensayos por clonacin. La relacin de la
DEF de las clulas HeLa con folato conjugado PNB con respecto a aquellos con pegilado
PNB (llamado el factor de focalizacin; TF) tambin se calcula y se presenta para todos
los haces de fotones.

a. Tener slo un 0,5 CMMD filtracin adicional.

b. Tener 0.5 CMMD + 4,32 MMAL filtracin adicional.

Figura 8. Comparacin de los porcentajes de supervivencia de clulas HeLa en presencia

y ausencia de FA- y PEG-PNB para el control y diversos grupos de tratamiento basado en
ensayo clonognico hecho 14 das despus de exponerlos a 2 Gy de radiacin ionizante
utilizando diferentes ortovoltaje x - y rayos gamma . (NB: la concentracin de
nanopartculas en los grupos de tratamiento fue de 50 m, y 200 y 200 kVpa kVpb
representan los grupos irradiados a 200 kVp vigas que tiene slo 0,5 y 0,5 CMMD CMMD
+ 4,32 filtraciones MMAL, respectivamente.)

Figura 9. Las curvas de supervivencia de clulas HeLa en presencia y ausencia de FA-

PNB irradiaron a la viga de rayos x de ortovoltaje 180 kVp.

Conclusiones

Con base en los resultados generales se puede concluir que PNB-folato conjugado
pueden utilizarse como un agente de radiosensibilizacin adecuado para las clulas
cancerosas FR-expresin, tales como HeLa, para mejorar el efecto de la dosis de
radiacin producida por ortovoltaje radiotherapymachines de rayos X o similares
modalidades que producen haces de rayos X polienergticos a energas cercanas a 180
kVp rayos gamma ormonoenergetic de 50 keV. Sin embargo, nuestros resultados slo
se basan en un estudio in vitro. Por lo tanto, ms en las investigaciones in vivo y tambin
se requieren ensayos clnicos antes de que podamos recomendar nuestra tcnica para
aplicaciones clnicas. A partir de entonces, y si tales integral en estudios in vivo conducen
a resultados similares a nuestros resultados in vitro, la aplicacin de esta nueva tcnica
en la prctica clnica podra permitir a los onclogos para disminuir las dosis de radiacin
prescrita, mientras que tienen el mismo dao a las clulas tumorales como el objetivo,
como as como una mayor proteccin de los tejidos / rganos normales en riesgo situado
cerca de la meta. Estas ventajas tambin pueden ser propuestas para futuros estudios
para mejorar la eficacia del tratamiento de los procedimientos de radioterapia y
braquiterapia intraoperatoria, en la que los haces de fotones kilovoltaje similares pueden
ser generadas y utilizadas.
Agradecimientos

Este estudio es el resultado de un proyecto de doctorado realizado por el primer autor,

bajo la supervisin del segundo autor y con la ayuda y asesoramiento de otros co-autores
como los asesores en Tarbiat Universidad Modares con la colaboracin del Hospital Imam
Hossein en Tehern, Irn . Por lo tanto, nos gustara expresar nuestro agradecimiento
especial a estas instituciones para que nos proporciona el apoyo financiero, tcnico y
clnico necesario para llevar a cabo esta investigacin. Nuestro especial agradecimiento
se expresan to Mrs afiase Farsi y la Sra. Maneje Beige por su generosa ayuda y
cooperacin prestada para la irradiacin de las clulas y los procedimientos de
dosimetra.