UE1 : Biochimie Biologie molculaire

Chapitre 8 :
Mthodes dtudes
Professeur Jol LUNARDI

Anne universitaire 2011/2012

Universit Joseph Fourier de Grenoble - Tous droits rservs.
 Chapitre
Chapitre8.8.Mthodes dtudes
Mthodes dtudes

I. Matriel biologique et outils enzymatique de

biologie molculaire
II. Lhybridation molculaire
III. Le clonage molculaire
I. Les techniques damplification de lADN
II. Le squenage de lADN
III. Modifier le matriel gntique des cellules eucaryotes
IV. Mthodes dtude de lexpression des gnes
V. Bio-informatique
I. Mthodes et outils gnraux
I. Mthodes
1. Extraction et outils
et purification gnraux
du matriel dtudes
gntique
molculaires
- matriel prsent dans les virus, les bactries et les cellules

- ADN des cellules eucaryotes animales = ADN nuclaire + ADNmit

- source : sang, tissus (biopsies), cultures cellulaires

- chez lhomme (2 x 3 109) x 660 / 6,02 1023 6-7 10-12 gramme /cellule

1 ml de sang 5-6 106 leucocytes soit 30 10-6 g dADN

et 1014 cellules dans le corps humain soit 600 g dADN !

- ARN = ARNm, ARNt, ARNr

- sensibilit aux RNAses

- spcificit tissulaire des ARNm (ADNc)

- quantification par mesure de labsorption 260 nm

 Principales tapes de la purification des
acides nucliques
prlvement biologique
- lyse par dtergents
- traitement mcanique
lyse des cellules nucles

dgradation des protines - traitement par la protinase K

- solvants organiques
extraction des acides nucliques - agents chaotropiques
- fixation par interaction de charges

prcipitation de lADN - alcools

Principales tapes de la purification des acides nucliques

2. Des outils outils
2. Des enzymatiques pour tudier l ADN
enzymatiques pour tudier
l ADN
(endonuclases, DNAses)

Colle (ligases)

(polymrases)

(polymrases, kinases)

atgctaATC tgat

(polymrases)
2.1. Couper
2.1.1 Enzymes de restriction Couper
- squences spcifiques de reconnaissance ( 4 8 bases, palindromes)

- origine bactrienne : Eco RI = Escherichia coli type R souche I

- coupures franches
5 ---GTTAAC--- Hpa I 5 ---GTT AAC---
---CAATTG---5 ---CAA TTG---5
- coupures cohsives

5 ---GAATTC--- Eco RI 5 ---G AATTC---

---CTTAAG---5 ---CTTAA G---5

2.1.2. Endonuclases

- DNAse I : - ADN double ou simple brin

- nuclase S1: - ADN simple brin
- RNAse A (ARN), H (hybrides ARN/ADN)

2.1.3. Exonuclases : 5 3 ou 3 5
2.2. Synthse et copie
2.2. Synthse
activit des polymrases : 5
3 et copie
ADN polymrases :
- produit : ADN
- matrice : ADN simple brin + amorce ARN ou ADN
- activits exonuclases 3 - 5 et/ou 5 - 3 exonuclases : + / -
- polymrases modifies, thermostables (PCR)

ARN polymrases :
- produit : ARN
- matrice : ADN simple brin

ADN polymrase ARN dpendante (transcriptase rverse, inverse) :

- produit : ADN
- matrice : ARN + amorce
2.3. Coller
Coller
Les ligases catalysent la formation dune liaison phosphodiester entre un
5 phosphate et un 3-OH de 2 brins adjacents

5 ---AGGTCG-OH Pi- CGTCCA--

---TCCAGC-Pi OH-GCAGGT--5

ligase + ATP

5 ---AGGTCGCGTCCA--
---TCCAGCGCAGGT--5
2.4. Marquer
Marquer
groupes marqueurs : isotopes (32P, 33P, 35S), fluorophores, biotinylation ...

marquage aux extrmits

- extrmit 3 -OH : terminal transfrase
- extrmit 5 - Pi : ATP- 32P & T4-kinase
5
Adnosine-Pi-Pi-Pi* Pi-GATC-------------------CAGTCA
(ATP) CTAG-------------------GTCAGT-Pi Pi*-Pi-Pi-Adnosine
5
kinase kinase

marquage interne par amorage alatoire (random priming)

+ amorces
5 + ADN pol 5
5
+ dNTP

5
5 5
3. Sparation de fragments dADN
3. Sparation de fragments dADN
3.1. lectrophorse sur gel (agarose, acrylamide)

taille en pb (chelle logarithmique)

- tmoins
(400 pb)
400
dpot ADN (-)
300 (300 pb)

+ 200 (200 pb)

taille
cathode (-) anode (+)
tablette de gel
(100 pb)
(mm)

distance de migration

lectrophorse en champ puls

 visualisation de l ADN

- utilisation de molcules fluorescentes

UV

bromure d thidium
(molcule intercalante fluorescente)

- coloration chimiques

- Isotopes radio-actifs et autoradiographie

3.2. Electrophorse capillaire

3.3. Chromatographie liquide haute pression (HPLC)

Chromatographie liquide-solide en phase rverse utilisant une forte pression

(cf cours protines )
DHPLC : HPLC en conditions dnaturantes
4. Synthse chimique dADN
II. Hybridation molculaire
II. Hybridation molculaire
1. Sondes molculaires et hybridation
- hybridation : association de 2 squences d acides nucliques sous
forme simple brin sur la base de leur complmentarit

5 5
caggtagtcatctgattactgacatgg
5
caggtagtcatctgattactgacatgg
caggtagtcatctgattactgacatgg

5 tcatctgatt
5 5
caggtagtcatctgattactgacatgg
caggtagtcatctgattactgacatgg
gtccatcagtagaccaatgactgtacc
gtccatcagtagaccaatgactgtacc
5 5
5 5
caggtagggatactgaactgacatgg
5
caggtagggatactgaactgacatgg
caggtagggatactgaactgacatgg

dnaturation 95C
d
5 tcatctgatt
5 5
caggtagggatactgaactgacatgg
caggtagggatactgaactgacatgg
gtccatcagtagaccaatgactgtacc
gtccatcagtagaccaatgactgtacc
gtccatcagtagaccaatgactgtacc 5 5 5
gtccatccctatgacttgactgtacc
gtccatccctatgacttgactgtacc
5 5

gtccatccctatgacttgactgtacc
gtccatccctatgacttgactgtacc
gtccatccctatgacttgactgtacc
5 5 5
II. Hybridation molculairemolculaire
II. Hybridation
1. Sondes molculaires et hybridation
- hybridation : association de 2 squences d acides nucliques sous
forme simple brin sur la base de leur complmentarit

- sonde : squence d ADN complmentaire de la squence cible

- facteurs ayant une influence sur lhybridation
- la temprature: la temprature optimale dhybridation est en gnral infrieure
au Tm de la sonde
- la taille des fragments ou des sondes
- la force ionique: lhybridation est acclre en forte concentration saline
- la nature des hybrides : la stabilit des hybrides (des plus stables aux moins
stables est la suivante: ARN/ARN > ARN/ADN > ADN>ADN
- types de sondes
- sonde gnomique : fragment obtenu par coupure de lADN gnomique
- sonde ADNc : sonde ADN obtenue par transcription rverse
d un ARNm messager (= squence codante)
- sonde oligonuclotides : ADN (ou ARN) simple brin de 18 50 nuclotides
synthtis chimiquement
2. Hybridation sur support : Southern blot (ADN), northern blot (ARN)

?
- Obtention dun ADNc
- 5

transcriptase rverse

- 5

RNAse H ou traitement NaOH

-5

-5

-5
5
III. Le clonage molculaire
III. Le clonage
obtenir une population de bactries, de cellules ou dorganismes qui
contiendront le mme matriel gntique
population homogne de cellules identiques (population clonale)
organisme vivant identique un organisme dorigine

clonage - pour amplifier et conserver une squence dADN

- pour exprimer une squence dintrt
- pour introduire un gne dans des cellules ou des organismes
- pour produire une protine dintrt
-
principales tapes du clonage

1. prparation de linsert cloner (fragment dADN dintrt) et du vecteur

2. intgration-ligation de linsert dans le vecteur
3. transformation de l hte par le vecteur recombin
4. slection des htes recombinants
1. Vecteurs

proprits gnrales gne de

slection (lac Z)

les plasmides
site de clonage
gne de rsistance multiple
un antibiotique

origine de rplication

phages, cosmides, yac et bac, vecteurs viraux, vecteurs navettes

2. Intgration, transformation et slection dun vecteur recombinant
2. Intgration, transformation et slection
2.1. Intgration
dun vecteur recombinant

coupure du vecteur et de lADN

intgrer avec le mme enzyme
de restriction

ligation des extrmits libres du

vecteur et de linsert

plasmide recombinant chimre

contenant linsert dADN

plasmide natif
recircularis
2.2. Transformation et slection des bactries htes

les plasmides sont introduits dans les bactries : la transformation

insert

chromosome chromosome

bactrie avec plasmide natif recircularis bactrie avec plasmide recombinant

les bactries ayant intgr un plasmide sont slectionnes grce aux 2 gnes de slection
prsents dans le vecteur (ex choisi : gne de rsistance lampicilline et gne permettant
lexpression de la -galactosidase)

colonie bleue: vecteur seul colonie blanche: vecteur recombin

milieu nutritif
+ ampicilline
+ Xgal
3. Les banques d ADN
banque gnomique
3. Les banques d ADN
- obtenue en intgrant des fragments d ADN gnomique dans des vecteurs.
- reprsente tout le matriel gntique

banque ADNc :
- obtenue en intgrant des fragments d ADNc dans des vecteurs
- ne reprsente que l ADN exprim dans les cellules partie desquelles l ARNm
a t extrait
IV. Amplifier lADN
IV. Amplifier lADN
1. Amplification par clonage
sites de restriction
ADN donneur

Fragments de restriction
Vecteur recombinant

Transformation

Rplication
Amplification,
Division cellulaire

Clone du fragment Clone du fragment

donneur n1 donneur n2
 2. Amplification PCR : polymerase
2. Amplification PCR :chain reaction
polymerase chain
(amplification enzymatique en chane par ADN polymrase thermostable)
reaction
oligonuclotides amorces
ADN amplifier
Taq polymrase
dNTP

95C 55-60C 72C

dnaturation amorage extension

n cycles

facteur damplification : 2 n
 5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg-----gatcgatcgtcgatcgatcgtagctgct--
--tcaatgaattacgactagcatgcagctagc-----ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5

94
5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg-----gatcgatcgtcgatcgatcgtagctgct--
ctagctagcagctagctagcatcgacga--
ctagctagcatcgacga-- 5

5 --agttacttaatgctga
--agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg
--tcaatgaattacgactagcatgcagctagc-----ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5

5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg-----gatcgatcgtcgatcgatcgtagctgct--
--tcaatgaattacgactagcatgcagctagc-----ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5

5 --agttacttaatgctgatcgtacgtcgatcg-----gatcgatcgtcgatcgatcgtagctgct--
--tcaatgaattacgactagcatgcagctagc-----ctagctagcagctagctagcatcgacga-- 5
Variantes de la PCR classique : PCR hot start , PCR long range ,
PCR multiplex

Quantification : dtermination du nombre de copies cibles initiales

x n cycles A = A0 x (1+E) n avec 0 < E < 1

dtermination de E (efficacit)

- par PCR temps rel o lamplification est mesure chaque

cycle grce un marqueur fluorescent qui s incorpore dans le
double brin form
- par utilisation dun standard interne

amplification partir dARN : RT-PCR

RT PCR
ARNm ADNc
V. Squencer lADN
V. Squencer lADN
1. Mthode enzymatique (aux di-doxynuclotides) de Sanger
- matrice ADN
- amorce de squenage
- ADN polymrase
- dNTP & ddNTP (didoxy-NTP)

dATP ddATP
 sparation des 2 brins

5 aatgctgatcgatgctatggctagctagctatcgatcgtatcgtatcgtagcatgatgcta
gcatagcatcgtactacgat
catagcatcgtactacgat
atagcatcgtactacgat
tagcatcgtactacgat
agcatcgtactacgat 5
+ amorce
+ ADN polymrase tagcatcgtactacgat 5
atagcatcgtactacgat 5
dATP + 1% ddATP catagcatcgtactacgat 5
+
dCTP + 1% ddCTP gcatagcatcgtactacgat 5
dGTP + 1% ddGTP
dTTP + 1% ddTTP

sparation par lectrophorse

capillaire des fragments
gnrs lors de
la raction de squenage
c
a
t visualisation des fragments
a portant un ddNTP fluorescent
g
c lumire
a
t
dtecteur de
lectrophorgramme de squence
5 fluorescence
2. Mthode chimique de Maxam et Gilbert
Mthodes alternatives
3. Pyro-squenage

4. Squenage haut-dbit
Squenage parallle
Puces de re-squenage

Puces de re-squenage
VI. Modifier le matriel
VI. Modifier gntique
le matriel gntique des
des cellules eucaryotes
cellules eucaryotes
1. Mutagnse
2. Transfert ex vivo et in vivo de matriel gntique
transfection, vecteurs de transfection , marqueurs de slection
(gnes de rsistance aux antibiotiques, thymidine kinase,
dihydrofolate rductase)

biolistique
injection

transformation

virus

transgne
 Modification des cellules germinales
Modification des cellules germinales ou des cellules somatiques

ou des cellules somatiques

modification de
toutes les cellules
de l organisme

modification dune
partie des cellules
de lorganisme y
compris au niveau
des gonades
(animal chimre)

modification dune cellule

ou dun clone cellulaire
VII.
VII.Mthodes
Mthodes dtude de de
dtude lexpression
lexpression des
des gnes gnes
1. Analyse qualitative et quantitative des transcrits
northern blot : - taille du transcrit
- intermdiaires de maturation
- estimation semi-quantitative

RT-PCR : quantification

2. Analyse dynamique de la transcription

longation in vitro (aprs isolement des noyaux) et en prsence dUTP 32P

de la transcription initie in vivo

- la quantit dUTP incorpore = (f) vitesse de transcription

(f) ARN pol fonctionnelles
3. Analyse des lments de rgulation de la transcription
3. Analyse des lments de
3.1. analyse de linteraction entre facteurs protiques trans et squences ADN cis
rgulation de la transcription
facteurs de
transcription
+ squence dADN

foot-printing retardement sur gel

zone dinteraction

traitement par la DNAse analyse par lectrophorse

et lectrophorse des complexes ADN/protines
3.2. Caractrisation de squences rgulatrices
5
3.2. Caractrisation de squences
gne dintrt
rgulatrices
5

promoteur

squences rgulatrices ?

fragments d ADN contenant

des squences rgulatrices potentielles

insertion de ces squences devant le promoteur dun gne reporter

promoteur du gne reporter
fragment dADN tester
gne reporter dont lactivit
est facilement mesurable

intgration de la construction dans un vecteur, transfection cellulaire et

mesure de lexpression du gne reporter dans la cellule modifie

expression du gne = (f) protine = (f) ARNm ) = (f) rle de la squence teste
4. Mthodes d analyse globale post gnomique
4. Mthodes d analyse globale post
gnomique
analyse du transcriptome
analyses simultanes du produit
(ARN, protine, activit) de
analyse du protome
lexpression dune grande
population de gnes
analyse du mtabolome
4.1. Analyse du transcriptome
squences dADN sonde
4. Mthodes d analyse globale post Prparation des ARNm
des cellules 1 et 2
gnomique Obtention Obtention
dADNc dARNc marqus chantillon 1
dpt des sondes correspondant
marqus aprs transcription
des milliers de gnes diffrents
des ADNc

chantillon 2
hybridation des sondes fixes sur le support
et des ADNc ou ARNc marqus

Activation des hydrides

sonde/ADNc ou ARNc

gne majoritairement exprim gne majoritairement exprim dans

dans chantillon 2 (vert) chantillon 1 (rouge)

gne exprim
dans chantillon 1 & 2
analyse informatise
et quantification des signaux
4.2. Analyse du protome
4. Mthodes d analyse globale post
protines
gnomique

lyse et extraction

charge

lectrophorse 2D

Analyse de la protine
taille - spectromtrie de masse
- immuno-dtection
- squenage
5. Analyse du rle dun gne
5. Analyse du rle dun gne
4.1. expression

4.2. extinction

- utilisation de anti-sens et dARN interfrents

- hybride ARNm normal / ARN anti-sens : expression

- hybride ARNm normal / ARNsi : dgradation des ARNm = expression

- invalidation gnique
- remplacement du gne cibl par recombinaison homologue dans une cellule
souche embryonnaire par :
- un gne inactiv (KO constitutif, KO conditionnel)
- un gne modifi (K-In)

- animaux chimriques et slection des homozygotes par croisement

 gne gne
inactiv normal
m M

Transgnse
1
prparation dun vecteur
contenant le gne dintrt inactiv
souriceau chimre form
gne mut de cellules provenant des
gne sain deux souches de souris

a/a; MM

transfection et
slection
3 de cellules ES
6
contenant le gne souris grise
dintrt inactiv
cellules ES 5
4 rimplantation
2
injection de cellules ES
A/A; MM transfectes dans le
blastocyste de lautre
type de souris embryon chimre
blastocyste

embryon a/a; MM + A/A; M/m

souris brune
VIII. Bioinformatique
X. Bioinformatique
- clonage in silico
- analyse et traitement des squences
- annotation des gnomes
- analyse gntique (lod scores, haplotypage)
- banques de donnes
- squences dADN, ARN, protines
- http://www.ncbi.nih.gov/Genbank/
- http://www.ensembl.org/Homo_sapiens/
- http://us.expasy.org/sprot

- gntiques :
- OMIM maladies gntiques: http://www.ncbi.nih.gov/Omim/
- HMDB mutations, http://www.uwcm.ac.uk
- info-biogne : http://www.infobiogen.fr
- ...
- bibliographiques : http://www.ncbi.nih.gov/PubMed/
 Que faut il retenir a :
- savoir pourquoi la nature des prlvements ncessaires ltude peut varier selon que
lon analyse lADN ou lARNm
- connatre le principe gnral de lextraction de lADN
- savoir dfinir les termes denzyme de restiction, de palindrome, dendonuclase, dexonuclase
- savoir dfinir les 3 grands types de polymrases
- savoir quelles donnes peuvent tre obtenues par une lectrophorse de fragments dADN
- connatre le principe de lhybridation et les diffrents types de sondes utilisables
- connatre le principe du clonage laide dun vecteur plasmidique , savoir dfinir ce quest
un banque gnomique, un banque dADNc
- connatre le principe de la PCR et savoir dessiner les 2 amorces ncessaires une
raction de PCR, savoir dfinir ce quest lefficacit dun raction PCR
- connatre le principe de la raction de squenage aux didoxynuclotides
- connatre les principales mthodes danalyse de lARN et des interactions entre ADN et facteurs
de rgulation
- connatre les mthodes danalyse du rle dun gne
a : les exemples numriques et de pathologies sont destins illustrer le cours et permettre une
meilleure intgration des connaissances, de mme les dtails des squences ou des protines
ainsi que les noms des mdicaments cits titre dexemples ne sont pas apprendre
systmatiquement
 Mentions lgales
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