EXTRACION Y CARACTERIZACION DE ADN DE LEVADURA

OBJETIVO: Aislar ADN de levadura y determinar algunas de sus caractersticas.

FUNDAMENTO:

Todos los tejidos contienen ADN, pero algunos no son muy buena fuente. La presencia de enzimas,
protenas, polisacridos y de otros cidos nucleicos hace que la extraccin de ADN en su forma nativa
sea difcil. Basta solo con la ruptura qumica o enzimtica de un solo nucletido de cada 1.000 para
suprimir la funcin y la estructura macromolecular.
Debido a que el ADN es una molcula muy grande su aislamiento en forma intacta y la separacin de
protenas y polisacridos es muy difcil por lo cual, probablemente, lo que se obtenga en la practica
sean solo fracciones de ADN con un considerable grado de impurezas.

Un mtodo consistente en cuatro fases: 1) rotura de las clulas de levaduras 2) su homogenizacin en

presencia de un detergente y gracias a la elevada fuerza inica del medio los iones que pueden
precipitarlo son secuestrados por el EDTA. 3) Las protenas se desnaturalizan en gran proporcin por
agitacin por cloroformo, formndose aglomerados de protenas y cloroformo por los extremos
lipoflicos de aquellas que permiten la separacin de buena parte de las protenas en la interfase del
sistema cloroformo:agua, lo que hace disminuir fuertemente el contenido del extracto del ADN; 4) este
se precipita por adicin de etanol.

MATERIALES Y REACTIVOS

Balanza analtica
Centrfuga
Tubos falcon de 50 mL
Mortero con su mango
Beaker de 250 mL
Termmetro
2 Erlenmeyers de 125 mL
Probeta de 50 mL
Varilla de vidrio gruesa
Levadura de panadera seca.
Arena lavada con cido y agua.
Solucin salina de EDTA: NaCl 0.1% en EDTA 0.1 M
Solucin de dodecil sulfato de sodio (SDS) al 25%
Perclorato de sodio o de potasio 6M
Solucin de cloroformo: alcohol isoamlico 24:1 (v/v)
Etanol absoluto o etanol 95%
Molibdato de amonio 25%
Cloruro estannoso 2%
Reactivo de difenilamina. 0.8 g. en 100 mL de cido actico glacial. Aada 2 mL de H2SO4
concentrado.
Reactivo de Shiff:
PROCEDIMIENTO

Pese 3 g de levadura seca y 3 g de arena fina y depostelos en un mortero previamente enfriado en la

nevera. (Todas las operaciones subsiguientes realcelas en frio, a menos que se indique lo contrario).
Macere fuertemente por lo menos 5 minutos, hasta dejar muy fina la levadura. Pase este slido a un
erlenmeyer de 125 mL con tapn y adicione 10 mL de solucin salina de EDTA. Adicione luego 2 mL
de SDS al 25% y en el bao de hielo, agite durante tres minutos. A continuacin caliente el conjunto
durante 20 minutos, a 60 C, en un bao de agua, con agitacin suave.

Enfre a temperatura ambiente y aada 3 mL de perclorato de sodio 6 M, agitando fuertemente para

conseguir una distribucin rpida y uniforme. Adicione 30 mL de la mezcla cloroformo-alcohol
isoamlico (24:1) y agite vigorosamente durante 15 minutos. Transfiera la emulsin resultante a un
tubo falcon de 50 mL y centrifugue a 5000 rpm durante 10 minutos. Recoja con cuidado la fase
superior acuosa sobrenadante con una pipeta Pasteur, cuidando de no arrastrar los precipitados de la
interfase.

Transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 125 mL colocando en un bao de hielo y aada muy
lentamente por las paredes del erlenmeyer 25 mL de etanol absoluto frio sobre la solucin
procurando que no se mezcle demasiado con el lquido contenido en el erlenmeyer. Al aadir el etanol
el DNA precipita en forma de un ovillo. Con una varilla de vidrio gruesa y limpia, se puede enrollar el
ovillo apretndolo contra las paredes del Erlenmeyer o pescarlo con una pipeta pasteur, escurrir el
exceso de etanol y transferirlo a un tubo limpio que contenga 2 mL de solucin salina de EDTA.

Si no aparece claramente el ovillo de DNA, incubar 10 minutos en hielo (o en el congelador de la

nevera). Centrifugar en un tubo falcon a 5000 rpm por 5 minutos. Descartar el sobrenadante y
resuspender el precipitado de cidos nucleicos en 2 mL de de solucin salina de EDTA, para utilizarse
en las reacciones de identificacin del ADN.

CARACTERIZACIN:

Soluciones de cidos nucleicos

Con el ADN obtenido prepare una solucin acuosa de cido nucleico al 1% aproximadamente. Con 10
mL de solucin es suficiente.

Prueba de Fosfatos
A 1 mL de la solucion de cido nucleico agregue 2 mL de molibdato de amonio y 1 mL de cloruro
estannoso la aparicin de color azul indica la presencia del grupo fosfato

Desoxipentosas
A 1 mL de la solucin de cido nucleico adicione 2 mL de cido tricloroactico al 10% y caliente el
conjunto en un bao mara durante unos 15 minutos. Agregue 6 mL del reactivo de difenilamina, agite
bien y deje en un bao mara durante diez minutos. El desarrollo de un color azul indica la presencia de
una 2-desoxipentosa.
Reaccin de Feulgen-Shiff
En un tubo de ensayo se coloca 2 mL del reactivo de Shiff (color azul) y se agrega 2 mL de hidrolizado
y coloquela durante 5 minutos a bao mara. La solucin tomar un color violeta. Si la prueba es
negativa, agrege un poco ms del hidrolizado (2 mL)

RESULTADOS:
Presente informe escrito sobre la obtencin de ADN y las pruebas de caracterizacin con sus
reacciones.