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FUNDAMENTOS DE LA INGENIERA BIOQUMICA (PRQ 218)

CULTIVOS CELULARES

1. INTRODUCCIN
Aunque el papel de los microorganismos en la biotransformacin fue reconocido
hasta el siglo XIX, los microorganismos han sido utilizados por los seres humanos
desde tiempos prehistricos en los alimentos, bebidas alcohlicas, productos
lcteos, textiles, etc.
Hoy el uso de microorganismos es an ms generalizado que antes, no slo se
utilizan para los procesos microbianos tambin para nuevos procesos como la
produccin de productos farmacuticos, productos qumicos industriales, enzimas,
productos qumicos agrcolas, aguas residuales tratamientos y tecnologas de ADN
recombinante.

2. CULTIVO CELULAR MICROBIANO

a. CLULAS MICROBIANAS
La clula microbiana es una entidad, aislada de otras clulas por una membrana
celular y que contiene en su interior una variedad de sustancias qumicas y de
estructuras subcelulares.

Caractersticas generales de la clula microbiana


Todas las clulas son similares en tres aspectos: todas inician su vida con una
membrana plasmtica, material gentico y una regin de citoplasma.
Membrana plasmtica: Membrana externa de doble capa, separa el
interior de la clula de sus alrededores y selectivamente permite que
las sustancias la atraviesen.
Citoplasma: Regin interna organizada donde se llevan a cabo
conversiones de energa, sntesis de protenas, desplazamiento de
partes celulares y otras actividades necesarias.
Material gentico: Dependiendo de la especie, el ADN ocupa un saco
recubierto de membrana (ncleo) en el interior de la clula o slo una
regin del interior de la clula (nucleoide).

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Todas las clulas microbianas contienen ciertos tipos de componentes qumicos


complejos que son:
Protenas
cidos nucleicos
Lpidos
Polisacridos

b. MEDIOS DE CULTIVO

El crecimiento de la poblacin microbiana en entornos artificiales es llamado cultivo.


Una cultura que slo contiene un tipo de microorganismo es un cultivo puro. Una
cultura mixta es aquella que contiene ms de un tipo de microorganismo.
Los pasos necesarios para la cultivacin de microorganismos son:
1. Preparacin de un medio de cultivo en el que un microorganismo crecer
mejor.
2. Esterilizacin para eliminar todos los organismos vivos
3. Inocular el microorganismo en el medio preparado.

Un microorganismo necesita para crecer nutrientes que le aporten energa y


elementos qumicos para la sntesis de sus constituyentes celulares.

El material alimenticio en el que crecen los microorganismos es el Medio de


Cultivo y el crecimiento de los microorganismos es el Cultivo.

Para que los microorganismos crezcan adecuadamente en un medio de cultivo


artificial debe reunir una serie de condiciones.

CLASIFICACION DE LOS MEDIOS DE CULTIVO

Se pueden clasificar en:

Definidos:Cuando su composicin qumica se conoce


totalmente

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Complejos: Cuando no es el caso porque estn compuestos


por mezclas de extractos de materiales complejos (extracto de
levadura, carne, etc.).
BACTERIAS
La bacteria es el organismo unicelular ms pequeo que existe en la tierra,
pertenece al reino mnera, se caracteriza por poseer una clula procariota, en la
cual su material gentico suele hallarse agrupado en una regin nuclear que carece
de envoltura o membrana propia.

Medios de cultivo bacterias

Un mtodo fundamental para estudiar las bacterias es cultivarlas en un medio


lquido o en la superficie de un medio slido de agar. Muchas especies bacterianas
son tan parecidas morfolgicamente que es imposible diferenciarlas slo con el uso
del microscopio; en este caso, para identificar cada tipo de bacteria, se estudian sus
caractersticas bioqumicas sembrndolas en medios de cultivo especiales,para
hacer esto, uno debe conocer el material alimenticio y las condiciones fsicas
requeridas.

Materiales de enriquecimiento para las bacterias


- Las fuentes de energa
- Las fuentes de carbono

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- Las fuentes de nitrgeno


- Las fuentes de azufre y fsforo
- Las fuentes de elementos metlicos
- Las fuentes de vitaminas

Condiciones fsicas: Hay que tener en cuenta tres grandes factores que son:
La temperatura
El ambiente gaseoso
El pH.
HONGOS

Los hongos son plantas carentes de clorofila y por lo tanto son incapaces de
sintetizar su propia comida, ellos varan en tamao a partir de levaduras unicelulares
a pluricelulares setas. Entre ellos, las levaduras y los mohos son industrialmente
importantes.

3. CULTIVODE CELULAS ANIMALES

3.1 CELULA ANIMAL


Las clulas animales tienen varias caractersticas que las diferencian de otras
clulas u organismos, utilizados en la biotecnologa; son clulas de eucariotes
superiores, por lo que poseen ncleo y diversos orgnulos, tales como retculo
endoplsmico y aparato de Golgi, carecen de pared celular y son ms grandes que
las levaduras o bacterias, con un dimetro aproximado de entre 10 y 20 m

Ellos estn unidos por material intercelular para formar tejidos que se dividen
habitualmente en cuatro categoras:

1. El tejido epitelial : Es el tejido formado por una o varias capas de clulas unidas
entre s, que puestas recubren todas las superficies libres del organismo y
constituyen el revestimiento interno de las cavidades, rganos huecos,
conductos del cuerpo, as como forman las mucosas y las glndulas.

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2. En el tejido conectivo: Las clulas siempre estn incrustados en una extensa


matriz intercelular, que puede ser lquido, semislido o slido.

3. Las clulas musculares: Son generalmente alargados y unidos en lminas o


haces de tejido conectivo, los msculos son responsables del mayor movimiento
en los animales superiores.

4. Las clulas nerviosas: Se componen de un cuerpo celular, que contiene el


ncleo y una o ms extensiones largas y delgadas llamadas fibras. Las clulas
nerviosas son fcilmente estimuladas y pueden transmitir impulsos muy
rpidamente.

Las clulas animales de uso ms comn son:

a) Linfositos

b) Clulas epiteliales

c) Clulas de fibroblastos

3.1.1 Caractersticas de cultivo de clulas animales


A diferencia de las clulas eucariotas inferiores (hongos, levaduras) y bacterias, el
cultivo de clulas animales representa retos enormes ya que, entre otras
caractersticas, las clulas animales son muy sensibles a estres comnmente
encontrados en biorreactores, presentan requerimientos nutricionales complejos,
crecen lentamente y slo dentro de intervalos estrechos de variables como pH,
temperatura y Osmolaridad.

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3.2 MEDIOS DE CRECIMIENTO


Las necesidades nutricionales de las clulas de mamferos son ms estrictas que
las de los microorganismos porque, a diferencia de ellos, los animales no
metabolizan el nitrgeno inorgnico. Por lo tanto, deben proporcionar muchos
aminocidos y vitaminas. Adems, el medio debe ser complementado de 2 a 20%
(en volumen) de suero de la sangre de mamferos. El suero proporciona
componentes que an no han sido identificados, pero han demostrado ser
necesarios para la viabilidad del cultivo.

3.3 ANTICUERPOS MONOCLONALES

3.3.1 Produccin de anticuerpos


Los anticuerpos son molculas proteicas compuestas de cuatro cadenas, dos
ligeras y dos pesadas unidas por puentes di sulfuro, los cuales tienen diversas
funciones tales como reconocimiento y neutralizacin de antgenos, opsonizacin,
presentacin de antgenos a clulas efectoras y activacin del sistema de
complemento.

Los anticuerpos monoclonales son glucoprotenas especializadas que hacen parte


del sistema inmune, producidas por las clulas B- Linfositos, con la capacidad de
reconocer molculas especficas (antgenos). Los anticuerpos monoclonales son
herramientas esenciales en el mbito clnico y biotecnolgico, y han probado ser
tiles en el diagnstico y tratamiento de enfermedades infecciosas, inmunolgicas
y neopl-sicas, as como tambin en el estudio de las interacciones patgeno-
hospedero y la marcacin, deteccin y cuantificacin de diversas molculas.

Actualmente, la incorporacin de las tcnicas de biologa molecular e ingeniera


gentica y proteica han permitido ampliar el horizonte de la generacin de
anticuerpos monoclonales y sus usos, y se han encontrado tcnicas como la
hibridacin, la quimerizacin, la humanizacin y la produccin de anticuerpos
monoclonales totalmente humanos.

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4. CULTIVO DE CELULAS VEGETALES


Con el fin de producir productos metablicos secundarios de una planta, tejido
vegetal exgeno en lugar de una planta entera, puede cultivarse un cultivo en
suspensin en una condicin asptica. La justificacin tcnica para el uso de tejido
vegetal se basa en la nica toti potencia bioqumica de las clulas vegetales.

El cultivo de clulas vegetales en lugar de toda la planta para la produccin de


metabolitos puede proporcionar varias ventajas:

Las clulas vegetales se pueden cultivar donde se necesitan sin importar del
tiempo y las condiciones geogrficas. Como resultado, no hay necesidad de
enviar o almacenar materias primas voluminosas.

La calidad del producto y los rendimientos tambin pueden ser controlados


por eliminar los problemas encontrados en el procesamiento de como la
calidad de la materia prima, la uniformidad dentro y entre lotes, y daos en
el envo y almacenamiento.

Algunos productos metablicos pueden ser producidos a partir de


suspensin cultivo en mayor cantidad que la observada en plantas enteras.

4.1 CLULAS VEGETALES


La clula vegetal est rodeada por una pared celular, que determina caractersticas
de la planta. La capa externa de la pared celular se llama centro porque contiene
una capa pesada de pectina (una Polygalacturonan) que sirve como el pegamento
para sostener firmemente una clula vegetal a una celda adyacente. La capa interna
de la pared es la membrana celular; la membrana celular es completamente
diferente de la pared celular en forma, composicin y funcin. Considerando que la
pared es una estructura gruesa, la membrana citoplasmtica es delgada
(aproximadamente 75) y flexible. La membrana se compone de protenas y lpidos,
mientras que la pared es carbohidrato en la naturaleza. La pared proporciona
soporte, mientras que la membrana regula el movimiento de sustancias dentro y
fuera de la clula.

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4.2 TIPOS DE CULTIVOS: Pueden ser:

Los cultivos de callos son agregados celulares amorfos derivados del


crecimiento desorganizado de explantes sobre un nutriente slido asptico
medio. Los explantes son los rganos pequeos o secciones de tejido.

Los agregados celulares no se corresponden con ningn tejido de la planta


entera. El trmino cultura del callo fue elegido porque se pens que la
proliferacin celular era inducida por una lesin del explante durante la
escisin. Sin embargo, se ha inducido por los reguladores del crecimiento
de las plantas en el nutriente slido medio.

Los cultivos de suspensin (o clulas) consisten en clulas y agregados


celulares, creciendo dispersado en medio lquido. Por lo general, se inician
colocando piezas de un cultivo de callos friable en el lquido en movimiento
medio. Por consiguiente, los cultivos en suspensin son progresin de la
planta al explante, al callo y finalmente a suspensin. El cultivo en
suspensin es ms adecuado para propagacin de las clulas vegetales que
el cultivo del callo, pueden mantenerse y manipularse de forma similar a
fermentaciones microbianas sumergidas.

Los cultivos de protoplastos implican el crecimiento de protoplastos en


medio lquido. Los protoplastos se pueden preparar mecnicamente o
eliminacin enzimtica de la pared celular. Los protoplastos aislados

Pueden utilizarse:

1) modificar la informacin gentica de las clulas vegetales

2) para crear hbridos vegetales a travs de la fusin de protoplastos

3) a estudiar las infecciones virales de la planta, y as sucesivamente. Otra


aplicacion de cultivos de protoplastos es la micropropagacin de plantas.
Despus de las divisiones de protoplastos, las paredes celulares pueden ser

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regenerados para dar lugar a callos y posteriormente a plantas, que


proporciona una ruta por la cual las plantas pueden multiplicado.

4.3 MEDIOS DE CULTIVO


Aunque los requerimientos nutricionales de diversos cultivos de tejidos varan
ampliamente, los medios tpicos de cultivo de tejidos vegetales contienen los
siguientes componentes:

1) Principales nutrientes: Sales de nitrgeno, potasio, calcio, Fsforo,


magnesio y azufre, que son seis elementos para el crecimiento de plantas
superiores.

2) Menores nutrientes: Sales de hierro, manganeso, zinc, boro, cobre,


molibdeno y cobalto en trazas.

3) Suplementos orgnicos: Pequea cantidad de vitaminas (mio-inositol,


Tiamina, cido nicotnico, piridoxina, etc.), aminocidos (Usualmente
omitido, pero a veces usado con ventaja), y otros suplementos indefinidos
(carne, malta y extracto de levadura e hidrolizados de protenas, y as
sucesivamente).

4) Reguladores de la planta: Auxinas (generalmente provistos con anlogo


sinttico, cido 2,4-diclorofenoxiactico) y Cytokininas (anlogo sinttico de
uso comn, kinetina) que regulan el crecimiento y la morfognesis en tejidos
y rganos de las plantas cultura.

5) Fuente de carbohidratos: Usualmente sacarosa para reemplazar el carbono


que la planta normalmente se fija de la atmsfera por fotosntesis, ya que la
mayora del cultivo de clulas vegetales carece de capacidad fotosinttica.

6) Agente solidifcante de semislido medio: Agar

4.4 PRODUCCION DE METABOLITOS SECUNDARIOS


Son los compuestos orgnicos sintetizados por las plantas que cumplen funciones
no esenciales en ellas, de forma que su ausencia no es letal para el organismo, al

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contrario que los metabolitos primarios. Los metabolitos secundarios intervienen en


las interacciones ecolgicas entre la planta y su ambiente; tienen una distribucin
restringida en el reino de las plantas y algunos solo se encuentran en una especie
o grupo, por lo que a menudo son tiles en la Botnica Sistemtica.

Los metabolitos secundarios se pueden clasificar en tres categoras principales:


Alcaloides, aceites esenciales y glucsidos.

5. MEDICION DE CRECIMIENTO DE CELULAR


En cualquier sistema biolgico, el crecimiento se puede definir como el aumento
ordenado de todos los componentes qumicos.

Crecimiento equilibrado en el que todos los constituyentes celulares (protenas,


ADN, ARN, H2O intracelular) se duplican en un mismo tiempo.

Los cultivos sometidos a crecimiento equilibrado mantienen una composicin


qumica constante.

El crecimiento celular se puede determinar por:

1.-El nmero de clulas

2.-La masa celular

3.-La actividad celular

5.1 MEDICIN DEL NMERO DE CLULAS

Mtodos directos
Recuento microscpico: El nmero de clulas en una poblacin
puede ser medido con un microscopio contando las clulas colocadas
en especial cmaras de recuento. Hay dos tipos de cmaras utilizadas
para el contando el nmero de clulas en muestras lquidas.

Tcnica comn, rpida y barata; para estos recuentos se utilizan cmaras para
contar el nmero de clulas en muestras liquidas.

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Existen 2 tipos de cmaras:

a) Hemocito metro: Cmara plana de vidrio reticulada a 0.1mm., para el uso


con los organismos de 3 m de dimetro o ms grandes.

Cmara cuenta glbulos.

b) Cmara de recuento de Petroff-Hausser: Cmara de recuento, para uso


principalmente con bacterias.

5.2 MEDICIN DE LA MASA CELULAR

5.2.1 Peso seco de la clula:


Se puede medir directamente mediante la adopcin de una alcuota de la
suspensin celular y centrifugando la misma. Despus se desecha el sobrenadante,
las clulas se lavan a fondo con agua destilada para eliminar toda la materia soluble.
La suspensin se vuelve a centrifugar y las clulas sedimentadas se secan en un
horno y se pesa.

Consiste en dejar secar volmenes conocidos de cultivo celular lentamente hasta


que alcancen un volumen constante. Esta tcnica slo se puede utilizar con
suspensiones de clulas densas, y las clulas se deben lavarse completamente libre
de toda materia extraa.

5.2.2 Turbidez:
La masa celular se puede medir pticamente mediante la determinacin la cantidad
de luz dispersada por una suspensin de clulas. La tcnica se basa en el hecho
de que las partculas pequeas dispersan la luz proporcionalmente, dentro de
ciertos lmites, a su concentracin.

La capacidad de absorcin se define como el logaritmo de la relacin de la


intensidad de luz que incide sobre la suspensin (o) a la transmitida por la
suspensin (I):

Io
A = log I p

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Una curva de calibracin se puede obtener mediante la medicin de la absorbancia


de las muestras con concentracin de clulas conocida. Las mediciones se hacen
generalmente a una longitud de onda de 600 - 700 nm.

5.3 MTODOS INDIRECTOS


Los mtodos indirectos para la medicin de la masa de clulas se basan en la
estequiometria general para el crecimiento y formacin de producto, que puede
escribirse en la forma general:

C-fuente + N-fuente fosfato + O2 masa celular + producto + H20 + CO2 + calor

El cambio de la masa celular se puede monitorizar indirectamente por el:

Consumo de nutrientes: Es necesario elegir un nutriente que es no


susceptibles de ser utilizados para sintetizar un producto metablico. Fosfato,
sulfato, o magnesio puede ser buenos candidatos.

Formacin de producto: Es importante comprobar que el producto formado


se asocia el crecimiento.

Componentes de la clula: Los componentes de la clula de macro-


molecular tales como protenas, ARN, y ADN se puede medir en lugar de la
masa celular. Sin embargo, es necesario tener cuidado porque la proporcin
de estos materiales en una clula pueden cambiar con el tiempo el cultivo no
se somete a un crecimiento equilibrado

Evolucin del calor: la medicin del calor de la fermentacin puede est


relacionado indirectamente con el crecimiento celular. El calor de combustin
de organismos es bastante constante con un valor tpico de 5 kcal / g. la
cantidad de calor desprendido depende de la eficiencia del carbono
utilizacin de la energa.

Viscosidad: El crecimiento de micelio o la formacin de polisacridos


aumentan la viscosidad del caldo de fermentacin. Por lo tanto, la medicin
de la viscosidad del caldo es til en muchas fermentaciones comerciales..

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6. INMOVILIZACION CELULAR
El termino inmovilizacin de clulas se refiere a clulas fsicamente confinadas o
localizadas en una cierta regin definida en el espacio, reteniendo sus propiedades
y actividades catalticas. Asimismo, dependiendo del tipo de inmovilizacin las
clulas pueden ser inmovilizadas de forma permanente o temporal para ser
utilizadas repetida y continuamente en diversos procesos qumicos. Bajo esta
perspectiva, la inmovilizacin debera ser definida como una tcnica capaz de
reutilizar o dar uso continuo de biocatalizadores y clulas. Por lo tanto, la sencillez
y el bajo costo de los mtodos de inmovilizacin juegan un papel fundamental en la
seleccin de protocolos de inmovilizacin. Es por ello que por medio de la
inmovilizacin es posible no solo controlar la ubicacin de las clulas sino tambin
modificar sus propiedades selectivamente.

6.1 METODOS DE INMOVILIZACION DE CELULAS: Los mtodos de


inmovilizacin son:
a) Adhesin

Es el trmino utilizado para cualquier forma de inmovilizacin en la que las clulas


forman una unin a la superficie de un soporte slido, ya sea de forma natural
(adsorcin y la adherencia) o como resultado del tratamiento de la superficie de las
clulas y el material de soporte (unin covalente). Adhesin Natural (adsorcin) de
las clulas a las superficies es un fenmeno generalizado y proporciona un mtodo
simple y suave para la inmovilizacin de las clulas.

b) Atrapamiento

El atrapamiento de las clulas individuales y su ventaja de crecimiento natural a la


colonizacin del material de soporte. El atrapamiento dentro de la estructura
preformada podra ocurrir a nivel microscpico usando partculas micro porosas
tales como cermica, vidrio sinterizado, o gel de slice o a nivel macro a travs de
la utilizacin de partculas con poros relativamente grandes, tales como malla de
acero inoxidable o de partculas de soporte de biomasa espuma reticulada.

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El atrapamiento de las clulas dentro de las estructuras porosas que se forman in


situ alrededor de las clulas se consigue mediante la mezcla de las clulas
microbianas, en la forma de una suspensin o pasta, con un compuesto adecuado,
que luego se gelifica o polimeriza para formar la estructura porosa que contiene las
clulas.

c) Agregacin

La agregacin y floculacin de las clulas microbianas resultantes en la formacin


de flculos grandes es un fenmeno natural que se puede observar en muchos tipos
de microorganismos en alguna etapa de su ciclo de vida. Los polmeros en la
superficie celular y sustancias polimricas extracelulares son factores importantes
en el desarrollo natural de flculos microbianos y su integridad.

d) Contencin: (contencin detrs de una barrera)

Las clulas pueden ser inmovilizadas en micro cpsulas que tienen una membrana
permanente o no permanente semipermeable. La ventaja de las tcnicas de
encapsulacin es la gran rea superficial para el contacto de sustrato y clulas.
La membrana semipermeable tambin pasa selectivamente los componentes slo
bajo peso molecular.

7. BIBLIOGRAFIA
- Dutta - Fundamentals of Biochemical Engineering
- https://prezi.com/qcojujkyfj8d/medios-de-cultivo-para-hongos/
- http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/09/tipos-y-
funciones-de-los-medios-de.html

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