Cintica de crecimiento en biorreactor

Prctica de laboratorio No. 4

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Resumen

Los biorreactores son importantes instrumentos de un bioproceso, a nivel industrial el mejor modelo es el de
tanque agitado mecnicamente. Para poder establecer el diseo de una fermentacin, es necesario conocer
algunos parmetros claves de la cintica del crecimiento celular del organismo de trabajo, as como un modelo
matemtico que permita predecir el comportamiento y optimizar el proceso. El objetivo de este trabajo es
evaluar el crecimiento celular, el consumo de sustrato y el coeficiente de transferencia de oxgeno (k La) para la
fermentacin de una levadura con posible actividad pectinoltica creciendo en un medio sinttico en un
biorreactor de tanque agitado de 3L, con volumen de operacin de 1,5 L. Se encontr, en este caso, que la
velocidad especfica de crecimiento de la levadura fue de 0,056 h-1, mientras el rendimiento global biomasa
sustrato fue de 0,54 y, por ltimo, un valor de k La de 60,48 h-1.

Palabras Clave: biorreactor, tanque agitado, biomasa, rendimiento, k La

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1. Introduccin

Los biorreactores son el centro del proceso de cultivo, pues son el lugar donde ocurren las reacciones
implicadas en los procesos especficos de conversin del sustrato por parte del microorganismo. Su
diseo debe proporcionar un sistema homogneo al interior para todos los componentes, as como las
condiciones ptimas para el crecimiento microbiano y la obtencin del producto objetivo. Unos de los
parmetros ms relevantes en el diseo son la transferencia de calor y la de oxgeno, dado que de ellas
depende en gran medida la supervivencia de las clulas necesarias en el proceso que se va a
desarrollar. Adicionalmente, la agitacin es relevante en la medida en que provee homogeneidad al
medio, sin embargo, se debe prestar atencin a los efectos de cizalladura que pueden ocurrir en las
clulas [1].

Los biorreactores se pueden clasificar por el tipo de operacin tanto como por la geometra y tipo de
agitacin, como los fermentadores agitados por aire (Air-lift), los de torre y los de agitacin mecnica.
Comnmente, se pueden distinguir tres tipos de procesos en un biorreactor: en batch, continuo y semi-
continuo; llevados a cabo, principalmente en tanques con agitacin mecnica, que son el tipo de
biorreactor ms usado, mientras el tipo de operacin depende mayormente del objetivo del proceso,
como tipo y cantidad de producto esperado, tiempo de reaccin, espacio y los costos asociados, entre
otros [2].

El crecimiento de los microorganismos en los biorreactores debe ocurrir de manera ordenada para que
la produccin de metabolitos pueda ser controlada, de forma indirecta, mediante la manipulacin las
condiciones de crecimiento elegidas como las ptimas para cumplir el objetivo del proceso. En este
orden de ideas, se pueden distinguir cuatro fases bien definidas durante el crecimiento celular: la fase
de latencia, posterior a la inoculacin; la fase exponencial, donde el crecimiento celular se acelera; la
fase estacionaria, que ocurre cuando el sustrato del medio se agota y la tasa de crecimiento iguala a la
tasa de muerte; por ltimo, la fase de muerte [3]. Entonces, dependiendo de los requerimientos del
proceso, se puede mantener a las clulas en la etapa exponencia, si se necesita producir biomasa, o en
la etapa estacionaria, si ofrece las condiciones necesarias para que el organismo desempee un tipo de
metabolismo que genere el producto de inters [4].

La informacin sobre las caractersticas del microorganismo es, as, indispensable para decidir sobre
la viabilidad de un proceso que se est diseando y se pretende implementar, de modo que los
estudios cinticos sobre el comportamiento del mismo bajo unas ciertas condiciones dadas ayudan a
predecir si la fermentacin es propicia. Dichos estudios arrojan parmetros tales como curvas de
crecimiento microbiano, los rendimientos obtenidos a partir del sustrato usado tanto para la biomasa
como para el producto, lo mismo que los rendimientos respecto al consumo de oxgeno, en caso de ser
ste un sustrato limitante en el proceso [5].

Los parmetros evaluados durante la cintica microbiana se miden, principalmente, mediante tcnicas
analticas y sensores equipados en el biorreactor. Por ejemplo, usando lecturas de densidad ptica y
mediciones de peso seco, se puede conocer el comportamiento del crecimiento celular; el consumo de
sustrato y la generacin de producto se pueden hallar por tcnicas como el DNS para medir azcares
reductores y mediciones de actividad enzimtica si el producto esperado es una enzima [6][7][8].

Al final, con toda la informacin recolectada, se pueden desarrollar modelos matemticos para el
proceso que permitan predecir el comportamiento de la fermentacin y la optimizacin del mismo [3].
Por tanto, en este trabajo se pretendi obtener las curvas de crecimiento de biomasa, el consumo de
sustrato y generacin de producto, as como la transferencia de oxgeno en un biorreactor de tanque
agitado de 3 L operando a una capacidad de 1,5 L para un cultivo de levaduras desconocidas aisladas
previamente por sus posibles capacidades pectinolticas usando un medio de cultivo sinttico de
formulacin conocida.

2. Antecedentes

Tabla 1. Matriz bibliogrfica cintica microbiana

Ttulo Revista Objetivo Sustrato Producto Microorganismo
Caracterizacin
Estudiar el
fermentativa de
comportamiento
levaduras
cintico de biomasa
productoras de Rev. Mex. Ing. Qum
y etanol nivel Jugo de Agave Kluyveromyces
etanol a partir de vol.12 no.3 Mxico Etanol
matraz y nivel cupreata. marxianus
jugo de Agave dic. 2013 biorreactor durante
cupreata en la
la fermentacin
elaboracin de
alcohlica.
mezcal [8]
Estudiar la
Bioprocessing of produccin de
citrus waste peel Journal of Radiation pectinasas a partir
for induced Research and Applied de fermentacin de
pectinase residuos
Sciences Cscara de
production by agroindustriales Pectinasas Aspergillus niger
Aspergillus niger; Volume 9, Issue 2, ctricos
como la cscara de
its purification and April 2016, Pages naranja por
characterization 148-154 microorganismos
[9] como Aspergillus
niger.
Biodegradation and Bioresource Evaluar la eficacia
Benceno
kinetic study of Technology de especies Benceno Bacillus sp. M3
degradado
benzene in 242, pp. 92-100 microbianas con
bioreactor packed potencial para
with PUF and degradacin de
alginate beads and benceno. Adems,
immobilized with maximizar la tasa
Bacillus sp. M3 de biodegradacin
por optimizacin
[10] de parmetros del
proceso como el
pH, la temperatura
y la concentracin
del benceno y el
tamao de los
inculos usando las
especies ms
eficientes.
Construccin de un
Multi-substrate modelo cintico no
growth kinetics of Applied lineal de doble
Pseudomonas Microbiology and sustrato, fenol y
Biotechnology oxgeno Fenol Pseudomonas
putida for phenol Fenol
May 1997, Volume disuelto,para el degradado putida
removal 47, Issue 5, pp 610 crecimiento de P.
[11] 614 putida en un
fermentador
continuo.
Examinar la
cintica del uso del
Kinetics of
APPLIED AND pentaclorofenol en
Microbial Growth
ENVIRONMENTAL cultivo batch y fed- Pentaclorofenol
on Pentaclorofenol NN
MICROBIOLOGY, batch por un degrado
Pentachlorophenol
Jan. 1985, p. 46-53 microorganismo
[12]
degradador de
pentaclorofenol

Tabla 2. Matriz bibliogrfica determinacin del kLa

Ttulo Revista Objetivo Sistema Mtodo

Development of a Heliyon Presentar un modelo Tanques de Se desarroll el

model to determine February 2017 mecnico validado aireacin modelo matemtico:
mass transfer Volume 3, Issue experimentalmente para (Biorreactor).
coefficient and 2. predecir el coeficiente de
oxygen solubility transferencia de oxgeno que evala el efecto de
in bioreactors (kLa) en tanques de la temperatura en el
aireacin para diferentes kLa.
[13] temperaturas del agua.

Dynamic pressure Biotechnology Proponer un mtodo Biorreactores Mtodo dinmico

method for kLa and dinmico para medir el de gran escala estndar, mtodo
measurement in Bioengineering kLa en reactores aireados dinmico con cambio
large-scale May, 1989. y agitados, donde el de presin, y mtodo
bioreactors Volume 33, Issue cambio en la presin de sulfito en estado
[14] 11. Pages 1406 total lleva a un cambio en estacionario.
1412. la concentracin de
oxgeno de todas las
burbujas de dispersin.

Comparison of Applied Presentar las propiedades Biorreactor de Mtodo de oxidacin

growth properties Microbiology and de crecimiento de raz paletas de del sulfito simulacin
 of carrot hairy root Biotechnology peluda de zanahoria en turbina de oxgeno disuelto
in various December, 1989 diferentes biorreactores, dinmico (OD)e sodio
bioreactors Volume 32, Issue y proponer el kLa como
[15] 3. Pages 291 - un criterio importante.
294.

Determinacin Revista peruana Determinar Biorreactor Mtodos de balance de

experimental del de qumica e experimentalmente el kLa batch oxgeno en el sistema
coeficiente de ingeniera en un biorreactor batch isotrmico o la tcnica dinmica
transferencia de qumica. (2001). inicialmente sin (BIOFLO III)
oxgeno (kLa) en Vol 4, Nmero 2. microorganismos, y
un biorreactor Pginas 22- 27. observar el efecto del
batch nivel de aireacin, el
[16] grado de agitacin y la
viscosidad en diferentes
medios.

Dynamic DO Huagong Construir un modelo de Sequencing Mtodo de simulacin

simulation for Xuebao/CIESC nitrificacin para obtener batch reactor dinmica de oxgeno
aerobic Journal datos dinmicos de OD (SBR) disuelto (OD)
nitrification 63(12), pp. 4048- del proceso en aireacin
process in SBR 4054 constante, a partir de la
with constant cual los valores de kLa
aeration intensity: podran determinarse
Model mediante anlisis
identification and tericos.
KLa determination
[17]

3. Metodologa

3.1. Preparacin del medio de cultivo

Se utiliz un medio de cultivo de composicin conocida (5g/L Glucosa, 0.1g/L CaCl2, 0.6g/L
MgSO4.7H2O, 0.78 g/L KH2PO4, 0.45 g/L cido ctrico, 0.3 mL/L solucin de Urea, 1.0mL/L
solucin de vitaminas, 1.0mL/L solucin de cationes) pH 4,7. Solucin de vitaminas: Inositol 70 g/L,
Acido p-amino benzoico 1.0 g/L, Pantotenato de calcio 4,0 g/L, D-Biotina 0.06g/L, Piridoxina 1.0g/L,
Acido nicotnico 12 g/L, Tiamina 0.6 g/L. Solucin de cationes: FeSO4 .7H2O 0.2mg/L,
ZnSO4 .7H2O, 60 g/L. Se prepar suficiente medio para un volumen final de operacin de 1,5 L.

3.2. Preparacin del inculo

Se dej creciendo una muestra del microorganismo en un erlenmeyer de 1 L con un volumen de
medio de 100 mL durante 24 horas a 30 C y con agitacin orbital de 200 rpm. Dicho medio se
inocul a partir de la levadura crecida enmedio slido y resuspendida en un pequeo volumen de agua
destilada estril.

3.3. Montaje de la fermentacin

El cultivo se realiz en un biorreactor de tanque agitado a escala de laboratorio, con una capacidad de
3 L, operando a 1,5 L de volumen. Se llen inicialmente con 1,4 L de medio (previamente descrito)
estril y se procedi al montaje del tanque, tal como se muestra en la figura 1; una vez preparado el
arreglo del sistema se procedi a inocular con los 100 mL de medio con microorganismo crecido por
24 horas y se encendi el biorreactor. Se mantuvo una agitacin 400 rpm, un flujo de aire de 0.8
L/min y una temperatura de 30 C para un tiempo de fermentacin de 30 horas y 25 minutos.

Figura 1. Montaje del biorreactor.

3.4. Mediciones experimentales

Se tomaron muestras regulares durante el tiempo de fermentacin de un volumen de 15 a 20 mL de

medio para evaluar algunos parmetros cinticos relevantes.
El crecimiento microbiano se determin por densidad ptica, mediante lecturas de absorbancia a 600
nm en un espectrofotmetro con celdas plsticas con capacidad 1 mL. As mismo se midi el peso
seco de la biomasa en estas muestras, mediante un proceso de filtracin de un volumen de 5 mL y el
posterior secado del mismo en un horno a 50 C durante 48 horas. Se registr previamente el peso de
los filtros y despus se contrast con el peso de los mismos ms la biomasa posterior al secado.

Se evalu el consumo de sustrato del medio por el microorganismo mediante un anlisis de

azcapresentes en la muestra recolectada, para ello se us el mtodo de DNS y se recolectaron datos
de absorbancia a 540 nm, tal como se trabaj en estudios cinticos en Erlenmeyer previamente.

Adicionalmente, se evalu la transferencia de oxgeno al sistema mediante el mtodo directo de

determinacin del kLa.

3.5. Determinacin de kLa por el mtodo dinmico

La determinacin del kLa por este mtodo se basa en la tcnica propuesta por Taguchi y Humphrey
[6], en el cual primero se realiza una medicin de la actividad respiratoria de microorganismos que
crecen activamente en un biorreactor. Luego, al cultivo se le suspende el suministro de gas, y este se
ver sometido a que la concentracin de oxgeno disuelto disminuir a una velocidad igual al
consumo de oxgeno por parte de la respiracin de los microorganismos (OUR). Luego de llegar a un
porcentaje bajo de oxgeno, se reanuda la aireacin hasta que la concentracin permanezca constante.
As, un balance de masa para el oxgeno disuelto en un medio de cultivo estar dado por la siguiente
ecuacin:
 Ecuacin 1

Para hallar el valor de kLa se toma la ecuacin 1 como lineal, y se grfica OD/t vs OD utilizando
los valores de OD y tiempo obtenidos en la regin OTR (despus de reanudar la aireacin), la
pendiente de esta recta ser el valor de kLa.

Teniendo en cuenta lo anterior se procedi de la siguiente manera: pasadas 4 horas de cultivo se

suspendi la aireacin, sta sera el tiempo cero (t=0) en la aplicacin de mtodo. Se suministr un
flujo de nitrgeno con el fin de acelerar el proceso de desplazamiento del oxgeno. Lo anterior
permiti que se alcanzar un nivel de concentracin de oxgeno disuelto de 18,7 % al pasar un minuto.
Luego, se volvi a activar el sistema de aireacin, y se tom datos de porcentaje de oxgeno disuelto
(%OD) hasta valores cercanos al valor inicial de OD=88% (valor previo a la iniciacin del
desplazamiento).

Para hallar el valor de OD/t se encontr un polinomio de grado 3 que se ajuste a la curva que
resulta luego de reanudar la aireacin. Teniendo la ecuacin del polinomio, se hall su funcin
derivada cuyas imgenes seran los valores de dOD/dt con respecto al tiempo. Con esto, se tiene un
sistema de ecuaciones paramtricas (f(t)=dOD/dt ; g(t)=OD) cuya grfica es una lnea recta de
pendiente -kLa.

4. Resultados y discusin

Las condiciones de operacin del biorreactor se fijaron de la siguiente manera:

T = 30 C
Agitacin = 400 rpm
Flujo de aire = 0,8 L/min

4.1 Crecimiento microbiano

La tabla 3 resume los resultados de densidad ptica y peso seco obtenidos para cada muestra. Con
estos datos se construy la curva de crecimiento microbiano presentado en la figura 2.

Tabla 3. Datos para crecimiento microbiano

Muestra Tiempo (h) DO (Absorbancia) Peso seco (g/L)
1 0 0,531 0,30
2 4 0,868 0,38
3 7 1,197 0,80
4 9 1,585 1,40
5 11 1,735 1,86
6 22 1,782 2,04
7 24 1,803 2,14
8 28 1,926 2,50
9 31 1,938 2,64
 Figura 2. Crecimiento microbiano en biorreactor determinado por la densidad ptica y peso seco

En la figura 2 la curva de crecimiento microbiano medido por peso seco, muestra claramente las fases
de latencia, exponencial y estacionaria, tpicas de una curva de crecimiento microbiano. En la curva
de crecimiento microbiano medido por densidad ptica, tambin se observan las fases pero no son tan
distinguibles. Por lo tanto, se evidencia que el mtodo de peso seco es un ms confiable para medir el
crecimiento microbiano, que midiendo la densidad ptica. As mismo, para ambos casos, luego de la
fase estacionaria se observa un pequeo crecimiento donde debera encontrarse la fase de muerte. Se
asume que en las ltimas muestras hubo un problema de contaminacin, pues no es lgico que haya
crecimiento de biomasa cuando el sustrato ha disminuido casi por completo, como lo muestra la
figura 3. Adicionalmente, la incertidumbre en el comportamiento de la grfica se ve apoyado por un
vaco de los datos presentado entre la quinta y la sexta medicin, correspondiente a once horas donde
no se tiene claridad de lo que ocurri, y en la grfica se muestra como la fase estacionaria.

4.2 Consumo de sustrato

La concentracin de glucosa, medida por el mtodo DNS, muestra el consumo de sustrato de la

levadura durante la fermentacin. Utilizando los datos de la tabla 4, se superpuso el consumo de
sustrato sobre el crecimiento microbiano, obteniendo la figura 3. Se observa que ambas variables
estn proporcionalmente relacionadas indicando que una parte significativa del sustrato es utilizado
por las clulas para crecer. Sin embargo, al observar las pendientes de las grficas se infiere que la
razn a la que disminuye el sustrato es mayor que la razn a la que aumenta la biomasa, esto se ve
reflejado en un valor de rendimiento global, Yx/s, menor que uno (0.54).
 Figura 3. Consumo de sustrato y crecimiento microbiano en el tiempo

Adicionalmente, dada la fase exponencial es posible conocer la velocidad especfica de crecimiento de

biomasa, m, la cual es una medida importante a la hora de estudiar el crecimiento de los
microorganismos. A partir de la definicin de (ecuacin 3) se obtiene un valor de m igual a 0.056 h-
1
resolviendo la ecuacin diferencial para la fase exponencial (ecuacin 4).

Tabla 4. Datos para medicin de azcares reductores.

Tiempo (h) Factor de dilucin Abs Azcares reductores (g/L)
0 0,0333 0,879 4,378
4 0,0500 1,068 3,550
7 0,0667 1,127 2,810
9 0,1250 1,261 1,678
11 0,2000 0,256 0,209
22 1,0000 0,794 0,132
24 1,0000 0,679 0,113
28 1,0000 0,576 0,095
31 1,0000 0,067 0,010

4.4 Determinacin del kLa

El mtodo dinmico inici a las 4 horas de cultivo, esperando que en ese momento las clulas
estuvieran por comenzar la fase exponencial de crecimiento. La figura 4 muestra como al interrumpir
el flujo de aire, se observa un consumo muy rpido de oxgeno ya que las clulas estn creciendo a
una tasa muy alta. Adicionalmente, antes de alcanzar el punto crtico, cuando se abre el flujo de aire
nuevamente, se observa el aumento del oxgeno disuelto a lo largo del tiempo, y es all donde se halla
el coeficiente de transferencia de oxgeno, segn el balance de materia presentado en la ecuacin 2.
La funcin que mejor se ajust al tramo utilizado para hallar el kLa fue el polinomio cbico
presentado en la ecuacin 5 cuya derivada es la ecuacin 6.

Figura 4. Comportamiento del oxgeno disuelto por el mtodo dinmico

La figura 5 representa el balance de materia (ecuacin 2) que es una lnea recta cuya pendiente es el
kLa = 0,0168 s-1 o 60,48 h-1. Dicho valor es ms bajo al obtenido en experimentos de estimacin del
coeficiente de transferencia de oxgeno por mtodos como el de la oxidacin del sulfito, puesto que
ste ltimo tiende a sobreestimar el valor, debido a que no considera el consumo de oxgeno por parte
de las clulas, as como tambin, que la reaccin de oxidacin ocurre mucho ms rpido gastando a
mayor velocidad el oxgeno disuelto de o que lo hara el metabolismo celular. En el trabajo anterior,
los valores de kLa para un Erlenmeyer de 1L y 250 mL operando con 100 mL de medio con agitacin
orbital de 200 rpm arroj valores entre 60 y 286 h-1 para diferentes arreglos geomtricos,
correspondiendo el ms bajo a un Erlenmeyer pequeo y sin bafles. Por estas razones, se esperaba que
la mayor agitacin del tanque, sumada a la aireacin del medio se tradujera en un valor del coeficiente
mucho mayor; an as cabe mencionar que sta caracterstica tambin est ligada a la especie en
particular del organismo usado y, en este caso, se carece de la certeza de que las levaduras usadas en
ambos estudios correspondan a la misma especie.
 Figura 5. Balance de materia de forma grfica para hallar el kLa

5. Bibliografa

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