Practica 1

Determinacin instrumental del color y extraccin y cuantificacin de

pigmentos naturales (betalanas, licopeno y rojo carmn)

1.1 Introduccin

La percepcin del color es una respuesta al estmulo fsico que la radiacin luminosa visible
produce en la retina; la cual depende del objeto, del observador y del entorno, por lo que se
le considera un concepto psicofsico. Desde el punto de vista fsico el color corresponde a
la distribucin de energa de la luz reflejada o transmitida por un objeto, dentro del
espectro electromagntico continuo. La porcin del espectro que es visible para el ojo
humano corresponde a la longitud de onda de 380 a 770 nm. Cuando la luz blanca pasa a
travs de un alimento, los compuestos cromforos o pigmentos presentes en el producto
absorben parte de la energa en la regin visible y reflejan el resto.

La radiacin electromagntica (RE) que refleja o emite un objeto es captada por las clulas
sensitivas de la retina, los bastones y los conos. Los bastones son sensibles a la iluminacin
y oscuridad y los conos al color; el nervio ptico se encarga se transmitir esta seal al
cerebro donde es interpretada como colores. El ojo humano identifica unos 10 millones de
colores distintos. La RE por encima y por debajo de los 380 y 780 nm, que corresponden a
las regiones del infrarrojo y ultravioleta, no son perceptibles por el ojo humano.

El color depender de la longitud de onda emitida por la excitacin de los pigmentos

presentes en el alimento. As, la distribucin espectral de la luz transmitida o reflejada por
el alimento entre los 380 a 400 nm corresponde a la percepcin del color violeta, entre los
400 a 475 nm se tiene el color azul, de 500 a 570 el verde, de 570 a 590 el amarillo y de
700 a 770 el rojo. En la mayora de los alimentos la absorcin y reflexin de la luz se
acompaan de otros fenmenos como la dispersin y reflexin mltiple acorde a la
uniformidad o rugosidad de la superficie del producto. Adems, el iluminante, la geometra
ptica, el rea, el fondo, el brillo y temperatura pueden modificar el color percibido. En la
industria alimentaria, el color es un parmetro de calidad que se puede evaluar por diversas
tcnicas tanto subjetivas como objetivas. Las primeras consisten en la comparacin visual
del producto con patrones de color especficos, como las guas de color slido Pantone. Los
mtodos objetivos miden la intensidad de la luz absorbida o reflejada, ya que sta es
proporcional al color percibido, estos mtodos son ms exactos e independientes de la
capacidad de percepcin del ojo humano.

La determinacin del color a travs de la espectrofotometra de reflectancia tiene una

estrecha correlacin con la percepcin visual humana. El Comit Internacional de la
Iluminacin (CIE) estableci un sistema de color universal denominado CIE-LAB basado
en la teora de la percepcin tricromtica de Young (coordenadas X, Y y Z), as como en la
teora de los colores opuestos. La determinacin del color se realiza bajo condiciones
controladas. La CIE defini varias fuentes de iluminacin normalizadas en funcin de su
curva de distribucin espectral y de la temperatura de color, como la iluminacin estndar
D65 o luz de da. De igual forma se estableci que la iluminacin del objeto debe realizarse
en un ngulo de 45 y defini un observador estndar situado perpendicularmente a 45.7
cm, de tal manera que el ngulo de visin ser de 10. El espacio de color CIE-LAB es un
espacio cromtico con coordenadas cilndricas de claridad (L*), croma o saturacin (C*) y
tonalidad (H*) adems de las coordenadas rectangulares adimensionales L*, a* y b*.

Figura 1.1 Espacio de color CIE-LAB

La coordenada L* recibe el nombre de luminosidad o claridad con valores entre 0 para el

negro y 100 para el blanco. La coordenada a* define la desviacin del punto acromtico
hacia el rojo si a* es positiva, o hacia el verde si a* es negativa. Anlogamente, la
coordenada b* define la desviacin hacia el amarillo si b* es positiva, y hacia el azul si b*
es negativa.

Por otra parte la espectrofotometra de absorbancia es una tcnica analtica que permite
determinar la concentracin de un compuesto en solucin. Cuando un rayo de luz de una
determinada longitud de onda de intensidad I incide perpendicularmente sobre una
o
disolucin de un compuesto qumico que absorbe luz o cromforo, el compuesto absorber
una parte de la radiacin incidente (I ) y dejar pasar el resto (I ), por lo que I = I + I .
a T o a T
. Se emplea un espectrofotmetro, en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la
luz que pasa por una solucin y medir la cantidad de luz absorbida por la misma, ya que la
longitud de onda de la radiacin que una molcula puede absorber depende de su estructura
atmica y de las condiciones del medio. La absorcin que a distintas longitudes de onda
presenta una molcula, representa su espectro de absorcin y constituye una seal de
identidad de la misma, por lo que esta tcnica permite medir la concentracin e identidad de
los pigmentos presentes en un alimento, acorde con la ley de Lambert-Beer que expresa la
relacin entre absorbancia de luz monocromtica (de longitud de onda fija) y la
concentracin de un cromforo en solucin mediante la siguiente ecuacin:

A = log I/Io = cl

Donde:
A = absorbancia del cromforo en solucin
= constante de proporcionalidad o coeficiente de extincin
l = distancia que atraviesa la luz a travs de la solucin del cromforo en cm
c = concentracin en moles

La legislacin mexicana permite el uso de ms de 50 colorantes o pigmentos, siendo la

mayora de origen natural. Estos pigmentos naturales pueden ser de origen vegetal, como la
clorofila, las antocianinas y las betalanas; de origen animal como la cochinilla, o de origen
mineral como el dixido de titanio de color blanco.

1.2 Objetivo

Que el alumno se familiarice con las tcnicas de espectrofotometra de reflectancia y

absorcin UV-Vis para evaluar el color de alimentos y la concentracin de algunos
pigmentos naturales.

1.3 Materiales

Materiales y reactivos

- Frutos: jitomate o pur de tomate, pitaya, betabel

- Extracto de carmn
- Metanol al 80% v/v
- Acetona
- Etanol
- Hexano
- Butilhidroxitolueno
- HCl 2N
- HCl 0.06N
- Gasa

Material de vidrio

- 2 Celdas para espectrofotmtero

- 2 Embudos de vidrio
- 2 Matraces Erlenmeyer de 125 mL
- 2 Pipeta de 10 mL
 - 2 pipeta de 5mL
- 2 tubos de 16 x 150 con tapa de rosca
- 2 tubos de centrifuga de 30-50 mL
- 2 vasos de precipitados de 100 mL
- 4 vasos de precipitados de 250 mL
- Barra magntica
- Cuchillo
- Esptula
- Gradilla para tubos
- Matraz aforado de 1L
- Matraz aforado del 50 mL
- Matraz Erlenmeyer de 250 mL
- Mortero
- Papel aluminio
- Papel Whatman No. 4 y No. 1
- Piceta
- Pinza para tubos
- Pipeta pasteur
- Plstico autoadherible
- Probeta graduada de 100 mL
- Propipeta
- Tabla para picar
- Varilla de vidrio

Equipo

- Parrilla de calentamiento con agitacin

- Centrfuga
- Espectrofotmetro
- Balanza
- Licuadora con vaso de vidrio

1.4 Metodologa

1.4.1 Determinacin color por espectrometra de reflectancia en el sistema CIE-LAB

1. Cortar por la mitad un fruto (betabel, pitaya o tuna), envolver una porcin con
pelcula plstica auto adherente. Reservar la otra porcin para la extraccin de
pigmentos (Seccin 1.4.2).
 2. Calibrar el espectrofotmetro 45/0 Hunter-Lab con las cermicas blanca y negra,
seleccionando una apertura 19.1, mm, ngulo 10 e iluminante D65.
3. Colocar el fruto asignado en la celda del colormetro, realizar la determinacin por
triplicado, girando la cela 90 en cada lectura y obtener los valores promedio de L*,
a*, b*, hue y croma, as como el espectro de reflectancia de 400 a 700nm.

1.4.2 Extraccin y cuantificacin de betalanas

2. Picar finamente la porcin restante del fruto (betabel, pitaya o tuna)
3. Pesar 5 g de pulpa fresca y adicionar 40 mL de metanol al 80 % (v/v)
4. Filtrar a travs de gasa colectando el filtrado en un matraz aforado de 50 mL
(previamente cubierto con papel aluminio) y llevar al aforo con metanol al 80%.
5. Tomar 10 mL y centrifugar a 3000 rpm por 10 min, recuperar el sobrenadante y
filtrar a travs de papel Whatman Nm. 4.
6. Obtener el espectro de absorcin del filtrado en un espectrofotmetro en el intervalo
de 400 a 600nm
7. Determinar el contenido de betacianinas y betaxantinas midiendo la absorbancia a
538 y 483 nm, respectivamente. Emplear como blanco la solucin de metanol al
80%. Realizar las diluciones pertinentes para que el valor de absorbancia sea
inferior a 0.6 unidades.
8. Para la conversin de las unidades de absorbancia en unidades de concentracin
utilizar la siguiente expresin:

Dnde:
B = contenido de betacianinas o betaxantinas
A = absorbancia a 538 nm para betacianinas y 483 nm para betaxantina
Fd = factor de dilucin al momento de leer en el espectrofotmetro
PM = peso molecular (Betanina = 550 g/mol o Indicaxantina = 308 g/mol)
V = volumen del extracto
e = coeficiente de extincin molar (60,000L/mol.cm para betaninas, 4,8000L/mol.cm para
betaxantinas)
L = longitud de la celda (1 cm)
P = peso de muestra (g)

1.4.3 Extraccin y cuantificacin de licopeno

1. Picar 150g de jitomates frescos, retirar las semillas y homogenizar en una licuadora.
Opcionalmente se puede emplear como material pur de tomate, ctsup o pasta de
tomate.
2. Forrar un matraz Erlenmeyer de 125 mL con papel aluminio y adicionar 5 mL de
Butilhidroxitolueno (BHT) 0.05 % (w/v) en acetona, 7.5 mL de etanol y 15 mL de
hexano.
3. Depositar 15g del homogenizado de jitomate o del pur, tapar y agitar durante 15
minutos. Adicionar 6 mL de agua destilada, mezclar suavemente y dejar reposar 3
minutos para permitir la separacin de las fases.
4. Con ayuda de una pipeta Pasteur colectar la capa superior de hexano que contiene los
compuestos liposolubles (anaranjado), depositar en un tubo de vidrio previamente
recubierto con papel aluminio y mantener tapado.
5. Obtener el espectro de absorcin en un espectrofotmetro UV/Vis en el intervalo de
300 a 600nm a intervalos de 10 nm, utilizando hexano como blanco. Realizar las
diluciones pertinentes para que el valor de absorbancia sea inferior a 0.6 unidades
6. Determinar el contenido de licopeno midiendo la absorbancia a 503 nm con la
siguiente ecuacin:

A = absorbancia leda a 503 nm

V = volumen total la fase superior (15 mL)
PM = peso molecular del licopeno (536.9 g/mol)
P = peso de muestra que se puso para hacer la extraccin (15g)
= coeficiente de extincin molar del licopeno en hexano ( M/1 cm) del licopeno
(17.2 x 104 M/cm)
L = longitud de la celda (1 cm)

1.4.4 Determinacin de cido carmnico

1. En un matraz Erlenmeyer de 250 mL pesar la cantidad de muestra acorde con el tipo

de extracto a analizar:

Peso de muestra (g) Producto

0.1000 Carmn 52%
0.1000 Carmn hidrosoluble al 52%
1.0000 Extracto 12-22%
2. Adicionar 100 ml de agua y 30 mL de HCl 2N, llevar a ebullicin hasta total
disolucin agitando con ayuda de una barra magntica
3. Enfriar a temperatura ambiente
4. Transferir a un matraz aforado de 1L y aforar hasta la marca con agua destilada.
5. Evaluar en color de esta solucin en espectrofotmetro 45/0 Hunter-Lab y obtener el
espectro de absorcin en un espectrofotmetro UV/Vis en el intervalo de 300 a
600nm usando HCL 0.06N como blanco.
6. Calcular la concentracin de cido carmnico a partir de la lectura de absorbancia a
494 nm. Si es necesario diluir la muestra para obtener una lectura entre 0.650 y 0.830
unidades de absorbancia.

% cido Carmnico = (10000 x A494) / (1.39 x muestra)

1.5 Informe

a. Numero de equipo y nombre completo de integrantes

b. Introduccin (mximo 300 palabras)
c. Objetivo
d. Diagrama de flujo
e. Resultados:
- Barrido espectral de 400 a 600 nm y concentracin de cada uno de los
pigmentos, indicando los mximos de absorcin.
- Espectro de reflectancia y valores de color L*, a*, b*, hue y croma del fruto
analizado
- Compare los valores obtenidos con los reportados en la bibliografa y entre los
diferentes extractos.
f. Discusin
g. Conclusin
h. Bibliografa

2.6 Cuestionario
1. Describa la estructura qumica y el proceso de obtencin industrial de los pigmentos
extrados en esta prctica.
2. Investigue las posibles aplicaciones de stos pigmentos como aditivos en alimentos,
as como el cdigo de clasificacin en las normas mexicanas y en la Unin Europea.
3. Que informacin se obtiene a partir de los espectros de absorcin y reflectancia.
4. Cul es la diferencia entre el espacio de color Hunter-Lab, Cie-Lab y Musel
 5. Qu iluminantes y observadores se pueden emplear en la determinacin del color y
cul es el criterio de seleccin.

2.6 Bibliografa

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