CAPTULO VIII ESTERILIZAO

Diogo B. Andreis
Jos A. M. de Campos

1. INTRODUO

Em processos fermentativos necessrio trabalhar com culturas puras,

ou seja, sem contaminantes para se ter uma operao eficaz, do ponto de vista
econmico e bioqumico. Os problemas causados pela contaminao sero
discutidos posteriormente. O fermentador, meio de cultura e os equipamentos
utilizados no processo, devem ser esterilizados para a destruio dos
microrganismos pelos mtodos apresentados neste captulo.

2. CONCEITOS

A palavra esterilizao em sua concepo maior o processo que

promove a eliminao de todas as formas de microrganismos presentes para
um nvel aceitvel de segurana. Antes de discutirmos a esterilizao dos
equipamentos e solues necessrio conceituarmos e explicarmos.

2.1. Esterilizao: processo que consiste na destruio completa dos

microrganismos. Pode ser definida como a inativao e/ou destruio total dos
microrganismos quanto a sua capacidade reprodutiva. Mas no significa,
necessariamente, a destruio de todas suas enzimas, seus produtos
metablicos e toxinas.

2.2. Desinfeco: o termo denota um processo que reduz o nmero de

microrganismos a um nvel razovel de segurana. Geralmente aplicado ao uso
de agentes qumicos. No implica, necessariamente, na eliminao de todos os
microrganismos viveis. H uma grande variao no resultado da desinfeco,
desde a esterilizao at a reduo mnima do nmero de microrganismos
viveis. Os diversos fatores que atuam so: natureza e nmero dos
1
microrganismos presentes, presena de esporos bacterianos, concentrao
dos desinfetantes, durao de aplicao, quantidade de matria orgnica
presente, tipo de material e temperatura de aplicao.

2.3. Pasteurizao: termo comumente utilizado na produo de alimentos.

Processo de destruio de microrganismos patognicos, no possui ao
sobre os esporos. Consiste em submeter as substncias a temperaturas
prximas 100C por um tempo adequado. O aquecimento pode ser feito por
meio de vapor, gua quente, calor seco ou resistncia eltrica. E por final,
resfria-se o produto rapidamente aps o tratamento trmico.

2.3.1. Existem trs tipos de pasteurizao

Pasteurizao Lenta: na qual se utiliza temperaturas menores durante maior

intervalo de tempo. Este tipo melhor para pequenas quantidades de produto,
por exemplo, o leite de cabra. A temperatura utilizada de 65C durante trinta
minutos.

Pasteurizao Rpida: na qual se utiliza altas temperaturas durante curtos

intervalos de tempo. mais utilizada, por exemplo, para leite de saquinho, do
tipo A, B e C. A temperatura utilizada de 75C durantes 15 a 20 segundos, na
literatura, frequentemente encontramos este tipo de pasteurizao com a
denominao HTST (High Temperature and Short Time), alta temperatura e
curto tempo.

Pasteurizao Muito Rpida: na qual as temperaturas utilizadas vo de 130C

a 150C, durante trs a cinco segundos, este tipo mais conhecido, por
exemplo, com o leite UHT (Ultra High Temperature) ou longa vida (Potter &
Hotchkiss, 1995).

2.4. Sanitizao: a diminuio do nmero de microrganismos sobre

superfcies, equipamentos e utenslios at nveis considerveis de acordo com
as exigncias de sade pblica.
2
2.5. Assepsia: a destruio de microrganismos patognicos ou inibio de
seu crescimento ou atividade por ao de substncias qumicas, sobre tecidos
vivos.

2.6. Tindalizao: processo que visa a esterilizao realizado pela exposio

do material ao vapor fluente por 30 minutos para destruio das clulas
vegetativas e posterior incubao para germinao de esporos. Este processo
repetido por trs ou quatro vezes, at que todos os esporos tenham
germinado e as clulas vegetativas resultantes estejam destrudas pelo calor.
Possui uma srie de limitaes como tipo de material que pode ser submetido
ao tratamento e baixo ndice de segurana de esterilizao.

3. MTODOS DE ESTERILIZAO

Mtodos Fsicos:

Calor (seco e mido);

Filtrao;
Radiao (ionizante e no ionizante);

Mtodos Qumicos (lquidos e gasosos):

lcoois;
Compostos fenlicos;
Halognios;
xido de etileno;
Oznio;
Perxido de hidrognio;
ETO (xido de Etileno).

3
Mtodos Fsico-qumicos:

Vapor a baixa temperatura com formaldedo (VBTF);

Plasma de perxido de hidrognio;

A escolha do mtodo de esterilizao a ser utilizado depender das

caractersticas dos produtos a serem esterilizados. Sempre que usarmos
radiao ou agentes qumicos o tempo de contato fundamental para termos
uma esterilizao adequada. Quando for empregado o mtodo de calor, o
tempo e a temperatura devem ser controlados para assegurar a esterilizao. A
ao da temperatura de aquecimento sobre o tempo necessrio para destruir
esporos de bactrias, submetidos ao calor mido, demonstrado na TABELA
10.

TABELA 10. Efeito da temperatura sobre o tempo necessrio para destruir

esporos bacterianos de fermentao simples em meio de concentrao inicial
de 1,6 X 105 esporos/mL (Farmacopia Brasileira, 2010).

TEMPERATURA TEMPO TEMPERATURA TEMPO

(C) (min) (C) (min)
100 1200 120 19
105 600 125 7
110 190 130 3
115 70 135 1

3.1. Mtodos Fsicos

Na esterilizao por mtodo fsico se utiliza o calor como agente

esterilizante. Segundo a Farmacopeia Brasileira (2010), este processo
considerado o mais simples, econmico e seguro de que se dispe. O
documento destaca, no entanto, que a sensibilidade dos diferentes
4
microrganismos ao do calor variada, sendo a eficincia de inativao
dependente da temperatura, tempo de exposio e presena de gua
(ANVISA, 2010). O mecanismo de esterilizao resulta da destruio da
estrutura das cadeias proteicas do microrganismo requer energia e a presena
de gua possibilita o emprego de menores tempos de exposio e
temperaturas.

3.1.1. Calor Seco

O mtodo da esterilizao por calor seco ocorre devido a processos

oxidativos, e, portanto, necessitam de altas temperaturas e longo tempo de
exposio. realizado em estufas com distribuio homognea do calor. Sua
eficcia depende da difuso do calor, da quantidade de calor disponvel e dos
nveis de perdas de calor. Existem dois tipos de estufas que operam com este
tipo de mtodo: a estufa de conveco por gravidade e a estufa de conveco
mecnica (circulao de ar forado). O mtodo tem como desvantagens a
necessidade de altas temperaturas e longo tempo de exposio (TABELA 10a),
alm da dificuldade de validao, que pode acelerar o processo de degradao
do instrumental. Deve-se utilizar o mtodo por calor seco quando os materiais a
serem esterilizados no suportarem a ao do vapor dos esterilizadores a
vapor.

TABELA 10a - Relao de valores de temperatura e tempo de exposio

necessrio para esterilizao por calor seco (ANVISA, 2010).

Temperatura (C) Tempo de exposio

170 1h
160 2h
150 2,5h
140 3h
121 12h

5
3.1.2. Calor mido

considerado o mtodo mais econmico, rpido e sem efeitos

adversos, por no deixar resduos do agente esterilizante. O processo
empregado vapor saturado denominado autoclave. O princpio bsico de
operao a substituio do ar da cmara por vapor saturado. Tem a
vantagem de produzir uma elevao da temperatura em forma rpida em
curtos tempos de esterilizao e de no deixar resduos txicos no material.

Para a esterilizao por calor mido existe um nmero de combinaes

aceitveis de tempo e temperatura reconhecidas por algumas farmacopias.
Exemplos de temperaturas e tempos mnimos estabelecidos para alcanar
nveis adequados de letalidade em processos de esterilizao so
demonstrados na Tabela 11. Todas as combinaes listadas esto baseadas o
conceito de sobre esterilizao com um fator de segurana que se tem
estabelecido para vapor saturado ou gua em contato com o microrganismo.

TABELA 11 - Relao de valores de temperatura e tempo de exposio

necessrio para esterilizao por vapor saturado (ANVISA, 2010).

Temperatura (C) Tempo de exposio

121 15min
126 10min
134 3min

Se uma substncia pura existe como vapor temperatura de saturao,

ela chamada vapor saturado. Quando o vapor est a uma temperatura
superior temperatura de saturao, chamado vapor superaquecido. A
presso e temperatura do vapor superaquecido so propriedades, pois a
temperatura pode aumentar, enquanto a presso permanece constante. As
especificaes para temperatura e presso do vapor saturado para uso na
esterilizao por calor mido so baseadas na normativa publicada em 1997 e
suas atualizaes recentes pela IAPWS-IF97 (The International Association for
the Properties of Water and Steam). Substncia pura aquela que tem

6
composio qumica invarivel e homognea. Para uma substncia pura h
uma relao definida entre a presso de saturao e a temperatura de
saturao. O termo temperatura de saturao designa a temperatura na qual
se d a vaporizao a uma dada presso, e esta presso chamada
depresso de saturao para a dada temperatura.

Na Figura 41, apresenta uma representao esquemtica da superfcie

termodinmica. Tradicionalmente so realizadas projees nos planos presso
volume especifico (p-v), temperatura volume especfico (T-v) e presso
temperatura (p-T) da curva de saturao.

FIGURA 41 - Representao esquemtica da superfcie termodinmica e

projees nos planos (ANGELO E. e SIMES M.J.R., 2011).

A Figura 42 apresenta o valor da presso de saturao funo

exclusiva da temperatura.

7
FIGURA 42 - Relao presso x temperatura (ANGELO E. e SIMES M.J.R.,
2011).

As equaes que descrevem as propriedades termodinmicas da gua e

vapor se baseiam na formulao de 1997. Esta formulao recomendada
para uso industrial, e chamado de Formulao industrial de 1997 para as
propriedades termodinmicas da gua e de vapor (IAPWS-IF97-International
Associationforthe PropertiesofWater and Steam). O modelo dividido em cinco
regies representadas em um grfico que apresenta as faixas de aplicao
para diferentes estados. Para as cinco regies do grfico os autores da
IAPWS-IF97 desenvolveram equaes fundamentais de alta preciso. Todas
as propriedades termodinmicas podem ser calculadas a partir dessas
equaes fundamentais utilizando as relaes termodinmicas apropriadas.

Utilizando a relao P x T a temperatura terica (TP) calculada a partir

da presso medida (Pm) no interior da cmara (figura 2). Se (TP) comparada
com as temperaturas dentro da cmara do esterilizador (Tm), trs situaes
podem ocorrer:

Tm = TP: vapor saturado 100 % est presente na cmara esterilizadora

Tm < TP: O vapor supersaturado

Tm > TP: O vapor superaquecido

8
 O vapor superaquecido se comporta como um gs seco e tem uma
eficcia microbicida baixa comparado com o vapor saturado. O vapor
superaquecido pode se formar como consequncia de uma reduo de
presso e/ou uma compresso termodinmica de vapor saturado.

A temperatura terica calculada a partir da presso medida segundo

as tabelas padro ou ele pode ser calculado a partir da equao a seguir:

TP = 42, 677 6 + [3 892,7 / (lnP- 9,486 54)] - 273,27

Onde:

TP: a temperatura terica de vapor de gua em graus Celsius;

P: a presso medida em megapascais.

1P = 0,0000099 atm

3.1.3. Destruio trmica de microrganismos

Tomando-se por base o fato de que a temperatura ideal para o

desenvolvimento e crescimento de organismos vivos vai de -5 C a 80 C,
podemos concluir que a exposio a temperaturas alm desta faixa resultar,
provavelmente, na morte destes organismos, com exceo dos esporos
resistentes ao calor. Acredita-se que o limite superior desta faixa de
temperatura seja determinado pela instabilidade dos constituintes qumicos da
matria viva, mais precisamente as protenas e os cidos nuclicos, sendo
estas substncias rapidamente destrudas, ou desnaturadas, a temperaturas na
faixa de 50 C a 90 C.

O mecanismo responsvel pela morte dos microrganismos quando

sujeitos ao calor ainda no claramente entendido. A teoria tradicional prega
que a morte de bactrias a temperaturas elevadas esteja intimamente
relacionada a alteraes em protenas, gerando alteraes protoplasmticas
irreversveis no interior da clula da bactria. Alguns pesquisadores afirmam
que a morte est associada inativao por calor de algumas enzimas ou
9
sistemas enzima-protena na clula. Os outros mecanismos que atuam quando
a bactria destruda a altas temperaturas tiveram avano graas aos
trabalhos de Chick (1906). As medies quantitativas originais de Chick
contriburam enormemente para a evoluo de uma ferramenta muito til
conhecida como ordem logartmica da morte de bactrias

Estudos mais recentes nos levam a crer que o modo de ao do calor

sobre a bactria bastante semelhante coagulao de protenas pelo calor.
Suportando este ponto de vista, Amaha e Sakagushi concluram que a causa
da morte dos esporos bacterianos submetidos ao calor mido possa ser
atribuda desnaturao de uma molcula proteica essencial clula do
esporo. Deste modo, bastante razovel concluirmos que o efeito da umidade
sobre a temperatura de coagulao da protena precisa guardar alguma
relao com a temperatura na qual a bactria destruda. Este ponto de vista
foi investigado por Lewith, que detectou o fato das protenas serem coaguladas
pelo calor a temperaturas mais baixas quando estas contm uma quantidade
maior de gua . Alm disso, quando o vapor encontra-se presente, as bactrias
so destrudas sob temperaturas bem menos elevadas e em perodos bem
mais curtos, diferentemente de quando h ausncia de vapor. Este fenmeno
pode ser explicado se levarmos em conta que todas as reaes qumicas,
incluindo aqui a coagulao de protenas, so catalisadas pela presena de
gua.

Se a frequncia de citaes na literatura for um critrio, justo dizermos

que hoje amplamente aceito o conceito de que a morte bacteriana por calor
mido causada pela desnaturao e coagulao de uma rea proteica crtica
no interior da estrutura gentica da clula conforme a figura 43.

10
FIGURA 43: a) Bacillus colon tpico, em lquido para cultura aps 1 hora,
ampliado 28.000X. Verifica-se a uniformidade aparente do protoplasma celular.
b) Bacillus colon aps aquecimento em cultura salina por 10 min a 50 C,
ampliado 16.000 X. Verifica-se a granulao do protoplasma de forma
irreversvel (Perkins, John J., Principles and Methods of sterilization in Health
Sciences, p. 64).

3.1.4. Desnaturao

As protenas das clulas bacterianas, muitas das quais enzimticas,

existem em um estado coloidal perfeitamente disperso. Quando submetidas a
agentes antimicrobianos tais como: calor mido, lcoois ou fenis, a protena
coagula, se precipita, tornando-se antifuncional, como no caso do enrijecimento
da clara de ovo. Esta transformao envolve uma importante reao
caracterstica de protenas, conhecida como desnaturao e implica em
mudanas nas propriedades fsicas ou qumicas da protena, como a
solubilidade, incluindo ainda algumas alteraes na estrutura molecular da
mesma. Se a exposio ao calor no for prolongada, a desnaturao pode ser
revertida, retornando-se s condies nas quais a protena estava estvel.
Desta forma, isto significa que preciso distinguir-se entre a desnaturao
reversvel ou irreversvel de protenas.

11
 Alm do calor, outros agentes capazes de promover a desnaturao das
protenas so: radiao, ultrassom, congelamento, presso e uma variedade de
agentes qumicos (cidos, alcaloides, lcoois, ureia e detergentes). As reaes
envolvidas no processo de desnaturao so complexas e ainda pouco
entendidas.
A importncia da desnaturao de protenas para a esterilizao a
ao letal do calor sobre os esporos bacterianos a qual foi primeiramente
registrada por Chick e Martin, que caracterizaram a desnaturao protica
como uma reao mononuclear com gua.

3.1.5. Ordem de Mortalidade

Quando uma populao de microrganismos exposta a determinada

influncia esterilizante, a taxa ou velocidade na qual os organismos individuais
morrem diretamente proporcional concentrao ou ao nmero por unidade
de volume em um dado tempo. Geralmente, a ordem de mortalidade, como
pode ser determinada experimentalmente, segue um curso uniforme e
consistente e descrita comumente como sendo logartmica. Isto significa que
quando uma populao microbiana est em contato com um meio esterilizante,
o nmero de clulas vivas decresce gradualmente, de maneira tal que o
logaritmo do nmero de clulas sobreviventes em um dado momento, quando
plotado em relao ao tempo, decresce em uma linha reta como pode ser
verificado na Figura 44. Apesar de haver evidncias que suportem ordens de
mortalidade no logartmicas, os dados coletados desde as medies iniciais
de Chick, at a presente data, mostram que a morte de clulas vegetativas,
bem como de esporos essencialmente logartmica.

12
FIGURA 44: Curva de sobrevivncia. O nmero de sobreviventes plotado em
relao ao tempo de exposio temperatura constante. O valor D = 0,666 min
(PERKINS, 2008).

O conhecimento da ordem logartmica importantssimo, pois permite

ao microbiologista computar a taxa de mortalidade constante, designada por K.
Este termo expressa, atravs de um simples nmero, a Taxa de Mortalidade,
que apresenta uma relao direta com a eficincia do processo de
esterilizao. A constncia da taxa de mortalidade significa que o nmero de
bactrias que so mortas a cada minuto ou unidade de tempo um percentual
constante do nmero de bactrias vivas no incio de cada novo minuto.
comum expressarmos K atravs da equao 1:

1
= (1)

Onde, t = tempo em minutos ou tempo de exposio, N0 = Nmero inicial de

organismos no incio do intervalo de tempo e Nt = Nmero de organismos
sobreviventes no final do intervalo de tempo.
13
 A determinao da taxa de mortalidade possibilita a comparao da
resistncia ao calor de diferentes organismos mesma temperatura, ou a
resistncia de um organismo em particular a diferentes temperaturas. Alm
disso, possibilita descrever o efeito quantitativo de fatores, como o pH, sobre a
esterilizao. importante perceber que a caracterstica logartmica da ordem
de mortalidade implica na morte do mesmo percentual de bactrias vivas a
cada minuto. Teoricamente isto significa que a esterilizao completa nunca
obtida. A tabela 13 ilustra o caso terico baseado na premissa de que quando
uma suspenso de 1 milho de bactrias por mililitro submetida a uma
influncia esterilizante, 90% dos organismos so mortos a cada minuto de
exposio.

Minuto Bactrias vivas Bactrias Bactrias Logaritmo de

no incio do Mortas em 1 sobreviventes sobreviventes
primeiro minuto minuto ao final de 1
minuto

1 1.000.000 90%= 900.000 100.000 5

2 100.000 = 90.000 10.000 4
3 10.000 = 900 1.000 3
4 1.000 = 90 100 2
5 100 =9 10 1
6 10 = 0,9 1 0
7 1 = 0,09 0.1 -1
8 0,1 = 0,009 0.01 -2
9 0,01 = 0,0009 0.001 -3
10 0,001 = 0,00009 0.0001 -4
11 0,0001 = 0,000009 0.00001 -5
12 0,0001 = 0,0000009 0.000001 -6

TABELA 13: Exemplo terico da ordem de mortalidade de uma populao

bacteriana (PERKINS, 2008).

Na coluna de sobreviventes, nos casos de 0,1 ou 0,01 bactria/ ml, nos

d a informao de que apenas 1 bactria permanece viva em 10 ml ou em
14
100 ml da suspenso. Ao final de 12 minutos de exposio, teoricamente,
apenas 1 bactria ainda permaneceria viva em 1.000.000 de ml, equivalente a
1000 L da suspenso.

Como uma medida prtica, o exemplo acima mostra a necessidade de

um perodo proporcionalmente maior de tempo de exposio para a
esterilizao de um lquido contendo uma alta concentrao de bactrias, do
que um lquido contendo alguns poucos organismos. Esta condio
verdadeira para a esterilizao por calor, desinfeco qumica ou
pasteurizao. A aplicao deste princpio muitas vezes ultrapassada no
estabelecimento do perodo de exposio mnimo para a esterilizao de
materiais e produtos.

Por exemplo, da figura anterior, N0 = 1milho, ou 106 organismos, t = 2 minutos

e Nt = 1.000 ou 103 organismos. Desta forma na equao 2 temos:

1 63
= (106 103 ) = = 1,50 (2)
2 2

Vrias tentativas de explicao da caracterstica logartmica da ordem de

mortalidade tm sido feitas. Uma das mais plausveis a proposta por Rahn,
onde o processo de morte remonta uma reao unimolecular ou bimolecular de
primeira ordem. Com isso em mente, a caracterstica logartmica da ordem de
mortalidade matematicamente possvel apenas quando a morte devida a
destruio (desnaturao) de uma simples molcula da clula. A ordem
logartmica inteiramente impossvel se mais do que uma molcula precisar
ser inativada para gerar a morte da clula.

A taxa de mortalidade tambm pode ser expressa atravs do valor D ou

Tempo de Reduo Decimal. Este princpio, introduzido por Katzin baseado
na aplicao da reao unimolecular constante morte microbiana sob
condies uniformes. Por definio, o valor D o tempo necessrio, a uma
dada temperatura, para destruir 90% dos microrganismos. Da figura anterior,

15
podemos perceber tambm que o valor D representa o tempo necessrio para
que a curva de sobrevivncia atravesse um ciclo de log.

Quando a taxa de mortalidade exponencial, o valor D torna-se o

recproco da taxa de mortalidade constante, K, e ambos D e K representam a
inclinao da curva de sobreviventes. importante expressarmos a relao
entre estes termos como:

2.303
= (3)

Uma vez que o valor D pode ser determinado para qualquer

temperatura, um subescrito normalmente utilizado para designar a
temperatura empregada, como D 250 ou D 150.

O Tempo de Reduo Decimal (D) muito importante para a indstria

de processamento de alimentos, especialmente na avaliao dos mtodos para
a preservao de alimentos pelo processamento trmico e em estudos de
pesquisa sobre a microbiologia de alimentos enlatados.

3.1.6. Ponto de Destruio Trmica e Tempo de Destruio Trmica

H alguns anos, dentre os bacteriologistas, surgiu o conceito de que se

uma suspenso com bactrias fosse gradualmente aquecida, seria alcanado
um ponto na escala crescente de temperatura no qual todas as clulas na
suspenso seriam mortas instantaneamente. Este conceito deu origem ao
termo Ponto de Destruio Trmica, sendo este definido como a menor
temperatura na qual uma soluo aquosa de bactrias morta em 10 min. Este
foi o primeiro padro de comparao de tolerncia ao calor entre organismos
de diferentes espcies. O uso deste termo tem sido bastante criticado, tendo
em vista o fato de implicar em uma falta de entendimento, pois nos leva a
acreditar na existncia de uma determinada temperatura que, uma vez
alcanada, causaria a morte instantnea de todas as bactrias, sem levar-se

16
em conta o perodo de exposio, o nmero de organismos, o ambiente a redor
dos organismos e seu estado fisiolgico.

Em vista da evidncia de que a morte de microrganismos sob a

influncia de o calor ser um processo ordenado, uma vez que a coagulao da
protena celular um processo irreversvel, precisamos admitir que no existe
uma temperatura na qual todas as clulas em suspenso seriam mortas
instantaneamente.

O processo ocorre como uma funo do tempo dentro de uma

determinada faixa de temperatura. Se a temperatura aumentada, o tempo
pode ser reduzido, ou se a temperatura for reduzida, o tempo precisa ser
prolongado. Em outras palavras, a morte de microrganismos pelo calor uma
funo dependente da relao tempo-temperatura empregada. Por estas
razes, a expresso Ponto de mortalidade trmica tem dado caminho a uma
medio de cunho mais prtica conhecida como Tempo de Morte Trmica.
Este tempo se refere determinao do menor perodo de tempo necessrio
para matar toda uma populao conhecida de microrganismos em uma
suspenso a uma dada temperatura.

A natureza do meio nos quais os organismos esto suspensos tem uma

importante ligao com o Tempo de Destruio Trmica. Substncias txicas,
se presentes, tornam-se crescentemente germicidas com leves aumentos de
temperatura. Alm disso, os produtos do metabolismo mostram toxidade
aumentada em altas temperaturas. Um pH cido ou alcalino diminui o Tempo
de Mortalidade Trmica, bem como a presena de leos e gorduras retardam a
penetrao de calor aumentando o tempo.

3.1.7. Curva do Tempo de Destruio Trmica

Em ltima anlise, a curva do Tempo de Morte Trmica mostra a resistncia

relativa dos organismos a diferentes temperaturas letais. Esta curva pode ser
construda atravs da plotagem dos Tempos de Destruio Trmica,

17
determinados experimentalmente, sobre uma escala logartmica e as
temperaturas correspondentes em uma escala linear. Tal curva mostrada na
figura 45.

FIGURA 45: Curva de TMT com tempos de destruio e sobrevivncia

plotados em relao temperatura do calor mido. Z = 20F (11,2C) (Perkins,
John J., Principles and Methods of sterilization in Health Sciences, p.72).

importante percebermos que qualquer valor de Tempo de Morte

Trmica no apresenta sentido, a menos que o nmero de organismos
originais seja conhecido, tendo em vista o fato de diferentes populaes
resultarem em diferentes curvas.

A inclinao da curva na figura 45, simbolizada por Z, definida como o

nmero de graus necessrios para a curva atravessar um ciclo de log. Este
nmero equivalente ao nmero de graus de temperatura que precisam ser
aumentados ou diminudos a uma dada temperatura de referncia para gerar
um decrscimo ou aumento no tempo de destruio. Com uma inspeo mais
detalhada na curva podemos perceber que o valor de Z a medida de como o
Tempo de Morte Trmica varia com a temperatura, seguindo da que, se Z for
um valor elevado, a temperatura influir menos sobre o TMT do que nos casos
onde Z um nmero pequeno. A maioria dos esporos bacterianos resistentes
18
exibe um valor de Z dentro da faixa de 10 a 15 C. Na confeco da curva de
Tempo de Morte Trmica certas condies precisam ser observadas. Estas
condies, como estipuladas por Townsend e Col so:

a) Um Ponto de Sobrevivncia considerado um dado positivo e a curva

precisa estar acima (temperatura mais elevado ou tempo mais prolongado) de
cada um dos pontos de sobrevivncia;

b) Pontos de Destruio so indicativos, mas no positivos devido ao

fenmeno de saltos (sobrevivncia de organismos aps decorrido um tempo
alm do prescrito para a obteno de esterilidade). Em geral, uma curva de
Morte Trmica deve estar abaixo de tantos pontos de destruio quanto
possveis e acima de todos os pontos de sobrevivncia;

c) A inclinao da curva de morte trmica deve ser paralela tendncia geral

dos pontos de sobrevivncia e de destruio.

Estudos do Tempo de Morte Trmica so de suma importncia para os

estudos no campo da bacteriologia aplicada, como por exemplo, na indstria de
enlatados. Deve-se lembrar que os Tempos de Morte Trmica so valores
falsamente considerados constantes e imprecisos.

Todas as informaes a respeito dos Tempos de Morte Trmica

apresentam certo erro associado, cuja magnitude depende dos intervalos de
tempo considerados. O nmero de sobreviventes nunca zero, podendo
tornar-se muito pequeno, da ordem de 1 em 100 ou 1 em 1000 l.

3.1.8. Resistncia de Microrganismos ao Calor

A resistncia de microrganismos a agentes destrutivos externos, tais

como: calor, produtos qumicos e radiaes ionizantes formam a base para
todos os processos de esterilizao e desinfeco. O que precisa ficar claro
que, hoje em dia, nosso conhecimento do porqu e de como certas espcies
so mais resistentes do que outras muito limitado. Esta situao nos leva ao
fato das clulas bacterianas serem compostas por um sistema altamente
19
complexo, responsvel pela habilidade de sobreviver em um ambiente
desfavorvel. De acordo com Wyss, quando o estresse levado ao sistema,
trs possibilidades se revelam: 1) O sistema entra em colapso e o organismo
morre ou deixa de ser vivel para a continuao de sua linhagem; 2) O sistema
desenvolve mecanismos de resistncia; 3) O sistema se altera, acomodando-
se temporria ou permanentemente presena da influncia indesejvel.
(Wyss, O.: Bacterial resistance and dynamics of antibacterial activity. In G. F.
Reddish (Ed): Antiseptics, Desinfectants, Fungicides and Sterilization, 2a ed.
Philadelphia, Lea & F, 1957, p. 210).

3.1.9. Filtrao

Essencialmente um mtodo que no destri, porm remove

microrganismos, quando outras metodologias no podem ser empregadas seja
pela caracterstica dos produtos ou por sua termo estabilidade. A esterilizao
por filtrao ocorre por remoo fsica dos microrganismos presente na soluo
testada, com reteno dos mesmos em membranas filtrantes.

As membranas filtrantes disponveis no mercado podem ser de: acetato

de celulose, nitrato de celulose, fluorcarbonato, polmeros acrlicos, poliesteres,
policarbonato, cloreto de polivinila, vinil, nylon, com porosidade de dimetro de
0,2 micras removem os microrganismos das solues e do ar.

Contudo, a maior parte dos vrus suficientemente pequena para

atravessarem os poros destas membranas filtrantes, pelo que esta tcnica no
assegura a esterilidade total das solues ou gases filtrados.

3.1.10. Radiao Ionizante

20
 A ao antimicrobiana da radiao ionizante se d atravs de alterao
da composio molecular das clulas, modificando seu DNA. As clulas sofrem
perda ou adio de cargas eltricas.

Existem fatores ambientais, fsicos e alguns compostos que influenciam

na resposta celular radiao, aumentando ou diminuindo sua sensibilidade a
esta. H tambm microrganismos que so mais resistentes radiao, como
os esporos bacterianos; as leveduras e fungos tm resistncia considerada
mdia e os Gram negativos tm baixa resistncia radiao.

A esterilizao por radiao ionizante realizada por emisses de alta

energia de ondas eletromagnticas ou de partculas que se chocam com os
tomos do material irradiado, alterando sua carga eltrica por deslocamento de
eltrons transformando os tomos irradiados em ons positivos ou negativos
podendo gerar hidrognio livre, radicais hidroxilas e alguns perxidos,
causando leses intracelulares. As principais fontes de radiao so raios: alfa,
beta, gama e raios X.

Particularmente na indstria farmacutica a esterilizao por radiao

ionizante apresenta vantagens que so consideradas prioritrias como, por
exemplo: os produtos esterilizados j na sua embalagem final, tornando o
processo um dos mais seguros quanto ao aspecto de recontaminao, o alto
poder de penetrao da radiao assegura esterilizao de todo o volume do
produto, seja lquido, slido ou gel, principalmente para produtos que
apresentem cavidades de difcil acesso e uma srie de materiais so
compatveis com este tipo de radiao (termoplsticos, borrachas, metais,
papis, vidros, etc.).

3.2. Mtodos Qumicos

Os mtodos qumicos utilizados para esterilizao podem ser lquidos ou

gasosos e se caracterizam pelas interaes entre compostos qumicos.

21
3.2.1. Qumicos lquidos

Os mtodos qumicos lquidos utilizam glutaraldedo, perxido de

hidrognio, formaldedo ou cido peractico.

Esterilizao por glutaraldedo: O glutaraldedo um biocida utilizado em

processos de desinfeco na concentrao de 2 % (p/v), por um perodo de
tempo de 30 minutos. Seu mecanismo de ao a alquilao de grupos
hidroxila, carboxila e amino dos microrganismos, alterando seu DNA, seu RNA
e sua sntese de protenas. Esse mtodo de esterilizao recomendado para
esterilizaes de materiais sensveis ao calor. um produto extremamente
txico para o operador sendo o seu uso restrito. O glutaraldedo tem potente
ao biocida, sendo bactericida, virucida, fungicida e esporocida. O mecanismo
de ao do glutaraldedo sobre esporos causar reao com a superfcie do
esporo provocando endurecimento das camadas externas e morte.

Esterilizao por formaldedo: Na esterilizao pelo formaldedo o

mecanismo de ao ocorre na alquilaode radicais amino, carboxil, oxidril e
sulfidrilde protenas e cidos nuclicos microbianos, formando pontes
metilnicas ou etilnicas, o que impedem que esses compostos celulares
realizem suas funes no microrganismo. Existem vrios fatores que impede o
seu uso: o efeito carcinognico no homem, ao lenta sobre esporos podendo
levar 18 horas para destruio total das formas esporuladas, perda de atividade
quando os microrganismos esto envoltos com matria orgnica, odor forte e
irritante para olhos e mucosas e presena de resduo txico aps o uso.

Esterilizao por cido peractico: O cido peractico uma mistura entre

gua, cido actico e perxido de hidrognio que atua oxidando a parede
celular dos microrganismos e oxidando elementos do interior dos mesmos,
danificando o sistema enzimtico levando a morte. Possui como vantagem a
ao esporocida mesmo em temperaturas baixas e sua ao no impedida
em presena de matria orgnica.

Esterilizao por perxido de hidrognio: O perxido de hidrognio possui

como registro de sua primeira comercializao no ano de 1800, desde essa
22
poca, sua produo mundial aumenta a cada ano. Sendo utilizado na forma
isolada ou na forma combinada com outras substncias, um dos reagentes
mais empregados nos ltimos tempos. Seu mecanismo de ao sobre os
microrganismos causar desnaturao de protenas e ruptura da
permeabilidade da membrana celular. A ao letal do perxido de hidrognio
depende: do tempo de exposio, da temperatura e da concentrao do
mesmo. Em comparao com glutaraldedo, o perxido de hidrognio
superior. O glutaraldedo possui: dificuldade de validao um agente que
produz carcinogenicidade ao homem, requer alta umidade na rea de
descontaminao, tm baixo poder de ao e necessita de tempo de ciclo de
descontaminao maior que o perxido de hidrognio, alm de possuir poder
de aderncia o que dificulta a sua retirada da rea de trabalho. O perxido de
hidrognio um agente oxidante superior ao cloro, dixido de cloro e
permanganato de potssio. Atravs da catlise, o perxido de hidrognio pode
ser convertido em radical hidroxila (OH), com reatividade inferior apenas ao
flor. Quando a ao desinfetante do perxido de hidrognio comparada com
a ao do glutaraldedo, o perxido o que fornece melhores resultados,
sendo capaz de eliminar maior nmero de esporos de Clostridium
sporogenesem dispositivos mdicos reutilizveis. Os prons so um desafio nos
processos de descontaminao, mas estudos recentes demonstram a eficcia
do vapor de perxido de hidrognio contra os mesmos.

3.2.2. Mtodos Qumicos gasosos

O agente ativo geralmente utilizado no mtodo de esterilizao por gs

o xido de etileno (ETO- Ethylene Oxide). A vantagem do ETO ser uma
sustncia com grande poder de difuso e penetrao, o que permite uma
ampla versatilidade na esterilizao de materiais sensveis ao calor. A
desvantagem do mtodo seu elevado custo e toxicidade, podendo provocar
reaes locais em pele e mucosas, alm de efeitos sistmicos com
manifestaes clnicas como dispnia, cianoses, transtornos gastrointestinais,
hemlises, necroses e fenmenos mutagnicos. Devido aos efeitos adversos
23
considerada uma substncia de grande periculosidade, estando restrita ao uso
de operador habilitado. um processo lento, que requer controle ambiental e
controle residual dos materiais. No h indicadores qumicos que passam
monitorar a concentrao do ETO durante o ciclo de esterilizao.

3.3. Mtodos Fsico-Qumicos

O mtodo fsico-qumico consiste na associao de dois mtodos, que

de modo geral so realizados a baixa temperatura. Podem ser por vapora baixa
temperatura com formaldedo ou por plasma de perxido de hidrognio.

3.3.1. Vapor a baixa temperatura com formaldedo (VBTF) ou gs de vapor

de formaldedo (FO)

uma alternativa esterilizao por ETO para a esterilizao de

equipamentos e materiais que no resistem a altas temperaturas. As vantagens
so sua rapidez, ausncia de resduos txicos e fcil instalao. As
desvantagens so a incompatibilidade com materiais sensveis a umidade e
sua toxicidade, sendo considerado potencialmente cancergeno e mutagnico.

3.3.2. Plasma de perxido de hidrognio

Esse mtodo usa perxido de hidrognio como precursor de plasma. O

plasma, que considerado como um quarto estado da matria, diferente do
lquido, slido e gasoso, composto por ons reativos, eltrons e partculas
atmicas neutras. As vantagens do mtodo so a ausncia de resduos txicos,
fcil instalao, rapidez do processo e compatibilidade com materiais sensveis
a umidade. As desvantagens so o reduzido poder de penetrao, a

24
impossibilidade de esterilizar materiais derivados da celulose, e a necessidade
de emprego de pacotes especiais sem celulose em sua composio.

4. ESTERILIZAO NA INDSTRIA FERMENTATIVA

4.1. Esterilizao do Meio de Cultura

De acordo com um conceito bem amplo, a esterilizao de um meio a

operao que tem por finalidade remover ou destruir todas as formas de vida,
animal ou vegetal, macro ou microscpicas, saprfita ou no, existentes no
meio considerado. O grau de esterilizao dos meios de fermentao varia
conforme o processo a que se destina. Algumas vezes totalmente
dispensvel (fermentao lctica de hortalias e polvilho; tratamento biolgicos
de resduos); realizada de forma incipiente (fermentao alcolica; produo de
leveduras para panificao; fermentao actica do vinagre); realizada com
alto grau de exigncia (produo de antibiticos, enzimas, vitaminas, acetona,
butanol). Em ensaios laboratoriais sempre necessrio (devido ao uso de
culturas puras).

Em plantas industriais o calor mido a principal forma de se efetuar a

esterilizao. Pode ser feita nos prprios recipientes destinados a fermentao
(processo descontnuo) ou em separado (processo contnuo).

4.2. Esterilizao em batelada:

Vrios meios de cultura so esterilizados no fermentador a 121 C (para

destruir esporos), o tempo calculado em funo dos constituintes do mosto
(pH, material em suspenso, etc) e do tamanho do fermentador. Tambm
necessrio esterilizar s vlvulas e eletrodos e outros equipamentos que
entram em contato direto com o fermentador.
25
 Mtodo indireto - injetar vapor no fermentador atravs de camisa ou da
serpentina;

Mtodo direto - injetar vapor direto na soluo nutriente, assim o vapor deve
estar livre de aditivos qumicos.

OBS.: O vapor gerado pela indstria normalmente contm substncias

potencialmente txicas aos microrganismos, derivadas de anticorrosivos
utilizados no processo de gerao de vapor. Com injeo direta de vapor no
meio de cultura o volume deste aumentar, pois uma parte do vapor se
condensa aumentando o volume do lquido dentro do fermentados.

Vantagem:

a) tem a vantagem de esterilizar o fermentador e o meio simultaneamente,

evitando perigos de contaminaes.

Desvantagem:

a) Manuteno de temperaturas altas por perodos longos, favorecendo

possveis alteraes no meio;

b) Consumo elevado de vapor e gua de resfriamento;

c) Problemas de corroso pelo contato do equipamento com o meio aquecido.

d) Elevado tempo ocioso do equipamento;

e) interaes qumicas com nutrientes

4.3. Esterilizao Contnua

As principais desvantagens apresentadas podem ser evitadas pela

esterilizao contnua; melhor controle de temperatura; temperaturas mais
elevadas diminui o tempo da operao; Fornece meio esterilizados para
fermentadores de vrios tamanhos. Uma etapa preliminar obrigatria nos
processos fermentativos contnuos, tambm tem valor nos processos em
batelada, pois diminui o tempo de esterilizao e a rea fsica necessria para
26
o processo, devido a relao exponencial entre taxa de morte e temperatura
tomando bem menor o tempo necessrio para a destruio de todos os
microrganismos quando temperaturas maiores so utilizadas.

Na esterilizao em batelada so necessrios 30 a 60 minutos a 121 C

e na esterilizao contnua normalmente realizada em 30 a 120 segundos a
140 C. O meio de cultura torna-se diludo pois a condensao do vapor
aumenta o volume do lquido, para resolver este problema o meio aquecido
bombeado atravs de uma vlvula de expanso e o condensado removido
por uma bomba de vcuo at que o meio de cultura fique com a mesma
concentrao de antes da esterilizao. Pode se feita pela injeo direta de
vapor ou por meio de trocadores de calor.

Em certos casos a pasteurizao j p suficiente para eliminar grande

parte da comunidade microbiana. uma operao rpida utilizando
temperaturas prximas de 100 C seguida de resfriamento. Para pequenas
quantidades de meio pode-se lanar mo da tindalizao.

FIGURA 46: Esquema de esterilizao contnua em trocadores de calor.

4.4. Destruio de Nutrientes

27
 A esterilizao do meio pelo calor pode acarretar alteraes na sua
composio qumica. A experincia mostra que, quanto mais elevada for a
temperatura necessria para esterilizao de um dado meio, menor ser a
destruio de nutrientes e, consequentemente, melhores sero os resultados
da fermentao posterior. Esta menor destruio de nutrientes uma
consequncia de fato observada experimentalmente de ser a energia de
ativao de destruio trmica dos microrganismos maior do que a de
destruio trmica dos nutrientes. Essa afirmativa de importncia prtica,
tanto na esterilizao de meios de fermentao como na esterilizao de
alimentos.

4.5. Esterilizao do Ar

As fermentaes aerbias, com o microrganismo em suspenso,

constituem os processos fermentativos de maior importncia industrial
atualmente. Em tais fermentaes a quantidade de ar introduzida no sistema
grande e perfeitamente aceitvel, que haja grande preocupao quanto a
esterilizao do ar a ser admitido nos fermentadores. Tais cuidados devem ser
tomados principalmente nas horas iniciais da fermentao.
A maior parte dos processos fermentativos conduzida com agitao
vigorosa, e o ar fornecido ao fermentador deve ser estril. O nmero de
partculas e microrganismos depende da localizao da indstria, do
movimento do ar e do tratamento prvio que o ar foi submetido.

4.5.1. Mtodos de Esterilizao do Ar

Calor seco - normalmente antieconmica ou de difcil realizao.

28
Radiaes - Apenas as radiaes UV poderiam ter aplicao prtica, porm
pouco usada devido ao grande tempo de exposio. Pode ser usada em
pequenas instalaes (laboratrios, pesquisa). Atua mais como desinfetante.
Filtrao - sem dvida o processo mais importante por ser o de maior
aplicao na indstria. Filtros feitos de l de vidro, acetato de celulose, etc.
Os filtros podem ser de dois tipos principais:
Filtros que apresentam poros - reteno mecnica dos microrganismos
(cartuchos de membranas de steres de celulose, nylon);
Filtros de camadas de material fibroso (l-de-vidro) - Atua na combinao de
vrios efeitos fsicos: inrcia, bloqueio, difuso, separao por gravidade e
atrao eletrosttica.

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ANVISA Agncia Nacional de Vigilncia Sanitria. Resoluo da Diretoria

Colegiada RDC 17/2010 : Seo VII - Tecnologia de isoladores.

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29
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