Sunteți pe pagina 1din 13

Curs 2. 9.10.

2017

II. REGLAREA TRANSCRIPIONAL N CURSUL EMBRIOGENEZEI

Una din cele mai mari descoperiri ale ultimilor 20 de ani este aceea c
mecanismele moleculare ale embriogenezei sunt conservate n lumea animal de la
nevertebrate la om. Astfel, gene omoloage realizeaz aceleai funcii la
organisme diferite. De exemplu, la Drosophila exist gena Engrailed, implicat n
formarea sistemului nervos. Gena Engrailed-1 de la oarece este implicat n
formarea cerebelului. Dac gena Engrailed-1 de la oarece nu se exprim,
cerebelul nu se formeaz sau este rudimentar. Dac n embrionii de oarece la
care s-a inactivat gena Engrailed-1 se introduce gena Engrailed de la Drosophila,
se constat c embrionii de oarece prezint un cerebel normal.
Dac se analizeaz din punct de vedere molecular genele omoloage, se
constat c, dei regiunile codificatoare sunt asemntoare, regiunile reglatorii
sunt foarte diferite. De aici, s-a tras concluzia c diferenele ntre specii care
exprim gene omoloage sunt date de secvenele reglatorii de care se pot lega
anumii factori de transcripie.

Factorii de transcriptie (factori transcriptionali)

Reglarea expresiei genice necesit aciunea unor proteine care se leag de


ADN i interacioneaz cu aparatul transcripional.

Factorii de transcripie sunt reprezentai de proteine care, prin


legarea de ADN pot afecta transcrierea unei gene prin activarea sau
blocarea ei. Acest efect poate fi exercitat direct prin legarea de ADN sau
indirect, prin interacia cu alte proteine.

Factorii transcripionali care interacioneaz cu regiunile de control ale


genelor (promotor i enhancer) se mpart n 2 mari categorii:

1. factori transcripionali generali sau bazali


2. factori transcripionali reglatori.

1.Factorii transcripionali generali sau bazali iniiaz transcrierea

genelor int de la nivelul secvenei promotoare TATA, aflat la aproximativ 25


nucleotide n faa situsului START, de iniiere a transcrierii. Acetia sunt

1
necesari pentru transcrierea majoritii genelor i din acest motiv sunt prezeni
n toate tipurile celulare.

2.Factorii transcripionali reglatori se leag de ADN la distan de


situsul de iniiere a transcrierii, au rolul de a modula activitatea transcripional
i sunt specifici unui tip celular.

Analizele moleculare ale acestor factori transcripionali au demonstrat


existena unor motive structurale implicate n fixarea sau legarea de ADN. Pe
baza acestor motive sau domenii, factorii transcripionali reglatori au fost
mprii n superclase, clase i familii.

n afara motivului de legare de ADN n cadrul unei familii sau clase,


factorii transcripionali conin i alte domenii.
-domeniu de activare transcripional ,
-domeniu de blocare transcripional,
-domeniu de legare a unui ligand,
-domeniu de dimerizare,
-domeniu de interacie cu alte proteine,
-domeniu de rspuns la un semnal intracelular.

CLASIFICAREA FACTORILOR DE TRANSCRIPTIE

I. Superclasa factorilor transcripionali cu motive zinc-finger


1. Clasa C2H2 (Cys2His2)

a) Familia factorilor ubiqitari: TF III A


b) Familia reglatorilor embrionari/celulari: - KRPPEL
- HUNCHBACK
c) Familia ZIC

2. Clasa Cys4 (C4) = receptori nucleari

a) Familia receptorilor pentru hormoni steroizi:GR (Receptor pentru


Glucocorticoizi)

b) PR (Receptor pt Progesteron),

c) AR (Receptor pentru Androgen),

2
d) ER (Receptor pentru Estrogen)

e) RAR

f) RXR

g) T3R (Receptor pentru hh tiroidianT3)

f) VDR (Receptor pentru vit D)

3. Diveri factori cu motive zinc finger tip Cys4

a) Familia GATA

4. LIM

Clasa C2H2

n motivele zinc-finger al proteinelor din aceast clas, Zn joac un rol


structural, pentru c el stabilizeaz aceste domenii scurte prin interacii ionice
ntre 2 Cys dintr-o structur -pliat i 2 Hys dintr-un -helix. Conformaia
acestei structuri a sugerat un deget, de aici denumirea de zinc-finger.
Datorit faptului c motivele zinc-finger interacioneaz cu 3-5 pb i
formeaz contacte scurte, ele se gsesc dispuse n tandem i sunt mai multe n
cadrul unei proteine. Interacia ntre motivele zinc-finger i ac nucleici implic
doar aminoacizii din -helixurile fiecrui motiv, structurile -pliate nefiind
implicate n acest proces.

TF III A

(denumirea vine de la Transcription Factor, care interacioneaz cu ARN


polimeraza IIIA)

A fost descoperit n ovocitele de amfibian i el recunoate o secven


specific din promotorul genei pentru ARNr 5S. TF III A poate interaciona i
cu produsul genei, adic cu ARNr 5S pentru a forma particule ribonucleoproteice
de 7S, formate dintr-o molecul de ARNr 5S i una de TF III A.
TF III A este o protein de 39 kD, care prezint 9 motive zinc-finger.
Cele 3 motive zinc-finger de la fiecare capt al moleculei se nfoar n jurul
foselor majore ale ADN, n timp ce cele 3 molecule zinc-finger centrale sunt
aezate pe o singur fa a acidului nucleic.

3
Factorul transcripional KRPPEL

Este implicat n dezvoltarea embrionar la Drosophila. El conine 5 motive


zinc-finger, are capacitatea de a se lega de promotorul propriei gene i poate
realiza un autoreglaj la nivel transcripional, dar el se poate lega i de alte gene,
pe care fie le activeaz, fie le blocheaz.

Factorul transcripional HUNCHBACK

Este implicat tot n dezvoltarea embrionar la Drosophila.

Spre deosebire de alte proteine zinc-finger, el prezint 2 domenii


distincte: unul cu 4 i altul cu 2 motive zinc-finger. Aceste 2 domenii distincte
permite factorului transcripional s fie implicat n 2 procese embrionare: pe de
o parte este implicat n formarea capului embrionului, iar pe de alt parte
blocheaz genele din complexul Bithorax.

n ultimii ani s-au descoperit o serie de domenii suplimentare n proteinele


zinc-finger: - domeniul KRAB (=Kruppel Associated Box)

- domeniul SCAN.

Domeniul KRAB se gsete ntotdeauna spre extremitatea aminoterminal


a proteinelor zinc-finger de la vertebrate, care au ntre 5 i 30 de motive zinc-
finger. Aceste domenii funcioneaz ca represori transcripionali, atunci cnd
proteinele se leag de ADN, ele induc formarea unei stri tip heterocromati na.
Domeniul SCAN este prezent tot numai n proteinele zinc-finger de la
vertebrate, nu au funcie transcripional, acest domeniu fiind implicat n
dimerizarea proteinelor zinc-finger.

Familia ZIC (Zinc-finger In Cerebel)

Sunt 5 gene ZIC, notate cu cifre (ZIC 1,, ZIC 5). Proteinele ZIC conin 5
motive zinc-finger dispuse central, flancate de o regiune de activare
transcripional i o regiune carboxiterminal.

4
La om, mutaiile genelor ZIC-1 i ZIC-4 determin sindromul Dandy-
Walker, care se caracterizeaz prin dilatarea ventriculului 4 i atrofia
cerebelului. Aceast mutaie este asociat cu retard mintal. n unele ri
aceast mutaie este destul de frecvent, ea apare 1:5000 nateri.

Clasa C4 (receptori nucleari)

Aceast clas cuprinde peste 150 de proteine diferite. Majoritatea


acestora, dar nu toate, interacioneaz direct cu moleculele ligand care, datorit
caracterului lipofilic pot ptrunde prin membrana plasmatic.
Spre deosebire de receptorii transmembranari, receptorii nucleari sunt
intracelulari i influeneaz direct exprimarea genelor. Au fost descrise 3 ci
prin care liganzii sunt livrai receptorilor nucleari:

1) Ligandul (hormonii steroizi i tiroidieni) este produs n afara celulei int


printr-un mecanism endocrin. Acesta ajunge pe cale sangvin la celula int, unde
este importat prin traversarea membranei plasmatice.

2) Ligandul (acizi retinoici) este produs n celula int dintr-un apohormon


importat din snge. De exemplu, retinolul sangvin este convertit intracelular de
ctre izomeraze n retinoizi bioactivi trans i 9-cis. Acetia sunt recoltai de 2
proteine chaperon care ii transloc n nucleu pentru a interaciona cu receptorii
RAR (=Retinoic Acid Receptor), de care se leag toi acizii retinoici trans i 9-cis
i de receptorii RXR (=Retinoid X Receptor), de care se leag doar acizii retinoici
9-cis.

3) Ligandul (unele prostaglandine) este sintetizat n celula int.

n concluzie, indiferent cum ligandul ajunge n celula int, el trebuie


translocat n nucleu, unde interacioneaz cu receptorii nucleari.
Receptorii nucleari prezint o structur format din mai multe regiuni:

1) o regiune variabil, ca lungime, notat AB, n care se gsete un domeniu


de activare transcripional denumit AF1 (Activation Function).
2) o regiune de legare de ADN (C), n care exist 2 motive zinc-finger, n
care Zn interacioneaz n fiecare motiv cu 4 Cys (de aici si denumirea
clasei de C4).

Aminoacizii de la baza -helixului primului motiv zinc-finger recunosc o


secven specific din promotorul genelor, i poart denumirea de P-BOX.

5
Aminoacizii de la baza structurii -pliate a celui de-al doilea motiv zinc-finger
sunt implicai n dimerizare i poart denumirea de D-BOX.

3) o regiune D, prin care receptorii nucleari interacioneaz cu co-represorii.


4) o regiune, notat E, este o regiune de legare e ligandului, n care exist un
domeniu de legare a ligandului, un domeniu de dimerizare i al doilea
domeniu de activare transcripional, denumit AF2.
5) o regiune variabil ca lungime, carboxiterminal, denumit F, care poate
lipsi n unii receptori nucleari.

Analizele moleculare au demonstrat c receptorii nucleari recunosc


secvene specifice din promotorul genelor. Iniial s-a constatat c mai muli
receptori nucleari se leag de aceeai secven i s-a pus problema specificitii
funcionale. Analizele ulterioare au artat c secvenele repetitive pot fi
repetate direct, indirect sau opus, i separate de 1-5 nucleotide.

Secvenele repetitive recunoscute de receptorii nucleari aflate n


promotorul genelor poart denumirea de HRE (Elemente de Rspuns la Hormon)
sau RARE (Elemente de Rspuns la Acid Retinoic).

Receptorii nucleari se pot lega de ADN ca homo- sau heterodimeri. De


exemplu, receptorii pentru hormonii steroizi se leag de ADN ca homodimeri.
Receptorii pentru hormonii tiroidieni sau acizii retinoici trans se leag de ADN
ca heterodimeri; n cazul heterodimerului RAR-RXR, monomerul RAR vine n

6
contact i interacioneaz cu proteinele complexului transcripional bazal.
Receptorii pentru acizii retinoici 9-cis formeaz homodimeri.

La un grup de receptori nucleari nu s-a identificat ligandul sau, n unele cazuri,


acetia nu au nevoie de ligand pentru legarea de ADN. Aceti receptori nucleari
sunt denumii receptori orfani, n sensul ca nu au ligand. Acetia se leag mai
ales n form monomeric de ADN.

Modelul activrii transcripionale a receptorilor nucleari


ex.: heterodimerul RAR-RXR

n absena ligandului, heterodimerul RAR-RXR nu poate recunoate


secvenele RARE din ADN, deoarece monomerul RAR este asociat cu un co-
represor. Dac ligandul ajuns n nucleu se leag de monomerul RXR,
heterodimerul nu recunoate secvenele RARE. Numai n momentul n care
ligandul se leag de monomerul RAR are loc o modificare de conformaie, care
permite, pe de o parte, eliberarea co-represorului i recrutarea unui co-activator
care interacioneaz cu complexul transcripional bazal i iniiaz transcrierea
genei respective. n cazul n care n nucleu este o cantitate mai mare de ligand,
acesta se poate lega i de monomerul RXR, aceast legare determinnd
intensificarea transcrierii genei respective, prin recrutarea mai multor co-
activatori.

Familia GATA
Aceti factori transcripionali conin un domeniu ce prezint 2 motive
zinc-finger, n care Zn este asociat tot cu 4 Cys. Aceti factori transcripionali
recunosc o secven din ADN bogat n GATA.
Factorii transcripionali GATA sunt implicai n formarea endodermului la
toate metazoarele. Ei confer competen unei foie embrionare pluripotente,
nainte ca aceasta s exprime gene specifice. Acest fenomen poart denumirea
de potenare genic i se caracterizeaz prin faptul c factorii transcripionali
GATA se leag de genele int naintea activrii acestor gene.
De exemplu, n cursul dezvoltrii embrionare, n celulele endodermale din
care se va forma mugurele hepatic, gena albuminei nu este transcris, dei de
enhancer-ul ei este legat factorul transcripional GATA-4. Ulterior, cnd se
formeaz mugurele hepatic, gena albuminei este transcris, pentru c de

7
enhancer-ul ei se leag ali factori transcripionali.
Fenomenul potenrii genice permite asamblarea mai rapid a unui
enhancer, i exprimarea sincron a unei gene, ntr-o populaie celular.

Clasa LIM

Denumirea LIM provine de la iniialele proteinelor descoperite iniial:

L-factor transcripional Lin-12 (Lineage) de la Caenorhabditis elegans

I-factor transcripional Isl-1, care interacioneaz cu gena insulinei

M-factor transcripional Mec-3, implicat n formarea unor celule


mecanoreceptoare, tot de la Caenorhabditis elegans.

Toate proteinele LIM prezint unul sau mai multe domenii LIM. Fiecare
domeniu sau motiv LIM este formati din 2 motive zinc-finger, unite prin 2
aminoacizi. Zn este asociat cu 3 Cys i 1 His n primul motiv, i 3 Cys i 1 Asp n al
doilea motiv.

n funcie de rolul jucat n celul, proteinele LIM au fost mprite n 3


grupuri:

1. Fac parte proteinele:


i) LHX (Lim HomeoboX), care conin n afara domeniului LIM i un
homeodomeniu; De exemplu, proteinele Lhx 3 i Lhx 4 sunt
implicate n formarea hipofizei, i anume a pungii Rathke.
ii) LMO (LIM only), care conin doar domenii LIM.
iii) LIMK (LIM Kinaze) - proteine care, n afara domeniului LIM,
conin un domeniu kinazic.
2. Fac parte proteinele care conin, n afara domeniului LIM, un motiv
conservat carboxi-terminal; de exemplu, proteina CRP (Cysteine Rich
Protein).
3. Fac parte proteine care conin doar domenii LIM, localizate mai ales
spre extremitatea carboxi-terminal a moleculei. Acestea nu au funcie
transcripional, fiind implicate mai ales n reglarea citoscheletului.

8
II. Super clasa factorilor transcriptionali cu domenii bazice
1. Clasa leucin zipper
2. Clasa helix loop helix (HLH)

Acesti fact transcr contin o reg bazica de legare de ADN urmata de o


serie de motive leucin zipper sau helix loop helix.

Clasa leucin zipper

In forma lor monomerica proteinele acestei clase contin 2 regiuni distincte


(domenii): un domeniu de dimerizare carboxi terminal si un domeniu bazic de
legare de ADN amino terminal.

Domeniul de dimerizare este format dintr-o succesiune de heptade (=7 AA),


notati cu litere a,b,.....,g. AA din pozitiile a si d sunt hidrofobi, formand o banda
care se infasoara in jurul alfa-helixului. Acesti AA hidrofobi sunt implicati in
formarea de interactii van der Waals cu acelasi tip de AA din domeniul de
dimerizare al altei proteine leucin zipper. Existenta acestor AA hidrofobi si a
leucinei in pozitia g a heptadei a sugerat denumirea de fermoar cu leucina.

Regiunea bazica de legare de ADN: AA de la niv regiunii interne a regiunii


bazice interactioneaza cu perechile de baze din ADN si recunosc o secv generala
de tipul TGACGTCA.

Proteinele leucin zipper pot forma homo sau heterodimeri. Prin


heterodimerizare se extind foarte mult posibilitatile functionale ptr ca fiecare
monomer recunoaste o anumita secv de ADN.

Din aceasta categorie de factori transcriptionali fac parte:

a) factorul transcriptional AP1(=actvation protein 1)

b) C/EBP = prot care se leaga de un enhancer in care exista secv CCAAT


(Enhancer binding protein). Aceasta prot prezinta mai multa izoforme fiind
implicata in diferentierea cel adipoase, hepatice si hematopoietice. n ficat prez
2 izoforme: prot LAP = prot leucin zipper completa (= liver activator protein) si
izoforma LIP care nu contine reg bazica de legare de ADN (=liver inhibitory
protein). Atunci cand LIP interact cu LAP ii blocheaza activitatea
transcriptionala, pentru ca se formeaza doar jumatate din contactele necesare
fixarii de ADN.

9
Clasa helix loop helix (HLH)

Prot acestei clase contin un motiv format din 2 alfa helixuri unite printr-o
bucla flexibila si variabila ca lungime. Prot acestei clase recunosc o secv
specifica din ADN de tipul CANNTG (N=orice nucleotida). Aceasta secv a
fost descop intr-un enhancer si poarta denumirea de E-box.

Prot HLH pot forma homo sau hetero dimeri. Si in acest caz pot exista
prot HLH incomplete fara reg bazica de legare de ADN. Cand aceste prot
incomplete dimerizeaza cu prot HLH intregi le blocheaza activitatea. Rolul
acestor fact transcript a fost demonstrat in cursul miogenezei sau formarii
cel musculare.

Prot miogene HLH sunt reprez de : MyoD, Myf5 si miogenina. Aceste prot
devin functionale prin heterodimerizarea cu un membru al familiei de prot
HLH ubicuitare, reprezentate de prot E12 si E47. Activitatea prot miogene
poate fi blocata prin heterodimerizarea cu o prot HLH incompleta denumita
Id (=inhibitor differentiation).

Factorii transcriptionali HLH miogeni asigura succesiunea celor 2 stari


celulare (determinare si diferentiere). Acestea sunt 2 stari care se exclud si
o data ce celula a parasit ciclulc celular, ea in mod normal nu se mai divide
chiar in prezenta factorilor de crestere. Succesiunea celor 2 stari este
asigurata de 2 mecanisme moleculare.

Primul mecanism asigura diviziunea mioblastelor si impiedica iferentierea


prematura a acestora o data cu aparitia in citoplasma a prot miogene MyoD si
Myf5.

In cursul starii determinate, mioblastele contin in mb plasmatica receptori


ptr factori de crestere prezenti in spatiul extracelular. Interactia dintre
fact de crestere si recep coresp din mb plasm a mioblastelor determina o
serie de cai de semnalizare care induc mai multe evenimente:

A) Evenimente care determina diviziunea mioblastelor. Acestea sunt reprez


de actvarea fact transcrip AP1 si a prot retinoblastoma (=RB). Activarea
Rb este realizata de o protein kinaza C care o fosforileaza pe resturile de
serina si treonina. RB se gaseste in stare defosforilata in celulele in
repaus si incepe sa fie fosforilata in momentul tranzitiei la faza S.

10
B) Evenimente care conduc la blocarea diferentierii premature.
i) Activarea unei protein kinaze C, care fosforileaza prot miogene Myo
D si Myf5 la situsul de legare de ADN. In stare fosforilata aceste
prot nu recunosc secventa E-box din ADN.
ii) Are loc transcrierea intensa a genei Id si producerea unei cantitati
mari de prot Id care heterodimerizeaza cu prot miogene blocandu.le
activitatea. In consecinta, in cursul starii determinate, mioblastele
se divid dar nu se diferentiaza.

Cel de-al doilea mecanism initiaza diferentierea mioblastelor (fuziunea lor


in miotuburi) si impiedica reintoarcerea lor in ciclul celular. S-a constatat ca o
data cu inceperea diferentierii mioblastele pierd receptorii ptr factori de creste
astfel incat chiar daca acestia sunt prezenti in spatiul extracelular nu au efect
asupra celulelor. In absenta cailor de semnalizare initiate de receptoii pentru
factorii de crestere, RB nu mai este fosforilata, proteinele miogene sunt produse
intr-o cantitate mare si ele, pe de o parte, heterodimerizeaza cu RB, acoperind
situsul ei de fosforilare dar si cu AP1 creind un factor trascriptional
nefunctional leucin zipper HLH. De asemenea, prot miogene heterodimerizeaza
cu prot E12 si E47, in aceasta forma fiind implicate in diferentierea celulara.

Deci acest al doilea mecanism asigura blocarea diviziunii celulare si


initierea diferentierii celulare.

III. Superclasa fact trans cu motiv HTH (Helix turn helix)

Motivul HTH de aprox2 0 de AA a fost descoperit initial intr-o serie de prot


reglatorii de la Pk. Motivul HTH este format din 2 alfa helixuri unite printr-un
element structural rigid scurt denumit turn. Cel de-al doilea helix al motivului se
fixeaza la nivelul adanciturii sau fosei majore din ADN si din acest motiv poarta
denumirea de helix de recunoastere.

Aceasta superclasa contine mai multe clase si familii imp:

1. Clasa prot cu homodomeniu:

a) familia prot cu homodomeniu

b) familia POU

11
2. Clasa PAX

3. Clasa tryptophan clusters:

- Familia ETS

4. Clasa Forkhead (FOX)

Clasa prot cu homodomeniu

Prot din aceasta clasa contin in extremitatea carboxi terminala a prot un


motiv similar HTH. Homodomeniul, insa este format din 3 alfa helixuri. Primul
helix este precedat de un brat flexibil aminoterminal si unit de al doilea printr-o
bucl.

Motivul HTH este reprez de helixurile 2 si 3, cel de.al treilea helix fiind
de recunastere. Helixurile 1 si 2 sunt antiparalele si perpendiculare pe al treilea,
care este pozitionat la nivelul adanciturii majore din ADN. Bratul flexibil
aminoterminal se infasoara in jurul ADN-ului si contacteaza perechile de baze
bogate in AT din fosa sau adancitura minora de pe fata opusa a ADN. Spre
deosebire de prot HTH de la Pk, care se leaga de ADN ca dimri, prot cu
homeodomeniu funct ca monomeri in proc transcriptional.

Homeodomeniul este codificat de o secv specifica de ADN care poarta


denumirea de homeobox. Prot cu homeodomeniu recunsc secv scurte din ADN de
tipul ATTA, AA din pozitia 50 a homeodomeniului contactand cele 2 perechi de
baze dinaintea acestei secvente. De ex. secv GGATTA este recunoscuta de lizina
din pozitia 50 a homeodomeniilor proteinelor Bicoid si Fushi tarazu, ambele de la
Drosophila. Secventa CCATTA este recunoscuta de glutamina din pozitia 50 a
homeodomeniului Antenapedia de la Drosophila.

Factorii transcritionali POU

Denumirea lor vine de la initialele fact transcri descoperiti prima data:

P = Pit 1, fact trans care se leaga de gena prolactinei din hipofiza

O = Oct 3, care se leaga de o secv octamerica

12
U = Unc = fact transcript prezent la C. elegans si denumit dupa tipul mutant
caract prin miscari necoordonate.

POU prez 2 dom distincte: POU specfic si homeodomeniu, legate printr-o


regiune de legatura flexibila si variabila ca lungime. Dom POU specific este
format din 4 alfa helixuri impachetate ptr a form un miez hidrofob. Ptr legarea
cu specifictate de ADN sunt necesare ambele domenii. De ex fact transcp Pit 1
fara domeniul POU specific nu se leaga de gena prolactinei. Prezenta acestor 2
domenii permite invelirea acidului nucleic si realizarea de contacte pe ambele
fete ale ADN-ului.

13